CN107406510B

CN107406510B - 前列腺抗原标准品及其用途

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Publication number: CN107406510B
Application number: CN201680018332.XA
Authority: CN
Inventors: 文森特·林德; 克里斯蒂娜·希金斯
Original assignee: OPKO Diagnostics LLC
Current assignee: OPKO Diagnostics LLC
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2036-03-25
Also published as: IL254412B; MX2017012320A; MX2022002138A; ES2867798T3; WO2016160545A1; US20160282349A1; EP3318878A3; DE202016008692U1; TWI698639B; TW201643429A; US11921115B2; CN107406510A; JP6749337B2; PL3253800T3; EP3253800B1; JP2018511055A; UA124522C2; US20240159758A1; HUE055020T2; IL254412A0

Abstract

本公开内容的一些方面涉及用于预测从对象获得的前列腺组织活检物是否将包含可检出的前列腺癌的改进方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于对前列腺抗原水平进行定量的改进的前列腺抗原标准品。

Description

前列腺抗原标准品及其用途

发明背景

总前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)的血液水平升高与前列腺相关疾病(包括前列腺癌)相关。有相当多的证据表明单独测量PSA同种型的水平以及测量人激肽释放酶2(human kallikrein 2，hK2)导致与对象中前列腺癌的存在相关的预测得到改善。一般而言，用于测量前列腺抗原(例如PSA同种型和hK2)的水平升高的测定利用抗原标准曲线来对前列腺抗原水平进行定量。

发明概述

本公开内容的一些方面涉及这样的认识：目前使用的前列腺测定标准品需要使用大量前列腺抗原，这不具有成本效益(cost-effective)。此外，目前使用的测定中标准品所涵盖的宽的浓度范围可导致抗原浓度的不精确定量，原因是标准品范围与典型临床样品中存在的抗原量未适当地匹配。因此，已经认识到需要具有成本效益并提供提高的抗原水平定量准确度的新标准品。

用于对前列腺抗原水平进行定量的许多测定依赖于将所检测到的抗原信号与从一组标准抗原浓度获得的一组值进行比较。然而，目前使用的测定不具有成本效益，因为它们需要大量的前列腺抗原标准品。例如，一些前列腺抗原测试依赖于每次测定最大浓度高达350ng/mL的iPSA或高达22ng/mL的hK2的标准品。此外，目前使用的抗原标准品所涵盖的大的前列腺抗原范围可导致样品中前列腺抗原水平的不准确定量，并提高不正确诊断的风险。本公开内容通过提供用于改善前列腺抗原水平定量的具有成本效益的组合物和方法解决了这些问题。

因此，在一方面，本公开内容提供了用于对前列腺抗原水平进行定量的方法。在一些实施方案中，所述方法包括进行免疫测定以检测样品中前列腺抗原的存在；以及相对于使用相同免疫测定检测的信息性前列腺抗原标准品最小组(minimal set of informativeprostate antigen standard)，对在样品中检测到的前列腺抗原水平进行定量。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组包含至少两种含有预定量前列腺抗原的滴度，其中所述组的最大滴度为i)目标对象群体的上四分位数(upper quartile)血液前列腺抗原浓度至ii)该血液前列腺抗原浓度的75倍高。在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度的量低于免疫测定的定量限(limit of quantification)。在一些实施方案中，目标对象群体由男性组成，其中位年龄为60至70岁。在一些实施方案中，目标对象群体由男性组成，其下四分位数(lower quartile)年龄为55至65岁。在一些实施方案中，目标对象群体由男性组成，其上四分位数年龄为65至75岁。在一些实施方案中，前列腺抗原选自：总前列腺特异性抗原(total prostate specific antigen，tPSA)、游离前列腺特异性抗原(freeprostate specific antigen，fPSA)、完整前列腺特异性抗原(intact prostate specificantigen，iPSA)和人激肽释放酶2(human kallikrein 2，hK2)。在一些实施方案中，前列腺抗原是iPSA或hK2。在一些实施方案中，前列腺抗原是完整前列腺特异性抗原(iPSA)。在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度为0.025ng/mL。在一些实施方案中，所述组的最大滴度为15ng/mL。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.025ng/mL、0.089ng/mL、0.322ng/mL、1.157ng/mL、4.167ng/mL和15ng/mL。在一些实施方案中，前列腺抗原是hK2。在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度为0.002ng/mL。在一些实施方案中，所述组的最大滴度为8ng/mL。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.002ng/mL、0.011ng/mL、0.055ng/mL、0.290ng/mL、1.524ng/mL和8ng/mL。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组由前列腺抗原标准品的七种滴度组成。在一些实施方案中，前列腺抗原标准品的每种中间滴度与高于和低于所述中间滴度的滴度在对数标尺(logarithmicscale)上等距(equidistant)。在一些实施方案中，免疫测定选自：

酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心测定、western印迹测定和免疫沉淀测定(IPA)。在一些实施方案中，免疫测定是

在一些实施方案中，免疫测定是ELISA。在一些实施方案中，样品获自人对象。在一些实施方案中，样品是前列腺组织活检物。在一些实施方案中，样品是血液或血浆样品。

在一些方面，本公开内容提供了用于对前列腺抗原水平进行定量的前列腺抗原检测试剂盒，所述试剂盒包含用于使用免疫测定对样品中前列腺抗原水平进行定量的信息性前列腺抗原标准品最小组，其中每种前列腺抗原标准品作为溶液存在于容器中。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组包含至少两种含有预定量前列腺抗原的滴度，其中所述组的最大滴度为i)目标对象群体的上四分位数血液前列腺抗原浓度至ii)该血液前列腺抗原浓度的75倍高。在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度的量低于免疫测定的定量限。在一些实施方案中，所述前列腺抗原选自：总前列腺特异性抗原(tPSA)、游离前列腺特异性抗原(fPSA)、完整前列腺特异性抗原(iPSA)和人激肽释放酶2(hK2)。在一些实施方案中，前列腺抗原是iPSA或hK2。在一些实施方案中，前列腺抗原是完整前列腺特异性抗原(iPSA)。在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度为0.025ng/mL。在一些实施方案中，所述组的最大滴度为15ng/mL。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.025ng/mL、0.089ng/mL、0.322ng/mL、1.157ng/mL、4.167ng/mL和15ng/mL。在一些实施方案中，前列腺抗原是hK2。在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度为0.002ng/mL。在一些实施方案中，所述组的最大滴度为8ng/mL。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.002ng/mL、0.011ng/mL、0.055ng/mL、0.290ng/mL、1.524ng/mL和8ng/mL。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组由前列腺抗原标准品的七种滴度组成。在一些实施方案中，前列腺抗原标准品的每种中间滴度与高于和低于所述中间滴度的滴度在对数标尺上等距。

在一些方面，本公开内容涉及用于制备用于对样品中前列腺抗原水平进行定量的前列腺抗原标准品的方法，所述方法包括：(i)获得与前列腺癌相关的抗原；(ii)在合适的缓冲液中制备抗原的储备溶液，其中所述储备溶液的滴度为i)目标对象群体的上四分位数血液前列腺抗原浓度至ii)该血液前列腺抗原浓度的75倍高；以及(iii)通过连续稀释储备溶液制备前列腺抗原标准品最小组，使得前列腺抗原标准品的每种中间滴度与高于和低于所述中间滴度的滴度在对数标尺上等距。在一些实施方案中，目标对象群体由男性组成，其中位年龄为60至70岁。在一些实施方案中，目标对象群体由男性组成，其下四分位数年龄为55至65岁。在一些实施方案中，目标对象群体由男性组成，其上四分位数年龄为65至75岁。在一些实施方案中，前列腺抗原选自：总前列腺特异性抗原(tPSA)、游离前列腺特异性抗原(fPSA)、完整前列腺特异性抗原(iPSA)和人激肽释放酶2(hK2)。在一些实施方案中，前列腺抗原是iPSA或hK2。在一些实施方案中，前列腺抗原是完整前列腺特异性抗原(iPSA)。在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度为0.025ng/mL。在一些实施方案中，所述组的最大滴度为15ng/mL。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.025ng/mL、0.089ng/mL、0.322ng/mL、1.157ng/mL、4.167ng/mL和15ng/mL。在一些实施方案中，前列腺抗原是hK2。在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度为0.002ng/mL。在一些实施方案中，所述组的最大滴度为8ng/mL。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.002ng/mL、0.011ng/mL、0.055ng/mL、0.290ng/mL、1.524ng/mL和8ng/mL。在一些实施方案中，信息性前列腺抗原标准品最小组由前列腺抗原标准品的七种滴度组成。在一些实施方案中，前列腺抗原标准品的每种中间滴度与高于和低于所述中间滴度的滴度在对数标尺上等距。

附图简述

图1示出了对象群体(N＝1012)的hK2水平(ng/mL)的非限制性盒须图(box andwhisker plot)。

图2示出了对象群体(N＝1012)的iPSA水平(ng/mL)的非限制性盒须图。

发明详述

本公开内容的一些方面提供了用于对样品中前列腺抗原水平进行定量的标准品。本公开内容中描述的标准品代表了对目前使用的标准品的改进，原因是它们具有成本效益(例如，需要较低量的前列腺抗原)，并提供了与临床相关的前列腺抗原范围更紧密匹配的值组(set of value)。本公开内容部分地涉及这样的认识：相对于信息性前列腺抗原标准品最小组校准滴度范围显著地降低了成本，同时提供提高的前列腺水平定量的准确度。因此，在一些方面，本公开内容提供了用于对前列腺抗原水平进行定量的改进方法。所述方法通常包括进行免疫测定以检测样品中前列腺抗原的存在，以及相对于使用相同免疫测定检测的信息性前列腺抗原标准品最小组，对在样品中检测到的前列腺抗原水平进行定量。

本文中使用的“信息性前列腺抗原标准品最小组”是用于特定免疫测定的一组前列腺抗原标准品，其包含至少两种含有预定量前列腺抗原的滴度，其中所述组的最小滴度的量低于免疫测定的定量限，并且其中所述组的最大滴度的量为i)目标对象群体(例如，怀疑患有前列腺癌或需要进行活检的男性)的上四分位数血液前列腺抗原浓度至ii)该血液前列腺抗原浓度的100倍高。在一些实施方案中，所述组的最大滴度为i)目标对象群体的上四分位数血液前列腺抗原浓度至ii)该血液前列腺抗原浓度的75倍高。在一些实施方案中，所述组的最大滴度为i)目标对象群体的上四分位数血液前列腺抗原浓度至ii)该血液前列腺抗原浓度的50倍高。在一些实施方案中，所述组的最大滴度为i)目标对象群体的上四分位数血液前列腺抗原浓度至ii)该血液前列腺抗原浓度的25倍高。

在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度的量低于免疫测定的定量限。本文中使用的术语“定量限”是指通过使用免疫测定可检出和可定量的材料的最小量。在一些实施方案中，定量限是通过使用免疫测定可检出和可定量的变异系数小于25％、小于15％、小于5％或小于1％的材料的最小量。

在一些实施方案中，所述组的最小非零滴度的量低于免疫测定的检测度。本文中使用的术语“检测度”是指通过使用免疫测定可检出但不一定可定量的材料的最小量。

前列腺抗原标准品

在一些方面中，本公开内容提供了用于对样品中前列腺抗原水平进行定量的前列腺抗原标准品。本文中使用的“前列腺抗原标准品”是适用于针对可测量未知量的前列腺抗原建立参考的前列腺抗原的基本均质的制备物。在一些实施方案中，前列腺抗原标准品包含至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％纯度的前列腺抗原的制备物。然而，在一些实施方案中，标准品在与待测试样品(例如血液、血清、尿液或血浆样品)类似的培养基(例如，作为溶液)中包含前列腺抗原的均质制备物。例如，前列腺抗原标准品可掺入(spiked)原本不含前列腺抗原的血液、血清、尿液或血浆样品中。以这种方式，前列腺抗原标准品和未知样品的背景相似或相同，这可改善检测和定量的准确度。

在一些实施方案中，使用浓度曲线来确定样品中特定抗原的浓度。例如，可通过将相对荧光单位(relative fluorescence unit，RFU)相对于多种已知的抗原浓度(例如，一组抗原浓度)作图来产生浓度曲线。然后可将从具有未知抗原浓度的样品获得的RFU值与浓度曲线进行比较以确定样品的抗原浓度。

在一些实施方案中，标准品材料包含抗原滴度组。本文中使用的术语“抗原组”是指多种离散的抗原滴度。在一些实施方案中，一组中的每种抗原滴度容纳在不同的容器中。在一些实施方案中，从抗原滴度高于所述组的最大抗原浓度的主储备溶液(master stock)产生一组抗原标准品。在一些实施方案中，通过连续稀释储备溶液从主储备溶液产生一组抗原标准品。在一些实施方案中，从抗原浓度为所述组的最大抗原浓度的主储备溶液产生一组抗原。在一些实施方案中，一组抗原是1至20种抗原滴度、5至15种抗原滴度或8至12种抗原滴度。在一些实施方案中，一组抗原是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗原滴度。

在一些方面，本公开内容涉及这样的发现：建立前列腺抗原标准品最小组显著降低成本同时提供了提高的前列腺抗原水平定量的准确度。本文中使用的术语“信息性”是指抗原或抗原组提供具有未知抗原量或浓度的样品中抗原的临床相关定量的特征。例如，具有宽范围的抗原浓度的标准品可产生一组值(例如，浓度曲线)，其中临床相关抗原浓度落在所述值的可用范围之外。这可以降低所提供值的预测能力(predictive power)，并因此倾向于信息较少。另一方面，使用具有与目标群体中可能的抗原量或浓度一致的抗原浓度范围的标准品是具有信息的，因为所得值(例如，浓度曲线)具有更多数量的临床相关的抗原浓度落入值的可用范围(曲线)内。

在一些方面，本公开内容涉及前列腺抗原浓度在信息性前列腺抗原浓度的组中的分布。在一些实施方案中，组的每个信息性前列腺抗原浓度与高于或低于它的信息性前列腺抗原浓度等距。本文中使用的术语“等距”是指前列腺抗原浓度之间的单位数。例如，浓度为1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL和4ng/mL与线性标尺上高于和/或低于它的浓度各自等距(即1ng/mL)。该单位可以在任何适当标尺上进行测量，例如线性标尺(linear scale)或对数标尺(例如log₁₀，自然对数(LN)等)。在一些实施方案中，组的每个信息性前列腺抗原浓度与高于或低于它的信息性前列腺抗原浓度在对数标尺上等距。例如，iPSA抗原的信息组可以是0ng/mL、0.025ng/mL、0.089ng/mL、0.322ng/mL、1.157ng/mL、4.167ng/mL和15ng/mL。作为另一个实例，hK2抗原的信息组可以是0ng/mL、0.002ng/mL、0.011ng/mL、0.055ng/mL、0.290ng/mL、1.524ng/mL和8ng/mL。抗原的等距浓度可通过任何合适的方法制备，例如连续稀释，或将一定数量的抗原溶于合适的缓冲液中以获得具有信息性抗原浓度的溶液。

本公开内容考虑多种类型的抗原。抗原的实例包括但不限于肽、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白和小分子(例如半抗原)。抗原的另一些非限制性实例包括核酸，例如DNA、RNA和寡核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含前列腺抗原的标准品。本文中使用的术语“前列腺抗原”是指在对象的前列腺中产生或表达的抗原。前列腺抗原的实例包括但不限于：总前列腺特异性抗原(tPSA)、游离前列腺特异性抗原(fPSA)、完整前列腺特异性抗原(iPSA)和人激肽释放酶2(hK2)。在一些实施方案中，标准品材料包含iPSA浓度的信息组。在一些实施方案中，标准品材料包含hK2浓度的信息组。

本文中使用的术语“对象”是指患有或怀疑患有癌症或用于癌症测试的哺乳动物。对象的实例包括人、非人灵长类(例如，绒猴和猴)、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠。在一些实施方案中，对象是人对象。在一些实施方案中，所述对象是患有或怀疑患有前列腺癌的人。在一些实施方案中，所述对象是用于测试前列腺癌的人。人对象可以或可以不表现出前列腺癌的症状或体征，包括需要频繁排尿(尤其是在夜间)、开始排尿困难或憋尿困难、尿流弱或中断、排尿疼痛或灼烧、难以勃起、射精疼痛和/或尿液或精液中有血液。

在本公开内容还考虑用于标准品材料的容器。本文中所述的标准品材料可包含在任何合适的容器中。合适容器的非限制性实例包括小瓶(例如，玻璃小瓶或塑料小瓶)、试管、泡罩包装(blister pack)、瓶、小袋和测定板。在一些实施方案中，可将抗原浓度的组(例如，信息性前列腺抗原浓度组)容纳在多个容器中。例如，七种信息性前列腺抗原标准品的组可以存储在七个密封管中，每个管容纳单种信息性前列腺抗原标准品。一般而言，标准品材料在液相中同时被容器容纳。然而，本领域技术人员认识到可以以粉末形式(例如，以冻干形式)包含标准品材料(例如蛋白质抗原)，并用合适量的溶剂(例如，水或缓冲溶液)重构成信息性抗原浓度。

在一些实施方案中，本公开内容涉及包含标准品材料的试剂盒。试剂盒可包含标准品材料、用于进行测定的相关设备(例如测定板、适当的缓冲液、样品收集仪器和装置等)以及用于使用标准品材料进行测定的说明书。在一些实施方案中，本公开内容提供了具有多个容器的试剂盒，每个容器容纳标准品材料。在一些实施方案中，每个容器包含信息性前列腺抗原浓度组的信息性前列腺抗原浓度。在一些实施方案中，本文中所述的试剂盒还包含用于对来自样品的前列腺抗原水平进行定量的说明书。

本公开内容还考虑制备前列腺抗原标准品的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于制备用于对前列腺抗原水平进行定量的前列腺抗原标准品的方法，所述方法包括(i)获得与前列腺癌相关的抗原；(ii)在合适的缓冲液或溶剂中制备抗原的储备溶液；以及(iii)由储备溶液制备信息浓度组，其中所述组的每个信息浓度具有与高于或低于它的浓度在对数标尺上等距的浓度。在一些实施方案中，与前列腺癌相关的抗原是前列腺抗原。在一些实施方案中，前列腺抗原选自tPSA、fPSA、iPSA和hK2。在一些实施方案中，前列腺抗原是iPSA或hK2。合适的缓冲液和/或溶剂的非限制性实例包括水、磷酸缓冲盐水(PBS)和tris-缓冲盐水(TBS)。可例如通过连续稀释储备溶液由储备溶液制备信息性抗原浓度组以实现多个信息性抗原浓度。

用于对前列腺抗原水平进行定量的测定

在一些方面，本公开内容涉及用于对前列腺抗原水平进行定量的方法。本公开内容部分地基于这样的发现：本公开内容所描述的前列腺抗原标准品允许比目前使用的前列腺抗原标准品更具有成本效益且准确地定量前列腺抗原。

因此，在一些方面，本公开内容提供了用于对前列腺抗原水平进行定量的方法，所述方法包括进行免疫测定以检测样品中前列腺抗原的存在和基于通过免疫测定来自于信息性前列腺抗原浓度组的检测的值对在样品中检测到的前列腺抗原水平进行定量。例如，在一些实施方案中，抗原浓度的信息组是iPSA浓度的信息组。在一些实施方案中，抗原浓度的信息组是hK2浓度的信息组。

例如在2014年3月28日提交的USSN 61/972,099中(其内容通过引用整体并入本文)公开了用于检测前列腺抗原之存在的另外的方法。

免疫测定

可通过任何适当的方法评估前列腺特异性抗原(例如，tPSA、iPSA、fPSA和hK2)的水平。在一些实施方案中，提供了适合用于免疫测定的抗体或抗原结合片段。利用这样抗体或抗原结合片段的免疫测定可以是直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。这样的免疫测定的非限制性实例是解离增强的镧系元素荧光免疫测定(dissociation-enhancedlanthanide fluorescence immunoassay，

)、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心测定(免疫计量测定)、流式细胞术、western印迹测定、免疫沉淀测定、免疫组织化学、免疫显微术、侧向流动免疫色谱测定(lateral flow immunochromatographicassay)和蛋白质组学阵列。

在一些实施方案中，免疫测定是

(解离增强的镧系元素荧光免疫测定)是时间分辨荧光(time-resolved fluorescence，TRF)强度技术，其设计用于使用镧系元素螯合物标记的试剂检测化合物或生物分子的存在。

测定是灵活的，与多种读板器兼容，并且作为基于洗涤的技术，与多种样品类型(例如，血液、血清、血浆、细胞等)兼容。该技术基于镧系元素(铕、钐和铽)螯合物的荧光。这些镧系元素螯合物标记的荧光衰减时间比传统荧光团长得多，允许高效利用时间分辨率来降低自身荧光背景。大的斯托克斯位移(Stoke’s shift)(激发和发射波长之间的差异)和窄的发射峰有助于提高信噪比。由于解离增强原理，灵敏度进一步提高：镧系元素螯合物被解离，并且新的高度荧光螯合物形成保护性胶束溶液。与传统ELISA不同，

不包括使用酶(例如，辣根过氧化物酶HRP)来产生可检测的信号。

例如可通过与固体支持物(例如，载体、膜、柱、蛋白质组学阵列等)结合来将抗原或抗体或抗原结合片段固定。固体支持物材料的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性的纤维素，例如硝酸纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。支持物的性质可以是固定或悬浮于溶液中(例如，珠)。

在一些实施方案中，标记的抗体或抗原结合片段可用作示踪剂，以检测抗原结合抗体复合物。可用于产生示踪剂的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、磁、化学发光化合物和生物发光化合物。通过将放射性同位素例如¹⁵³Eu、³H、³²P、³⁵S、⁵⁹Fe或¹²⁵I(其随后可由γ计数器、闪烁计数器或通过放射自显影来检测)偶联以已知的方式制备放射性标记的抗体。如本文中所讨论的，抗体和抗原结合片段可作为替代地用酶(例如酵母醇脱氢酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)标记，然后显影并以分光光度法或可视地进行检测。合适的荧光标记包括荧光素异硫氰酸酯、荧光胺、罗丹明等。合适的化学发光标记包括鲁米诺(luminol)、咪唑、草酸酯、萤光素等。

免疫测定可以包括：在使抗体或抗原结合片段与抗原之间能够形成结合复合物的条件下，使含有抗原的样品(例如，血浆样品)与抗体或抗原结合片段(例如，F(ab)、F(ab)₂)接触。在一些实施方案中，如果抗原存在于样品中，在抗体或抗原结合片段适合与靶抗原结合的条件下，使血浆样品与抗体或抗原结合片段接触。这可以在合适的反应室(例如试管、板孔(plate well)、膜浴、细胞培养皿、显微镜载玻片以及其他腔室)中进行。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段被固定在固体支持物上。与样品中抗原结合的抗体或抗原结合片段可被称为捕获抗体。在一些实施方案中，捕获抗体包含标签(例如，生物素标记)，其通过涉及标签的相互作用(例如，生物素-链霉亲和素相互作用，其中链霉亲和素被固定于固体支持物)促进其固定化于固体支持物上。在一些实施方案中，所述固体支持物是反应室的表面。在一些实施方案中，所述固体支持物是聚合物膜(例如，硝酸纤维素条、聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Difluoride，PVDF)膜等)。在另一些实施方案中，所述固体支持物是生物结构(例如，细菌细胞表面)。本文中公开了另一些示例性固体支持物，并且其对于本领域普通技术人员将是明显的。

在一些实施方案中，抗体和抗原结合片段在与抗原接触之前被固定在固体支持物上。在另一些实施方案中，在形成结合复合物后进行抗体和抗原结合片段的固定化。在另一些实施方案中，抗原在形成结合复合物之前被固定在固体支持物上。在一些实施方案中，可以向反应室添加示踪剂，以检测固定的结合复合物。在一些实施方案中，所述示踪剂包含针对抗原的可检测标记的二抗。在一些实施方案中，所述示踪剂包含针对捕获抗体的可检测标记的二抗。在一些实施方案中，一抗或抗原结合片段本身是可检测标记的。

在一个实施方案中，本文中公开的免疫测定方法包括：将抗体或抗原结合片段固定于固相支持物上；在允许抗原与抗体或抗原结合片段(如果在样品中存在的话)结合的条件下，将样品(例如，血浆样品)施加于固体支持物；从所述固体支持物移除过量的样品；在允许示踪剂与抗原结合的固定化抗体或抗原结合片段结合的条件下，施加示踪剂(例如，可检测标记的抗体或抗原结合片段)；洗涤固体支持物，并测定存在的示踪剂。

在一些实施方案中，抗体和抗原结合片段在反应室中与抗原接触后被固定在固体支持物上。在一些实施方案中，抗体和抗原结合片段在反应室中与抗原接触之前被固定在固体支持物上。不论哪种情况，可向反应室添加示踪剂，以检测固定的结合复合物。在一些实施方案中，示踪剂包含可检测标记的针对抗原的二抗。在一些实施方案中，所述示踪剂包含可检测标记的针对一抗或抗原结合片段的二抗。如本文中所公开的，可检测标记可以是例如放射性同位素、荧光团、发光分子、酶、生物素-部分(biotin-moiety)、表位标签或染料分子。本文中描述了合适的可检测标记。

在一些实施方案中，已经发现，在低pH值缓冲液中进行某些免疫测定导致抗原检测更敏感。因此，在一些实施方案中，在pH为6.5至小于7.75的缓冲液中，示踪剂抗体与捕获抗体接触，使得示踪剂与捕获抗体-抗原复合物结合。在一些实施方案中，缓冲液pH为约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。

应理解，在本文中公开的任何测定中，捕获抗体可以与示踪剂抗体交换。

在一些实施方案中，测量fPSA水平的免疫测定包括：在其中第一捕获抗体与fPSA结合的条件下，使血浆样品中存在的fPSA与fPSA特异性捕获抗体接触，从而产生捕获抗体-fPSA复合物；以及使用示踪剂检测捕获抗体-fPSA复合物。捕获抗体可以是H117抗体。在一些实施方案中，所述示踪剂包含5A10抗体或其片段(例如，F(ab)片段)。在一些实施方案中，所述示踪剂包含与5A10抗体具有至少80％、至少85％、至少90％或至少99％的氨基酸序列同一性的抗体或其片段(例如，F(ab)片段)。在一些实施方案中，所述示踪剂包含与5A10抗体具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的抗体或其片段(例如，F(ab)片段)。

可并入片段中的5A10抗体的重链和轻链序列如下所示：

5A10重链

EVQLVESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTTGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHLYWDEDKRYNPSLKSRLTISEDSSRNQVFLKITSVGPADSATYYCARKGYYGYFDYWGQGTALTVSS(SEQ ID NO：1)

5A10轻链

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVNTDVAWYQQKPGQSPKALIFSTSYRSSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLAEYFCQQYSNYPLTFGAGTKVDLN(SEQ ID NO：2)

在一些实施方案中，测量iPSA水平的免疫测定包括：在其中第二捕获抗体至少与iPSA结合的条件下，使血浆样品中存在的iPSA与游离PSA特异性捕获抗体(其包含iPSA和有缺口PSA)接触，从而产生捕获抗体-iPSA复合物，并使用第二示踪剂检测捕获抗体-iPSA复合物。在一些实施方案中，所述示踪剂包含4D4抗体。在一些实施方案中，所述捕获抗体是5A10抗体或其片段(例如，F(ab)片段)。

在一些实施方案中，测量tPSA水平的免疫测定包括：在其中第三捕获抗体与tPSA结合的条件下，使血浆样品中存在的tPSA与tPSA特异性捕获抗体接触，从而产生捕获抗体-tPSA复合物；以及使用第三示踪剂检测捕获抗体tPSA复合物。在一些实施方案中，所述示踪剂包括H50抗体。在一些实施方案中，所述捕获抗体是H117抗体。

在一些实施方案中，测量hK2水平的免疫测定包括：使血浆样品中的PSA与PSA特异性阻断抗体接触；在其中第四捕获抗体与hK2结合的条件下，使血浆样品中存在的hK2与hK2特异性第四捕获抗体接触；从而产生捕获抗体-hK2复合物；并使用第四示踪剂检测捕获抗体-hK2复合物。在一些实施方案中，所述示踪剂包含7G1抗体。在一些实施方案中，所述捕获抗体是6H10F(ab)₂。在一些实施方案中，所述阻断抗体包含5H7抗体、5H6抗体和2E9抗体。

下表1列出了可用于本文中公开的方法中的抗体和抗原结合片段及其相应的表位。

表1：抗体和表位/抗体的来源

在一些方面，本公开内容涉及使用免疫测定来定量样品中的抗原水平。本文中使用的术语“定量”是指基于具有一组信息性抗原浓度的前列腺抗原标准品来确定样品中的抗原量或浓度。例如，iPSA的水平可通过使一组信息性iPSA浓度与可检测的抗体接触来定量；基于每种抗体结合的信息性iPSA浓度的可检测的输出产生一组值(例如，浓度曲线)；将具有未知iPSA浓度的样品与可检测的抗体接触；测量样品的抗体结合iPSA的可检测输出；以及基于与通过信息性浓度的检测产生的值的组的比较来对样品的iPSA水平进行定量。

在一些实施方案中，通过获得抗体的可检测输出产生一组值。在一些实施方案中，通过荧光读取器(例如荧光显微镜、微板读取器和/或UV分光光度计)获得可检测的输出。在一些实施方案中，荧光读取器与计算机连接。在一些实施方案中，所述计算机包含用于从可检测输出计算浓度曲线的软件(例如，SoftMax Pro^TM或Gen5数据分析)。

本公开内容的一些方面可使用计算机来实现。例如，可通过以下相对于前列腺抗原标准品测定样品中前列腺抗原的量：获得样品中前列腺抗原的免疫测定测量值并通过使用计算机将这些测量值与前列腺抗原标准品最小组中的前列腺抗原量进行比较。例如，本公开内容所描述的计算机系统可用于检测抗体-抗原结合的输出或使用从一组信息性抗原浓度获得的输出值来产生标准曲线。所述计算机系统可包含一个或更多个处理器和一个或更多个计算机可读的非暂时性存储介质(例如，存储器和一个或多个非临时性存储介质)。处理器可以以任何合适的方式来控制写入数据和从存储器以及非易失性存储装置(non-volatile storage device)读取数据，因为本文中描述的本公开内容的一些方面并不限制于此方面。

为了执行本文中所描述的任何功能，例如基于信息性前列腺抗原最小组来计算前列腺水平，处理器可以执行存储在一个或更多个计算机可读存储介质(例如，存储器)中的一个或更多个指令(例如程序模块)，所述一个或更多个计算机可读存储介质可作为存储由处理器执行的指令的非临时性计算机可读存储介质。一般而言，程序模块包含执行特定任务或实现特定抽象数据类型的例程(routine)、程序、对象、组件、数据结构等。一些实施方案也可在分布式计算环境中执行，其中任务由通过通信网络连接的远程处理设备进行。在分布式计算环境中，程序模块可以位于包含存储器装置的本地和远程计算机存储介质中。数据输入和程序命令可由计算机通过输入接口接收。输入接口可包含键盘、触摸屏、USB端口、CD驱动器、DVD驱动器或其他输入接口。

应理解，可用一个或更多个上述特征形成多个实施方案。上述方面和特征可以以任何合适的组合使用，因为本公开内容不限于此方面。还应理解，附图示出了可并入多个实施方案中的多种组件和特征。为了简化，一些附图可示出多于一个的可选特征或组件。然而，本公开内容不限于附图中所公开的具体实施方案。应认识到，本公开内容涵盖可仅包括在任何一个附图中所示的组件的一部分的实施方案，和/或还可涵盖将多个不同附图中所示组件组合的实施方案。

实施例

实施例1：PSA和人激肽释放酶2的序列

PSA蛋白(SEQ ID NO：3)

IVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP

hK2蛋白(SEQ ID NO：4)

IVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSLHLLSNDMCARAYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANP

实施例2：用于检测前列腺抗原的改进的标准品材料

先前的iPSA标准品的最大浓度范围为166至350ng/mL。该实施例描述了通过最大浓度15ng/mL的连续稀释重新配制iPSA标准品，如表2中所示。以下示出的信息组相对于现有技术标准组(prior standard set)提供了若干益处。首先，由于需要较少的抗原，因此最大iPSA浓度的减小将成本降低约11至23倍。其次，减小的测定范围允许校准曲线的更多点(例如，值)落入用于诊断前列腺癌的iPSA浓度的临床相关范围内。最后，使用七种连续稀释的浓度(例如，等距浓度)允许对从该组中检测到的原始信号值进行规范，这改善了标准品的批次之间和测定的运行之间的质量控制。

表2：iPSA标准组(ng/mL)的比较

以类似的方式重新配制人激肽释放酶2(hK2)标准品。先前可用的hK2标准品的最大浓度为13.1ng/mL至22.7ng/mL，如表3中所示。以下示出的信息组相对于现有技术标准组提供了若干益处。首先，由于需要较少的抗原，最大hK2浓度的减小将成本降低约1.6至2.8倍。其次，减小的测定的范围允许校准曲线的更多点(例如，值)落入用于诊断前列腺癌的hK2浓度的临床相关范围内。最后，使用七种连续稀释的浓度(例如，等距浓度)允许对从该组中检测到的原始信号值进行规范，这改善了标准品的批次之间和运行之间的质量控制。

表3：hK2标准组(ng/mL)的比较

实施例3：在4Kscore测定中使用iPSA和hK2标准品

该实施例描述了在4Kscore测试中使用上述iPSA和hK2标准品。4Kscore测试是经校准的多变量个体化风险评分，其来自于包含血液样品中与前列腺相关的四种激肽释放酶蛋白(总前列腺特异性抗原(tPSA)、游离PSA(fPSA)、完整PSA(iPSA)和人激肽释放酶2(hK2))的测量值加上以下临床信息的算法：先前的阴性活检的存在(或不存在)、患者的年龄、以及直肠指检(digital rectal examination，DRE)状态下观察到(观察不到)结节。如果要进行前列腺活检，则该算法计算用于发现高等级癌症的风险概率(格利森评分(Gleason Score)7)。该测试旨在在临床决定是否进行前列腺活检中用作辅助。

通过由FDA批准的用于人诊断的商业测定法(Roche^TM

仪器和

测定)测定tPSA和fPSA的浓度。使用开发用于在

仪器上运行的测试来测定iPSA和hK2的浓度。

将静脉血液样品收集在K₂EDTA管中。管尺寸必须足够大以允许收集约7.5mL的血液(至少5mL的血液)。为了确保与EDTA的良好混合，样品收集后必须立即将血液管颠倒8次。这些血液量确保可获得足够的血浆。四种激肽释放酶标志物的单个测定需要约1mL的血浆。如果需要，两毫升(2mL)的血浆允许重新进行测定。

通过夹心(非竞争性)免疫测定来检测iPSA和hK2的存在。iPSA测定采用两种不同的小鼠单克隆抗体产物。捕获探针是单克隆抗体5A10的生物素化的重组His₆-Cys标记的Fab片段，其对fPSA(其中iPSA是其组分)具有特异性。示踪剂是铕标记的单克隆抗体4D4，其对iPSA和复合PSA(PSA-ACT)具有特异性。综合来看，试剂对iPSA是特异性的。hK2测定采用五种不同的小鼠单克隆抗体产品。捕获探针是6H10单克隆抗体的生物素化的F(ab)2片段，其对hK2和tPSA具有特异性。示踪剂是铕标记的单克隆抗体7G1，其对hK2和tPSA具有特异性。该测定需要使用tPSA的阻断抗体。样品用三种tPSA单克隆抗体(克隆2E9、5F7和5H6)的混合物稀释，并且示踪剂制剂还含有5H6。综合来看，试剂对hK2是特异性的。

如下校准测定。相对于

ProStatus^TM PSA游离/总试剂盒校准iPSA测定，其进而相对于WHO 96/670(tPSA)和96/668(fPSA)进行校准。ProStatus测定允许定量测定tPSA和fPSA，其中iPSA是亚组分子(subset molecule)。iPSA校准溶液的分配来自于tPSA和fPSA测定获得的平均回收率。相对于

ProStatus^TM PSA游离/总试剂盒校准hK2测定，其进而相对于WHO 96/670(tPSA)和96/668(fPSA)进行校准。ProStatus测定允许定量测定tPSA和fPSA，并且tPSA组分与hK2具有等摩尔交叉反应性。hK2校准溶液的分配来自于对于tPSA测定获得的回收率。

然后将从在免疫测定中iPSA和hK2的检测获得的信号与使用相同的iPSA和hK2抗体从一组标准品(例如，校准溶液)的检测获得的信号进行比较。iPSA和hK2测定各自使用7种标准品(例如，校准溶液)。使用标准品(例如，校准溶液)的测量来确定测定的报告范围。报告范围受低端的定量限(LoQ)和高端的最高校准物限制。对于iPSA和hK2测定，使用CLSIEP-17A确定LoQ。测定的报告范围如下表4中所示。

表4：iPSA和hK2的4Kscore报告范围

	iPSA	hK2
			测定范围	0.014-15ng/mL	0.022-8ng/mL

通过分析来自美国临床试验的4Kscore测试(其包含1012名参与者)的数据，获得了iPSA和hK2的预期值。基于患者进行活检后组织的病理学检查，将参与者分为三组。数据如下表5和6以及图1和图2中的盒须直方图(box and whisker histogram)所示。结果表明，99.9％的hK2值(1011/1012)和99.6％的iPSA值(1008/1012)落入测定的报告范围内。

表5：iPSA和hK2的值

表6：iPSA和hk2百分位数据(所有对象，N＝1012)

使用CLSI EP5-A2和CLSI EP6-A评估iPSA和hK2的测定性能。结果如下表7中所示。注意，在每个测定(例如，iPSA或hK2)内，变异系数(coefficient of variance，CV)值在整个报告范围内保持较低(＜15％)。此外，每个测定的R²值为1。总之，这些数据表明在测定的整个报告范围内的高准确度和精密度。

表7：测定性能

评价了4Kscore测试的临床性能。总共1,012位患者参加了美国26个泌尿外科学中心的盲法前瞻性临床研究。为了获得现有活检选择实践的群组代表，无论年龄、PSA、DRE或先前的活检如何，所有计划进行前列腺活检的男性都欢迎入组。每个参与者进行了至少10个核心的经直肠超声引导的前列腺活检，并且根据每个中心的已建立实践进行组织病理学检查。具有已知影响PSA水平的治疗史的患者被排除在外。在活检之前收集盲式血液样品，并送到Nackville，TN的OPKO实验室中以测试四种激肽释放酶标志物(tPSA、fPSA、iPSA和hK2)。四种激肽释放酶标志物、组织病理学、年龄、DRE和先前活检状态数据的结果是非盲的，并由独立的生物统计学家进行分析，并示于表8中。再次注意到iPSA和hK2的中位数和四分位数水平在测定的报告范围内并具有高度显著的p值。

表8：患者数据表

虽然本文中已描述并说明了本发明的数个实施方案，但是本领域普通技术人员将容易预见用于执行功能和/或获得结果和/或本文中所述的一个或更多个优点的多种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化和/或修改都被视为在本发明的范围之内。更一般地，本领域的技术人员将容易理解，本文中所描述的所有参数、尺寸、材料和构造意为示例性的且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于具体的应用或使用本发明的教导的应用。本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定，许多与本文中所描述的本发明的具体实施方案等同的方案。因此，可以理解的是，前述的实施方案仅通过示例的方式给出，且在所附权利要求书及其等同方案的范围之内，可以以除了具体描述和要求保护的其他方式来实施本发明。本发明涉及本文中所述的每个单独的特征、系统、制品、材料和/或方法。此外，如果这类特征、系统、制品、材料和/或方法相互不矛盾，则两个或更多个这类特征、系统、制品、材料和/或方法的任意组合也包括在本发明的范围内。

除非明确指出相反，否则如本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。

如本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应被理解为是指如此结合起来的要素(例如，在一些情况下联合存在而其他情况下分开存在的要素)的“任一或两者”。除非明确有相反的指示，否则除了通过由“和/或”子句表述所具体确定的元素之外，其他要素也可任选地存在，无论其与具体确定的那些元素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言如“包含”联合使用时，关于“A和/或B”在一个实施方案中可以指A但没有B(任选地包含除了B之外的元素)；在另一个实施方案中，可以指B但没有A(任选包括除了A之外的元素)；在另一个实施方案中，可以指A和B两者(任选包含其他元素)等。

如本文中在说明书和权利要求书中使用的“或”应被理解为具有与如上所定义“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括数字或要素列表中的至少一个，但还包含了多于一个，并且任选地包含其他未列出的项目。只有明确表述示相反的术语，例如“仅仅之一”或“正好之一”，或者，在权利要求书中使用“由......组成”时，才将指仅包含许多要素要素列表中的一个要素。一般而言，当前面有排他性的术语例如“任一”，“之一”，“仅有之一”或“恰好之一”时，本文中所使用的术语“或”应该仅解释为表示排他性的替代选择(例如“一个或另一个但不是两者”)。当在权利要求书中使用时，“基本由......组成”应具有其在专利法领域中所使用的通常含义。

关于一个或更多个要素的列表，如本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中任意一个或更多个要素中的至少一个要素，但是不一定包含要素列表内具体列出的各个要素和每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任意组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所指的要素列表内的明确指出的要素之外，要素可任选地存在，不论其与那些明确指出的要素相关或不相关。因此，作为非限制性的实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指，至少一个A，任选报读多于一个A，而不存在B(且任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个B，任选包含多于一个B，而不存在A(且任选地包含除A之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个A，任选地包括多于一个A，和至少一个B，任选包含多于一个B(且任选地包含其他要素)等。

在权利要求书以及在上述说明书中，所有的连接词例如“包含”，“包括”，“携带”，“具有”，“含有”，“涉及”，“持有”等应理解为开放式的，例如意指包括但不限制于。仅连接词“由......组成”和“基本上由...组成”应分别是封闭的或半封闭的连接词，如美国专利局专利审查程序手册2111.03部分所述。

在权利要求中使用例如“第一”、“第二”、“第三”等的序数词来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个的优先级、优先性或顺序或者执行方法中的动作的时间顺序，而仅用作区分将具有某个名称的一个权利要求要素与具有相同名称(但使用序数词)的另一元素来区分开的标签，以区分权利要求要素。

还应理解，除非明确指出相反，否则在本文中所要求保护的任何包括多于一个步骤或作用的方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于所记载方法的步骤或作用的顺序。

序列表

<110> 欧普科诊断有限责任公司

<120> 前列腺抗原标准品及其用途

<130> C1256.70015WO00

<140> 未分配

<141> 于此同时

<150> US 62/139,365

<151> 2015-03-27

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Thr

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Leu Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Glu Asp Ser Ser Arg Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Pro Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Lys Gly Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Phe Ser Thr Ser Tyr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Asp Leu Asn

100 105

<210> 3

<211> 237

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His

20 25 30

Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val

35 40 45

Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln

50 55 60

Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser

65 70 75 80

Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp

85 90 95

Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val

100 105 110

Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys

115 120 125

Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro

130 135 140

Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys

145 150 155 160

Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly

165 170 175

Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro

180 185 190

Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu

195 200 205

Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His

210 215 220

Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro

225 230 235

<210> 4

<211> 237

<212> PRT

<213> 人

<400> 4

Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His

20 25 30

Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln

35 40 45

Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln

50 55 60

Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser

65 70 75 80

Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp

85 90 95

Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val

100 105 110

Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys

115 120 125

Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro

130 135 140

Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys

145 150 155 160

Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly

165 170 175

Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro

180 185 190

Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His

210 215 220

Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Ala Ala Asn Pro

225 230 235

Claims

1.用于对前列腺抗原水平进行定量的前列腺抗原标准品组用于制备用于对所述前列腺抗原水平进行定量的诊断剂的用途，所述定量包括：

进行免疫测定以测量样品中的前列腺抗原水平，其中所述前列腺抗原是完整前列腺特异性抗原(iPSA)和/或人激肽释放酶2(hK2)；

进行相同免疫测定以测量所述前列腺抗原标准品组中每种滴度的前列腺抗原水平，其中所述前列腺抗原标准品组包含至少两种含有已知水平前列腺抗原的滴度，其中所述前列腺抗原的每种中间滴度与高于和低于所述中间滴度的滴度在对数标尺上等距，其中所述组的最小非零滴度的量低于所述免疫测定的定量限，并且其中所述组的最大滴度的前列腺抗原水平小于或等于15ng/mLiPAS或者小于或等于8ng/mL hK2；以及

基于所述前列腺抗原标准品组中前列腺抗原的测量水平，确定所述样品中的所述前列腺抗原水平。

2.权利要求1所述的用途，其中所述前列腺抗原是完整前列腺特异性抗原(iPSA)。

3.权利要求2所述的用途，其中所述组的最小非零滴度为0.025ng/mL。

4.权利要求2至3中任一项所述的用途，其中所述组的最大滴度为15ng/mL。

5.权利要求2所述的用途，其中所述前列腺抗原标准品组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.025ng/mL、0.089ng/mL、0.322ng/mL、1.157ng/mL、4.167ng/mL和15ng/mL。

6.权利要求1所述的用途，其中所述前列腺抗原是hK2。

7.权利要求6所述的用途，其中所述组的最小非零滴度为0.002ng/mL。

8.权利要求6至7中任一项所述的用途，其中所述组的最大滴度为8ng/mL。

9.权利要求6所述的用途，其中所述前列腺抗原标准品组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.002ng/mL、0.011ng/mL、0.055ng/mL、0.290ng/mL、1.524ng/mL和8ng/mL。

10.权利要求1至3、5至7或9中任一项所述的用途，其中所述前列腺抗原标准品组由前列腺抗原标准品的七种滴度组成。

11.权利要求1至3、5至7或9中任一项所述的用途，其中所述免疫测定选自：解离增强的镧系元素荧光免疫测定、酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心测定、western印迹测定和免疫沉淀测定(IPA)。

12.权利要求11所述的用途，其中所述免疫测定是解离增强的镧系元素荧光免疫测定。

13.权利要求11所述的用途，其中所述免疫测定是ELISA。

14.权利要求1至3、5至7或9中任一项所述的用途，其中所述样品获自人对象。

15.权利要求1至3、5至7或9中任一项所述的用途，其中所述样品是前列腺组织活检物。

16.权利要求1至3、5至7或9中任一项所述的用途，其中所述样品是血液或血浆样品。

17.用于对前列腺抗原水平进行定量的前列腺抗原检测试剂盒，所述试剂盒包含用于使用免疫测定对样品中所述前列腺抗原水平进行定量的前列腺抗原标准品组，其中每种前列腺抗原标准品作为溶液存在于容器中，其中所述前列腺抗原标准品组包含至少两种含有已知水平前列腺抗原的滴度，其中所述前列腺抗原的每种中间滴度与高于和低于所述中间滴度的滴度在对数标尺上等距，其中所述组的最小非零滴度的量低于所述免疫测定的定量限，其中所述前列腺抗原是完整前列腺特异性抗原(iPSA)和/或人激肽释放酶2(hK2)，并且其中所述组的最大滴度的前列腺抗原水平小于或等于15ng/mLiPAS或者小于或等于8ng/mLhK2。

18.权利要求17所述的试剂盒，其中所述前列腺抗原是完整前列腺特异性抗原(iPSA)。

19.权利要求18所述的试剂盒，其中所述组的最小非零滴度为0.025ng/mL。

20.权利要求18至19中任一项所述的试剂盒，其中所述组的最大滴度为15ng/mL。

21.权利要求18所述的试剂盒，其中所述前列腺抗原标准品组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.025ng/mL、0.089ng/mL、0.322ng/mL、1.157ng/mL、4.167ng/mL和15ng/mL。

22.权利要求17所述的试剂盒，其中所述前列腺抗原是hK2。

23.权利要求22所述的试剂盒，其中所述组的最小非零滴度为0.002ng/mL。

24.权利要求22至23中任一项所述的试剂盒，其中所述组的最大滴度为8ng/mL。

25.权利要求22所述的试剂盒，其中所述前列腺抗原标准品组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.002ng/mL、0.011ng/mL、0.055ng/mL、0.290ng/mL、1.524ng/mL和8ng/mL。

26.权利要求17至19、21至23或25中任一项所述的试剂盒，其中所述前列腺抗原标准品组由前列腺抗原标准品的七种滴度组成。

27.权利要求17至19、21至23或25中任一项所述的试剂盒，其还包含tPSA的阻断抗体。

28.权利要求17至19、21至23或25中任一项所述的试剂盒，其还包含对所述前列腺抗原具有特异性的可检测的抗体。

29.权利要求28所述的试剂盒，其中所述可检测的抗体标记有酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、磁化合物、或其组合。

30.权利要求28所述的试剂盒，其中所述可检测的抗体标记有化学发光化合物、生物发光化合物、或其组合。

31.权利要求17至19、21至23或25中任一项所述的试剂盒，其还包含对所述前列腺抗原具有特异性的生物素化的捕获抗体。

32.用于制备用于对样品中前列腺抗原水平进行定量的前列腺抗原标准品的方法，所述方法包括：

(i)获得与前列腺癌相关的抗原，其中所述抗原是完整前列腺特异性抗原(iPSA)和/或人激肽释放酶2(hK2)；

(ii)在合适的缓冲液中制备前列腺抗原的储备溶液，其中所述储备溶液的滴度小于或等于15ng/mL iPAS或者小于或等于8ng/mL hK2；以及

(iii)通过连续稀释所述储备溶液制备前列腺抗原标准品组，使得前列腺抗原标准品的每种中间滴度与高于和低于所述中间滴度的滴度在对数标尺上等距，并且使得所述组的最小非零滴度的量低于免疫测定的定量限。

33.权利要求32所述的方法，其中所述前列腺抗原是完整前列腺特异性抗原(iPSA)。

34.权利要求33所述的方法，其中所述组的最小非零滴度为0.025ng/mL。

35.权利要求33至34中任一项所述的方法，其中所述组的最大滴度为15ng/mL。

36.权利要求33所述的方法，其中所述前列腺抗原标准品组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.025ng/mL、0.089ng/mL、0.322ng/mL、1.157ng/mL、4.167ng/mL和15ng/mL。

37.权利要求32所述的方法，其中所述前列腺抗原是hK2。

38.权利要求37所述的方法，其中所述组的最小非零滴度为0.002ng/mL。

39.权利要求37或38中任一项所述的方法，其中所述组的最大滴度为8ng/mL。

40.权利要求37所述的方法，其中所述前列腺抗原标准品组由前列腺抗原标准品的以下滴度组成：0ng/mL、0.002ng/mL、0.011ng/mL、0.055ng/mL、0.290ng/mL、1.524ng/mL和8ng/mL。

41.权利要求32至34、36至38或40中任一项所述的方法，其中所述前列腺抗原标准品组由前列腺抗原标准品的七种滴度组成。