MX2007003003A

MX2007003003A - Biomarcadores para cancer de mama.

Info

Publication number: MX2007003003A
Application number: MX2007003003A
Authority: MX
Inventors: Zhen Zhang; Jinong Li; Carolyn Nicole White; Daniel W Chan; Eric Thomas Fung; Xiao-Ying Meng
Original assignee: Univ Johns Hopkins
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2007-11-09
Also published as: CA2580494A1; WO2006034032A2; EP1802764A2; US7951529B2; US20080311673A1; EP1802764A4; AU2005287074A1; CN101087889A; WO2006034032A3

Abstract

La invencion proporciona biomarcadores y combinaciones de biomarcadores a base de proteinas que son utiles para calificar estado de cancer de mama en un paciente. En particular, los biomarcadores de esta invencion son utiles para clasificar una muestra de un sujeto como con cancer de mama o sin cancer de mama. Los biomarcadores pueden ser detectado mediante espectroscopia de masas SELDI.

Description

BIOMARCADORES PARA CÁNCER DE MAMA Antecedentes de la invención Con base en los datos incidencia del Instituto Nacional del Cáncer (NCl, por ss siglas en inglés) y de mortalidad del Centro Nacional para Estadísticas de Salud (NCHS) , la Sociedad Americana del Cáncer calculó que el cáncer de mama sería el cáncer más comúnmente diagnosticado entre mujeres en 2002 en Estados Unidos. Se espera que equivalga al 31 por ciento (203,500) de todos los casos nuevos de cáncer entre mujeres y 39,600 morirán de esta enfermedad. Jemal A, Thomas A, Murray T, Thun M. Cáncer statistics, 2002. CA Cáncer J Clin. 2002; 52:23-47. El análisis presintomático para detectar cáncer en etapas tempranas mientras aún es tratable con potencial de cura puede reducir ampliamente la mortalidad relacionada con cáncer de mama. Desafortunadamente, sólo alrededor de 50% de los cánceres de mama se detectan en el momento del diagnóstico. National Cáncer Institute. Cáncer Net PDQ Cáncer Information Summaries . Monographs no "Screening for breast cáncer" http://cancernet.nci.nih.gov/pdq.html (Actualizado Enero de 2001). A pesar de la disponibilidad y uso recomendado de la mamografía para mujeres de 40 años y mayores como un método de análisis de rutina, aún se está investigando su efectividad para reducir la mortalidad en la población general por cáncer de mama. K. Animan et al., REF.: 130112 JAMA . 1999;281:1470-2. Actualmente, marcadores tumorales de suero que han sido investigados para usarse en la detección del cáncer de mama aún carecen de la sensibilidad y especificidad adecuadas como para ser aplicables para detectar carcinomas en etapas tempranas en una gran población. La FDA aprobó marcadores tumorales tales como CA15.3 y CA27.29, son sólo recomendados para monitorear terapia de cáncer o recurrencia de cáncer de mama avanzado. D.W. Chan et al . , J. Clin . Oncology, 1997, 15:2322-2328. Nuevos biomarcadores que pudieran ser usados individualmente o en combinación con una modalidad existente para el análisis económico del cáncer de mama se requieren aún urgentemente. Breve descripción de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para calificar estado de cáncer de mama en un sujeto, que comprenden medir al menos un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el por lo menos un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en los biomarcadores de fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?d y C3a-desArg y correlacionar la medición con el estado del cáncer de mama. En una modalidad, los métodos comprenden medir cada uno de: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg. En otra modalidad, los métodos comprenden además medir CA15-3. En una modalidad, el por lo menos un biomarcador se mide al capturar el biomarcador sobre una superficie adsorbente de una sonda SELDI y detectar los biomarcadores capturados mediante espectrometría de masas de desorción-ionización láser. En otra modalidad, el por lo menos un biomarcador se mide mediante inmunoensayo, por ejemplo, usando un anticuerpo específico para el por lo menos un biomarcador. En una modalidad preferida, el por lo menos un biomarcador se detecta usando un método que no es espectrometría de masas. En otra modalidad preferida, la muestra es suero. En aún otra modalidad, la correlación se lleva a cabo por un algoritmo de clasificación de software. En una modalidad, el estado del cáncer de mama se selecciona de cáncer de mama y cáncer que no es de mama. En otra modalidad, el estado del cáncer de mama se selecciona de cáncer de mama no invasor y cáncer de mama invasor. En una modalidad más, los métodos comprende manejar tratamientos en el sujeto con base en el estado. En una modalidad preferida, el adsorbente es un adsorbente IMAC-Ni . En otra modalidad preferida, el adsorbente es un adsorbente bioespecífico (por ejemplo, un anticuerpo) . En otra modalidad, si la medición se correlaciona con cáncer de mama, entonces los métodos pueden comprender además manejar tratamiento del sujeto que comprende administrar un agente quimioterapéutico o radiación al sujeto. En aún otra modalidad, los métodos comprenden medir más el por lo menos un biomarcador después del manejo del sujeto y correlacionar la medición con el progreso de la enfermedad. En otra modalidad, los métodos de la invención comprenden medir al menos un biomarcador en una muestra de un sujeto, en donde el por lo menos un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en biomarcadores: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg. En una modalidad, los métodos comprenden medir cada uno de los siguientes biomarcadores: fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 , y C3a-desArg. En otra modalidad, los métodos comprenden además medir CA15-3. En una modalidad, el biomarcador se mide) al capturar el biomarcador sobre una superficie adsorbente de una sonda SELDI y detectar los biomarcadores capturados mediante espectrometría de masas de desorción-ionización láser. En una modalidad preferida, la muestra es suero. En otra modalidad, el adsorbente es un adsorbente IMAC-Ni. En una modalidad preferida, el adsorbente es un adsorbente bioespecífico (por ejemplo, un anticuerpo) . En otra modalidad, la invención proporciona un kit que comprende un soporte sólido que contiene al menos un reactivo de captura unido al mismo, en donde el reactivo de captura se une al menos a un biomarcador de un primer grupo que consiste en fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg e instrucciones para usar el soporte sólido para detectar el por lo menos un biomarcador. En una modalidad, el kit comprende instrucciones para usar el soporte sólido para detectar cada uno de los biomarcadores: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg. En otra modalidad, el kit proporciona instrucciones para usar el soporte sólido para detectar CA15-3. En una modalidad, el kit proporciona un soporte sólido que comprende un reactivo de captura que es una sonda SELDI . En otra modalidad, el reactivo de captura es un anticuerpo . En otra modalidad, el kit comprende además un recipiente que contiene al menos uno de los biomarcadores de fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?d y C3a-desArg. En otra modalidad, el kit comprende además un sorbente de cromatografía IMAC-Ni . En otra modalidad, la invención proporciona un kit que comprende un soporte sólido que contiene al menos un reactivo de captura unido al mismo, en donde los reactivos de captura se unen al menos a un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en los biomarcadores de fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a- desArg; y un recipiente que contiene al menos uno de los biomarcadores. En una modalidad, el recipiente contieno cada uno de los siguientes biomarcadores: fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-d sArg. En una modalidad más, el recipiente contiene CA15-3. En una modalidad, el soporte sólido que comprende un reactivo de captura es una sonda SELDI . En una modalidad más, el kit comprende un sorbente de cromatografía IMAC-Ni . En otra modalidad, la invención proporciona un producto de software que comprende: código que tiene acceso a datos atribuidos a una muestra, los datos comprenden la medición de al menos un biomarcador en la muestra, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste en los biomarcadores de fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg; y código que ejecuta un algoritmo de clasificación que clasifica el estado de cáncer de mama de la muestra como una función de la medición. En otra modalidad, el algoritmo de clasificación clasifica el estado de cáncer de mama de la muestra como una función de la medición de un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg. En otra modalidad, el algoritmo de clasificación clasifica el estado de cáncer de mama de la muestra como una función de la medición de cada uno de los biomarcadores: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg. En otra modalidad, el algoritmo de clasificación clasifica el estado de cáncer de mama de la muestra además como una función de la medición de CA15-3. En otra modalidad, la invención proporciona biomoléculas purificadas seleccionadas de los biomarcadores fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg. En otra modalidad, la invención proporciona un método que comprende detectar un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg mediante espectrometría de masas o inmunoensayo. En otra modalidad, la invención proporciona un método que comprende comunicar a un sujeto un diagnóstico que se refiere a un estado de cáncer de mama determinado a partir de la correlación de biomarcadores en una muestra del sujeto, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg. En una modalidad, el diagnóstico se comunica al sujeto por un medio generado por computadora . En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que interactúa con un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg en donde el método comprende: poner en contacto el biomarcador con un compuesto de prueba y determinar si el compuesto de prueba interactúa con el biomarcador. En otra modalidad, la invención proporciona un método para modular la concentración de un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg en una célula, en donde el método comprende: poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, en donde el compuesto de prueba evite el corte de fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb) o C3a-desArg?8. En otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar una condición en un sujeto, en donde el método comprende: administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, en donde el compuesto previene el corte del fragmento IT H4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) o C3a-desArg?8. En una modalidad preferida, la condición es cáncer de mama. Breve descripción de las figuras Las figuras ÍA a ÍN muestran espectros de masas de los Marcadores I a XIV respectivamente. En esas figuras, el pico espectral de masas del marcador especificado se designa dentro de los espectros ilustrados con una flecha. La designación de la figura se muestra arriba de cada uno de los espectros mencionados. La figura 2 muestra un espectro de picos de masas representativos obtenido mediante el análisis SELDI de proteínas de suero retenidas sobre un fragmento de IMAC-Ni2'J El panel superior muestra la vista del espectro; el panel inferior muestra la vista seudo-gel del mismo espectro de M/Z (velocidades dependientes de masa) entre 4,000 y 10,000. La figura 3 muestra los resultados de la transformación logarítmica en la reducción e igualación de la variación de datos. Las figuras 4A-4B muestran una gráfica de componentes UMSA tridimensional de las etapas 0-1 de cáncer de mama (cuadrados más oscuros) contra no cáncer (cuadrados blancos) . La figura 4A muestra resultados ilustrativos de la separación lograda usando una combinación derivada de UMSA de todos los 147 picos. La figura 4B muestra resultados ilustrativos de la separación lograda usando una combinación lineal derivada de UMSA usando los tres picos seleccionados. La figura 5 es una gráfica que muestra quince picos con clasificaciones medias superiores y desviaciones estándares de clasificación mínimas derivadas del Análisis ProPeak Bootstrap. La línea horizontal en 7.0 fue la desviación estándar de clasificación mínima calculada al aplicar el mismo procedimiento a un conjunto de datos generado aleatoriamente que simulaba la distribución de los datos originales . Las figuras 6A-6B son gráficas que muestran una curva de valores absolutos de las puntuaciones de significatividad relativa de picos seleccionados con base en la contribución hacia la separación entre las etapas 0-1 de cáncer de mama y los controles no cáncer. La figura 6A muestra los resultados de 15 picos seleccionados del Análisis ProPeak Bootstrap con desviación estándar de clasificación < 7.0. La figura 6B es una gráfica que muestra puntuaciones revaluadas de los cuatro picos superiores seleccionados de la figura 6A. La figura 7 es una gráfica que muestra el análisis de curva de característica operativa de receptor (ROC) de BCl, BC2 , BC3 y un índice compuesto derivado de regresión logística. Los valores p de la comparación del AUC (Área bajo la curva) entre cada biomarcador individual y el índice Compuesto se listan en la figura. Las figuras 8A-8B son gráficas de dispersión que muestran la distribución de los biomarcadores seleccionados a través de todos los grupos de diagnóstico incluyendo etapas clínicas de los pacientes de cáncer. La figura 8A es una gráfica de dispersión que muestra los resultados obtenidos con BC3 solo. La figura 8B es una gráfica de dispersión que muestra los resultados de un índice compuesto derivado de regresión logística usando BCl, BC2 y BC3. La figura 9 muestra un panel de tres gráficas de dispersión bidimensionales que ilustran distribuciones de todas las muestras de pacientes. La figura 10 muestra la distribución del marcador BC-2 (C3a-desArg?8) . La figura 11 muestra la distribución del marcador BC-3 (C3a-desArg) . La figura 12 muestra la captura de los marcadores BC-2 (C3a-desArg?8) y BC-3 (C3a-desArg) por un anticuerpo contra C3a. La figura 13 muestra la captura del marcador BC-2 (C3a-desArg?8) por un anticuerpo contra C3a. La figura 14 muestra la captura del marcador BC-3 (C3a-desArg) por un anticuerpo contra C3a. La figura 15 muestra la distribución del marcador BC-lb (fragmento ITIH4 lb) . La figura 16 muestra la identificación de varios fragmentos ITIH4 en muestras de cáncer de mama. La figura 17 muestra la curva característica operativa receptora (ROC) para marcadores BC-1 (fragmento ITIH4 1), BC-lb (fragmento ITIH4 lb) , BC-2 (C3a-desArg?8) y BC-3 (C3a-desArg) . La figura 18 muestra el esquema usado para la purificación e identificación del marcador BC-3. La figura 19 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:n) del marcador BC-3 (C3a-desArg) . Descripción detallada de la invención 1. Introducción Un biomarcador es una biomolécula orgánica que está presente diferencialmente en una muestra tomada de un sujeto de un estado fenotípico (por ejemplo, que tiene una enfermedad) en comparación con otro estado fenotípico (por ejemplo, que no tiene la enfermedad) . Un biomarcador está presente diferencialmente entre diferentes estados fenotípicos si la media o nivel de expresión mediano del biomarcador en los grupos diferentes se calcula para ser estadísticamente significativa. Las pruebas comunes para la significatividad estadística incluyen, entre otras, la prueba t, ANOVA, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney y relición de probabilidades. Los biomarcadores, solos o en combinación, proporcionan medidas de riesgo relativo de que un sujeto pertenece a un estado fenotípico u a otro. Por lo tanto, todos son útiles como marcadores para enfermedad (diagnóstico), efectividad terapéutica de un fármaco ( teranóstico ) y toxicidad de fármacos . 2. Biomarcadores para cáncer de mama 2.1 Biomarcadores Esta invención proporciona biomarcadores a base de polipéptidos que están presentes diferencialmente en sujetos que tienen cáncer de mama, en particular cáncer de mama de etapa temprana contra normales (sin cáncer de mama) . Los biomarcadores se caracterizan por una relación masa a carga determinada por espectrometría de masas, por la forma de su pico espectral en espectrometría de masas de tiempo de vuelo y por sus características de unión a superficies adsorbentes. Estas características proporcionan un método para determinar si una biomolécula detectada particular es un biomarcador de esta invención. Estas características representan características inherentes de las biomoléculas y no limitaciones de proceso en la manera en la cual las biomoléculas son discriminadas. En un aspecto, esta invención proporciona estos biomarcadores en forma aislada. Los biomarcadores fueron descubiertos usando tecnología SELDI empleando disposiciones ProteinChip de Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, CA) ("Ciphergen")- Muestras de suero fueron colectadas de sujetos diagnosticados con cáncer de mama, incluyendo carcinoma ductal in si tu (DCIS) y cáncer de mama invasor, sujetos diagnosticados como normales, así como de sujetos con enfermedad de mama benigna. Las muestras fueron fraccionadas mediante cromatografía IMAC- Ni (Captura por Afinidad de Metales Inmovilizados) . Las muestras fraccionadas se aplicaron a biofragmentos SELDI y se generaron espectros de polipéptido en las muestras mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelvo en un espectrómetro de masas Ciphergen PBSII. Los espectros obtenidos de esta manera fueron analizados por software administrador de datos Ciphergen Express™ con software Biomarker Wizard y Biomarker Pattern de Ciphergen Biosystems, Inc. Los espectros de masas para cada grupo fueron sometidos a análisis de gráfica de dispersión. Un análisis de prueba de Mann-Whitney se empleó para comparar los grupos de cáncer de mama y de control para cada racimo de proteínas en la gráfica de dispersión, y las proteínas se seleccionaron que diferían significativamente (p<0.0001) entre los dos grupos. Este método se describe en más detalle en la sección de ejemplos . En paralelo con la evaluación SELDI , los presentes inventores determinaron la identidad proteínica de tres de los marcadores. BC-1, con m/z de aproximadamente 4.3 KD, se identificó como un fragmento ("fragmento 1") de inhibidor de inter-alfa tripsina humana, cadena pesada H4 (también referido como "ITIH4", "IAIH4" o "PK-120"). Una forma alterna de BC-1, designada "BC-lb" o "fragmento ITIH4 lb" , también fue identificada. El fragmento ITIH4 lb tiene una m/z de aproximadamente 4.6 KD. Ambos fragmentos ITIH4 1 y 2 contienen un epítope reconocido por el anticuerpo para ?TIH4 que está presente en un biomarcador que está correlacionado con cáncer ovárico. BC-2, con m/z de 8.1 KD, es una forma truncada de C3a-desArg (referido como C3adesdArg-8.1 o C3a-desArg?8) . La secuencia de aminoácidos de C3a-desArg?8 es SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSC QRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHA (SEQ ID NO : 2 ) . Esta forma tiene una masa teórica de 8132 daltons, y el pl predicho es de 9.38. BC-3, m/z de 8.9 KD, se identifica como C3a-desArg. La secuencia de aminoácidos de C3a-desArg es SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMR ENPMRFSCQRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHARASHLGLA, mostrada como SEQ ID NO:l. Su masa predicha es de 8923 daltons, consistente con la masa medida de 8926 daltons y el pl predicho es 9.54, consistente con su incapacidad para unirse a resina de intercambio aniónico a un pH de 9.0. Los biomarcadores descubiertos entonces se presentan en la tabla 1. La columna "ensayo de ProteinChip" se refiere a una fracción cromatográfica en la cual se encuentra el biomarcador, el tipo de biofragmento al cual el biomarcador se une y las condiciones de lavado, al igual que para el ejemplo.

Tabla 1 Los biomarcadores de esta invención se caracterizan por su relación masa a carga determinada por espectrometría de masas . La relación masa a carga de cada biomarcador se proporciona en la tabla 1 después de la "M" . Así, por ejemplo, M4283 tiene una relación masa a carga medida de 4283. Las relaciones masa a carga se determinaron a partir de espectros de masas generados en un espectrómetro de masas Ciphergen Biosystems, Inc. PBS II. Este instrumento tiene una precisión de masas de aproximadamente +/- 0.15 por ciento. Además, el instrumento tiene una resolución de masas de aproximadamente 400 a 1000 m/dm, en donde m es masa y dm es el ancho del pico espectral de masa a una altura de pico de 0.5. La relación masa a carga de los biomarcadores se determinó usando software Biomarker Wizard™ (Ciphergen Biosystems, Inc.). Biomarker Wizard asigna una relación masa a carga a un biomarcador al agrupar las relaciones aísa a carga de los mismos picos provenientes de todos los espectros analizados, como se determina por el PBSII, tomando la relación masa a carga máxima y mínima en el grupo, y dividiéndola entre dos. En consecuencia, las masas proporcionadas reflejan estas especificaciones. Los biomarcadores de esta invención se caracterizan además por la forma de su pico espectral en espectrometría de masas de tiempo de vuelo. Los espectros de masas que muestran picos que representan los biomarcadores se presentan en la figura 1. Los biomarcadores de esta invención se caracterizan además por sus propiedades de unión sobre superficies cromatográficas. La mayoría de los biomarcadores se unen a adsorbentes de quelatos metálicos (por ejemplo, la disposición IMAC-Ni ProteinChip® de Ciphergen®) después de lavar con PBS . Una caracterización adicional de los biomarcadores puede encontrarse en la publicación internacional no. WO 03/076896, los contenidos completos de la cual se incorporan en la presente a manera de referencia. La identidad de ciertos biomarcadores de esta invención ha sido determinada y se indica en la tabla 1. El método mediante el cual esta determinación se hizo se describe en la sección de ejemplos. Para biomarcadores cuya identidad ha sido determinada, la presencia del biomarcador puede determinarse mediante otros métodos conocidos en la técnica. Debido a que los biomarcadores de esta invención se caracterizan por una relación masa a carga, propiedades de unión y forma espectral, pueden ser detectados mediante espectrometría de masas sin conocer su identidad específica. Sin embargo, si se desea, los biomarcadores cuya identidad no se determine pueden identificarse mediante, por ejemplo, determinación de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos. Por ejemplo, un biomarcador puede ser mapeado por péptidos con un número de enzimas, tales como tripsina o V8 proteasa, y los pesos moleculares de los fragmentos de digestión pueden usarse para buscar bases de datos para secuencias que coincidas con los pesos moleculares de los fragmentos de digestión generados por las diferentes enzimas. Como alternativa, los biomarcadores de proteínas pueden secuenciarse usando tecnología EMS tándem. En este método, la proteína es aislada mediante, por ejemplo, electroforesis en gel . Una banda que contenga el biomarcador se corta y la proteína se somete a digestión con proteasa. Los fragmentos de proteína individuales se separan por un primer espectrómetro de masas. El fragmento es después sometido a enfriamiento inducido por colisión, lo cual fragmenta al péptido y produce una escalera de polipéptidos. Una escalera de polipéptidos es luego analizada por el segundo espectrómetro de masas del MS tándem. La diferencia en masas de los miembros de la escalera de polipéptidos identifica los aminoácidos en la secuencia. Una proteína completa puede secuenciarse de esta manera, un fragmento de secuencia puede someterse a minado de base de datos para encontrar candidatos de identidad. La fuente biológica preferida para la detección de los biomarcadores es orina. Sin embargo, en otras modalidades, los biomarcadores pueden detectarse en suero. Los biomarcadores de esta invención son biomoléculas. En consecuencia, esta invención proporciona estas biomoléculas en forma aislada. Los biomarcadores pueden ser aislados de fluidos biológicos, tales como orina o suero. Pueden ser aislados mediante cualquier método conocido en la técnica, con base tanto en su masa como en sus características de unión. Por ejemplo, una muestra que comprenda las biomoléculas puede ser sometida a fraccionado cromatográfico, como el descrito en la presente, y sujeta a separación adicional mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de acrilamida. El conocimiento de la identidad del biomarcador permite también su aislamiento mediante cromatografía de inmunoafinidad. 2.2 Uso de formas modificadas de un biomarcador Se ha encontrado que las proteínas existen frecuentemente en una muestra en una pluralidad de formas diferentes caracterizadas por una masa detectablemente diferente. Estas formas pueden resultar ya sea de, o ambos, de una modificación antes y después de la traducción. Las formas modificadas antes de la traducción incluyen variantes alélicas, variantes de empalme y formas de edición de ARN . Las formas modificadas después de la traducción incluyen formas que resultan del corte proteolítico (por ejemplo, fragmentos de una proteína progenitora) , glicosilación, fosforilación, lipidación, oxidación, metilación, cistinilación, sulfonación y acetilación. La colección de proteínas que incluyen una proteína específica y todas las formas modificadas de ésta es referida en la presente como un "grupo de proteínas". La colección de todas las formas modificadas de una proteína específica, excluyendo la propia proteína específica, es referida en la presente como un "grupo de proteínas modificado" . Las formas modificadas de cualquier biomarcador de esta invención (incluyendo cualquiera de los marcadores fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y/o C3a-desArg) también pueden usarse, ellas mismas, como biomarcadores. En ciertos casos las formas modificadas pueden exhibir una mejor potencia discriminadora en diagnóstico que las formas especificadas mostradas en la presente. Las formas modificadas de un biomarcador incluyendo cualquiera de los marcadores fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y/o C3a-desArg pueden detectarse inicialmente mediante cualquier metodología que pueda detectar y distinguir la forma modificada del biomarcador. Un método preferido para la detección inicial incluye capturar primero el biomarcador y formas modificadas de éste, por ejemplo, con reactivos de captura bioespecíficos y luego detectar las proteínas capturadas mediante espectrometría de masas. Más específicamente, las proteínas se capturan usando reactivos de captura bioespecíficos, tales como anticuerpos, aptámeros o aficuerpos que reconozcan en el biomarcador y formas modificadas de éste. Este método también dará como resultado la captura de interactores de proteínas que se unan a las proteínas o que de otra manera sean reconocidos por anticuerpos y que, ellos mismos, ser biomarcadores. De preferencia, los reactivos de captura bioespecíficos son unidos a una fase sólida. Después, las proteínas capturadas pueden detectarse mediante espectrometría de masas SELDI o al eluir las proteínas del reactivo de captura y detectar las proteínas eluidas mediante MALDI tradicional o mediante SELDI . El uso de espectrometría de masas es esencialmente atractivo toda vez que puede distinguir y cuantificar formas modificadas de una proteína con base en la masa y sin la necesidad de marcado. De preferencia, el reactivo de captura bioespecífico se une a una fase sólida, tal como una esfera, una placa, una membrana o un fragmento. Los métodos para acoplar biomoléculas, tales como anticuerpos, a una fase sólida se conocen bien en la técnica. Pueden emplear, por ejemplo, agentes de enlace bifuncionales, o la fase sólida puede ser derivada con un grupo reactivo, tal como un epóxido o un imidizol, que se unirá a la molécula después del contacto. Los reactivos de captura bioespecíficos contra diferentes proteínas objetivo pueden ser mezclados en el mismo lugar, o pueden ser unidos a fases sólidas en diferentes ubicaciones físicas o dirigibles. Por ejemplo, se puede cargar varias columnas con esferas derivadas, cada columna siendo capaz de capturar un solo grupo de proteínas. Como alternativa, se puede empacar una sola columna con diferentes esferas derivadas con reactivos de captura contra una variedad de grupos de proteínas capturando así todos los analitos en un solo lugar. En consecuencia, las tecnologías a base de esferas derivadas por anticuerpos, tales como la tecnología xMAP de Luminex (Austin, TX) se pueden usar para detectar los grupos de proteínas. Sin embargo, los reactivos de captura bioespecíficos deben ser dirigidos hacia los miembros de un grupo para poderlos diferenciar. En otra modalidad más, las superficies de biofragmentos pueden derivarse con los reactivos de captura dirigidos contra grupos de proteínas ya sea en la misma ubicación o en ubicaciones diferentes y dirigibles. Una ventaja de capturar diferentes grupos en diferentes ubicaciones dirigibles es que el análisis se hace más simple. Después de la identificación de formas modificadas de una proteína y la correlación con el parámetro de interés clínico, la forma modificada se puede usar como un biomarcador en cualquiera de los métodos de esta invención. En este punto, la detección de la forma modificada puede lograrse mediante cualquier metodología de detección específica incluyendo captura de afinidad seguida por espectrometría de masas, o inmunoensayo tradicional dirigido específicamente a la forma modificada. El inmunoensayo requiere de reactivos de captura bioespecíficos, tales como anticuerpos, para capturar los analitos. Además, el ensayo debe diseñarse para distinguir específicamente proteínas y formas modificadas de proteínas. Esto se puede hacer, por ejemplo, al emplear un ensayo de emparedado en el cual un anticuerpo capture más de una forma y segundos anticuerpos marcados de manera distinta, se unan específicamente, y proporcionen una detección distinta de, las diferentes formas. Se pueden producir anticuerpos al inmunizar animales con las biomoléculas. Esta invención contempla inmunoensayos tradicionales que incluyen, por ejemplo, inmunoensayos de emparedado que incluyen ELISA o inmunoensayos a base de fluorescencia, así como otros inmunoensayos enzimáticos. 3. Detección de biomarcadores para cáncer de mama Los biomarcadores de esta invención pueden detectarse mediante cualquier método adecuado. Los paradigmas de detección que pueden emplearse para este fin incluyen métodos ópticos, métodos electroquímicos (técnicas de voltametría y amperometría) , microscopia de fuerza atómica y métodos de frecuencia de radio, por ejemplo, espectroscopia de resonancia multipolar. Ejemplos de métodos ópticos, además de la microscopia, tanto con focal como no con focal son detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia y de refrigencia o índice de refracción (por ejemplo, resonancia plasmónica de superficie, elipsometría, un método de espejo resonante, un método de guía de ondas acopladoras de rejilla o interferometría) . En una modalidad, una muestra se analiza por medio de un biofragmento . Los biofragmentos comprenden generalmente substratos sólidos y tienen una superficie generalmente plana, a la cual un reactivo de captura (también llamado un adsorbente o reactivo de afinidad) es unido. Frecuentemente, la superficie de un biofragmento comprende una pluralidad de ubicaciones dirigibles, cada una de las cuales tiene el reactivo de captura unido ahí . Los biofragmentos de proteínas son biofragmentos adaptados para la captura de polipéptidos. Muchos biofragmentos de proteínas se describen en la técnica. Éstos incluyen, por ejemplo, los biofragmentos de proteínas producidos por Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, CA) , Packard BioScience Company (Meriden CT) , Zyomyx (Hayward, CA) , Phylos (Lexington, MA) y Biacore (Uppsala, Suecia) . Ejemplos de estos biofragmentos de proteínas se describen en las siguientes patentes o solicitudes de patente publicadas: patente de E.U.A. No. 6,225,047; publicación internacional del PCT No. WO 99/51773; patente de E.U.A. No .6, 329 , 209 , publicación internacional del PCT No. WO 00/56934 y patente de E.U.A. No.5, 242, 828. 3.1 Detección mediante espectrometría de masas En una modalidad preferida, los biomarcadores de esta invención son detectados mediante espectrometría de masas, un método que emplea un espectrómetro de masas para detectar iones en fase de gas. Ejemplos de espectrómetros de masas son de tiempo de vuelo, sector magnético, filtro cuadripolar, trampa iónica, resonancia de ciclotrones iónicos, analizador de sectores electrostáticos e híbridos de estos. En un método que se prefiere más, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de desorción/ionización láser. En la espectrometría de masas de desorción/ionización láser, los analitos son puestos sobre la superficie de una sonda de espectrometría de masas, un dispositivo adaptado para acoplar una interfaz de la sonda del espectrómetro de masas para presentar un analito a energía ionizante para la ionización e introducción en un espectrómetro de masas. Un espectrómetro de masas de desorción láser emplea energía láser, típicamente proveniente de un láser ultravioleta, pero también de un láser infrarrojo, para desorber analitos de una superficie, para volatilizar y ionizarlos y hacerlos disponibles a los lentes iónicos del espectrómetro de masas. 3.1.1 SELDI Una técnica espectrométrica de masas quo se prefiere usar en la invención es "Desorción y Ionización Láser Mejorada en Superficie" o "SELDI", como la descrita, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 5,719,060 y No. 6,225,047, ambas a Hutchens y Yip. Esto se refiere a un método de espectrometría iónica en fase de gas de desorción/ionización (por ejemplo, espectrometría de masas) en la cual un analito (aquí, uno o más de los biomarcadores) es capturado sobre la superficie de una sonda de espectrometría de masas SELDI . Existen varias versiones de SELDI . Una versión de SELDI es llamada "espectrometría de masas por captura de afinidad" . También es llamada "Captura de Afinidad Incrementada en Superficie" o "SEAC". Esta versión incluye el uso de sondas que tienen un material sobre la superficie de la sonda que captura analitos a través de una interacción de afinidad no covalente (adsorción) entre el material y el analito. El material es llamado diferentemente un "adsorbente", un "reactivo de captura", un "reactivo de afinidad" o una "porción de unión" . Estas sondas pueden ser mencionadas como "sondas de captura de afinidad" y como teniendo una "superficie adsorbente". El reactivo de captura puede ser cualquier material capaz de unirse a un analito. El reactivo de captura puede ser unido directamente al substrato de la superficie selectiva, o el substrato puede tener una superficie reactiva que porte una porción reactiva que sea capaz de unirse al reactivo de captura, por ejemplo, a través de una reacción formando un enlace covalente o covalente coordinado. Epóxido y carbodiimidizol son emulsiones reactivas útiles para unir covalentemente reactivos de captura de polipéptidos tales como anticuerpos o receptores celulares. Ácido nitriloacético y ácido iminodiacético son porciones reactivas útiles que funcionan como agentes quelatadores para unir iones de metal que interactúen de manera no covalente con péptidos que tengan histidina. Los adsorbentes se clasifican generalmente como adsorbentes cromatográficos y adsorbentes bioespecíficos. "Adsorbente cromatográfico" se refiere a un material adsorbente usado típicamente en cromatografía. Los adsorbentes cromatográficos incluyen, por ejemplo, materiales de intercambio iónico, quelantes de metales (por ejemplo, ácido nitriloacético o ácido iminodiacético) , quelatos de metal inmovilizados, adsorbentes de interacción hidrofóbicos, adsorbentes de interacción hidrofílicos, coloróintes, biomoléculas simples (por ejemplo, nucleótidos, aminoácidos, azúcares simples y ácidos grasos) y adsorbentes de modo mixto (por ejemplo, adsorbentes de atracción hidrofóbica/repulsión electrostática) . "Adsorbente bioespecífico" se refiere a un adsorbente que comprende una biomolécula, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un aptámero) , un polipéptido, un polisacárido, un lípido, un esteroide o un conjugado de estos (por ejemplo, una glicoproteína, una lipoproteína, un glicolípico, una ácido nucleico (por ejemplo, conjugado de ADN/proteína) . En ciertos casos, el adsorbente bioespecífico puede ser una estructura macromolecular tal como un complejo de varias proteínas, una membrana biológica o un virus. Ejemplos de adsorbentes bioespecíficos son anticuerpos, proteínas receptoras y ácidos nucleicos. Los adsorbentes bioespecíficos tienen típicamente una especificidad más alta para un analito objetivo que los adsorbentes cromatográficos. Ejemplos adicionales de adsorbentes para usarse en SELDI pueden encontrarse en la patente de E.U.A. No. 6,225,047. Un "adsorbente bioselectivo" se refiere a un adsorbente que se une a un analito con una afinidad de al menos 10~8 M.

Los biofragmentos de proteínas producidos por Ciphergen Biosystems, Inc. comprenden superficies que tienen adsorbentes cromatográficos o bioespecíficos unidos a las mismas en ubicaciones dirigibles. Las disposiciones Ciphergen ProteinChip® incluyen NP20 (hidrofílico) ; H4 y H50 (hidrofóbico); SAX-2, Q-10 y LSAX-30 (intercambio de aniones); WCX-2, CM-10 y LWCX-30 (intercambio de cationes); IMAC-3, IMAC-30 y IMAC 40 (quelato metálico) y PS-10, PS-20 (superficie reactiva con carboimidizol, epóxido) y PG-20 (proteína G acoplada a través de carboimidizol) . Las disposiciones ProteinChip hidrofóbicas tienen funcionales de isopropilo o metacrilato de nonilfenoxi-poli (etilenglicol) . Las disposiciones ProteinChip de intercambio aniónico tienen funcionalidades de amonio cuaternario. Las disposiciones ProteinChip de intercambio catiónico tienen funcionalidades carboxilato. Las disposiciones ProteinChip de quelatos de metal inmovilizados tienen funcionalidades de ácido nitriloacético que adsorben iones de metales de transición, tales como cobre, níquel, zinc y galio, mediante quelación. Las disposiciones ProteinChip preactivadas tienen grupos funcionales carboimidizol o epóxido que pueden reaccionar con grupos sobre proteínas para unión covalente. Estos biofragmentos se describen además en: patente de E.U.A. No. 6,579,719 (Hutchens y Yip, "Reténtate Chromatography, " 17 de junio de 2003) ; Publicación internacional del PCT No. WO 00/66265 (Rich et al . , "Probes for a Gas Phase Ion Spectrometer, " 9 de noviembre de 2000) ; patente de E.U.A. No. 6,555,813 (Beecher et al . , "Sample Holder with Hydrophobic Coating for Gas Phase Mass Spectrometer, " 29 de abril de 2003) ; solicitud de patente de E.U.A. No. U.S. 2003 0032043 Al (Pohl y Papanu, "Látex Based Adsorbent Chip," 16 de Julio de 2002); y publicación internacional del PCT No. WO 03/040700 (Um et al . , "Hydrophobic Surface Chip," 15 de Mayo de 2003); solicitud de patente de E.U.A. No. US 2003/0218130 Al (Boschetti et al . , "Biochips With Surfaces Coated With Polysaccharide-Based Hydrogels, " 14 de abril de 2003) y solicitud de patente de E.U.A. No. 60/448,467, titulada "Photocrosslinked Hydrogel Surface Coatings" (Huang et al . , presentada el 21 de febrero de 2003) . En general, una sonda con una superficie adsorbente se pone en contacto con la muestra durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir que el biomarcador o biomarcadores que pudieran estar presentes a la muestra se unan al adsorbente. Luego de un periodo de incubación, el substrato se lava para remover material no unido. Cualquier solución de lavado adecuada puede usarse; de preferencia, se emplean soluciones acuosas. El grado al cual las moléculas permanecen unidas puede manipularse al ajustar la severidad de lavado. Las características de elusión de una solución de lavado pueden depender, por ej emplo , de pH, potencia iónica , hidrofobicidad, grado de caotropismo , potencia detergente y temperatura . A menos que la sonda tenga ambas propiedades SEAC y SEND ( como las descritas en la presente) , se aplica entonces una molécula adsorbente de energía al substrato con los biomarcadores unidos . Los biomarcadores unidos a los substratos se detectan en un espectrómetro de iones en fase de gas tal como un espectrómetro de tiempo de vuelo . Los biomarcadores son ionizados por una fuente de ioni zación tal como un láser , los iones generados son recogidos por un ensamble óptico iónico , y luego un analizador de masas dispersa y analiza los iones que pasan . El detector traduce después la información de los iones detectados en relaciones masa a carga . La detección de un biomarcador típicamente incluirá la detección de la intensidad de la señal . Así , tanto la cantidad como la masa del biomarcador pueden ser determinados . Otra versión de SELDI es Desorción Concentrada Mejorada en Superficie (SEND, por sus siglas en inglés) , la cual incluye el uso de sondas que comprenden moléculas absorbentes de energía que son unidas químicamente a la superficie de la sonda ( "sonda SEND" ) . La frase "moléculas absorbentes de energía" (EAM, por sus siglas en inglés) denota moléculas que son capaces de absorber energía de una fuente de desorción/ ionización láser y, posteriormente, contribuir a la desorción y ionización de moléculas de analito en contacto con la misma. La categoría EAM incluye moléculas usadas en MALDI, frecuentemente referidas como "matriz", y es ejemplificada por derivados de ácido cinámico, ácido cinapínico (SPA, or sus siglas en inglés) , ácido ciano-hidroxi-cinámico (CHCA, porsus siglas en inglés) y ácido dihidroxibenzoico, ácido ferúlico y derivados de hidroxiaceto- enona. En ciertas modalidades, la molécula absorbente de energía es incorporada en un polímero lineal o entrelazado, por ejemplo, un polimetacrilato. Por ejemplo, la composición puede ser un cspolímero de un ácido y acrilato a-ciano-4-metacriloiloxicinámico . En otra modalidad, la composición es un copolímero de ácido a-ciano-4 -metacriloi loxicinámico , acrilato y metracrilato 3 -( tri -etoxi ) silil propilo. En otra modalidad, la composición es un copolímero de ácido a-ciano-4 -metacr iloiloxicinámico y metacrilato de octadecilo ("C18 SEND") . SEND se describe además en la patente de E.U.A. No. 6,124,137 y publicación internacional del PCT No. WO 03/64594 (Kitagawa, "Monomers And Polymers Having Energy Absorbing Moieties Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes", 17 de agosto de 2003). SEAC/SEND es una versión de SELDI en la cual tanto un reactivo de captura como una molécula absorbente de energía son unidas a la superficie presentadora de muestra. Las sondas SEAC/SEND permiten por lo tanto la captura de analitos a través de captura de afinidad y ionización/desorción sin la necesidad de aplicar una matriz externa. El biofragmento C18 SEND es una versión de SEAC/SEND que comprende una porción C18 que funciona como un reactivo de captura, y una porción CHCA que funciona como una porción absorbente de energía. Otra versión de SELDI, llamada Unión y Liberación Fotolábil Mejorada en Superficie (SEPAR, por sus siglas en inglés) , incluye el uso de sondas que tienen porciones unidas a la superficie que pueden unirse covalentemente a un analito, y luego liberar el analito a través de la ruptura de un enlace fotolábil en la porción después de su exposición a luz, por ejemplo a luz láser (véase, patente de E.U.A. No. 5,719,060). SEPAR y otras formas de SELDI son fácilmente adaptadas para detectar un biomarcador o perfil de biomarcador conforme a la presente invención. 3.1.2 Otros métodos de espectrometría de masas En otro método de espectrometría de masas, los biomarcadores pueden ser primero capturados sobre una resina cromatográfica que tenga propiedades cromatográficas que se unan a los biomarcadores. En el presente ejemplo, esto puede incluir una variedad de métodos. Por ejemplo, se puede capturar los biomarcadores sobre una resina de intercambio catiónico, tal como una resina CM Ceramic HyperD F, lavar la resina, eluir los biomarcadores y detectar por MALDI . Como alternativa, este método podría ser precedido por fraccionar la muestra sobre una resina de intercambio aniónico antes de su aplicación a la resina de intercambio catiónico. En otra alternativa, se puede fraccionar sobre una resina de intercambio aniónico y detectar por MALDI directamente. En otro método más, se puede capturar los biomarcadores sobre una resina inmunocromatográfica que comprenda anticuerpos que se unan a los biomarcadores, lavar la resina para remover un material no unido, eluir los biomarcadores de la resina y detectar los biomarcadores eluídos mediante MALDI o mediante SELDI . 3.1.3 Análisis de los datos El análisis de analitos mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo genera un espectro de tiempo de vuelo. El espectro de tiempo de vuelo finalmente analizado típicamente no representa la señal que proviene de un solo impulso de energía ionizante contra una muestra, sino más bien la suma de señales provenientes de un número de impulsos. Esto reduce el ruido e incrementa la escala dinámica. Estos datos de tiempo de vuelo son después sujetos a procesamiento de datos. En el software ProteinChip® de Ciphergen, el procesamiento de datos típicamente incluye transformación TOF-a-M/Z para generar un espectro de masas, sustracción de línea base para eliminar desplazamientos de instrumentos y filtración de ruido de alta frecuencia para reducir el ruido de alta frecuencia. Los datos generados mediante desorción y detección de biomarcadores pueden ser analizados con el uso de una computadora digital programable. El programa de computadora analiza los datos para indicar el número de biomarcadores detectados, y opcionalmente la fuerza de la señal y la masa molecular determinada para cada biomarcador detectado. El análisis de los datos puede incluir etapas de determinar la potencia de la señal de un biomarcador y eliminar datos que se desvíen de una distribución estadística predeterminada. Por ejemplo, los picos observados pueden ser normalizados, al calcular la altura de cada pico en relación a cierta referencia. La referencia puede ser ruido de fondo generado por el instrumento y químicos tales como la molécula absorbente de energía que esté puesta en cero en la escala. La computadora puede transformar los datos resultantes en varios formatos para su presentación visual. El espectro estándar puede ser presentado visualmente, pero en un formato útil sólo a la altura del pico y la información de masa son conservadas para la visión del espectro, produciendo una imagen más limpia y haciendo posible que los biomarcadores con pesos moleculares casi idénticos se observen más fácilmente. En otro formato útil, dos o más espectros son comparados, resaltando convenientemente biomarcadores únicos y biomarcadores que sean sobre o sub-regulados entre muestras. Usando cualquiera de estos formatos, se puede determinar fácilmente si un biomarcador particular está presente en una muestra. El análisis generalmente incluye la identificación de picos en el espectro que representen señales provenientes de un analito. La selección de picos puede llevarse a cabo visualmente, pero está disponible software, como parte del paquete de software ProteinChip® de Ciphergen, que puede automatizar la detección de picos. En general, este software funciona al identificar señales que tienen una relación señal a ruido por arriba de un umbral seleccionado y se marca la masa del pico en el centroide de la señal pico. En una aplicación útil, se comparan muchos espectros para identificar picos idénticos presentes en cierto porcentaje seleccionado de los espectros de masas. Una versión de este software agrupa todos los picos que aparecen en los diferentes espectros dentro de una escala de masas definida, y asigna una masa (M/Z) a todos los picos que estén cerca del punto medio del grupo de masas (M/Z) . El software usado para analizar los datos puede incluir un código que aplique un algoritmo al análisis de la señal para determinar si la señal representa un pico en una señal que corresponda a un biomarcador de acuerdo con la presente invención. El software también puede someter los datos que se refieran a picos de biomarcadores observados a un árbol de clasificación o análisis ANN, para determinar si un pico de biomarcador o combinación de picos de biomarcadores está presente que indique el estado del parámetro clínico particular bajo examen. El análisis de los datos puede ser "regulado" a una variedad de parámetros que se obtengan ya sea directa o indirectamente, a partir del análisis espectrométrico de masas de la muestra. Estos parámetros incluyen, pero no están limitados a, la presencia o ausencia de uno o más picos, la forma de un pico o grupo de picos, la altura de uno o más picos, el logaritmo de la altura de uno o más picos y otras manipulaciones aritméticas de datos de altura de picos. 3.1.4 Protocolo general para la detección SELDI de biomarcadores para cáncer de mama Un protocolo preferido para detección de los biomarcadores de esta invención es el siguiente. La muestra biológica a ser probada, por ejemplo, suero u orina, es de preferencia sometida a prefraccionado antes del análisis SELDI . Esto simplifica la muestra y mejora la sensibilidad. Un método de prefraccionado que se prefiere incluye poner en contacto la muestra con un material cromatográfico de intercambio aniónico, tal como Q HyperD (BioSepra, SA) . Los materiales unidos son después sometidos a una elusión de pH por pasos usando reguladores a pH 9 , pH 7 , pH 5 y pH 4. (véase ejemplo 1 - lista de reguladores de pH) . (Las fracciones en las cuales los biomarcadores son eluídos también se indica en la tabla 1) . Se recogen varias fracciones que contienen el biomarcador. La muestra a ser probada (de preferencia prefraccionada) es luego puesta en contacto con una sonda de captura de afinidad que comprende un adsorbente de intercambio catiónico (de preferencia una disposición WCX ProteinChip (Ciphergen Biosystems, Inc.)) o un adsorbente IMAC (de preferencia una disposición IMAC3 ProteinChip (Ciphergen Biosystems, Inc.)), de nuevo como se indica en la tabla 1. La sonda se lava con un regulador de pH que conservará el biomarcador mientras se deslavan las moléculas no unidas . Un lavado adecuado para cada biomarcador es el regulador de pH identificado en la tabla 1. Los biomarcadores son detectados mediante espectrometría de masas de desorción/ionización láser. Como alternativa, si anticuerpos que reconozcan el biomarcador están disponibles, por ejemplo, en el caso de ITIH4 o C3a-desArg, éstos pueden ser unidos a la superficie de una sonda, tal como una disposición PS10 o PS20 ProteinChip preactivada (Ciphergen Biosystems, Inc.). Estos anticuerpos pueden capturar los biomarcadores provenientes de una muestra sobre la superficie de la sonda. Después los biomarcadores pueden ser detectados mediante, por ejemplo, espectrometría de masas de desorción/ionización láser. 3.2 Detección mediante inmunoensayo En otra modalidad, los biomarcadores de esta invención pueden medirse mediante inmunoensayo. El inmunoensayo requiere reactivos de captura bioespecíficos, tales como anticuerpos, para capturar los biomarcadores. Los anticuerpos pueden producirse mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, al inmunizar animales con los biomarcadores. Los biomarcadores pueden ser aislados de muestras con base en sus características de unión. Como alternativa, si la secuencia de aminoácidos de un biomarcador polipéptidos que conoce, el polipéptido puede ser sintetizado y usado para generar anticuerpos mediante métodos bien conocidos en la técnica . Esta invención contempla inmunoensayos tradicionales incluyendo, por ejemplo, inmunoensayos de emparedado que incluyen ELISA o inmunoensayo a base de fluorescencia, así como otros inmunoensayos de enzimas. En el inmunoensayo a base de SELDI, un reactivo de captura bioespecí f ico para el biomarcador es unido a la superficie de una sonda MS , tal como una disposición ProteinChip preactivada. El biomarcador es después capturado específicamente sobre el biofragmento a través de este reactivo, y el biomarcador capturado se detecta mediante espectrometría de masas. 4. Determinación del estado de cáncer de mama en el sujeto 4.1 Marcadores individuales Los biomarcadores de la invención pueden usarse en pruebas de diagnóstico para evaluar el estado de cáncer de mama en un sujeto, por ejemplo, para diagnosticar cáncer de mama en etapa temprana. La frase "estado de cáncer de mama" incluye cualquier manifestación distinguible de la enfermedad, incluyendo no enfermedad. Por ejemplo, el estado de enfermedad incluye, sin limitación, la presencia o ausencia de enfermedad (por ejemplo, cáncer de mama contra no cáncer de mama) , el riesgo de desarrollar la enfermedad, la etapa de la enfermedad (por ejemplo, cáncer de mama no invasor o en etapa inicial contra cáncer de mama invasor o metastásico) , el progreso de la enfermedad (por ejemplo, progreso de la enfermedad o remisión de la enfermedad con el tiempo) y la efectividad o respuesta al tratamiento de la enfermedad. Con base en este estado, procedimientos adicionales pueden ser indicados, incluyendo pruebas de diagnóstico adicionales o procedimientos o regímenes terapéuticos . La potencia de una prueba de diagnóstico para predecir correctamente el estado se mide comúnmente como la sensibilidad del ensayo, la especificidad del ensayo o el área bajo una curva característica operada por receptor ("ROC", por sus siglas en inglés). La sensibilidad es el porcentaje de verdaderos positivos que son predichos por una prueba para que sea positiva, mientras que la especificidad es el porcentaje de los verdaderos negativos que se predicen por una prueba para ser negativos . Una cuerva ROC proporciona la sensibilidad de una prueba con una función de especificidad 1. Entre mayor sea el área bajo la curva ROC, más potente será el valor predictivo de la prueba. Otras medidas útiles de la utilidad de una prueba son el valor predLctivo positivo y el valor predictivo negativo. El valor predictivo positivo es el porcentaje de positivos reales quienes dan positivo. El valor predictivo negativo es el porcentaje de negativos reales que dan negativo. Los biomarcadores de esta invención muestran una diferencia estadística en diferentes estados de cáncer de mama de al menos p =0.05, p <10"2, p <10"3, p <10"4 o p =105. Las pruebas de diagnostico que usan estos biomarcadores solos o en combinación muestran una sensibilidad y especificidad de al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% y alrededor de 100%. Cada biomarcador listado en la tabla 1 está presente diferencialmente en cáncer de mama y, por lo tanto, cada uno es individualmente útil para ayudar en la determinación del estado de cáncer de mama. El método incluye, primero, medir el biomarcador seleccionado en una muestra del sujeto usando los métodos descritos en la presente, por ejemplo, captura sobre un biomarcador SELDI seguida por la detección mediante espectrometría de masas y, segundo, comparar la medición con una cantidad de diagnóstico o límite que distinga un estado de cáncer de mama positivo de un estado de cáncer de mama negativo. La cantidad de diagnóstico representa una cantidad medida de un biomarcador sobre la cual o debajo de la cual un sujeto es clasificado como teniendo un estado de cáncer de mama particular. Por ejemplo, si el biomarcador es sobre regulado en comparación con lo normal durante el cáncer de mama, entonces una cantidad medida por arriba del límite de diagnóstico proporciona el diagnóstico de cáncer de mama. Como alternativa, si el biomarcador es subregulado durante el cáncer de mama, entonces una cantidad medida debajo del límite de diagnóstico proporcionar un diagnóstico de cáncer de mama. Como se entiende bien en la técnica, al ajustar el límite de diagnóstico particular usado en un ensayo, se puede incrementar la sensibilidad o especificidad del ensayo de diagnóstico dependiendo de la preferencia de quien diagnostique. El límite de diagnóstico particular puede determinarse, por ejemplo, al medir la cantidad del biomarcador en un número estadísticamente significativo de muestras provenientes de sujetos con los diferentes estados de cáncer de mama, como se hizo aquí, y ajustando el límite para adecuarse a los niveles deseados de especificidad y sensibilidad de quien diagnostique. 4.2 Combinaciones de marcadores Aunque biomarcadores individuales son útiles biomarcadores de diagnóstico, se ha encontrado que una combinación de biomarcadores puede proporcionar un mayor valor predictivo de un estado particular que marcadores individuales solos. Específicamente, la detección de una pluralidad de biomarcadores en una muestra puede incrementar la sensibilidad y/o especificidad de la prueba. 4.3 Determinación del riesgo de desarrollar la enfermedad En una modalidad, esta invención proporciona métodos para determinar el riesgo de desarrollar enfermedad en un sujeto. Cantidades o patrones de biomarcadores son característicos de varios estados de riesgo, por ejemplo, alto, medio o bajo. El riesgo de desarrollar una enfermedad se determina al medir el biomarcador o biomarcadores relevantes y después ya sea sometiéndolos a un algoritmo de clasificación o comparándolos con una cantidad y/o patrón de referencia de biomarcadores que estén asociados con el nivel de riesgo particular. 4.4 Determinación de la etapa de enfermedad En una modalidad, esta invención proporciona métodos para determinar la etapa de enfermedad en un sujeto.

Cada etapa de la enfermedad tiene una cantidad característica de un biomarcador o cantidades relativas de un conjunto de biomarcadores (un patrón) . La etapa de una enfermedad se determina al medir el biomarcador o biomarcadores relevantes y después sometiéndolos a un algoritmo de clasificación o comparándolos con una cantidad y/o patrón de referencia de biomarcadores que esté asociada con la etapa particular. Por ejemplo, los biomarcadores de detección fragmento ITIH4 1, fragmento ITIH4 lb, C3a-desArg?8 y/o C3a-desArg se pueden usar para distinguir entre cáncer de mama en etapa temprana (no invasor) a cáncer de mama invasor. 4.5 Determinación del curso (progresión/remisión) de la enfermedad En una modalidad, esta invención proporciona métodos para determinar el curso de enfermedad en un sujeto.

Curso de la enfermedad se refiere a cambios en el estado de la enfermedad con el tiempo, incluyendo progresión de la enfermedad (empeoramiento) y regresión de la enfermedad (mejora) . Con el tiempo, las cantidades o cantidades relativas (por ejemplo, el patrón) de biomarcadores cambia. Por ejemplo, los biomarcadores fragmento ITIH4 1, fragmento ITIH4 lb, C3a-desArg?8 y/o C3a-desArg se reducen en la enfermedad. Por lo tanto, la tendencia de estos marcadores, ya sea incrementada o reducida con el tiempo hacia enfermo o no enfermo indica el curso de la enfermedad. En consecuencia, este método incluye medir uno o más biomarcadores en un sujeto en al menos dos puntos de tiempo diferentes, por ejemplo, un primer tiempo y un segundo tiempo, y comparar el cambio en cantidades, si lo hay. El curso de la enfermedad se determina con base en estas comparaciones. En forma similar, este método es útil para determinar la respuesta al tratamiento. Si un tratamiento es efectivo, entonces los biomarcadores tenderán hacia lo normal, mientras que si el tratamiento no es efectivo, los biomarcadores tenderán hacia indicaciones de enfermedad. 4.6 Manejo de los sujetos En ciertas modalidades los métodos para calificar el estado de cáncer de mama, los métodos comprenden además manejar el tratamiento de sujetos con base en el estado. Este manejo incluye las secciones del médico o clínico después de determinar el estado de cáncer de mama. Por ejemplo, si un médico hace un diagnóstico de cáncer de mama, entonces cierto régimen de tratamiento, tal como la prescripción o administración de quimioterapia o radicación podrían seguir. Como alternativa, un diagnóstico de cáncer no de mama o enfermedad de mama benigna puede ser seguido por pruebas adicionales para determinar una enfermedad específica que pudiera estar sufriendo el paciente. También, si la prueba de diagnóstico da un resultado inconcluso sobre el estado del cáncer de mama, se pueden requerir pruebas adicionales . Modalidades adicionales de la invención se refieren a la comunicación de los resultados del ensayo o diagnósticos o ambos a técnicos, médicos o pacientes, por ejemplo. En ciertas modalidades, se usarán computadoras para comunicar los resultados de ensayos o diagnósticos o ambos a partes interesadas, por ejemplo, médicos y sus pacientes. En algunas modalidades, los ensayos serán llevados a cabo o los resultados del ensayo serán analizados en un país o jurisdicción que sea diferente al país o jurisdicción al cual se comuniquen los resultados o diagnósticos. En una modalidad preferida de la invención, un diagnóstico a base de la presencia o ausencia en un sujeto de prueba de cualquiera de los biomarcadores de la tabla 1 se comunica al sujeto lo más pronto posible después de que se obtiene el diagnóstico. El diagnóstico puede ser comunicado al sujeto por el médico que trata al mismo. Como alternativa, el diagnóstico puede ser enviado a un sujeto de prueba por correo electrónico o ser comunicado al sujeto por teléfono. Se puede usar una computadora para comunicar el diagnóstico por correo electrónico o teléfono. En ciertas modalidades, el mensaje que contiene los resultados de una prueba de diagnóstico puede ser generado y entregado automáticamente al sujeto usando una combinación de hardware y software de computadora la cual será familiar para los expertos en las telecomunicaciones. Un ejemplo de un sistema de comunicaciones orientado al cuidado de la salud se describe en la patente de E.U.A. No. 6,283,761; sin embargo, la presente invención no está limitada a métodos que utilizan este sistema de comunicaciones particular. En ciertas modalidades de los métodos de la invención, todos o algunas de las etapas de método, incluyendo el ensayo de muestras, diagnóstico de enfermedades y comunicación de los resultados de ensayo o diagnóstico pueden llevarse a cabo en diversas jurisdicciones (por ejemplo, extranjeras) . 5. Generación de algoritmos de clasificación para calificar el estado del cáncer de mama En algunas modalidades, los datos derivados de. los espectros (por ejemplo, espectros de masas o espectros de tiempo de vuelo) que se generan usando muestras tales como "muestras conocidas" pueden usarse después para "entrenar" un modelo de clasificación. Una "muestra conocida" es una muestra que ha sido preclasificada. Los datos que se derivan de los espectros y se usan para formar el modelo de clasificación pueden ser referidos como un "conjunto de datos de entrenamiento". Una vez entrenado, el modelo de clasificación puede reconocer patrones en datos derivados de espectros generados usando muestras desconocidas. El modelo de clasificación puede usarse después para clasificar las muestras desconocidas en clases. Esto puede ser útil, por ejemplo, para predecir si una muestra biológica particular está asociada o no con cierta condición biológica (por ejemplo, enfermo contra no enfermo) . El conjunto de datos de entrenamiento que se usa para formar el modelo de clasificación puede comprender datos brutos o datos pre-procesados . En algunas modalidades, los datos brutos pueden obtenerse directamente de espectros de tiempo de vuelo o espectros de masas, y pueden ser opcionalmente "pre-procesados" como se describió arriba. Se pueden formar modelos de clasificación usando cualquier método adecuado de clasificación estadística (o "aprendizaje") que intente segregar cuerpos de datos en clases con base en parámetros objetivos presentes en los datos. Los métodos de clasificación pueden ser ya sea supervisados o no supervisados. Ejemplos de procesos de clasificación supervisados y no supervisados se describen en Jain, "Statistical Pattern Recognition: A Review", IEEE Transactions no Pattern Analysis and Machina Intelligence, Vol. 22, No. 1, Enero de 2000, cuyas enseñanzas se incorporan a manera de referencia. En la clasificación supervisada, datos de entrenamiento que contienen ejemplos de categorías conocidas son presentados a un mecanismo de aprendizaje, el cual aprende uno o más conjuntos de relaciones que definen cada una de las clases conocidas. Después pueden aplicarse nuevos datos al mecanismo de aprendizaje, el cual clasifica después los nuevos datos usando las relaciones aprendidas. Ejemplos de proceso de clasificación supervisados incluyen procesos de regresión lineal (por ejemplo, regresión lineal múltiple (MLR) , regresión por últimos cuadrados parciales (PLS) , regresión de componentes principales (PCR) ) , árboles de decisión binarios (por ejemplo, procesos de división recursiva tales como CART-árboles de clasificación y regresión) , redes neurales artificiales tales como redes de retropropagación, análisis discriminatorios (por ejemplo, clasificador Bayesiano o análisis de Fischer) , clasificadores logísticos y clasificadores de vectores de soporte (máquinas de vectores de soporte) . Un método de clasificación supervisada que se prefiere es un proceso de división recursiva. El proceso de división recursiva usa árboles de división recursivos para clasificar espectros derivados de muestras desconocidas. Detalles adicionales a cerca de los procesos de división recursiva se proporcionan en la solicitud de patente de E.U.A. No. 2002 0138208 Al a Paulse et al . , "Method for analyzing mass spectra" . En otras modalidades, los modelos de clasificación que se crean pueden formarse usando métodos de aprendizaje no supervisados. La clasificación no supervisada intenta aprender clasificaciones con base en similitudes en el conjunto de datos de entrenamiento, sin preclasificar los espectros de los cuales se derivaron el conjunto de datos de entrenamiento. Los métodos de aprendizaje no supervisados incluyen análisis de grupo. Un análisis de grupo intenta dividir los datos en "racimos" o grupos que idealmente deben tener miembros que sean muy similares entre sí, y muy disimilares a miembros de otros racimos. Similarmente, se mide después usando cierta métrica de distancia, la cual mide la distancia entre artículos de datos y racimos de artículos de datos juntos que están más cerca unos de otros. Las técnicas de formación de racimo incluyen el algoritmo K-means de MacQueen y el algoritmo de Mapa de Auto-Organización de Kohonen . Los algoritmos de aprendizaje evaluados para usarse en la clasificación de información biológica se describen, por ejemplo, en la publicación internacional de PCT No. WO 01/31580 (Barnhill et al . , "Methods and devices for identifying patterns in biological systems and methods oí: use thereof), solicitud de patente de E.U.A. No. 2002 0193950 Al (Gavin et al . , "Method or analyzing mass spectra"), solicitud de patente de E.U.A. No. 2003 0004402 Al (Mitt et al . , "Process for discriminating between biological states based on hidden patterns from biological data"), y solicitud de patente de E.U.A. No. 2003 0055615 Al (Zhang and Zhang, "Systems and methods for processing biological expression data") . Los modelos de clasificación pueden formarse y usarse en cualquier computadora digital adecuada. Las computadoras digitales adecuadas incluyen micro, mini o grandes computadoras usando cualquier sistema operativo estándar o especializado, tal como un sistema operativo a base de Unix, Windows™ o Linux™. La computadora digital que se usa puede estar físicamente separada del espectrómetro de masas que se use para crear los espectros de interés, o puede estar acoplada al espectrómetro de masas. El conjunto de datos de entrenamiento y los modelos de clasificación de acuerdo con modalidades de la invención pueden incorporarse mediante código de computadora que sea ejecutado o usado por una computadora digital. El código de computadora puede ser almacenado por cualquier medio legible por computadora adecuado incluyendo discos magnéticos u ópticos, USBs, cintas, etc., y pueden ser escritos en cualquier lenguaje de programación de computadoras incluyendo C, C++, visual basic, etc. Los algoritmos de aprendizaje descritos arriba son útiles tanto para desarrollar algoritmos de clasificación para los biomarcadores ya descubiertos, o para encontrar nuevos marcadores para cáncer de mama. Los algoritmos de clasificación, a su vez, forman la base para pruebas de diagnóstico al proporcionar valores de diagnóstico (por ejemplo, puntos de límite) para biomarcadores usados individualmente o en combinación. 6. Kits para la detección de biomarcadores para cáncer de mama En otro aspecto, la presente invención proporciona kits para calificar el estado de cáncer de mama, kits que se usan para detectar los biomarcadores de acuerdo con la invención. En una modalidad, el kit comprende un soporte sólido, tal como un fragmento o chip, una placa de microtitulación o una esfera o resina que tiene un reactivo de captura unido a la misma, en donde el reactivo de captura se une a un biomarcador de la invención. Así, por ejemplo, los kits de la presente invención pueden comprender sondas para espectrometría de masas SELDI, tales como disposiciones ProteinChip®. En el caso de reactivos de captura bioespecíficos, el kit puede comprender un soporte sólido con una superficie reactiva, y un recipiente que comprende el reactivo de captura bioespecífico . El kit también puede comprender una solución de lavado o instrucciones para hacer una solución de lavado, en las cuales la combinación del reactivo de captura y la solución de lavado permita la captura del biomarcador o biomarcadores sobre el soporte sólido para su detección subsecuente mediante, por ejemplo, espectrometría de masas. El kit puede incluir más de un tipo de adsorbente, cada uno presente sobre un diferente soporte sólido. En una modalidad más, este kit puede comprender instrucciones para parámetros operativos adecuados en forma de una etiqueta o inserto separado. Por ejemplo, las instrucciones pueden informar a un consumidor de cómo recoger la muestra, cómo lavar la sonda o los biomarcadores particulares a ser detectados. En otra modalidad más, el kit puede comprender uno o más recipientes con muestras de biomarcador, que se usarán como estándares para calibración. 7. Uso de biomarcadores para cáncer de mama en ensayos de tamizado y métodos para tratar cáncer de mama Los métodos de la presente invención tienen otras aplicaciones también. Por ejemplo, los biomarcadores pueden usarse para tamizar compuestos que modulen la expresión de los biomarcadores in vi tro o in vivo, compuestos que a su vez pueden ser útiles para tratar o prevenir cáncer de mama en pacientes. En otro ejemplo, los biomarcadores pueden usarse para monitorear la respuesta a tratamientos de cáncer de mama. En otro ejemplo, los biomarcadores pueden usarse en estudios de herencia para determinar si el sujeto está en riesgo de desarrollar cáncer de mama. Así, por ejemplo, los kits de esta invención pueden incluir un substrato sólido que tenga una función hidrofóbica, tal como un biofragmento de proteína (por ejemplo, una disposición Ciphergen H50 ProteinChip, por ejemplo, disposición ProteinChip) y un regulador de pH de acetato de sodio para lavar el substrato, así como instrucciones que proporcionen un protocolo para medir los biomarcadores de esta invención sobre el fragmento y para usar estas mediciones para diagnosticar cáncer de mama. Los compuestos adecuados para pruebas terapéuticas pueden ser tamizados inicialmente al identificar compuestos que interactúen con uno o más biomarcadores listados en la tabla 1. A manera de ejemplo, el tamizado puede incluir expresar de manera recombinante un biomarcador listado on la tabla 1, purificar el biomarcador y fijar el biomarcador a un substrato. Los compuestos de prueba serían entonces puestos en contacto con el substrato, típicamente en condiciones acuosas, y se miden las interacciones entre el compuesto de prueba y el biomarcador, por ejemplo, al medir velocidades de elusión como una función de la concentración de sal . Ciertas proteínas pueden reconocer y cortar uno o más biomarcadores de la tabla 1, en cuyo caso las proteínas pueden ser detectadas al monitorear la digestión de uno o más biomarcadores en un ensayo estándar, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de las proteínas. En una modalidad relacionada, la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la actividad de uno o más de los biomarcadores de la tabla 1 puede ser medida. Alguien de capacidad en la técnica reconocerá que las técnicas usadas para medir la actividad de un biomarcador particular variarán dependiendo de la función y propiedades del biomarcador. Por ejemplo, una actividad enzimática de un biomarcador puede ensayarse siempre y cuando esté disponible un substrato adecuado y siempre que la concentración del substrato o la apariencia del producto de reacción sea fácilmente medible. La capacidad de los compuestos de prueba potencialmente terapéuticos para inhibir o incrementar la actividad de un biomarcador dado puede determinarse al medir las velocidades de catálisis en presencia o ausencia de los compuestos de prueba. La capacidad de un compuesto de prueba para interferir con una función o actividad no enzimática (por ejemplo, estructural) de uno de los biomarcadores de la tabla 1 también puede ser medida. Por ejemplo, el autoensamble de un complejo de varias proteínas que incluye uno de los biomarcadores de la tabla 1 puede ser monitoreado mediante espectroscopia en presencia o ausencia de un compuesto de prueba. Como alternativa, si el biomarcador es un potenciador de transcripción no enzimático, compuestos de prueba que interfieran con la capacidad del biomarcador para incrementar la transcripción pueden identificarse al medir los niveles de transcripción dependiente de biomarcador in vivo o in vi tro en presencia y ausencia del compuesto de prueba .

Los compuestos de prueba capaces de modular la actividad de cualquiera de los biomarcadores de la tabla 1 pueden administrarse a pacientes quienes estén sufriendo o estén en riesgo de desarrollar cáncer de mama u otro cáncer. Por ejemplo, la administración de un compuesto de prueba que incrementa la actividad de un biomarcador particular puede reducir el riesgo de cáncer de mama en un paciente si la actividad del biomarcador particular in vivo evita la acumulación de proteínas para cáncer de mama. De manera inversa, la administración de un compuesto de prueba que reduzca la actividad de un biomarcador particular puede reducir el riesgo de cáncer de mama en un paciente si la actividad incrementada del biomarcador es responsable, al menos en parte, del inicio de cáncer de mama. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar compuestos útiles para el tratamiento de trastornos tales como cáncer de mama que están asociados con niveles incrementados de formas modificadas de fragmento ITIH4 1, fragmento ITIH4 lb, C3a-desArg?8 y/o C3a-desArg. Por ejemplo, en una modalidad, extractos de células o bibliotecas de expresión pueden tamizarse para compuestos que catalicen el corte de ITIH4 o C3a-desArg de longitud completa para formar formas truncadas. En una modalidad de este ensayo de tamizado, el corte de los biomarcadores puede detectarse al unir un fluoróforo al biomarcador, el cual permanezca extinto o apagado cuando los biomarcadores no sean cortados, pero el cual emita fluorescencia cuando la proteína sea cortada. Como alternativa, una versión de biomarcador de longitud completa modificada para hacer el enlace de amida entre ciertos aminoácidos no cortable se puede usar para unir o "atrapar" selectivamente la proteasa celular que corta biomarcador de longitud completa en el sitio in vivo . Los métodos para tamizar e identificar proteasas y sus objetivos están bien documentados en la literatura científica, por ejemplo, en Lopez-Ottin et al . , (Nature Reviews, 3:50.9-519 (2002) ) . En otra modalidad más, la invención proporciona un método para tratar o reducir la progresión o probabilidad de una enfermedad, por ejemplo, cáncer de mama, la cual está asociada con los niveles incrementados de ITIH4 o C3a-desArg truncados. Por ejemplo, después de una o más proteínas han sido identificadas que cortan la longitud completa de los biomarcadores, bibliotecas combinatorias pueden tamizarse para compuestos que inhiban la actividad de corte de las proteínas identificadas. Los métodos para tamizar bibliotecas químicas para estos compuestos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Lopez-Ottin et al . (2002). Como alternativa, los compuestos inhibidores pueden diseñarse de manera inteligente con base en la estructura de ITIH4 o C3a-desArg.

A nivel clínico, el tamizado de un compuesto de prueba incluye obtener muestras de sujetos de prueba antes y después de que los sujetos hayan sido expuestos a un compuesto de prueba. Los niveles en las muestras de uno o más de los biomarcadores listados en la tabla 1 pueden medirse y analizarse para determinar si los niveles de los biomarcadores cambian luego de su exposición a un compuesto de prueba. Las muestras pueden analizarse mediante espectrometría de masas, como se describió en la presente, o las muestras pueden analizarse mediante cualquier medio adecuado conocido por alguien de capacidad en la técnica. Por ejemplo, los niveles de uno o más de los biomarcadores listados en la tabla 1 pueden medirse directamente mediante Western blot usando anticuerpos marcados con radio o fluorescentemente los cuales se unen específicamente a los biomarcadores. Como alternativa, cambios en los niveles de ARNm que codifica para el uno o más biomarcadores pueden medirse y correlacionarse con la administración de un compuesto de prueba dado a un sujeto. En una modalidad más, los cambios en el nivel de expresión de uno o más de los biomarcadores pueden medirse usando métodos y materiales in vi tro . Por ejemplo, células cultivadas de tejido humano que expresen, o sean capaces de expresar, uno o más de los biomarcadores de la tabla 1 pueden ser puestas en contacto con compuestos de prueba. Sujetos quienes hayan sido tratados con los compuestos de prueba serán examinados rutinariamente para cualquier efecto fisiológico que pudiera resultar del tratamiento. En particular, los compuestos de prueba serán evaluados para su capacidad en reducir la probabilidad de enfermedad en un sujeto. Como alternativa, si los compuestos de prueba se administran a sujetos quienes hayan sido previamente diagnosticados con cáncer de mama, compuestos de prueba serán tamizados para su capacidad para hacer más lenta o detener la progresión de la enfermedad. 8. Ejemplos En los siguientes ejemplos, se usaron los siguientes materiales y métodos. Muestras Las muestras de suero retrospectivas se obtuvieron de bancos de suero de Johns Hopkins Clinical Chemistry, de acuerdo con el protocolo aprobado por el Johns Hopkins Joint Committee on Clinical Investigation. Un total de 169 especimenes fueron incluidos en este estudio. El grupo de cáncer consistía en 103 muestras de suero de pacientes con cáncer de mama en diferentes etapas clínicas: Etapa 0 (n=4), Etapa I (n=38), Etapa II (n=37) y Etapa III (n=24) . Los diagnósticos se confirmaron patológicamente y se obtuvieron especimenes antes del tratamiento. La información de la edad no estuvo disponible en seis de estos pacientes. La edad promedio de los 96 pacientes restantes fue 56 años, variando de 34 a 87 años. El grupo de control sin cáncer incluyó suero de 25 mujeres con enfermedades de mama benignas (BN) y 41 saludables (HC) . La información de edad exacta no estuvo disponible de 21 mujeres saludables. La edad promedio de las 20 mujeres saludables restantes fue 45 años, variando de 39 a 57 años. La edad promedio del grupo de condición benigna fue de 48 años con una escala entre 21 y 78 años. Todas las muestras se almacenaron a -80°C hasta usarse. Análisis ProteinChip A 20 µl de cada muestra de suero, 30 µl de urea 8 M, 1% de CHAPS en PBS, pH 7.4 fue añadido. La mezcla se vortexeó a 4°C durante 15 minutos y se diluyó 1:40 en PBS.

Los fragmentos de captura de afinidad de metal inmovilizados (IMAC3) fueron activados con 50 mM de NiS0 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ciphergen Biosystems, [nc . , CA) . Cincuenta microlitros de muestras diluidas fueron aplicados a cada punto sobre la disposición ProteinChip usando un bioprocesador de 96 pocilios (Ciphergen Biosystems, Inc . , CA) . Después de la unión a temperatura ambiente durante 60 minutos en un agitador de plataforma, la disposición se lavó dos veces con 100 µl de PBS durante 5 minutos seguida por dos enjuagues rápidos con 100 µl de dH20.

Después de secar al aire, 0.5 µl de ácido cinapínico saturado (SPA) preparado en 50% de acetonitrilo, 0.5% de ácido trifluoroacético se aplicó dos veces a cada punto. Las proteínas se unieron al metal y las proteínas unidas al metal quelado (a través de histidina, triptófano, cisteína o aminoácidos fosforilados) fueron detectadas en un lector de masas PBS-II. Los datos fueron recabados al promediar 80 puntos láser con una intensidad de 240 y una sensibilidad detectora de 8. La capacidad de reproducción se calculó usando dos muestras de suero representativas, una de los controles saludables y una de los pacientes con cáncer. Cada muestra de suero se punteó en todas las superficies de cebo 8 de un chip IMAC-Ni en cada uno de los dos bioprocesadores . La coeficiencia de variación se calculó para los picos de masas seleccionados. Bioinf ormática y bioestadistica Los picos de masa calificados (S/N > 5, ventana de masa de racimo a 0.3%) con M/Z entre 2K y 150K se seleccionaron y las intensidades pico se normalizaron a la corriente iónica total usando software ProteinChip 3.0 (Ciphergen Biosystems, Inc., CA) . Las etapas de procesamiento adicionales incluyeron la transformación logarítmica aplicada a los datos de intensidad pico para poder obtener un nivel más consistente de variación de datos a través de la escala completa del espectro de interés (M/Z 2kD - 150 kD) . El paquete de software ProPeak (3Z Informatics, SC) se usó para calcular y clasificar la contribución de cada pico individual hacia la separación óptima de dos grupos de diagnóstico. Implementos ProPeak la versión lineal del algoritmo Unified Máximum Separability Analysis (UMSA) se reportó primero para su uso en análisis de datos de microdisposición. Z . Zhang et al . , Applying Classification Separability Analysis to Microarray Data, in Proc. Of Critical Assessment of Techniques for Microarray Data Analysis (CAMDA'OO), Kluwer Academic Publishers, 2001. La característica clave del algoritmo UMSA es la incorporación de la información de distribución de datos en un algoritmo de aprendizaje de minimización de riesgos estructurales (Vapnik VN, Statistical Learning Theory, John Wiley & sons, Inc., Nueva York, 199814) para identificar una dirección a lo largo de la cual las dos clases de datos se separan mejor. La dirección es representada como una combinación lineal (suma ponderada) de las variables originales. El peso asignado a cada variable en esta combinación mide la contribución de la variable hacia la separación de las dos clases de datos. ProPeak ofrece tres módulos analíticos a base de UMSA. El primero es un módulo de análisis de componente, el cual proyecta cada espécimen como un punto individual sobre un espacio de componentes tridimensionales. Los componentes (ejes) son combinaciones lineales de las intensidades de pico de espectro originales. Los ejes corresponden a direcciones a lo largo de las cuales dos grupos preespecificados de datos logran capacidad de separación máxima. La separación entre los dos grupos de datos puede inspeccionarse en una presentación visual en 3D interactiva. El segundo módulo es la selección por pasos, el cual usa un proceso de selección por pasos hacia atrás para aplicar UMSA y calcular una puntuación de significatividad para picos individuales y clasificarlos de acuerdo con su contribución colectiva hacia la separación máxima de los dos grupos de datos preespecificados . Una puntuación positiva o negativa indica un nivel de expresión elevado o reducido relativamente del pico de masa correspondiente para el grupo enfermo mientras que el valor absoluto de la puntuación representa su importancia relativa hacia la separación de datos. Para evitar seleccionar picos con base en artefactos no relacionados únicamente en los datos, el tercer módulo de ProPeak, Bootstrap utiliza un procedimiento Bootstrap para repetir UMSA para varias corridas cada vez aleatoriamente dejando fuera un porcentaje fijo de las muestras de ambos grupos. La media y las clasificaciones medias así como la desviación estándar correspondiente se calculan para cada pico. Un biomarcador potencial debe ser un pico de media superior y clasificaciones medias y una desviación estándar de clasificación mínima. Como una forma de establecer un criterio de selección objetivo, se aplicó también el mismo procedimiento Bootstrap a un conjunto de datos aleatorios que pico por pico simulan la distribución de los datos reales. Los resultados de los datos reales se comparan contra aquellos de los datos simulados para establecer un valor límite estadísticamente adecuado en la desviación de estándar de clasificación para seleccionar picos con rendimiento consistente. Ejemplo 1 Identificación de biomarcadores que detectan cáncer de mama en las etapas tempranas Para identificar biomarcadores potenciales que pueden detectar cáncer de mama en etapas tempranas, perfiles de proteínas de especimenes de las muestras y las etapas 0-1 de pacientes con cáncer de mama se compararon contra aquellos de los controles sin cáncer. El análisis se llevó a cabo en varias iteraciones usando los tres módulos en ProPeak. A través de este proceso iterativo el espectro completo original se redujo a un pequeño subconjunto de picos de masas que habían demostrado consistentemente un alto nivel de significatividad en la separación óptima entre los dos grupos de diagnóstico seleccionados. Una vez que un pequeño panel de biomarcadores fue seleccionado, su capacidad para detectar cáncer de mama se probó independientemente usando datos de las etapas y de los pacientes con cáncer de las etapas II y III. Con base en el conjunto de datos completo, un índice compuesto se derivó usando la regresión logística multivariada . Las estadísticas descriptivas que incluyen valores p de dos pruebas t de dos muestras fueron estimadas. El análisis de curva de característica operativa receptora (ROC) se llevó a cabo después en los biomarcadores seleccionados y el índice compuesto. Los criterios de rendimiento tales como sensibilidades y especificidades del índice compuesto se calcularon usando un procedimiento especial. Efron B y Tibshirani R. Bootstrap Methods for Standard Errors, Confidence Intervals, and Other Measures of Statistical Accuracy, Statistical Science, 1986; 1:54-75. En este procedimiento, el conjunto de datos total se dividió a través de un muestreo adicional aleatorio en un conjunto de entrenamiento para derivar un índice compuesto a través de la regresión logística y un conjunto de prueba para calcular sensibilidades y especificidades. Este proceso de muestreo adicional se repitió muchas veces. Los resultados de varias corridas finalmente se agregaron para formar el cálculo de las sensibilidades y especificidades. Ejemplo 2 Detección de picos y preprocesamiento de datos Proteínas de suero retenidas sobre dos fragmentos IMAC-Ni2+ fueron analizadas en un lector de masas PBS-II. Un total de 147 picos de masa calificados (S/N > 5, ventana de masa de grupo a 0.3%) con M/Z de más de 2 KD fueron seleccionados. Picos de M/Z de menos de 2KD se excluyen para eliminar la interferencia de la matriz. La precisión de medición de 0.1% se logró mediante calibración externa usando All In 1 Protein Standard (Ciphergen Biosystems, Inc., CA) . Un espectro representativo obtenido de este análisis se muestra en la figura 2. La transformación logarítmica se aplicó a los valores de intensidad pico. Las gráficas de la figura 3 ilustran el efecto de la reducción en variación e igualación a través de transformación logarítmica. Ejemplo 3 Selección de biomarcadores con base en cáncer en etapa temprana y controles sin cáncer Para identificar biomarcadores con potencial para detección temprana de cáncer de mama, se llevó a cabo UMSA usando cáncer en etapa temprana como el grupo positivo (etapa 0-1, n=42) y los controles sin cáncer (HC+BN, n=66) como el grupo negativo. Se probó primero la capacidad de separación entre los dos grupos usando combinación lineal derivada de UMSA de todos los 147 picos de masa. El cáncer en etapa temprana fue separable del grupo no cáncer cuando los perfiles de proteína completos se compararon. La figura 4A gráfica el cáncer en etapa temprana (más ligero) contra sin cáncer (más oscuro) en el espacio 3D del componente UMSA. Para seleccionar biomarcadores que lleven a cabo consistentemente bien, UMSA se aplicaron repetidamente para un total de 100 corridas cada una con 30% de velocidad de salida usando el módulo Bootstrap de ProPeak. También se aplicó el mismo procedimiento a un conjunto de datos aleatorios simulado. La desviación estándar mínima derivada de los datos simulados fue 7. En los datos experimentales, 15 picos tuvieron desviación estándar de menos de este valor. Este subconjunto de picos de masa se seleccionó como biomarcadores candidatos para análisis adicional. Sus clasificaciones medias y las desviaciones estándar correspondientes se grafican en la figura 4. Para clasificar más los picos en este conjunto reducido de biomarcadores candidatos, el módulo de selección por pasos de ProPeak fue aplicado. El valor absoluto de las puntuaciones de significado relativas de los 15 picos (véase tabla 5) se gráfica en orden descendente en la figura 8?, la cual muestra la mayoría de la capacidad de separación entre los dos grupos de datos fue contribuida por los primeros seis picos. Entre estos seis picos, cuatro son únicos. Los otros dos fueron identificados como formas doblemente cargadas de los dos de los picos únicos usando software ProteinChip 3.0. El reconocimiento tanto de las formas doblemente cargadas como individualmente cargadas de los picos sugiere su importancia para discriminar los dos grupos de diagnóstico seleccionados. Sacando las formas doblemente cargadas, los cuatro picos únicos fueron combinados y evaluados usando selección por pasos nuevamente. Las puntuaciones de significado relativas recalculadas se grafican en la figura 6B. Los tres picos con puntuación superior, designados BCl, BC2 y BC3, fueron finalmente seleccionados como los biomarcadores potenciales para la detección de cáncer de mama. BCl pareció subregulado (puntuación negativa) mientras que BC2 y BC3 parecieron sobre regulados (puntuación positiva) . Una gráfica 3D de cáncer de mama de las etapas 0-I contra los controles sin cáncer usando estos tres biomarcadores se muestra en la figura 4B. Ejemplo 4 Evaluación de los biomarcadores seleccionados Las estadísticas descriptivas de estos tres biomarcadores se listan en la tabla 2. La figura 7 muestra los resultados del análisis ROC. Entre los tres biomarcadores, BC3 demostró la potencia de diagnóstico más individual. Sus distribuciones sobre los grupos de diagnóstico incluyendo etapas clínicas de pacientes con cáncer se grafican en la figura 8A. Las sensibilidades y especificidades de usar BC3 solo a un valor límite de 0.8 para diferenciar los grupos de diagnóstico se listan en la tabla 3A. La CV calculada de la intensidad pico transformada logarítmica fue de 6% para BCl, 7% para BC2 y 13% para BC3 (datos no mostrados) . Entre los tres biomarcadores BC3 tuvo el CV más grande de 13%. En comparación, el valor promedio de BC3 en los pacientes con cáncer fue de casi 90% arriba que en los controles sin cáncer (calculado con base en datos de la tabla 2) . Tabla 2 Esta tabla muestra las estadísticas descriptivas de BCl, BC2 , BC3 y el índice compuesto de derivado de regresión logística. Las diferencias entre controles sin cáncer y etapas 0-1 y entre controles sin cáncer y etapas II-III, tienen ambas (p <0.000001) estadísticamente significativas para los tres biomarcadores y el índice del compuesto.

Ejemplo 5 Uso combinado de tres biomarcadores seleccionados La figura 9 compara la distribución de pacientes de cáncer en todas las etapas clínicas contra controles sin cáncer en todas las combinaciones de biomarcadores por pares .

Con base en esta observación, se usó regresión logística multivariada para combinar los tres biomarcadores seleccionados para formar un índice compuesto de un solo valor. El estado descriptivo de este índice compuesto está adjunto en la tabla 2. Sus distribuciones sobre los diferentes grupos de diagnóstico se grafican en la figura 8B. El análisis de curva ROC del índice compuesto dio un AUC más mejorado en comparación con aquellos de biomarcadores individuales (figura 7). Se usó la crosvalidación Bootstrap para estimular el rendimiento de diagnóstico del índice compuesto (20 corridas; en cada corrida, 70% de muestra se seleccionaron aleatoriamente para derivación del índice compuesto y el 30% restante para pruebas) . Las sensibilidades y especificidades calculadas se listan en la tabla 3B. Los niveles de los tres biomarcadores potenciales también se evaluaron en relación a pT (tamaño del tumo) y categorías pN (metástasis de nodulos linfáticos) . No se observó alguna correlación significativa.

Tabla 3 Rendimiento de diagnóstico de BC3 Tabla 3B Esta tabla muestra el rendimiento de diagnóstico calculado de la regresión logística derivada de un índice compuesto usando BCl, BC2 y BC3 (20 corridas, velocidad de salida = 30%) .

Ejemplo 6 Detección de carcinoma de mama in situ mediante análisis proteómico en suero usando disposiciones ProteinChip® y espectrometría SELDI de masas Se analizaron los perfiles de proteínas de 169 muestras de suero de mujeres con y sin cáncer de mama, y se identificó un panel de tres proteínas (8.9 KD, 8.1 KD, 4.3 KD) que en uso combinado pueden detectar cáncer de mama con alta sensibilidad (Etapa O-III, 93%) y especificidad (Control Saludable + Benigno, 91%) . Entre los tres marcadores, la proteína de 8.9KD tuvo el mejor desempeño. Una sensibilidad de 85% y una especificidad de 91% fueron logradas. El carcinoma in si tu lobular y ductal (DCIS y LCIS) son las formas más tempranas (etapa 0) de cáncer de mama no invasivo. Casi 100% de las mujeres diagnosticadas en esta etapa temprana de cáncer de mama pueden ser curadas . Para validar estos marcadores para una detección temprana de cáncer de mama, el rendimiento de los tres biomarcadores previamente identificados se evaluó usando sueros tomados por una institución colaboradora. La cohorte de muestra consistía en 17 mujeres con DCIS, 1 con LCIS, 8 con enfermedades de mama benignas, y 40 controles aparentemente saludables que coincidían en una edad de 40 años (45-65 años) . Los perfiles de proteínas se generaron por triplicad usando IMAC-Ni (Captura de afinidad de metales inmovilizados) disposiciones ProteinChip bajo las mismas condiciones experimentales que las descritas arriba. Las intensidades relativas logarítmicas de cada uno de los tres proteínas se compararon entre diferentes grupos de diagnóstico usando una prueba t de doble muestra. Los patrones de expresión de dos (8.9 KD y 8.1 KD) de los tres marcadores fueron consistentes con los resultados anteriores. Los valores p y las áreas bajo la curvas ROC de estos dos biomarcadores se resumen en la tabla 4.

Tabla 4 Resumen de análisis estadistico DCIS, Carcinoma Ductal in si tu; LCIS, Carcinoma Lobular in si tu ; HC, Control Saludable; BN, Benigno. Las siguientes referencias específicas también se incorporan a manera de referencia en la presente. 1. Jemal A, Thomas A, Murray T, Thun M. Cáncer statistics, 2002. CA Cáncer J Clin. 2002;52:23-47. 2. National Cáncer Institute. Cáncer Net PDQ Cáncer Information Summaries . Monographs on "Screening for breast cáncer." http: //cáncer net.nci.nih.gov/pdq.html (Actualizada en Enero de 2001) . 3. Ant an K, Shea S. Screening mammography under age 50. JAMA. 1999;281:1470-2. 4. Chan DW, Beveridge RA, Muss H, Fritsche HA, Hortobagyi G, Theriault R, et al. Use of Truquant BR Radioimmunoassay for early detection of breast cáncer recurrence in patients with stage H and stage III disease, J Clin. Oncology. 1997;15:2322-2328. 5. Karas M, Hillenkamp F. Láser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988;60:2299-2301. 6. Hutchens TW, Yip TT. New desorption strategies for the mass spectrometric analysis of micrómolecules . Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993;7:576-80. 7. Merchant M, Weinberger SR. Recent advancements in surface-enhanced láser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry. Electrophoresis . 2000;21:1164-67. 8. Wright Jr GL, Cazares LH, Leung S-M, Nasim S, Adam B-L, Yip T-T, et al. ProteinChip® surface enhanced láser desorption/ionization (SELDI) mass spectrometry: a novel protein biochip technology for detection of prostate cáncer biomarkers in complex protein mixtures. Prostate Cáncer Prostate Dis. 1999;2:264-76. 9. Hlavaty JJ, Partin AW, Kusinitz F, Shue MJ, Stieg M, Bennett K, Briggman JV. Mass spectroscopy as a discovery tool for identifying serum markers for prostate cáncer. Clin. Chem. [Resumen]. 2001;47:1924-26. 10. Paweletz CP, Trock B, Pennanen M, Tsangaris T, Magnant C, Liotta LA, et al. Proteomic patterns of nipple aspírate fluids obtained by SELDI-TOF: potential for new biomarkers to aid in the diagnosis of breast cáncer. Dis Markers. 2001;17:301-7. 11. Vlahou A, Schellhammer PF, Medrinos S, Patel K, Kondylis Fl, Gong L, et al. Development of a novel proteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of the bladder in uriñe. Am J Pathol. 2001;158:1491-502. 12. Patricoin EF III, Ardekani AM, Hitt BA, Levine Pi, Fusaro VA, Steinberg SM, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cáncer. The Lancet. 2002;359:572-577. 13. Zhang Z, Page G, Zhang H. Applying Classification Separability Analysis to Microarray Data, in Proc. of Critical Assessment of Techniques for Microarray Data Analysis (CAMDA'OO), Kiuwer Academic Publishers, 2001. 14. Vapnik VN, Statistical Learning Theory, John Wiley & Sons, Inc., ?ew York, 1998. 15. Efron B y Tibshirani R. Bootstrap Methods for Standard Errors, Confidence Intervals, and Other Measures of Statistical Accuracy. Statistical Science. 1986;1:54-75. Ejemplo 7 Identificación de biomarcadores BC-1, BC-2 y BC-3 Materiales y métodos Nuestras de pacientes Muestras de suero archivadas de 176 mujeres- se seleccionaron y analizaron retrospectivamente. Estos sueros se tomaron de 2000 a 2002 por el Instituto Nacional del Cáncer de Italia y se almacenaron a -30°C hasta usarse.

Todas las mujeres proporcionaron un consentimiento informado antes de la toma de suero para este estudio aprobado por la IRB (Mesa de Regulación Interna) . El grupo de cáncer incluyó 32 casos de DCIS (36-80 años, media = 56 años) y 61 casos de cáncer de mama invasor (47 casos de invasor ductal, 9 casos de invasor lobular y 5 casos con características ductales y lobulares mixtas) (24-84 años, media = 56 años) . Los diagnósticos fueron confirmados patológicamente, y se obtuvieron especimenes antes del tratamiento. La información clínica adicional para pacientes de cáncer incluye el estado ER/PR, grado de Elston, tamaño del tumor y estado de nodulos linfáticos (casos invasores únicamente) . Los controles incluyeron 37 mujeres con varias enfermedades de mama benignas incluyendo 13 casos de atípicas (18-77 años, media =44 años) y 46 mujeres aparentemente saludables con una edad de 46 años (44-68 años, media 52 años) . Perfilado de proteínas SELDI Los perfiles de proteína se generaron usando disposiciones de fragmentos IMAC-Ni (Captura de afinidad de metales inmovilizados) bajo las mismas condiciones de unión y lavado que las descritas arriba. Brevemente, se añadieron 45 mL de urea 9M, 2% de CHAPS, 50 mM de Tris-HCl, pH 9 a 30 mL de cada muestra de suero. La mezcla se vortexeó a 4°C durante 15 minutos y se diluyó 1:40 en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) pH 7.4. Las disposiciones de chips IMAC3 fueron activadas con 50 mM de NiS0 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ciphergen Biosystems, Inc., CA) . Se aplicaron muestras diluidas de 50 mL a cada punto sobre la disposición ProteinChip usando un bioprocesador de 96 pocilios (Ciphergen Biosystems, Inc., CA) . Después de la unión a temperatura ambiente durante 60 minutos en un agitador de plataforma, la disposición se lavó dos veces con 100 ml de PBS durante 5 minutos seguida por dos enjuagues rápidos con 100 ml de dH20. Después de secar al aire, 0.5 ml de ácido cinapínico saturado (SPA) preparado en 50% de acetonitrilo, 0.5% de ácido trifluoroacético se aplicó dos veces a cada punto. Todas las etapas se automatizaron usando una estación de trabajo Biomek 2000. La asignación de especimenes sobre las disposiciones de chip fueron aleatorizadas. Cada espécimen se procesó y analizó repetidamente en tres experimentos diferentes e independientes. Las proteínas unidas a las superficies del chip fueron detectadas con un PBS-II ProteinChip Reader (Ciphergen Biosystems, Inc., CA) . Los datos se recabaron al promediar 80 disparos láser con una intensidad de 240 y una sensibilidad detectora de 8. Bioinformática y bioestadística El proceso de análisis de datos usado en este estudio implicó las siguientes etapas, (a) Detección de picos. Software ProteinChip 3.0 (Ciphergen Biosystems, Inc . , CA) se usó para tomar y evaluar los nuevos espectros en bruto. Cada conjunto de los 196 especimenes incluyendo 176 sueros de estudio, 20 sueros de control de calidad (suero humano agrupado obtenido de Serologicals Corp., GA) se compilaron, se restaron de la línea de base, y se calibraron externamente usando All In 1 Protein Standard (Ciphergen Biosystems, Inc., CA) . Los picos de masas cualificados (examen visual) con relaciones masa a carga (m/z) entre 2K y 150K fueron seleccionados manualmente. Las intensidades pico se normalizaron al contenido iónico total de m/z entre 2.0 kD y 150 kD con el mismo coeficiente externo y los datos se exportaron a una hoja de cálculo Excel. (b) Evaluación de la reproducibilidad La reproducibilidad de los replicados se calculó al conmutar la correlación de cada par de replicas y calcular el CV de los tres picos reportados como se calcula para sueros de sangre en bancos . Si no se ha observado alguna polarización, las intensidades de pico identificadas en el análisis de triplicado se promedian y luego se transforma en log. (c) Evaluación de marcador. Se llevaron a cabo una prueba t de dos muestras y análisis de curva de característica operativa de receptor (ROC) (en software doméstico implementado en MATLAB, versión 6.0) para la evaluación de los biomarcadores seleccionados. Identificación de proteínas La purificación de proteínas se llevó a cabo de acuerdo con las propiedades bioquímicas individuales usando una serie de procedimientos de separación de proteínas incluyendo intercambio aniónico, exclusión de tamaño y cromatografía en fase inversa, seguida por separación mediante SDS-PAGE. Para monitorear el proceso de purificación, muestras de control saludable se procesaron en paralelo con las muestras de cáncer. Durante cada una de las iteraciones, las fracciones nuevas fueron perfiladas sobre disposiciones ProteinChip para monitorear la presencia o ausencia de los biomarcadores de interés. La banda de gel que contenía la proteína dirigida fue identificada por el análisis de microcircuito de la proteína eluída, y se digirió con ASP-N. La huella digital del péptido se adquirió en un lector PBSII ProteinChip. Las masas de los fragmentos proteolíticos se usaron para la búsqueda en base de datos con el algoritmo ProFound. Para confirmación, las disposiciones NP20 que contenían los fragmentos proteolíticos fueron analizadas mediante disociación inducida por colisión usando un PE Sciex QStar (Concord, Canadá) equipado con una intrefaz ProteinChip Array (Ciphergen) . La identificación de las proteínas se llevó a cabo usando el programa UCSF ProteinProspectro MS-Tag. CA15-3 El valor de CA 15-3 se determinó usando IRMA-mat CA 15-3 (Byk-Sangtec Diagnostica Dietzenbach - Alemania) . Evaluación de BC-1, BC-2 y BC-3 por SELDI Un total de 71 racimos de picos se seleccionó manualmente en la región de masas de 2 KD a 150 KD. La reproducibilidad de tres experimentos SELDI independientes se calculó usando análisis de correlación. El coeficiente de correlación (r) observado entre las replicas es de 0.885 (rpl vs 2), 0.893 (rep 1 vs 3 ) y 0.8635 (rep 2 vs 3). Ya que ninguna polarización sistemática entre pares de replicados fuera identificada, las intensidades pico promedio en cada valor M/Z se usaron para análisis adicional. Las CVs calculadas de las intensidades pico transformadas por logaritmo BC-1 (4.3KD), BC-2 (8.1KD) y BC-3 (8.9 KD) fueron 0.172, 0.117 y 0.156 respectivamente. Para propósito de comparación, la distribución de BCl, BC2 y BC3 en ambos datos fue desplegada. Consistente con nuestros resultados previos, los niveles BC2 y BC3 se elevaron en cáncer, incluyendo DCIS (figura 10 y 11) . Sin embargo, BC-1, el cual se encontró bajo en cáncer previamente, fue elevado en grupos de cáncer de los datos actuales. El rendimiento de BC-1 es inestable. Ejemplo 8 Identificación de proteínas En paralelo con la evaluación SELDI, se ha determinado la identidad de proteínas de los tres marcadores . BC-1, con m/z de 4.3 KD, se identificó como un fragmento de inhibidor de inter-alfa tripsina humana, cadena pesada H4 (también referida en la presente como "IT1H4", "IAIH4" o "PK-120") . BC-2, con m/z de 8.1 KD, es una forma truncada de C3a-desArg (también referida en la presente como C3a-desArg-8.1 o C3a-desArg?8. La secuencia de aminoácidos de C3a- desArg?8 es SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSCQRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYIT ELRRQHA (SEQ ID NO : 2 ) . Esta forma tiene una masa teórica de 8132 daltons, y el pl predicho es de 9.38. BC-3, m/z de 8.9 KD, se identifica como C3a-desArg.

El procedimiento y resultado de la identificación de proteína se muestra en las figuras 18-19. La secuencia de aminoácidos de C3a-desArg es SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSCQRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYIT ELRRQHARASHLGLA, ilustrada como SEQ ID NO : 1. Su masa predicha es de 8923 daltons, consistente con la masa medida de 8926 daltons y la pl predicha es 9.54, consistente con su incapacidad para unirse a resina de intercambio aniónico a un pH de 9.0. La identidad de BC-2 y BC-3 se verificó más mediante inmunocaptura usando un anticuerpo monoclonal contra C3a (figura 12). En forma similar, BC-1 fue un anticuerpo capturado contra ITIH4. Validación independiente de BC-2 y BC-3 usando inmunoensayo en fragmento Un pequeño subgrupo de las muestras de suero (10 casos de normal, 9 casos de benigno, 10 casos de DCIS y 10 casos de invasivo) se seleccionaron aleatoriamente para un experimento de tracción IP usando anticuerpo contra C3a. La distribución del C3a-desArg y C3a-desArg-8.1 en grupos de cáncer y sin cáncer es consistente con el resultado de SELDI (figuras 13 y 14) . Un fragmento ITIH4 de 4.6 KD (fragmento ITIH4 lb; BC-lb) es consistentemente subregulado en cáncer en ambos cohortes . ITIH4 es fuertemente procesado, y varios fragmentos de IHIH4 se observaron en suero. Para investigar si la inconsistencia en la distribución de bel se debe a inestabilidad, también se evaluó la distribución del ITIH4 de longitud completa, y varios productos de procesamiento. Un fragmento de 4.6 KD se encuentra consistentemente subregulado en cáncer en ambas cohortes, como se muestra en la gráfica de dispersión de la figura 15.

La confirmación de la identidad de proteínas se muestra en la figura 16. Rendimiento de diagnóstico de los biomarcadores evaluados y CA15-3 Aunque se recomiendan sólo para monitorear terapia de cáncer de mama avanzado o recurrencia, CA15-3 y CA27.29 son las dos pruebas para marcadores tumorales en suero usadas principalmente aprobadas por la Administración de Fármacos y Alimentos para cáncer de mama {Chan DW, 2001 #46}. Para investigar si CA15-3 tiene alguna potencia discriminatoria en esta cohorte de estudio, se ha medido el nivel de CA15-3 en suero usando IRMA-mat CA 15-3 (Byk-Sangtec Diagnostic Dietzenbach - Alemania) . De 176 sueros de estudios probados, solo 5 (todos de pacientes con cáncer invasivo) dieron positivo usando 30 unidades/mL de corte. No se observó diferencia significativa alguna entre controles saludables, benignos, DCIS y grupos de cáncer invasivo (datos no mostrados) . CA15-3 no es efectivo en la detección de cáncer de mama. El rendimiento de diagnóstico de los tres biomarcadores evaluados en términos del análisis ROC se presenta en la figura 17. El área bajo la curva para BC-2, BC3, 4.6 en los datos de validación es 0.65, 0.70 y 0.68, respectivamente . Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son por propósitos ilustrativos únicamente y que varias modificaciones o cambios en vista de los mismos serán sugeridas para las personas capacitadas en la técnica y deben incluirse dentro del espíritu y previsión de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas aquí se incorporan en la presente a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos. Los desarrollos tecnológicos en la medición de expresión de proteínas de alta emisión han hecho posible comparar patrones de expresión proteómicos de especimenes clínicos en una gran escala. Sin embargo, el tamizado para nuevos marcadores de diagnóstico que están verdaderamente asociados con un proceso de enfermedad particular en presencia de una gran variabilidad biológica, así como las desviaciones en datos debido a variables pre-analíticcis y analíticas permanece siendo una tarea retadora. En un estudio anterior, se analizaron perfiles de proteínas de 169 muestras de suero de pacientes con o sin cáncer de mama usando disposiciones SELDI y ProteinChip. Proteína/péptido que tenía una contribución significativa hace la separación óptima del cohorte de cáncer y no cáncer se seleccionó usando ProPeak, y en un paquete de software doméstico desarrollado para el análisis de una disposición de ADN y datos de disposición de proteínas {Zhang, 2001 #176}. Para evitar la selección de marcadores falsos cuya alta potencia discriminadora sea simplemente por probabi Lidad debido a artefactos en los datos que no estén relacionados con el proceso de enfermedad, se toman varias etapas en estos datos de análisis. Primero, el módulo Bootstrap de ProPeak introdujo alteraciones aleatorias en varias corridas y usó la clasificación de picos promediada para dar un cálculo más confiable de la potencia discriminadora de los picos {Efron, 1986 #178) . Segundo, para establecer un valor de límite de unión superior en una desviación estándar de clasificación de un pico para su rendimiento no debe considerarse como simplemente por probabilidad, se aplicó el mismo procedimiento a un conjunto de datos generado aleatoriamente que simula la distribución de los datos reales. El valor mínimo de desviaciones estándares de clasificación de estos "picos simulados" indica el nivel de consistencia que un pico puede lograr mediante probabilidad aleatoria. Este valor mínimo se usó como límite para reducir los 147 picos originales a un subconjunto de 15 picos de clasificación superior cuyo rendimiento debe ser menos probable debido a artefactos aleatorios dentro de los datos. Los 3 discriminadores más significativos BCl, BC2 y BC3 se seleccionaron además dentro de este conjunto de picos reducido usando selección por pasos hacia atrás. Aunque se han tomado varias etapas para minimizar la selección de marcadores falsos debido a variables analíticas, la validez de los 3 marcadores es limitada toda vez que el estudio no obtuvo un conjunto de prueba independiente completo. La potencia discriminadora de los marcadores seleccionados puede aún ser asociada con cierta desviación pre-analítica tales como diferencias en el procedimiento de toma o condiciones de almacenamiento de diferentes grupos de diagnóstico. Para resolver este aspecto, y para evaluar estos marcadores para la detección de la forma más temprana de cáncer de mama, se probaron estos marcadores usando sueros DCIS tomados independientemente por una institución colaboradora. Aungue no se pueden descartar la posibilidad de que las mismas desviaciones pre-analíticas estén presentes en ambos datos, sin embargo la probabilidad debe ser mucho más baja. En resumen, se han evaluado el rendimiento de tres biomarcadores de suero para la detección temprana de cáncer de mama usando sueros tomados por una fuente independiente. Aunque varios paneles de biomarcadores han sido reportados para varias enfermedades usando disposiciones SELDI ProteinChip {Adam, 2002 # 171; Adam, 2003 #22; Clarke, 2003 #116; Koopmann, 2004 #78; Li , 2002 #137; Paweletz, 2001 #36; Petricoin, 2002 #170; Rosty, 2002 #143; Vlahou, 2003 #48; Vlahou, 2001 #174; Vlahou, 2003 #90} {Li, 2004 #346}, esto es por el momento el primer estudio de validación reportado usando un conjunto de prueba independiente. Mientras que los marcadores tumorales en suero actuales aprobados para cáncer de mama tales como CA15-3 permanecen inefectivos en la detección temprana de cáncer de mama, este pane]. de biomarcadores tiene un potencial para discriminar el cáncer de mama en etapa temprana (DCIS) contra los controles saludables . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para cuantificar estado de cáncer de mama en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) medir al menos un biomarcador en una muestra biológica del sujeto, en donde el por lo menos un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en los biomarcadores de la tabla 1 y (b) correlacionar la medición con estado de cáncer de mama .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el por lo menos un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en: fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende medir cada uno de: fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?d y C3a-desArg.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende además medir CA15-3.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el por lo menos un biomarcador se mide al capturar el biomarcador sobre una superficie adsorbente de una sonda SELDI y detectar los biomarcadores capturados mediante espectroscopia de masas mediante desorción-ionización láser.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el por lo menos un biomarcador se mide mediante inmunoensayo .

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el por lo menos un biomarcador se detecta usando un anticuerpo específico para el por lo menos un biomarcador.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el por lo menos un biomarcador se detecta usando un método que no es espectroscopia de masas.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque la muestra es suero.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque la correlación se lleva a cabo mediante un algoritmo de clasificación de software.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el estado de cáncer de mama se selecciona de cáncer de mama y no de cáncer de mama.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el estado de cáncer de mama se selecciona de cáncer de mama no invasor y cáncer de mama invasor .

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque comprende además: (c) manejar el tratamiento del sujeto con base en el estado .

14. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el adsorbente es un adsorbente IMAC-Ni.

15. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el adsorbente es un adsorbente bioespecífico .

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el adsorbente bioespecífico comprende un anticuerpo.

17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque, si la medición se correlaciona con cáncer de mama, entonces el manejo del tratamiento del sujeto comprende administrar un agente quimioterapéutico o radiación al sujeto.

18. El método de conformidad con la reivindiceición 11, caracterizado porque comprende además: (d) medir el por lo menos un biomarcador después del manejo del sujeto y correlacionar la medición con la progresión de la enfermedad.

19. Un método que comprende medir al menos un biomarcador en una muestra de un sujeto, caracterizado porque el por lo menos un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en los biomarcadores de la tabla 1.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el por lo menos un biomarcador se selecciona del grupo que consiste en: fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende medir cada uno de los siguientes biomarcadores: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porgue comprende además medir CA15-3.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19, 20 ó 21, caracterizado porque el por lo menos un biomarcador se mide al capturar el biomarcador sobre una superficie adsorbente de una sonda SELDI y detectar los biomarcadores capturados mediante espectroscopia de masas mediante desorción-ionización láser.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19, 20 ó 21, caracterizado porque la muestra es suero.

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el por el adsorbente es un adsorbente IMAC-Ni .

26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el adsorbente es un adsorbente bioespecífico .

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el adsorbente bioespecífico comprende un anticuerpo.

28. Un kit caracterizado porque comprende: (a) un soporte sólido que comprende al menos un reactivo de captura unido al mismo, en donde el reactivo de captura se une a por lo menos un biomarcador de un primer grupo que consiste en los biomarcadores de la tabla 1 e (b) instrucciones para usar el soporte sólido para detectar un biomarcador de la tabla 1.

29. El kit de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende instrucciones para usar el soporte sólido para detectar un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg.

30. El kit de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende instrucciones para usar el soporte sólido para detectar cada uno de los biomarcadores: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a- desArg?8 y C3a-desArg.

31. El kit de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque comprende instrucciones para usar el soporte sólido para detectar CA15-3.

32. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, caracterizado porque el soporte sólido que comprende un reactivo de captura es una sonda SELDI .

33. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, caracterizado porque el reactivo de captura es un anticuerpo.

34. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, caracterizado porque comprende además: (c) un recipiente que contiene al menos uno de los biomarcadores de la tabla 1.

35. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, caracterizado porque comprende además: (c) un sorbente de cromatografía IMAC-Ni.

36. Un kit caracterizado porque comprende: (a) un soporte sólido que comprende al menos un reactivo de captura unido al mismo, en donde el reactivo de captura se une a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en los biomarcadores de la tabla 1 y (b) un recipiente que contiene al menos uno de los biomarcadores .

37. El kit de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el recipiente contiene al menos un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg.

38. El kit de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el recipiente contiene cada uno de los biomarcadores: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg.

39. El kit de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el recipiente contiene además CA15-3.

40. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36, 37 ó 38, caracterizado porque el soporte sólido que comprende un reactivo de captura es una sonda SELDI.

41. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36, 37 ó 38, caracterizado porque comprende además: (c) un sorbente de cromatografía IMAC-Ni.

42. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36, 37 ó 38, caracterizado porque el reactivo de captura es un adsorbente IMAC-Ni .

43. Un producto de software caracterizado porque comprende : a. un código que tiene acceso a datos atribuidos a una muestra, los datos comprenden la medición de al menos un biomarcador en la muestra, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste en los biomarcadores de la tabla 1 y b. un código que ejecuta un algoritmo de clasificación que clasifica el estado de cáncer de mama de la muestra como una función de la medición.

44. El producto de software de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el algoritmo de clasificación clasifica el estado de cáncer de mama de la muestra como una función de la medición de un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en: fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?8 y C3a-desArg.

45. El producto de software de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porgue el algoritmo de clasificación clasifica el estado de cáncer de mama de la muestra como una función de la medición de cada uno de los biomarcadores: fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg.

46. El producto de software de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porgue el algoritmo de clasificación clasifica el estado de cáncer de mama de la muestra como una función de la medición de CA15-3.

47. Una biomolécula purificada caracterizada porque se selecciona de los biomarcadores de la tabla 1.

48. Un método caracterizado porque comprende detectar un biomarcador de la tabla 1 mediante espectroscopia o inmunoensayo de masa .

49. Un método caracterizado porque comprende comunicar a un sujeto un diagnóstico que se refiere a estado de cáncer de mama determinado a partir de la correlación de biomarcadores en una muestra del sujeto, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?d y C3a-desArg.

50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porgue el diagnóstico se comunica al sujeto por un medio generado por computadora.

51. Un método para identificar un compuesto que interactúa con un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg, caracterizado porque comprende : a) poner en contacto el biomarcador con al menos un compuesto de prueba y b) determinar si el compuesto de prueba interactúa con el biomarcador.

52. Un método para modular la concentración de un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 y C3a-desArg en una célula, caracterizado porque comprende: a) poner en contacto la célula con un compuesto de prueba, en donde el compuesto de prueba evita el corte de fragmento ITIH4 1 (BC-1), fragmento ITIH4 lb (BC-lb), C3a-desArg?d o C3a-desArg.

53. Un método para tratar una condición en un sujeto, caracterizado porque comprende: administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, en donde el compuesto evita el corte de fragmento ITIH4 1 (BC-1) , fragmento ITIH4 lb (BC-lb) , C3a-desArg?8 o C3a-desArg.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la condición es cáncer de mama.