DE69328098T2

DE69328098T2 - Lösliche derivate des complement type-rezeptors (cr1)

Info

Publication number: DE69328098T2
Application number: DE69328098T
Authority: DE
Inventors: Ian Dodd; Mary Freeman; Eva Mossakowska; Anthony Smith
Original assignee: Adprotech PLC
Current assignee: Adprotech PLC
Priority date: 1992-06-24
Filing date: 1993-06-16
Publication date: 2000-08-24
Anticipated expiration: 2013-06-17
Also published as: EP0649468B1; US5859223A; JPH07508516A; WO1994000571A1; EP0649468A1; DE69328098D1; HK1014552A1; US5833989A; JP3939747B2

Description

LÖSLICHE CR1-DERIVATE

Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide und deren Verwendung bei der Diagnose und Therapie von Erkrankungen in Verbindung mit Komplementaktivität und verschiedenen Entzündungs- und Immunerkrankungen.
Das etwa 10% der Globulirie in normalem Serum darstellende Komplementsystem besteht aus vielen verschiedenen Proteinen, die für die Reaktion des Immunsystems auf Fremd-Antigene wichtig sind. Das Komplementsystem wird aktiviert, wenn seine Primärkomponenten gespalten werden und die Produkte alleine oder mit anderen Proteinen zusätzliche Komplementproteine aktivieren, wodurch es zu einer proteolytischen Kaskade kommt. Eine Aktivierung des Komplementsystems führt zu einer Vielzahl von Reaktionen, wie erhöhte Gefäßdurchlässigkeit, Chemotaxis von Phagozyten, Aktivierung von Entzündungszellen, Opsonisierung von Fremdpartikeln, direkte Abtötung von Zellen und Gewebeschädigung. Eine Aktivierung des Komplementsystems kann von Antigen-Antikörper-Komplexen (der klassische Weg) oder zum Beispiel von Lipopolysacchariden ausgelöst werden, die in den Zellwänden von pathogenen Bakterien anwesend sind (der alternative Weg).
Komplementrezeptor Typ 1 (CR1) ist erwiesenermaßen auf den Membranen von Erythrozyten, Monozyten/Makrophagen, Granulozyten, B-Zellen, einigen T-Zellen, dendritischen Milzfollikelzellen und glomerulären Podozyten vorhanden. CR1 bindet sich an die Komplementkomponenten C3b und C4b und wird auch als C3b/C4b-Rezeptor bezeichnet. Die strukturelle Organisation und Primärsequenz eines Allotypus von CR1 ist bekannt (Klickstein et al., 1987, J. Exp. Med. 165: 1095-1112, Klickstein et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 1699-1717; Hourcade et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 1255-1270, WO 89/09220, WO 91/05047). Er besteht aus 30 kurzen Konsensus-Wiederholungen (SCR), die jeweils etwa 60-70 Aminosäuren enthalten. In jeder SCR werden etwa 29 der durchschnittlichen 65 Aminosäuren konserviert. Es wurde vorgeschlagen, daß jede SCR eine dreidimensionale Dreifachschleifenstruktur durch Disulfid- Kopplungen mit den dritten und ersten und den vierten und zweiten Halb-Cystinen in Disulfidbindungen bildet. CR1 ist ferner als 4 lange homologe Wiederholungen (LHR) von jeweils 7 SCR angeordnet. Einer Leader-Sequenz folgend, besteht das CR1- Molekül aus der N-terminalen LHR-A, den nächsten beiden Wiederholungen LHR-B und LHR-C und der C-terminalsten LHR-D, gefolgt von 2 zusätzlichen SCR, einer mutmaßlichen 25-Rest- Transmembranregion und einem 43-Rest-Zytoplasmaschwanz.
Wenn das reife CR1-Molekül einen vorhergesagten N- terminalen Glutaminrest hat, der nachfolgend als Rest 1 bezeichnet wird, dann werden die ersten vier SCR-Domänen von LHR-A hierin so definiert, daß sie jeweils aus den Resten 2-58, 63-120, 125-191 und 197-252 von reifem CR1 bestehen.
Hourcade et al., 1988, J. Exp. Med. 168: 1255-1270 beobachteten einen alternativen Polyadenylierungsort in der humanen CR1-Transkriptionseinheit, der laut Vorhersagen eine sekretierte Form von CR1 produzierte. Die von dieser abgestutzten Sequenz kodierte mRNA umfaßt die ersten 8,5 SCR von CR1 und kodiert ein Protein von etwa 80 kDa, von dem man annahm, daß es die C4b-Bindungsdomäne enthält. Als eine cDNA, die dieser abgestutzten Sequenz entsprach, in COS-Zellen transfiziert und ausgeprägt wurde, demonstrierte sie die erwartete C4b-Bindungsaktivität, band sich aber nicht an C3b (Krych et al., 1989, FASEB J. 3:A368; Krych et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 1991, 88, 4353-7). Krych et al. beobachteten außerdem eine der vorhergesagten ähnliche mRNA in verschiedenen menschlichen Zellinien und gingen davon aus, daß eine solche abgestutzte lösliche Form von CR1 mit C4b-Bindungsaktivität in Menschen synthetisiert werden könne.
Darüber hinaus haben Makrides et al. (1992, J. Biol. Chem. 267 (34) 24754-61) SCR 1 + 2 und 1 + 2 + 3 + 4 von LHR-A als membranangeheftete Proteine in CHO-Zellen ausgeprägt.
Verschiedene lösliche Fragmente von CR1 wurden auch über rekombinante DNA-Prozeduren erzeugt, indem die Transmembranregion von den ausgeprägten DNAs beseitigt wurde (WO 89/09220, WO 91/05047). Die löslichen CR1-Fragmente waren funktionell aktiv, banden C3b und/oder C4b und demonstrierten je nach den Regionen, die sie enthielten, Faktor 1 Cofaktor- Aktivität. Solche Konstrukte inhibierten in vitro komplementbezogene Funktionen wie oxidativen Neutrophilen- Burst, komplementbewirkte Hämolyse sowie C3a- und C5a- Produktion. Ein besonders lösliches Konstrukt, sCR1/pBSCR1c, demonstrierte ebenfalls in vivo Aktivität in einer reversen passiven Arthus-Reaktion (WO 89/09220, WO 91/05047); Yeh et al., 1991, J. Immunol. 146: 250) unterdrückten postischämische Myokardinflammation und Nekrose (WO 89/09220, WO 91/05047); Weisman et ah, Science, 1990, 249: 146-1511, Dupe, R. et al., Thrombosis & Haemostasis (1991) 65(6) 695) und verlängerten die Überlebensraten nach einer Transplantation (Pruitt & Bollinger, 1991, J. Surg. Res 50: 350; Pruitt et al., 1991 Transplantation 52; 868). Ferner führte eine Co-Formulierung von sCR1/pBSCR1c mit p-anisoyliertem [*1] menschlichem Plasminogen- Streptokinase-Aktivatorkomplex (APSAC) zu einer ähnlichen antihämolytischen Aktivität wie beim sCR1 alleine, woraus zu schließen war, daß die Kombination des Komplementinhibitors sCR1 mit einem thrombolytischen Mittel realisierbar war (WO 91/05047).
Es wurde jetzt gefunden, daß lösliche Polypeptide, die einem Teil von CR1 entsprechen, funktionelle komplementhemmende sowie antihämolytische Aktivität besitzen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein lösliches Polypeptid bereitgestellt, umfassend der Reihe nach ein bis vier kurze Konsensus-Wiederholungen (SCR), ausgewählt aus SCR 1, 2, 3 und 4 einer langen homologen Wiederholung A (LHR-A), als die einzigen strukturell und funktionell intakten SCR- Domänen von CR1, und wenigstens SCR3 beinhaltend, wobei SCR 1, 2, 3 und 4 jeweils aus den Resten 2-58, 63-120, 125-191 und 197-252 von reifem CR1 besteht.
In bevorzugten Aspekten umfaßt das oben definierte Polypeptid der Reihe nach SCR 1, 2 und 3 von LHR-A oder SCR 1, 2 und 3 von LHR-A als die einzigen strukturell und funktionell intakten SCR-Domänen von CR1.
Es ist zu verstehen, daß Variationen in der Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids durch Addition, Deletion oder konservative Substitution von Resten, wie Allelvariationen, bei denen die biologische Aktivität des Polypeptids erhalten bleibt, in der Erfindung eingeschlossen sind. Konservative Substitution ist als Retention der Ladungs- und Größenmerkmale der Aminosäureseitenkette zu verstehen, zum Beispiel Arginin ersetzt durch Histidin.
Gemäß einem Aspekt kann das erfindungsgemäße Polypeptid symbolisch wie folgt repräsentiert werden:
NH&sub2;-V¹-SCR1-W¹-SCR2-X¹-SCR3-Y¹-OH (I)
wobei SCR1 die Reste 2-58 von reifem CR1 repräsentiert, SCR2 die Reste 63-120 von reifem CR1 repräsentiert, SCR3 die Reste 125-191 von reifem CR1 repräsentiert und V¹, W¹, X¹ und Y¹ Bindungen oder kurze Verknüpfungssequenzen von Aminosäuren repräsentieren, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 5 Resten und vorzugsweise von nativen Zwischendomänen-Sequenzen in CR1 abstammend.
In einer bevorzugten Ausgestaltung von Formel (I) repräsentieren W¹, X¹ und Y¹ jeweils die Reste 59-62, 121-124 und 192-196 von reifem CR1, und V¹ repräsentiert Rest 1 von reifem CR1, bei Bedarf über seinen N-Terminus mit Methionin verknüpft.
Gemäß einem anderen Aspekt kann das erfindungsgemäße Polypeptid symbolisch wie folgt repräsentiert werden:
NH&sub2;-V²-SCR1-W²-SCR2-X²-SCR3-Y²-SCR4-Z²-OH (II)
wobei SCR1, SCR2 und SCR3 der vorherigen Definition entsprechen, SCR4 die Reste 197-252 von reifem CR1 repräsentiert und V², W², X², Y² und Z² Bindungen oder kurze Verknüpfungssequenzen von Aminosäuren repräsentieren, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 5 Resten und vorzugsweise von nativen Zwischendomänen-Sequenzen in CR1 abstammend.
In bevorzugten Ausgestaltungen von Formel (II) repräsentieren W², X², Y² und Z² jeweils die Reste 59-62, 121- 124, 192-196 und Rest 253 von reifem CR1, und V² repräsentiert Rest 1 von reifem CR1, bei Bedarf über seinen N-Terminus mit Methionin verknüpft.
In einer bestimmten Ausgestaltung von Formel (II) ist Arginin 235 durch Histidin ersetzt.
In der bevorzugten Ausgestaltung von Formel (II) ist Rest 235 Arginin.
Gemäß einem weiteren Aspekt kann das erfindungsgemäße Polypeptid symbolisch wie folgt repräsentiert werden:
NH&sub2;-X³-SCR3-Y³-OH (III)
wobei SCR3 der vorherigen Definition entspricht und X³ und Y³ Bindungen oder kurze Verknüpfungssequenzen von Aminosäuren repräsentieren, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 5 Resten und vorzugsweise von nativen Zwischendomänen-Sequenzen in CR1 abstammend.
In einer bevorzugten Ausgestaltung von Formel (III) repräsentiert X³ die Aminosäuren 122-124 von reifem CR1, bei Bedarf mit Methionin an seinem N-Terminus verknüpft, und Y&sup4; repräsentiert die Aminosäuren 192-196 von reifem CR1.
Gemäß einem anderen weiteren Aspekt kann das erfindungsgemäße Polypeptid symbolisch wie folgt repräsentiert werden:
NH&sub2;-X&sup4;-SCR3-Y&sup4;-SCR4-Z&sup4;-OH (IV)
wobei SCR3 und SCR4 der vorherigen Definition entsprechen und X&sup4;, Y&sup4; und Z&sup4; Bindungen oder kurze Verknüpfungssequenzen von Aminosäuren repräsentieren, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 5 Resten und vorzugsweise von nativen Zwischendomänen- Sequenzen in CR1 abstammend.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung von Formel (IV) präsentiert X&sup4; die Aminosäuren 122-124 von reifem CR1, bei Bedarf mit Methionin an seinem N-Terminus verknüpft, und Y&sup4; und Z&sup4; repräsentieren jeweils die Aminosäuren 192-196 und 253 von reifem CR1.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für die Präparation eines erfindungsgemäßen CR1- Polypeptids bereit, wobei das Verfahren das Ausprägen von DNA, die das genannte Polypeptid kodiert, in einer rekombinanten Wirtszelle und das Wiedergewinnen des Produktes umfaßt.
Insbesondere kann das Verfahren die folgenden Schritte umfassen:
i) Präparieren eines replizierbaren Expressionsvektors, der in einer Wirtszelle ein DNA-Polymer ausprägen kann, umfassend eine Nucleotidsequenz, die das genannte Polypeptid kodiert;
ii) Transformieren einer Wirtszelle mit dem genannten Vektor;
iii) Kultivieren der genannten transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression des genannten DNA- Polymers zulassen, um das genannte Polypeptid zu produzieren;
und
iv) Wiedergewinnen des genannten Polypeptids.
Das DNA-Polymer, das das Polypeptid kodiert, ist ebenfalls Teil der Erfindung.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann anhand konventioneller Rekombinationstechniken durchgeführt werden, wie sie z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und DNA Cloning, Bd I, II und III (D. M. Glover, Hrsg., IRL Press Ltd), beschrieben sind.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Präparieren des DNA-Polymers durch Kondensation entsprechender mono-, di- oder oligomerer Nucleotideinheiten bereit.
Die Präparation kann nach Bedarf chemisch, enzymatisch oder durch eine Kombination der beiden Verfahren in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Somit kann das DNA-Polymer durch die enzymatische Ligation entsprechender DNA-Fragmente anhand konventioneller Verfahren präpariert werden, wie sie z. B. von D. M. Roberts et al. in Biochemistry 1985, 24, 5090-5098 beschrieben werden.
Die DNA-Fragmente können durch den Abbau von DNA, die die benötigten Sequenzen von Nucleotiden enthält, mit geeigneten Restriktionsenzymen durch chemische Synthese, enzymatische Polymerisierung oder durch eine Kombination dieser Verfahren erhalten werden.
Der Abbau mit Restriktionsenzymen kann in einem geeigneten Puffer bei einer Temperatur zwischen 20ºC und 70ºC erfolgen, im allgemeinen in einem Volumen von 50 ul oder weniger, mit 0,1 bis 10 ug DNA.
Eine enzymatische Polymerisierung von DNA kann in vitro unter Verwendung einer DNA-Polymerase wie DNA-Polymerase 1 (Klenow-Fragment) in einem geeigneten Puffer, der die Nucleosid-Triphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP nach Bedarf enthält, bei einer Temperatur zwischen 10º und 37ºC, im allgemeinen in einem Volumen von 50 ul oder weniger durchgeführt werden.
Eine enzymatische Ligation von DNA-Fragmenten kann mit einer DNA-Ligase wie T4 DNA-Ligase in einem geeigneten Puffer bei einer Temperatur zwischen 4ºC und 37ºC, im allgemeinen in einem Volumen von 50 ul oder weniger durchgeführt werden.
Die chemische Synthese des DNA-Polymers oder von Fragmenten kann mit konventioneller Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie unter Anwendung von Festphasentechniken durchgeführt werden, wie solchen, die in Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual (Chemische und enzymatische Synthese von Genfragmenten - ein Laborhandbuch) (Hrsg. H. G. Gassen und A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) oder in anderen wissenschaftlichen Publikationen beschrieben werden, wie z. B. M. J. Gait, H. W. D. Matthes M. Singh, B. S. Sproat und R. C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B. S. Sproat und W. Bannwarth, -Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M. D. Matteucci und M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M. D. Matteucci und M. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S. P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus und H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; und H. W. D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801. Vorzugsweise wird ein automatisiertes DNA-Synthesegerät (zum Beispiel das Synthesegerät 381A von Applied Biosystems) verwendet.
Das DNA-Polymer wird vorzugsweise dadurch präpariert, daß zwei oder mehrere DNA-Moleküle ligiert werden, die zusammen eine DNA-Sequenz umfassen, die das Polypeptid kodiert.
Die DNA-Moleküle können durch einen Abbau mit geeigneten Restriktionsenzymen von Vektoren erhalten werden, die die benötigten Kodierungssequenzen tragen.
Die genaue Struktur der DNA-Moleküle und die Art und Weise, in der sie erzeugt werden, sind von der Struktur des gewünschten Produktes abhängig. Die Entwicklung einer geeigneten Strategie zur Konstruktion der DNA-Molekülkodierung für das Polypeptid ist für den Fachkundigen eine Routineangelegenheit.
Insbesondere wird evtl. die Codonnutzung der jeweiligen Wirtszelle berücksichtigt. Die Codone können für eine hochgradige Expression in E. coli unter Anwendung der in Devereux et al., (1984) Nucl. Acid Res., 12, 387, dargelegten Prinzipien optimiert werden.
Die Expression des DNA-Polymers, das das Polypeptid kodiert, in einer rekombinanten Wirtszelle kann mit Hilfe eines replizierbaren Expressionsvektors erfolgen, der in der Wirtszelle das DNA-Polymer ausprägen kann. Der Expressionsvektor ist neuartig und ist ebenfalls Teil der Erfindung.
Der replizierbare Expressionsvektor kann gemäß der Erfindung präpariert werden, indem ein mit der Wirtszelle kompatibler Vektor gespalten wird, um ein lineares DNA-Segment mit einem intakten Replikon zu erhalten, und das genannte lineare Segment mit einem oder mehreren DNA-Molekülen kombiniert wird, die, zusammen mit dem genannten linearen Segment, das Polypeptid kodieren, unter Ligationsbedingungen.
Eine Ligation des linearen Segmentes mit mehr als einem DNA-Molekül kann nach Wunsch simultan oder sequentiell durchgeführt werden.
Folglich kann das DNA-Polymer nach Wunsch während der Konstruktion des Vektors vorgeformt oder geformt werden. Die Wahl des Vektors wird zum Teil durch die Wirtszelle festgelegt, die prokaryotisch wie E. coli oder eukaryotisch wie C127- Mauszellen, Mausmyeloma, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, Pilze wie z. B. Fadenpilze oder einzellige Hefe, oder eine Insektenzelle wie Drosophila sein kann. Die Wirtszelle kann sich auch in einem transgenen Tier befinden. Zu geeigneten Vektoren gehören Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide und rekombinante Viren, die zum Beispiel von Baculoviren oder Vakziniaviren abstammen.
Das DNA-Polymer kann zum Vektoren zusammengesetzt werden, die zur Isolierung stabiler transformierter Säugetierzellinien vorgesehen sind, die das Fragment ausprägen, wie zum Beispiel Rinderpapillomvirus-Vektoren in C127-Mauszellen oder amplifizierte Vektoren in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (DNA Cloning, Bd. II, D. M. Glover Hrsg. IRL Press 1985; Kaufman, R. J. et al. Molecular and Cellular Biology 5, 1750-1759, 1985; Pavlakis G. N. und Hamer, D. H. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 80, 397-401, 1983; Goeddel, D. V. et al., europäische Patentanmeldung Nr. 0093619, 1983).
Die Präparation des replizierbaren Expressionsvektors kann konventionell mit geeigneten Enzymen zur Restriktion, Polymerisation und Ligation der DNA unter Anwendung von Verfahren durchgeführt werden, die zum Beispiel in Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben sind. Polymerisation und Ligation können wie oben für die Präparation- des DNA-Polymers beschrieben durchgeführt werden. Ein Abbau mit Restriktionsenzymen kann in einem geeigneten Puffer bei einer Temperatur zwischen 20º und 70ºC erfolgen, im allgemeinen in einem Volumen von 50 ul oder weniger, mit 0,1-10 ug DNA.
Die rekombinante Wirtszelle wird gemäß der Erfindung durch Transformieren, einer Wirtszelle mit einem replizierbaren Expressionsvektor der Erfindung unter Transformationsbedingungen präpariert. Geeignete Transformationsbedingungen sind konventionell und werden zum Beispiel in Sambrook et al. (siehe oben) oder "DNA Cloning", Bd. II, D. M. Glover, Hrsg., IRL Press Ltd, 1985 beschrieben.
Die Wahl der Transformationsbedingungen wird durch die Wirtszelle festgelegt. Folglich kann eine bakterielle Wirtszelle wie E. coli mit einer Lösung aus CaCl&sub2; (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) oder mit einer Lösung aus einem Gemisch von RbCl, MnCl&sub2;, Kaliumacetat und Glycerol und dann mit 3-[N-Morpholino]-propansulfonsäure, RbCl und Glycerol oder durch Elektroporation behandelt werden, wie zum Beispiel von Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA, Hersteller eines Elektroporationsgerätes, beschrieben wird. Säugetierzellen in Kultur können durch Calcium-Mitfällung der Vektor-DNA auf die Zellen oder unter Verwendung von kationischen Liposomen transformiert werden.
Die Erfindung erstreckt sich außerdem auf eine mit einem erfindungsgemäßen replizierbaren Expressionsvektor transformierte Wirtszelle.
Das Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression des DNA-Polymers zulassen, wird konventionell durchgeführt, wie zum Beispiel in Sambrook et al. und "DNA Cloning" (siehe oben) beschrieben. Die Zelle wird somit vorzugsweise mit Nährstoffen versorgt und bei einer Temperatur unter 45ºC kultiviert.
Das Proteinprodukt wird mit konventionellen Verfahren entsprechend der Wirtszelle wiedergewonnen. Ist die Wirtszelle eine Bakterienzelle, wie E. coli, und das Protein ist intrazellulär ausgeprägt, so kann es physikalisch, chemisch oder enzymatisch lysiert und das Proteinprodukt von dem resultierenden Lysat isoliert werden. Ist die Wirtszelle eine Säugetierzelle, so wird das Produkt gewöhnlich vom Nährmedium isoliert.
Ist die Wirtszelle eine Bakterienzelle, wie E. coli, dann muß das von der Kultur erhaltene Produkt für eine optimale Funktionsaktivität möglicherweise gefaltet werden. Dies ist am ehesten dann der Fall, wenn das Protein als Einschlußkörper ausgeprägt ist. Es gibt eine Reihe von Aspekten des Isolierungs- und Faltungsprozesses, die als wichtig angesehen werden. Insbesondere wird das Polypeptid vorzugsweise teilweise vor dem Falten gereinigt, um die Bildung von Aggregaten mit kontaminierenden Proteinen und eine Fehlfaltung des Polypeptids gering zu halten. Folglich sind das Entfernen von kontaminierenden E. coli Proteinen durch spezifisches Isolieren der Einschlußkörper und die nachfolgende zusätzliche Reinigung vor dem Falten wichtige Aspekte des Verfahrens.
Der Faltungsprozeß wird so durchgeführt, daß Häufungen von Zwischenfaltungszuständen des Polypeptids vermieden werden. Daher müssen unter anderem Salztyp und Konzentration, Temperatur, Proteinkonzentration, Redoxpufferkonzentrationen und Faltdauer sorgfältig überlegt werden. Die exakte Bedingung für ein bestimmtes Polypeptid kann im allgemeinen nicht vorhergesagt und muß per Experiment ermittelt werden.
Es stehen eine Reihe von Verfahren zum Falten von Proteinen von Einschlußkörpern zur Verfügung, die dem Fachkundigen bekannt sein werden. Die Verfahren beinhalten im allgemeinen das Aufspalten aller Disulfidbindungen im Einschlußkörper, zum Beispiel mit 50 mM 2-Mercaptoethanol, in Anwesenheit einer hohen Konzentration eines Denaturierungsmittels wie 8 M Harnstoff oder 6 M Guanidin- Hydrochlorid. Im nächsten Schritt werden diese Mittel entfernt, damit die Proteinfaltung stattfinden kann. Die Bildung der Disulfidbrücken setzt eine Oxidationsumgebung voraus, die auf vielerlei Art und Weise geschaffen werden kann, zum Beispiel durch Luft oder durch die Einbeziehung eines geeigneten Redoxsystems, wie zum Beispiel ein Gemisch aus reduziertem und oxidiertem Glutathion.
Vorzugweise wird der Einschlußkörper mit 8 M Harnstoff in Anwesenheit von Mercaptoethanol solubilisiert, und Protein wird nach der anfänglichen Entfernung von kontaminierenden Proteinen durch Zugabe eines kalten Puffers gefaltet. Ein bevorzugter Puffer ist 20 mM Ethanolamin mit 1 mM reduziertem Glutathion und 0,5 mM oxidiertem Glutathion. Die Faltung findet vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 1 und 5ºC über einen Zeitraum von 1 bis 4 Tagen statt.
Wird eine Fällung oder Aggregation beobachtet, so kann das aggregierte Protein auf verschiedene Weise entfernt werden, zum Beispiel durch Zentrifugieren oder durch eine Behandlung mit Fällungsmitteln wie Ammoniumsulfat. Wird eines dieser beiden Verfahren angewendet, dann ist monomeres Polypeptid das hauptsächliche lösliche Produkt.
Wenn die Bakterienzelle das Protein sekretiert, dann ist eine Faltung gewöhnlich nicht notwendig.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist in der Behandlung oder Diagnose vieler komplementbewirkter oder komplementbezogener Krankheiten und Störungen von Nutzen, wie unter anderem bei den nachfolgend aufgeführten.

Krankheiten und Störungen in Verbindung mit Komplement Neurologische Störungen

multiple Sklerose
Hirnschlag
Landry-Guillain-Barré-Syndrom
Hirntrauma
Parkinsonsche Krankheit
allergische Enzephalitis
Alzheimersche Krankheit

Störungen durch unangemessene oder unerwünschte Komplementaktivierung

Hämodialysekomplikationen
hochakute Allograftabstoßung
Xenograftabstoßung
Hornhauttransplantatabstoßung
Interleukin-2 induzierte Toxizität während IL-2-Therapie
paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie

Entzündungserkrankungen

Entzündungs- oder[*2] Autoimmunkrankheiten
Crohnsche Krankheit
Schocklunge
thermische Verletzungen wie Verbrennungen oder Erfrierungen
Uveitis
Psoriasis
Asthma
akute Pankreatitis

Postischämische Reperfusionszustände

Myokardinfarzierung
Ballonangioplastik
Atherosklerose (cholesterin-induziert) & Restenose
Hyertonie
Post-Pump-Syndrom bei kardiopulmonalem Bypass oder renaler
Hämodialyse
renale Ischämie
intestinale Ischämie

Infektionskrankheiten oder Sepsis

Mehrfachorganversagen
Sepsisschock

Imunkomplexstörungen und Autoimmunkrankheiten

Rheumatoidarthritis
systemischer Lupus erythematodes (SLE)
SLE-Nephritis
proliferative Nephritis
Glomerulonephritis
Hämolyseanämie
Myasthenie gravis

Reproduktionsstörungen

antikörper- oder komplementbewirkte Unfruchtbarkeit

Wundheilung

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch effektive Menge eines Polypeptids wie oben beschrieben, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Trägerstoff.
Die vorliegende Erfindung stellt überdies ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung in Verbindung mit Inflammation oder unangemessener Komplementaktivierung bereit, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids einem Subjekt, das einer solchen Behandlung bedarf.
In den obigen Verfahren ist das Subjekt vorzugsweise ein Mensch.
Eine effektive Menge des Polypeptids zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung liegt im Dosisbereich von 0,01 bis 100 mg/kg und vorzugsweise zwischen 0,1 mg und 10 mg/kg.
Zur Verabreichung sollte das Polypeptid zu einer geeigneten pharmazeutischen oder therapeutischen Zusammensetzung formuliert werden. Eine solche Zusammensetzung enthält typischerweise eine therapeutisch aktive Menge des Polypeptids und einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff oder Träger wie Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose oder Wasser. Zusammensetzungen können auch spezifische Stabilisierungsmittel wie Zucker, einschließlich Mannose und Mannitol, sowie Lokalanästhetika für injizierbare Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Lidokain, umfassen.
Ferner wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung in Verbindung mit Inflammation oder unangemessener Komplementaktivierung vorgesehen.
Um eine Komplementaktivierung zu inhibieren und gleichzeitig eine thrombolytische Therapie zu geben, stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die ferner eine therapeutisch aktive Menge eines thrombolytischen Mittels umfassen. Eine effektive Menge eines thrombolytischen Mittels liegt im Dosisbereich von 0,01-10 mg/kg und vorzugsweise zwischen 0,1 und 5 mg/kg. Zu bevorzugten thrombolytischen Mitteln gehören unter anderem Streptokinase, Humangewebe- Plasminogenaktivator und Urokinasemoleküle, sowie Derivate, Fragmente oder Konjugate davon. Die thrombolytischen Mittel können eine oder mehrere Kette(n) umfassen, die mit anderen Mitteln verschmolzen oder reversibel verknüpft werden können, um Hybridmoleküle zu bilden (EP-A-0297882 und EP 155387), wie zum Beispiel mit Plasmin verknüpfte Urokinase (EP-A-0152736), ein mit einem wasserlöslichen Polymer verknüpftes fibrinolytisches Enzym (EP-A-0183503). Die thrombolytischen Mittel können auch Muteine von Plasminogenaktivatoren umfassen (EP-A-0207589). In einer bevorzugten Ausgestaltung kann das thrombolytische Mittel ein reversibel blockiertes fibrinolytisches in vitro Enzym, wie im US-Patent Nr. 4,285,932 beschrieben, umfassen. Ein besonders bevorzugtes Enzym ist ein p-Anisoyl[*3]-Plasminogen-Streptokinase-Aktivatorkomplex, wie im US-Patent Nr. 4,808,405 beschrieben und von SmithKline Beecham Pharmaceuticals unter dem Warenzeichen EMINASE (Gattungsname Anistreplase, auch als APSAC bezeichnet; Monk et al., 1987, Drugs 34: 25-49) vertrieben wird.
Zu Verabreichungsrouten für die individuellen oder kombinierten therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung gehören Standardrouten, wie zum Beispiel intravenöse Infusion oder Bolusinjektion. Aktive Komplementinhibitoren und thrombolytische Mittel können zusammen oder nacheinander in jeder beliebigen Reihenfolge verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung einer Thromboseerkrankung, insbesondere einer akuten Myokardinfarzierung in einem menschlichen oder nicht menschlichen Lebewesen bereit. Dieses Verfahren umfaßt das Verabreichen einer effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids und einer effektiven Menge eines thrombolytischen Mittels einem behandlungsbedürftigen Menschen oder Tier.
Vorgesehen ist außerdem die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids und eines thrombolytischen Mittels bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Thromboseerkrankung bei einem Menschen oder einem Tier. Solche Verfahren und Verwendungen können wie in der WO 91/05047 beschrieben stattfinden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Behandlung einer Schocklunge (ARDS) bei einem menschlichen oder nichtmenschlichen Lebewesen bereit. Dieses Verfahren umfaßt das Verabreichen einer effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids einem Patienten.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Verzögerung hochakuter Allograft- oder hochakuter Xenograft- Abstoßung bei einem menschlichen oder nichtmenschlichen Lebewesen, das ein Transplantat empfängt, durch Verabreichen einer effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids bereit. Eine solche Verabreichung kann am Patienten oder am Transplantat vor der Implantation erfolgen.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Behandlung von Wunden bei einem menschlichen oder nichtmenschlichen Lebewesen durch Verabreichen einer effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids durch topische oder parenterale, z. B. intravenöse Routen, bereit.

ALLGEMEINE VERFAHREN, DIE IN DEN BEISPIELEN ANGEWENDET WERDEN

(i) DNA-Spaltung

DNA-Spaltung durch Restriktionsendonucleasen wurde gemäß Herstelleranweisungen unter Verwendung mitgelieferter Puffer durchgeführt. Ein Doppelabbau fand gleichzeitig statt, wenn die Pufferbedingungen für beide Enzyme geeignet waren. Ansonsten fand der Doppelabbau nacheinander statt, wobei Enzym, das die geringste Salzkonzentration benötigte, als erstes zum Abbau gegeben wurde. Nach Abschluß dieses Abbaus wurde die Salzkonzentration verändert und das zweite Enzym hinzugefügt.

(ii) Produktion von DNA-Fragmenten mit einem stumpfen Ende

Die ausgesparten 3 Termini von DNA-Fragmenten wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I wie in Sambrook et al (1989) beschrieben gefüllt.

(iii) DNA-Reinigung/-konzentration und -analyse

Eine Entfernung von Proteinkontaminanten, Nucleosiden fand mit Phenol/CHCl&sub3;, gefolgt von einer Fällung mit Ethanol statt. DNA wurde durch horizontale Agarose-Gelelektrophorese analysiert: beide Verfahren sind in Sambrook et al (1989) beschrieben.

(iv) DNA-Fragmentisolierung

1. DNA-Reinigung auf DEAE NA45 Membranen

DNA-Fragmente wurden von Agarosegelen gereinigt, indem ein Einschnitt in die Agarose über und knapp unter dem benötigten DNA-Fragment gemacht wurde. In TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) eingeweichte NA45-Membranen von Schleicher & Schuell (Anderman, Großbritannien) wurden in die Einschnitte eingefügt, und das Gel wurde noch einmal mit Strom gespeist, bis das DNA- Fragment auf der unteren Membran eingeschlossen war; DNA von höherer relativer Molekülmasse wurde auf der oberen Membran eingeschlossen. Die untere Membran wurde von dem Gel entfernt und die DNA in 0,05 M Arginin/1 M NaCl bei 70ºC 2 Stunden lang eluiert. Anschließend wurde die DNA durch Ethanolfällung wie in Sambrook et al (1989) beschrieben konzentriert.

2. Elektroelution

DNA-Fragmente wurden von Agarosegelen exzidiert, und DNA wurde durch Elektroelution mit dem Unidirectional Electroeluter (IBI Ltd., Cambridge, England) gemäß Herstelleranweisungen extrahiert.

3. Gelreinigung

DNA-Fragmente wurden von Agarosegelen exzidiert, und DNA wurde mit dem QIAEX-Gelextraktionskit gemäß Herstelleranweisungen (QIAGEN Inc., USA) extrahiert.

(v) Plasmidpräparation

Es wurde eine Plasmidpräparation von Plasmid-DNA in großem Umfang mit CsCl wie in Sambrook et al (1989) beschrieben oder mit Magic Maxipreps (Promega Corporation, Madison, USA) gemäß Herstelleranweisungen durchgeführt. Mini-Plasmidpräparationen wurden entweder mit dem in Sambrook et al (1989) beschriebenen alkalischen Lyseverfahren oder mit Magic Minipreps (Promega Corporation, Madison, USA) gemäß Herstelleranweisungen durchgeführt.

(vi) Einführung von Plasmid-DNA in E. coli

1. Plasmide wurden in E. coli HB101 oder E. coli BL21 (DE3) (Studier und Moffat, 1986) transformiert, die mit Calciumchlorid wie in Sambrook et al (1989) beschrieben kompetent gemacht worden waren.
2. Alternativ wurden Plasmide in E. coli DH1 (Low, 1968) oder E. coli BL21 (DE3) durch Elektroporation mit dem Gene Pulsar und Pulse Controller von Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA) gemäß Herstelleranweisungen eingeführt.

(vii) Kinasebehandlung von Oligonucleotiden

Oligonucleotide oder reassoziierte Oligonucleotide mit 5' Überhängen wurden mit T&sub4;-Polynucleotidkinase wie in Sambrook et al (1989) beschrieben kinasebehandelt.

(viii) Reassoziierung und Ligation von Oligonucleotiden

Oligonucleotide wurden miteinander reassoziiert, indem im allgemeinen äquimolare Konzentrationen der komplementären Oligonucleotide in 10 mM Tris, pH 8,5, 5 mM MgCl&sub2; vermischt, 5 Minuten lang 100ºC ausgesetzt und dann sehr langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wurden. Reassoziierte Oligonucleotide mit klebrigen Enden wurden mit einem Vektor oder anderen Oligonucleotiden, die komplementäre klebrige Enden enthielten, durch T&sub4;-DNA-Ligase wie in Sambrook et al (1989) beschrieben ligiert.

(ix) PCR-(Polymerase-Kettenreaktion)-Amplifikation von DNA

DNA-Fragmente von Ligationsreaktionen oder von Agarosegelen exzidierte und gereinigte DNA-Fragmente wurden per PCR von zwei Primern amplifiziert, die zu den 5 Enden des DNA- Fragmentes komplementär waren. Etwa 0,1-1 ug der Ligationsreaktion oder der gereinigten DNA von dem Agarosegel wurden in 10 mM Tris, pH 8,3 (bei 25ºC), 50 mM KCl, 0,1% Gelatine vermischt; MgCl&sub2;-Konzentrationen wurden zwischen 1,5 mM und 6 mM variiert, um eine geeignete Konzentration für jede Reaktion zu finden. Beide Primer wurden auf eine Endkonzentration von 2 uM hinzugegeben; dNTPs wurden jeweils auf eine Endkonzentration von 0,2 mM gegeben. Das endgültige Reaktionsvolumen lag bei 75 ul oder 100 ul und war mit Mineralöl überzogen, um eine Verdampfung zu verhindern. Anschließend fand ein Wärmeumlauf mit einer Wärmeumlaufvorrichtung (z. B. Hybaid Thermoreaktor) statt; dabei kamen zum Beispiel die folgenden Bedingungen zur Anwendung: 94ºC, 7 Minuten, 45ºC, 2 Minuten, bei 45ºC weniger als 5 Minuten halten und anschließend 5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (im Handel erhältlich, z. B. Gibco) zugeben. Das DNA-Fragment wurde durch Temperaturumlauf bei 72ºC, 2 Minuten, 94ºC, 1 Minute und 45ºC, 2 Minuten insgesamt 35 Mal amplifiziert.

(x) DNA-Sequenzierung mit dem Doppelstrangverfahren

Die Sequenzierung wurde mit "Sequenase " (United States Biochemical Corporatin) im wesentlichen gemäß Herstelleranweisungen durchgeführt.

(xi) DNA-Sequenzanalyse und -manipulation

Die Analyse von Sequenzen wurde mit einem digitalen VAX- Computer unter Verwendung des GCG-Programmpaketes wie in Devereux et al (1984) beschrieben durchgeführt.

(xii) Produktion von Oligonucleotiden

1. Oligonucleotide wurden mit einem Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB Biotechnology, Milton Keynes, England) oder einem 381 A Synthesiser (Applied BioSystems) gemäß Herstelleranweisungen synthetisiert.
2. Eine Oligonucleotidreinigung wurde mit MonoQ, wie von Pharmacia empfohlen, oder durch UV-Beschattung durchgeführt, wobei die Wiedergewinnung synthetischer Oligonucleotide mit Elektrophorese durch ein denaturierendes Polyacrylamidgel erfolgte. Die Oligonucleotide wurden auf ein 12% Acrylamid/7 M Harnstoffgel geladen und bei 1500 V separiert, bis das Oligonucleotid etwa zwei Drittel der Länge des Gels gewandert war. Die DNA wurde mit einer Langwellen-UV-Handlampe sichtbar gemacht; und die DNA-Banden wurden exzidiert. Das Oligonucleotid wurde mit Sep-Pak C18 Reversed-phase-Säulen (Waters) wie in Sambrook et al (1989) beschrieben zurückgewönnen.

(xiii) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS PAGE)

SDS PAGE wurde im allgemeinen mit dem Novex-System (British Biotechnology) gemäß Herstelleranweisungen durchgeführt. Vorgepackte Gele mit Acrylamidkonzentrationen von 14%, 16%, 4-20% oder 10-27% wurden am häufigsten verwendet. Elektrophoreseproben, einschließlich Proteinstandards von relativer Molekülmasse (LMW Kit, Pharmacia) wurden gewöhnlich in 1% (Gew.-Vol.) SDS-haltigem Puffer (mit oder ohne 5% (nach Volumen) 2-Mercaptoethanol) verdünnt und bei Raumtemperatur etwa 0,5 bis 1 Stunde lang vor der Gelapplikation ruhen gelassen.

(xiv) Veränderung der Codonnutzung

Die nicht-zufällige Verwendung von synonymen Codonen wurde in E. coli demonstriert, und es gibt einige Beweise, die die These stützen, daß die Proteinproduktion von Genen, die nichtoptimale oder minderwertige Codone enthalten (besonders am 5' Ende des Gens) weniger effizient ist als die von Genen, die solche Codone nicht enthalten (z. B. Chen an Inouye, 1990). Es wurde eine Codonnutzungstabelle mit in E. coli hochausgeprägten Genen (Lieferumfang des GCG-Sequenzanalyse-Softwarepakets, Devereux et al, (1984)) verwendet, um die optimalen Codone zur Expression in E. coli zu bestimmen. Die ersten 30 Codone aller Konstrukte (wenn mit den Restriktionenzymorten kompatibel) wurden alle hinsichtlich einer hochgradigen Expression optimiert. Die Codone für die sieben Aminosäuren arg, gly, ile, leu, pro, ser, ala wurden (wenn mit den Restriktionsenzymorten kompatibel) in der gesamten Codierungssequenz optimiert.

(xv) Konstruktion von Vektor pBROC413

Das Plasmid pT7-7 (Tabor, 1990) enthält DNA, die den Nucleotiden 2065-4362 von pBR322 entspricht, und kann wie pBR322 durch ein konjugatives Plasmid in Anwesenheit eines dritten Plasmids ColK mobilisiert werden. Ein von ColK kodiertes Mobilitätsprotein wirkt auf den nic Ort bei Nucleotid 2254 von pBR322 und initiiert von dieser Stelle aus eine Mobilisierung. pT7-7 wurde mit LspI und BglII abgebaut, und die vorstehenden 5' Enden wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA- Polymerase I gefüllt. Das Plasmid-DNA-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, die stumpfen Enden wurden miteinander ligiert und durch Elektroporation in E. coli DH1 transformiert. Das resultierende Plasmid pBROC413 (Fig. 1) wurde durch Restriktionsenzymanalyse von Plasmid-DNA identifiziert.
Durch die Deletion in pBROC413 vom LspI Ort unmittelbar vor dem ø10 Promoter zum BglII Ort bei Nucleotid 434 von pT7-7 wird die den Nucleotiden 2065-2297 von pBR322 entsprechende DNA deletiert. Folglich werden der nic Ort und benachbarte Sequenzen deletiert, wodurch pBROC413 nicht mobilisierbar gemacht wird.

(xvi) Hämolytischer Assay

Die antihämolytische Aktivität von Polypeptiden wurde durch Messen der Inhibition komplementbewirkter Lyse von Schafserythrozyten bewertet, die mit Kaninchen-Antikörpern (von Diamedix Corporation, Miami, USA) sensibilisiert waren. 1 : 125 in einem Puffer aus 0,1 M Hepes/0,15 M NaCl, pH 7,4, verdünntes Humanserum war die Komplementquelle und wurde von einem Pool Freiwilliger, im wesentlichen wie in (Dacie & Lewis, 1975) beschrieben, präpariert. Kurz gesagt, Blut wurde 5 Minuten lang auf 37ºC erwärmt, das Blutgerinnsel entfernt und das restliche Serum durch Zentrifugation geklärt. Die Serumfraktion wurde in kleine Aliquote geteilt und bei -196ºC gelagert. Die Aliquoten wurden nach Bedarf aufgetaut und unmittelbar vor dem Gebrauch im Hepes-Puffer verdünnt.
Die Inhibition komplementbewirkter Lyse von sensibilisierten Schafserythrozyten wurde unter Anwendung eines standardmäßigen hämolytischen Assay unter Verwendung eines V- bodenförmigen Mikrotiter-Plattenformats wie folgt gemessen.
50 ul eines Konzentrationsbereichs (0,01-100 ug/ml, typischerweise jedoch 0,05-25 ug/ml) von in Hepes-Puffer verdünntem Testprotein wurden mit 50 ul des verdünnten Serums Minuten lang bei 37ºC inkubiert. 100 ul vorgewärmter sensibilisierter Schafserythrozyten wurden 1 Stunde lang bei 37ºC in ein endgültiges Reaktionsvolumen von 200 ul gegeben. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 300 g und 4ºC geschleudert, bevor 150 ul Supernatant auf Mikrotiterplatten mit flachem Boden übertragen und die Absorption bei 410 nm bestimmt wurde, wodurch der Betrag der Lyse in jeder Testlösung reflektiert wird. Die maximale Lyse wurde durch Inkubieren von Serum mit Erythrozyten in Abwesenheit eines Inhibitors bestimmt, wovon der Anteil der Hintergrundlyse subtrahiert wurde (ermittelt durch Inkubieren von Erythrozyten mit Puffer). Die Inhibitor- Hintergrundlyse wurde dadurch beurteilt, daß Inhibitor mit Erythrozyten inkubiert und dies anschließend von Testproben subtrahiert wurde. Die Inhibition wurde als Fraktion der Gesamtzytolyse ausgedrückt, so daß IH50 die Inhibitorkonzentration repräsentiert, die für eine 50%ige Lyseinhibition notwendig ist.

(xvii) C3a RIA-Assay

Nach einer Komplementsystemaktivierung kann eine Messung der Freisetzung von Anaphylatoxin, C3a und seinem Abbauprodukt C3a des Arg stattfinden. Beide Produkte können mit einem kompetitiven Radioimmunoassay von Amersham International plc, GB (Humankomplement C3a des arg [¹²&sup5;I]Assay, Code RPA 518) gemessen werden.

(a) Alternative Systemaktivierung durch Zymosan A

Das Komplementsystem wurde auf dem alternativen Weg mit Zymosan A, einem komplexen Kohlenhydrat von Hefe (Sigma, Katalognummer Z-4250) aktiviert. Zymosan A wurde auf 50 mg/ml in Hepes-Puffer (0,1 M Hepes/0,15 M NaCl, pH 7,4) oder in PBS (50 mM Natriumphosphat/0,1 M NaCl, pH 7,4) gebracht und verwirbelt, bis sich eine feine Suspension ausbildete. Serum (wie für den hämolytischen Assay beschrieben präpariert; Verfahren xvi) wurde mit verschiedenen Konzentrationen von in Hepes-Puffer verdünntem Komplementinhibitor 15 Minuten lang bei 37ºC mit den nachfolgend genannten Volumen vorinkubiert. Zymosan A wurde dann jedesmal vor dem Zugeben in die Proben einige Sekunden lang verwirbelt, wonach die Proben weitere 30 Minuten bei 37ºC inkubiert wurden. Zymosan A wurde dann bei etwa 11.000 g 30 Sekunden lang bei Umgebungstemperatur zentrifugiert. Typischerweise wurden 100 ul Supernatant in ein gleiches Volumen einer in dem Kit enthaltenen Fällungslösung gegeben, und das folgende Supernatant wurde wie in dem von Amersham mit dem C3a des Arg Assay RIA Kit gelieferten technischen Mitteilungsblatt beschrieben untersucht. Jede Probe wurde zweimal untersucht, und nützliche Verdünnungen des Supernatants, die gewährleisten, daß sich Probenzählungen auf der Standardkurve befinden, lagen bei 1/50-1/100. EDTA oder Futhan wurden, wie im technischen Mitteilungsblatt vorgeschlagen, in keinen Lösungen und Röhrchen verwendet.
An jeder Probe wurde 1 Minute lang mit einem LKB-Wallac 1272 Clinigamma eine Zählung durchgeführt. Die Daten wurden mit dem RiaCalc-Programm für RIA-Assays verarbeitet, das mit dem Clinigamma mitgeliefert wird. Die Daten wurden im wesentlichen wie im technischen Mitteilungsblatt von Amersham beschrieben verarbeitet, wobei die Standardkurve durch nichtlineare Regressionsanpassung an die Daten erstellt wurde.
Der miniaturisierte Assay wurde im wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung geringerer Gesamtvolumen für die Serumaktivierung. Volumen der zugegebenen Proben
Beim miniaturisierten Assay wurden typischerweise 25 ul der Probe nach der Aktivierung präzipitiert. Die Assay-Kit- Reagensadditionen wurden von 50 ul auf 10 ul reduziert, wodurch der Assay in einer Mikrotiterplatte mit U-förmigem Boden durchgeführt werden konnte, die separate ablösbare Mulden enthielt. Der Assay wurde anschließend, wie im technischen Mitteilungsblatt beschrieben, mit den eingestellten Volumen bis zur letzten Verdünnung in isotonischer Kochsalzlösung durchgeführt. In diesem Fall wurden 200 ul Kochsalzlösung zugegeben und die Platte 12 Minuten lang bei etwa 2500 g und 4ºC geschleudert. Die Supernatanten von jeder Mulde wurden vorsichtig durch Ansaugen entfernt, und das Präzipitat wurde mit weiteren 300 ul isotonischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Platte wurde dann noch einmal 5 Minuten lang bei etwa 2500 g und 4ºC geschleudert, und das Supernatant wurde entsorgt. An den Mulden wurden dann jeweils 10 Minuten lang auf dem Clinigamma Zählungen durchgeführt. Die Daten wurden wie oben verarbeitet.
Um die prozentuale Inhibition der maximalen Aktivierung bei den einzelnen Inhibitorkonzentration zu ermitteln, wurde zu jedem Experiment eine Reihe von Vergleichen durchgeführt.
Hierzu gehörten: maximale Aktivierung (A), d. h. nur Serum + Zymosan A, Hintergrundaktivierung (B), d. h. nur Serum + Puffer, und Hintergrundaktivierung in Anwesenheit eines Inhibitors (C), d. h. nur Serum + Inhibitor. Die Hintergrundaktivierung wurde im allgemeinen von der maximalen Aktivierung subtrahiert. Auf ähnliche Weise wurde die Hintergrundaktivierung in Anwesenheit eines Inhibitors von dem Wert des aktivierten Serums in Anwesenheit des Inhibitors subtrahiert. Diese Werte konnten dann zum Bestimmen der prozentualen Inhibition bei jeder Inhibitorkonzentration unter Verwendung der folgenden Formel verwendet werden:
1 - D - C / (A - B) · 100
wobei D der Wert der Serumaktivierung in Anwesenheit von Inhibitor und Zymosan A ist. IC50 wird als die Konzentration des Inhibitors definiert, die zur Reduzierung der maximalen Aktivierung um 50% notwendig ist.

(b) Klassische Systemaktivierung durch wärmeaggregiertes IgG

Eine klassische Aktivierung des Systems durch IgG wurde wie folgt durchgeführt. Human-γ-Globulin (Sigma, Katalognummer G-4386) wurde auf 14 mg/ml in 0,1 M Hepes/0,15 M NaCl, pH 7,4, gebracht und bei 60ºC 1 Stunde lang erhitzt. Proben von wärmeaggregiertem IgG wurden dann als kleine Aliquote bei -80ºC gelagert, bis sie gebraucht wurden. Serum wurde mit wärmeaggregiertem IgG unter Verwendung der gleichen Volumen wie für den normalen oder miniaturisierten Zymosan-A-Assay beschrieben aktiviert. Eine Vorinkubation des Inhibitors mit Serum fand 15 Minuten lang bei 37ºC statt, gefolgt von der Zugabe des wärmeaggregierten IgG. Die Inkubation wurde weitere 45 Minuten bei 37ºC fortgesetzt. Die Proben wurden dann sofort hinsichtlich der C3a-Anteile unter Anwendung des normalen oder miniaturisierten Assay untersucht.

(xviii) C5a RIA-Assay

Nach einer Aktivierung von Komplementsystemen kann eine Messung der Freisetzung von Anaphylatoxin C5a und seinem Abbauprodukt C5a des Arg folgen. Beide Produkte können mit einem kompetitiven Radioimmunoassay von Amersham International plc, GB (Humankomplement C5a des Arg [¹²&sup5;I]Assay, Code RPA 520) gemessen werden.
Das Komplementsystem wurde auf dem alternativen Weg mit Zymosan A, wie für den C3a RIA-Assay (Verfahren (xvii)) beschrieben, aktiviert. Der Assay wurde in der miniaturisierten Form, wie für den C3a-Assay beschrieben, mit Reagenzien durchgeführt, die im C5a des Arg RIA-Kit enthalten waren.
Die in den Beispielen enthaltenen Verweise auf Aminosäurenummerierungen beziehen sich auf die entsprechenden Reste von reifem CR1 Protein.

1. Beispiel Konstruktion von Plasmid pDB1010-D11, das SCR 1 + 2 kodiert Allgemeines

Eine DNA-Sequenz für SCR 1 + 2, die Aminosäure 1 entsprach und bei Aminosäure 124 des reifen Humankomplementrezeptors 1 endete, war so konstruiert, daß das 5' Ende des Gens einen NdeI Ort enthielt. Dieser Ort umfaßt ein ATG-Codon, um das initiierende Methionin zu liefern, das für den Beginn der mRNA- Translation benötigt wird, und setzt das Gen in eine optimale Entfernung von der Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungssequenz von pBROC413. Das 3' Ende des Gens endete auf zwei Stoppcodonen, gefolgt von einem HindIII Ort.
Es wurden Restriktionsendonucleasen identifiziert, die pBROC413 nicht zerschneiden und die im Handel erhältlich waren. Die von den Endonucleasen erkannten Sequenzen von Restriktionsorten wurden in alle drei Leseraster translatiert.
Die Orte, die selten benutzte Codone für E. coli Expression enthielten, wurden verworfen. Die restlichen Orte wurden mit der DNA-Kodierung für SCR 1 + 2 abgeglichen. Wenn der Restriktionsort in die DNA-Sequenz eingebaut werden konnte, um die Kodierungssequenz zu erhalten und kein selten benutztes Codon hinzuzufügen, dann wurde die DNA-Sequenz so verändert, daß sie diesen Restriktionsort enthielt. 10 einmalige Restriktionsorte wurden auf diese Weise identifiziert und eingebaut. Um eine intrazelluläre Expression von Protein in E. coli zu ermöglichen, wurde ein ATG-Codon zum 5' Ende des Gens unmittelbar vor dem Codon für die erste Aminosäure von reife CR1 hinzugefügt. Das Codon ATG ist Teil des NdeI Restriktionsortes, der zum Klonen in Vektoren wie pBROC413 verwendet werden kann. Das Prolin 124 von reifem CR-1 entsprechende Codon wurde in eines geändert, das Glutamin kodiert und außerdem einen EcoRI Ort beinhaltet.

(a) Plasmid-Konstruktion

Oligonucleotide, die SCR 1 + 2 kodieren (Tabelle 1, 1-8), wurden als 4 komplementäre Paare von 87-101meren synthetisiert, die auf einzigartige Weise über komplementäre 8-bp-Überhänge zwischen den Oligonucleotidpaaren ligiert werden konnten. Die vier komplementären Oligonucleotidpaare wurden als Paar A (Oligos 1 + 2), Paar B (Oligos 3 + 4), Paar C (Oligos 5+6) und Paar D (Oligos 7+8) bezeichnet. Das Paar A, das dem 5 Ende des Gens entsprach, enthielt einen NdeI Restriktionsortüberhang, und Paar D enthielt einen HindIII Restriktionsortüberhang am 3 Ende. Abgesehen von 1 und 2, wurden alle Oligonucleotide vor dem Gebrauch auf Pharmacia Mono-Q-Säulen gereinigt. Oligonucleotid 2 von Paar A und Oligonucleotid -7 von Paar D wurden vor der jeweiligen Reassoziierung mit ihren nicht kinasebehandelten komplementären Oligonucleotiden 1 und 8 kinasebehandelt. Die Oligonucleotidpaare B und C wurden zunächst reassoziiert und dann kinasebehandelt. Die kinasebehandelten Oligonucleotidpaare wurden wie folgt ligiert; Paar A (etwa 0,1 ug) mit Paar B (etwa 0,2 ug) und Paar C (etwa ug) mit Paar D (etwa 4 ug). Die ligierten Oligonucleotide (A + B) wurden wiederum mit (C + D) ligiert, um die Genkodierung für SCR 1 + 2 zu bilden.
Die DNA-Kodierung für SCR 1 + 2 wurde per PCR unter Verwendung von zwei Oligonucleotiden (Tabelle 1; 15 und 16) amplifiziert, die zu den beiden DNA-Strängen komplementär waren. Beide Oligonucleotide enthielten nicht abgeglichene 5 Enden, die 6 bp einer Zufallssequenz enthielten, gefolgt von der Sequenz von NdeI- oder HindIII-Restriktionsorten, gefolgt von 18 bp, die komplementär zu dem Gen waren. Nach -der PCR wurde eine Bande von etwa 400 bp durch horizontale Agarose- Gelelektrophorese sichtbar gemacht, exzidiert und gereinigt auf DEAE NA45 Membranen. Die DNA wurde dann mit NdeI und HindIII zerschnitten und anschließend mit pBROC413 ligiert, der mit den gleichen Enzymen zerschnitten worden war. Der Vektor wurde in mit Calciumchlorid kompetent gemachte E. coli HB101 transformiert. Es fanden Mini-Plasmid-Präparationen statt, und die Plasmid-DNA würde durch Abbau mit NdeI und HindIII analysiert. Plasmide, die das Insert mit korrekter Größe enthielten, wurden ferner einer Restriktionskartierung mit EcoRI, HpaI, KpnI und SmaI unterzogen. Die Plasmide, die die korrekten Restriktionskarten aufzeigten, wurden durch DNA- Sequenzierung beider Stränge über die Genkodierung für SCR 1 + 2 analysiert. Es wurde herausgefunden, daß Plasmid pDB1010-D11 die korrekte Sequenz über die Genkodierung für SCR 1 + 2 hatte.

2. Beispiel Konstruktion, Expression, Reinigung, Faltung und Formulierung von MQ1 -> K196 von CR-1 (SCR 1 + 2 + 3) Allgemeines

Die DNA-Kodierung für SCR 1 + 2 + 3 wurde konstruiert, indem DNA-Kodierung für SCR 1 + 2 (Beispiel 1a) mit DNA-Kodierung für SCR3 ligiert wurde.
Allgemeine Punkte zu SCR3 sind im 9. Beispiel enthalten.
Die der Aminosäure 122 entsprechende SCR3- Kodierungseinheit, die bei Aminosäure 196 von reifem CR1 endet, wurde so konstruiert, daß das 5' Ende der Einheit den EcoRI Ort an der Junktion von SCR 2 & 3 und einen NdeI Ort 5' am EcoRI Ort enthielt. Das 3' Ende der Einheit endete an zwei Stoppcodonen, gefolgt von einem HindIII Ort. Die Plasmide, die die SCR3-Kodierungseinheit und die SCR1+2-Kodierungseinheit enthielten, wurden mit EcoRI und Hindill abgebaut. Die SCR3- Kodierungseinheit wurde isoliert und hinter der SCR1+2- Kodierungseinheit in dem mit EcoRI/HindIII zerschnittenen, SCR1+2-haltigen Plasmid eingefügt, um ein Plasmid zu erzeugen, das die SCR1+2+3-Kodierungseinheit enthält, die den Aminosäuren 1 bis 196 von reifem CR1 entspricht. Durch die Zugabe der SCR3- Kodierungseinheit durch den EcoRI Ort wird das Codon, das einem Glutamin bei Position 124 entspricht, zurück zur authentischen Aminosäure (Prolin) konvertiert, die in CR1 zu finden ist.

(a) Konstruktion von Plasmid pDB1013, das SCR 1 + 2 + 3 kodiert

Es wurden drei Oligonucleotidpaare (Tabelle 1; 9-14) synthetisiert, die die SCR3-Kodierungssequenz beinhalten. Die Oligonucleotide wurden zunächst als Paare (9, 10; 11, 12; 13, 14) reassoziiert, und das mittlere Paar wurde kinasebehandelt, so daß die drei Paare über 8 Basenpaar-Überlappungssequenzen miteinander ligiert werden konnten. Das 5 Ende dieses trimeren Moleküls war so ausgestaltet, daß es zu NdeI-abgebauter DNA komplementär war, und das 3' Ende zu HindIII-abgebauter DNA. Dadurch konnte das Trimer in NdeI/HindIII-abgebauten pBROC413 kloniert und pBROC435 erzeugt werden (Fig. 2). Die Identität von pBROC435 wurde per Restriktionsenzymanalyse geprüft und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Plasmid-DNA von pBROC435 und pDB1010-D11 (1. Beispiel) wurde mit EcoRI und Hindill zerschnitten; die EcoRI/HindIII- Bande von pBROC435-Kodierung für SCR3 sowie der zerschnittene Vektor pDB1010-D11 wurden auf einer DEAE NA45 Membran gereinigt. Die SCR3-Kodierungseinheit wurde dann mit pDB1010- D11 ligiert, um pDB1013-5 zu erzeugen, das dann in Calciumchlorid-kompetente E. coli HB101 transformiert wurde. Die resultierenden Kolonien wurden durch Mini-Plasmid- Präparation von DNA, gefolgt von Restriktionskartierung analysiert. Eine der Kolonien mit der Bezeichnung pDB 1013-5-4 (Fig. 2) enthielt die SCR1+2+3-Kodierungseinheit. Dieses Plasmid wurde dann für eine Expression des Genproduktes analysiert.

(b) Expression von SCR 1 + 2 + 3

pDB1013-5-4 wurde in Calciumchlorid-kompetente E. coli BL21 (DE3) transformiert, und die resultierenden Kolonien wurden durch Restriktionsabbau von Mini-Plasmid-DNA- Präparationen analysiert. Einzelne Kolonien wurden in Universalbehälter inokuliert, die 10 ml L-Nährlösung oder NCYZM-Medium und 50 ug/ml Ampicillin enthielten, und über Nacht bei 37º, 220 UPM, vermehren gelassen. Die Übernacht-Kulturen (typisch 5 ml) wurden zum Inokulieren von jeweils 2-L- Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 500 ml NCYZM-Medium, 150 ug/ml Ampicillin enthielten; die Kulturen wurden bei 37ºC, 220 UPM, vermehrt, bis A&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 Absorbanzeinheiten betrug. Die Kulturen wurden mit 1 mM Isopropylthioβ-D-Galactosid (IPTG) induziert und weitere 3 Stunden unter den gleichen Bedingungen vermehren gelassen. Die Kulturen wurden zentrifugiert (etwa 8000 g10 Min.), und die Supernatanten entsorgt. Die Zellpellets wurden bei -40ºC gelagert. Die L-Nährlösung war 1% (Gew.-Vol.) Bactotrypton, 0,5% (Gew.-Vol.) Bactohefeextrakt, 0,5% (Gew.- Vol.) NaCl. Das NCYZM-Medium war L-Nährlösung mit 0,1% (Gew.- Vol.) Caseinhydrolysat und 0,2% (Gew.-Vol.) MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, pH 7,0.

(c) Isolierung von solubilisierten Einschlußkörpern

Gefrorenes Zellpellet von E. coli BL21 DE3 (pDB1013-5-4) (1-Liter-Kultur), das auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2b beschrieben präpariert wurde, wurde bei 4ºC 2 Stunden lang auftauen gelassen und dann in 50 mM Tris/50 mM NaCl/1 mM EDTA/0,1 mM PMSF, pH 8,0, (33 ml) resuspendiert. Die Suspension wurde in ein 100 ml Becherglas gegeben und beschallt (Heat Systems - Ultrasonics W380; 70 Watt, 50 · 50% Impuls; Impulsdauer = 5 Sek.). Das Beschallungsprodukt wurde sofort zentrifugiert (6000 g/4ºC/10 Min.) und das Supernatant entsorgt. Das Pellet mit den Einschlußkörpern wurde in 20 mM Tris/8 M Harnstoff/50 mM 2-Mercaptoethanol/1 mM EDTA/0,1 mM PMSF, pH 8,5, (100 ml) resuspendiert und bei Raumtemperatur (etwa 23ºC) 1 Stunde lang ruhen gelassen. Die resultierende Lösung wurde zentrifugiert (etwa 2000 g bei 4ºC, 10 Min.), um Material zu entfernen, das nicht solubilisiert wurde. Das Supernatant dieser Schleuderung wurde bei -40ºC als das solubilisierte Einschlußkörperprodukt aufbewahrt.

(d) Reinigung von SCR 1 + 2 + 3 vom solubilisierten Einschlußkörper

Eine S-Sepharose-Fast-Flow-Säule (ID 16 mm; Höhe 10 mm) wurde präpariert und an ein FPLC-(Pharmacia)-System angeschlossen. Die Säule wurde mit 20 mM Tris/8 M Harnstoff/1 mM EDTA/50 mM 2-Mercaptoethanol, pH 8,5, äquilibriert. 10 ml aufgetauter, solubilisierter Einschlußkörper, der wie im Beispiel 2c beschrieben präpariert war, wurde auf die Säule aufgebracht und mit Äquilibrierungspuffer durchgewaschen. Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten auf 1 M NaCl (in Äquilibrierungspuffer) entwickelt, gefolgt von Spülungen mit 1 M NaCl und 2 M NaCl (ebenfalls in Äquilibrierungspuffer). Die gesamte Chromatographie lief bei 1,0 ml min&supmin;¹ und bei Raumtemperatur ab.
Eine Analyse durch SDS PAGE/Proteinfärbung der während der Chromatographie gesammelten Fraktionen ergab, daß praktisch das gesamte SCR1+2+3-Polypeptid von der Säule absorbiert [*4] und von dem 1 M NaCl-haltigen Puffer dissoziiert war. Die entsprechenden Fraktionen wurden bei -40ºC gelagert.
Eine nachfolgende Untersuchung hinsichtlich des Proteingehalts der Peakfraktion mit dem Bradford-Proteinassay und einem Rinderserumalbuminstandard ergab, daß sie 2,8 mg Protein enthielt.

(e) Faltung

S-Sepharose-gereinigtes SCR 1 + 2 + 3, auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2d beschrieben gereinigt und bei -40ºC gelagert, wurden aufgetaut, und 0,4 ml wurden mit Sephadex G25 (P10) in 0,05 M Ameisensäure puffergetauscht. Die Absorbanz bei 280 nm der puffergetauschten Lösung wurde mit 0,52 bestimmt, und unter Verwendung von = 34000 und geeigneten Verdünnungskorrekturfaktoren wurde die Proteinkonzentration der ursprünglichen Präparation (vor dem Pufferaustausch) mit 0,6 mg/ml berechnet.
Auf der Basis dieses Wertes wurden 1,7 ml S-Sepharosegereinigtes Protein mit 0,85 ml 20 mM Tris/8 M Harnstoff/50 mM 2-Mercaptoethanol/1 M NaCl, pH 8,5, verdünnt, um eine 0,4 mg/ml Lösung zu erzeugen, bei der die Faltung stattfand.
Die Faltung wurde mit einer Reihe von Verdünnungen bewirkt, wobei stets kaltes Verdünnungsmittel verwendet wurde.
Bei t = 0 h wurden 0,8 ml SCR 1 + 2 + 3 (0,4 mg/ml) in 0,8 ml mM Tris/1 M Harnstoff/5 mM EDTA/3 mM 2-Mercaptoethanol, pH 8,0 ('Verdünnungsmittel') in einem 30 ml Polystyrol- Universalbehälter gegeben. Die Lösung wurde durch sanftes Schwenken gründlich vermischt und abgedeckt in einem kalten Raum (etwa 2 bis 3ºC) ruhen gelassen.
Nach 1 h wurden 1,6 ml Verdünnungsmittel zugegeben und vermischt.
Nach 2 h wurden 3,2 ml Verdünnungsmittel zugegeben und vermischt.
Nach 4 h wurden 6,4 ml Verdünnungsmittel zugegeben und vermischt.
Die Lösung wurde weitere 20 Stunden in dem kalten Raum stehengelassen und anschließend auf etwa 1,4 ml ultrafiltriert (YMS, Amicon Ltd.). Anschließend fand unter Verwendung von Sephadex G25 (PD 10) ein Pufferaustausch in 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; (2,5 ml) in dem kalten Raum statt. Das Eluat wurde in Aliquote geteilt und bei -40ºC gelagert oder lyophilisiert.
Das SCR1+2+3-haltige Produkt wurde durch SDS PAGE analysiert, gefolgt von Proteinfärbung. Sowohl in nichtreduzierten als auch in reduzierten (mit 2-Mercaptoethanol 5% (nach Volumen)) Proben gab es eine einzelne Hauptbande. Die relative Molekülmasse der reduzierten Bande lag im Vergleich zu reduzierten Proteinstandards von bekanntem Mr bei etwa 24.000. Das nichtreduzierte Protein (Bande) wies eine geringfügig höhere Mobilität auf als das reduzierte Protein (Bande).
Das Produkt wurde in einem funktionellen hämolytischen Assay mit antikörpersensibilisierten Schafserythrozyten analysiert (Verfahren (xvi)). Das Produkt wies eine konzentrationsabhängige Inhibition der komplementbewirkten Lyse der Erythrozyten auf (IH50 etwa 0,4 ug/ml).

(f) Faltung

Präparation, Faltung, Verarbeitung und Analyse fanden genau wie im Beispiel 2e statt, mit den folgenden Ausnahmen:
(1) das Verdünnungsmittel für die Faltung war 20 mM Ethanolamin (pH 10,0)
(2) die gefaltete Lösung wurde auf ein Endvolumen von 1,55 ml ultrafiltriert, und
(3) der IH50-Wert lag bei etwa 0,6 ug/ml
(4) die Produktwiedergewinnung lag bei etwa 100 Prozent

(g) Bestimmung der N-terminalen Sequenz von SCR 1 + 2 + 3

1 ml Proben von sich vermehrenden E. coli BL21 (DE3) mit Plasmid pDB1013-5-4 wurden 3 Stunden nach der Induktion mit 1 mM IPTG wie in Beispiel 2b beschrieben entfernt. Diese Proben wurden in einer Eppendorf-Zentrifuge geschleudert, und die resultierenden Pellets jeweils in 200 ul Reduktionspuffer (100 mM Tris, pH 6,8/200 mM Dithiothreitol/4% (Gew.-Vol.) SDS/2% (Gew.-Vol.) Bromphenolblau und 20% (nach Volumen) Glycerol resuspendiert und 5 Minuten lang gekocht. 25 ul Proben wurden auf ein 14% Polyacrylamidgel aufgebracht. Nach Abschluß der Elektrophorese wurden die Proteine mit einem Sartoblot- Elektroblotting-Gerät (Sartorius) auf eine ProBlott-Membran (Applied Biosystems) übertragen, und zwar bei 0,8 mA/cm² 1 Stunde und 40 Minuten lang mit CAPS (3-[Cyclohexylamino]-1- propansulfonsäure)-Transferpuffer. Nach dem Transfer wurde die ProBlott-Membran 20 Sekunden lang gefärbt (0,1% (Gew.-Vol.) Coomassie-Blau R-250/40% (nach Volumen) Methanol/1% (nach Volumen) Essigsäure) und mit 50% (nach Volumen) Methanol entfärbt. Eine einem Mr-Protein von etwa 23.000 entsprechende Bande wurde exzidiert und die N-terminale Sequenz mit einer Blott-Patrone in einem Proteinsequenzierungsautomat 477A von Applied Biosystems ermittelt.
Es wurde gefunden, daß die Sequenz der ersten 20 Aminosäuren mit der vorhergesagten Sequenz übereinstimmte, mit der Ausnahme, daß der Rest 3 nicht von dem verwendeten Sequenzierungsprotokoll identifiziert werden konnte.

3. Beispiel Expression und Reinigung von SCR 1 + 2 + 3 von einem Fermentationsgefäß

(a) Fermentation von E. coli, die das Plasmid pDB1013-5-4 enthalten

In Flüssigstickstoff aufbewahrte E. coli BL21 (DE3): pDB1013-5-4 wurden durch Auftauen einer Ampulle mit 1 ml der Kultur wiedergewonnen und zum Inokulieren von 100 ml Impfmedium (NCYZM) verwendet, das 75 ug/ml Ampicillin enthielt. Die Primär- und Sekundär-Impffermentationen wurden in einfachen 500 ml Schüttelflaschen durchgeführt, die mit 100 ml Aliquoten NCYZM-Medium beladen waren. Die Bedingungen der Primär- und Sekundär-Impffermentationen waren wie folgt: 37ºC, 230 UPM in einem Rundschüttler mit einem 50 mm Hub. Die Primär- Impfinkubationszeit betrug 2 Stunden. Die Primärimpfkultur wurde zum Inokulieren des Sekundär-Impffermentationsmediums bei 0,1% (nach Volumen) verwendet. Das Sekundär-Impfgut wurde 14,5 Stunden lang inkubiert.
Zwei 15-Liter-Biolafitte-Fermenter wurden jeweils mit 10 Liter NCYZM-Medium und 0,01% (nach Volumen) Dow Corning DC1510 Antischaummittel beladen. Die Gefäße plus Medien wurden mit Dampf bei 121ºC 45 Minuten lang sterilisiert. Durch Mikrofiltration (0,2 um) sterilisiertes Ampicillin wurde aseptisch zu den Gefäßmedien auf eine Endkonzentration von 150 ul/ml gegeben. Die Fermenter wurden zu 3% (nach Volumen) mit zusammengefaßter Sekundärimpfkultur inokuliert. Die Bedingungen der Endphaseninkubation waren wie folgt: 37ºC, 400 UPM Rührer, Luftstrom 5 L/Min. (0,5 vvm). Bei den Endphasenfermentationen wurden vor der Inokulation Proben bei Stunde 0 und dann jede halbe Stunde genommen. Die Proben wurden auf Zunahmen der optischen Dichte (600 nm) hin überwacht. Als OD600 bei ≥ 0,5 lag, wurde IPTG zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen. Die Fermentationen wurden weitere 3 Stunden inkubiert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation mit 7000 g über einen Zeitraum von 25 Minuten wiedergewonnen. Der Gesamtzellenertrag (Feuchtgewicht) betrug 49,8 Gramm.

(b) Einschlußkörperisolierung

Einschlußkörper von 23 g (Feuchtgewicht) Zellenpellet wurden isoliert und im wesentlichen wie im 2. Beispiel beschrieben solubilisiert.

(c) Reinigung von denaturiertem SCR 1 + 2 + 3

Das Volumen des solubilisierten Einschlußkörpers aus Beispiel 3b betrug etwa 800 ml. In diese viskose Lösung wurde SP-Sepharose FF gegeben (100 ml Gelbett, mit Wasser gewaschen und sauggetrocknet). Das Gemisch wurde kräftig geschwenkt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur ruhen gelassen. Das Supernatant wurde dekantiert und bei -40ºC gelagert. Der verbleibende Schlamm wurde zu einer einheitlichen Suspension resuspendiert und in einen Glasmantel (ID 41,5 mm) gegossen und zu einem Festbett absetzen gelassen. Dieses Festbett wurde an ein Niederdruck-Chromatographiesystem bei 4ºC angeschlossen und mit 0,02 M Tris/8 M Harnstoff/0,05 M 2-Mercaptoethanol/0,001 M EDTA, pH 8,5, äquilibriert. Als A&sub2;&sub8;&sub0; des Eluats auf ein Minimum reduziert war, wurde der Puffer (schrittweise) in den Äquilibrierungspuffer geändert, der zusätzlich 1 M NaCl enthielt. Ein einzelner A&sub2;&sub8;&sub0; Peak wurde in einem Volumen von 90 ml (entspricht etwa 1 Vt) eluiert. Die Lösung war klar und farblos, und es wurde durch A&sub2;&sub8;&sub0;-Bestimmung einer puffergetauschten Probe (mit = 25.000) geschätzt, daß sie etwa 300 mg Zielprotein enthielt. SDS PAGE, gefolgt von Proteinfärbung ergab, daß das Zielprotein die hauptsächlich anwesende Bande war. Das 90 ml Produkt wurde bei -40ºC gelagert.

(d) Faltung und weitere Reinigung

18 ml des obigen Produktes (nominell 60 mg) wurden mit 12 ml 0,02 M Tris/8 M Harnstoff/1 M NaCl/0,05 M 2-Mercaptoethanol, pH 8,5, verdünnt. Das Produkt (30 ml) wurde unter Schwenken als 5 ml Aliquote in 1-Minuten-Intervallen in 930 ml frisch präpariertes, kaltes 0,02 M Ethanolamin/0,001 M EDTA gegeben und 1 Stunde lang bei 4ºC ruhen gelassen. Anschließend wurde reduziertes Glutathion zu 1 mM gegeben (durch Zugabe von 9,6 ml 0,1 M GSH), und oxidiertes Glutathion wurde zu 0,5 mM gegeben (durch Zugabe von 9,6 ml 0,05 M GSSG). Die Lösung war klar und wurde etwa 70 Stunden lang in Kälte ruhen gelassen. Die Lösung wurde dann mit einer YM10-Membran auf ein endgültiges Retentatvolumen von etwa 10 ml ultrafiltriert; dieses Retentat war wolkig. Es wurde mit 90 ml 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;/1 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, pH 7,0, (Puffer A) bei Raumtemperatur vermischt und dann bei 4000 UPM 20 Minuten lang zentrifugiert. Das Supernatant wurde dekantiert und SCR1+2+3-Protein durch Chromatographie des Supernatanten auf Butyl Toyopearl 650 S isoliert.
Die Butyl-Toyopearl-Säule (Vt ~ 12 ml) wurde mit Puffer A äquilibriert. Das 100 ml Supernatant wurde auf die Säule aufgebracht und die Säule mit Puffer A gewaschen. Anschließend wurde sie mit einem linearen Gradienten von 100% Puffer A bis 100% 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0, entwickelt. Die gesamte Chromatographie fand bei Raumtemperatur bei etwa 30 cmh&supmin;¹ statt.
Ein A&sub2;&sub8;&sub0;-Hauptpeak wurde während des Gradienten eluiert. Sich über den Peak erstreckende Fraktionen wurden per SDS PAGE, gefolgt von Proteinfärbung analysiert. Die am stärksten konzentrierten Fraktionen des Peak enthielten im wesentlichen reines SCR 1 + 2 + 3 und waren im hämolytischen Assay aktiv (Verfahren (xvi)) · (IH&sub5;&sub0; - 0,3 ug/ml). Sie wurden bei -40ºC gelagert.

4. Beispiel Formulierung von Butyl-Toyopearl-gereinigtem SCR 1 + 2 + 3

Chargen von SCR 1 + 2 + 3, die ähnlich wie in den Beispielen 2 und 3 beschriebene Chargen ausgeprägt, gefaltet und gereinigt und ferner durch Ammoniumsulfatbehandlung und Butyl-Toyopearl- Chromatographie im wesentlichen wie in Beispiel 3d beschrieben gereinigt worden waren, wurden wie folgt zu einem nützlichen Produkt formuliert.
Drei solcher Butyl-Toyopearl-Produkte wurden zusammengefaßt, um ein Volumen von etwa 31 ml zu erhalten. Die gesamten 31 ml wurden in 0,05 M Ameisensäure (mit 0,2 um gefiltertem 'MilliQ'-Wasser präpariert) unter Verwendung einer Sephadex-G25-Säule puffergetauscht. Die gesamte Chromatographie fand bei 50 cmh&supmin;¹ bei 4ºC statt. Das Eluat von der Säule wurde bei 280 nm überwacht, und die Vo-Fraktion wurde als einzelne Fraktion gesammelt. Der Großteil dieser Fraktion wurde in Aliquoten lyophilisiert.
Eine Analyse des Vo-Pools vor der Lyophilisation durch SDS PAGE/Färbung und C8-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen ergab, daß es sich im wesentlichen um reines Zielprotein handelte. Der Pool demonstrierte antihämolytische Aktivität (IN&sub5;&sub0; etwa 0,3 ug/ml), und der Endotoxingehalt war gering (< 1ng/mg).
Es wurde gezeigt, daß eine der lyophilisierten Aliquoten bei 10 mg ml&supmin;¹ in phosphatgepufferter Kochsalzlösung löslich war und komplementhemmende Aktivität im hämolytischen Assay zeigte (Verfahren xvi); IH50 betrug 0,3 ug/ml.
Es wurde eine weitere der lyophilisierten Aliquoten untersucht, um das. Disulfidbrückenmuster zu bestimmen. Es wurden alle sechs korrekten Disulfide (wie auf der Basis eines Konsensus-SCR-Motivs vorhergesagt) nachgewiesen.

5. Beispiel Effekt von SCR 1 + 2 + 3 auf IgG-bewirkte klassische Aktivierung des Komplementsystems, gemessen durch C3a- Freisetzung

Eine Inhibition von wärmeaggregiertem IgG-aktiviertem Serum wurde wie im Verfahren (xvii) beschrieben durchgeführt. Wärmeaggregiertes IgG aktiviert das Komplementsystem auf dem klassischen Weg. Verschiedene Inhibitorkonzentrationen (typisch 4-1000 ug/ml) wurden mit Serum in Anwesenheit von wärmeaggregiertem IgG inkubiert, und es wurde die prozentuale Aktivierungsinhibition bei jeder Konzentration bestimmt. Der IC50 von SCR 1 + 2 + 3 wurde mit etwa 22 ug/ml bestimmt, was darauf hinwies, daß SCR 1 + 2 + 3 das Komplementsystem auf klassische Weise inhibieren kann.

6. Beispiel Effekt von SCR 1 + 2 + 3 auf Zymosan-A-bewirkte alternative Aktivierung des Komplementsystems, gemessen anhand der folgenden C3a-Freisetzung

Eine Inhibition von Zymosan-A-aktiviertem Serum wurde wie im Verfahren (xvii) beschrieben durchgeführt. Verschiedene Konzentrationen von SCR 1 + 2 + 3 (gewöhnlich zwischen 1 und 1000 ug/ml) wurden mit Serum in Anwesenheit von Zymosan A inkubiert, und es wurde die prozentuale Aktivierungsinhibition bei jeder Konzentration bestimmt. Mehrere verschiedene Experimente ergaben ein IC50 von 20 bis 40 ug/ml, was darauf hinwies, daß SCR 1 + 2 + 3 das Komplementsystem auf dem alternativen Weg inhibieren kann.

7. Beispiel Effekt von SCR 1 + 2 + 3 auf Zymosan-A-bewirkte alternative Aktivierung des Komplementsystems, gemessen anhand C5a-Freisetzung

Eine Inhibition von Zymosan-A-aktiviertem Serum wurde wie im Verfahren (xvii) beschrieben durchgeführt und wie im Verfahren (xviii) beschrieben untersucht. Verschiedene Konzentrationen von SCR 1 + 2 + 3 (gewöhnlich zwischen 4 und 700 ug/ml) wurden mit Serum in Anwesenheit von Zymosan A inkubiert, und es wurde die prozentuale Aktivierungsinhibition bei jeder Konzentration bestimmt. Aus mehreren verschiedenen Experimenten ging ein IC50 von etwa 20 bis 30 ug/ml hervor, was darauf hinwies, daß SCR 1 + 2 + 3 das Komplementsystem auf dem alternativen Weg inhibieren kann.

8. Beispiel Bestimmung des Endotoxingehalts von gereinigtem, gefaltetem und formuliertem SCR 1 + 2 + 3

Eine Charge des Endproduktes SCR 1 + 2 + 3 wurde im wesentlichen wie im 4. Beispiel oben beschrieben präpariert, und es wurde der Endotoxingehalt mit einem Verfahren auf der Basis der Gelgerinnungsreaktion von Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) (Atlas Bioscan Ltd.) gemessen. Die Sensibilität der Untersuchung lag bei 0,125 EU/ml, und dies wurde durch Titration mit einer Verdopplungsverdünnungsserie überprüft, präpariert von standardmäßigem E. coli Endotoxin, das im LAL- Kit enthalten war.
10fache Verdünnungen von ~ 1,3 mg/ml SCR-1+2+3-Proteinstamm wurden viermal hinsichtlich ihres Effektes auf LAL getestet, indem 10 ul Probe in 10 ul LAL gegeben wurden. Nach 1 Stunde bei 37ºC wurde getestet, ob die Gemische verklumpten oder flüssig blieben. (Lösungen, die wenigstens 0,125 EU Endotoxin enthalten, lassen diese LAL-Präparation verklumpen). Unter Berücksichtigung der Ergebnisse simultan durchgeführter Interferenztests wurde davon ausgegangen, daß der Endotoxingehalt der SCR-1+2+3-Proteinpräparation < 12,5 EU/ml betrug, was etwa < 1 ng/mg Protein entspricht.

9. Beispiel Expression, Faltung, Reinigung und Formulierung von MR122 -> K196 von CR-1 (SCR3) Allgemeines

Die Sequenz für SCR 3, die Aminosäure 122 entspricht und bei Aminosäure 196 von reifem Humankomplementrezeptor 1 endet, wurde so konstruiert, daß das 5' Ende des Gens einen NdeI Restriktionsendonucleaseort enthielt. Dieser Ort umfaßt ein ATG-Startcodon, um das initiierende Methionin zu liefern, das für den Start der mRNA-Translation benötigt wird, und ermöglicht eine Plazierung des Gens in einer optimalen Entfernung vom Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungsort von pBROC413. Diesem Codon folgt unmittelbar die Genkodierung für SCR3, die mit Arginin 122 von reifem Humankomplementrezeptor 1 beginnt. Das 3' Ende des Gens endet mit einem Codon für Lysin 196, gefolgt von zwei Stoppcodonen, gefolgt von einem HindIII Ort.
Die DNA-Kodierung für SCR3 wurde im Hinblick auf eine optimale Codonnutzung in E. coli, wie in den Verfahren beschrieben, modifiziert. Das Gen wurde auch dahingehend geändert, daß es einmalige Restriktionsendonucleaseorte beinhaltet. Dies fand in der folgenden Art und Weise statt. Es wurden Restriktionsendonucleasen identifiziert, die pBROC413 nicht zerschneiden und die im Handel erhältlich waren. Die DNA- Sequenz dieser Restriktionsendonucleaseorte wurde dann in alle drei Leseraster translatiert, und die Codonnutzung wurde untersucht. Orte, die Codone enthielten, die selten von E. coli benutzt werden, wurden verworfen. Die restlichen Orte wurden hinsichtlich ihrer translatierten Sequenz untersucht; wenn diese Sequenz mit SCR3 übereinstimmte, dann wurde der Restriktionsort in die Sequenz eingebaut.

(a) Konstruktion von Plasmid pBROC435, das SCR3 kodiert

Die Konstruktion von pBROC435 ist im Beispiel 2a beschrieben.

(b) Expression von SCR3 von pBROC435

pBROC435 wurde durch Elektroporation in E. coli BL21 (DE3) transformiert, und die resultierenden Kolonien wurden durch Restriktionsabbau von Mini-Plasmid-DNA-Präparationen analysiert. Einzelne Kolonien wurden in Universalbehälter mit 10 ml L-Nährlösung oder NCYZM-Medium und 50-75 ug/ml Ampicillin inokuliert und über Nacht bei 37ºC, 220 UPM, vermehren gelassen. Typischerweise wurden 4 ml Übernacht-Kulturen zum Inokulieren von jeweils 2-L-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 500 ml NCYZM- Medium, 150 ug/ml Ampicillin enthielten; Kulturen wurden bei. 37ºC, 230 UPM, vermehrt, bis A&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 Absorbanzeinheiten betrug. Kulturen wurden mit 1 mM IPTG induziert und weitere 3 Stunden unter den gleichen Bedingungen vermehren gelassen. Die Kulturen wurden zentrifugiert (etwa 8000 g/10 Min.), und das Supernatant wurde entsorgt. Die Zellenpellets wurden bei -40ºC gelagert.

(c) Isolierung von solubilisierten Einschlußkörpern

Das in Beispiel 9b beschriebene gefrorene Zellenpellet von E. coli (von 31 Wachstumskulturen in NCYZM) wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang auftauen gelassen und dann in 50 mM Tris/50 mM NaCl/1 mM EDTA/0,1 mM PMSF, pH 8,0, (90 ml) resuspendiert. Die Suspension wurde in ein 200 ml Becherglas gegeben und beschallt (Heat Systems - Ultrasonics W380; 70 Watt, 50 · 50% Impuls, Impulsdauer = 5 Sek.). Das Beschallungsprodukt wurde sofort zentrifugiert (6000 g/4ºC/10 Min.) und das Supernatant entsorgt. Das die Einschlußkörper enthaltende Pellet wurde in 20 mM Tris/8 M Harnstoff/50 mM 2- Mercaptoethanol/1 mM EDTA/0,1 mM PMSF, pH 8,5, (300 ml) resuspendiert, unter leichtem Pipettieren zum Vermischen. Nach dem Mischen ließ man die Lösung bei Raumtemperatur (etwa 23ºC) 1 Stunde lang ruhen. Die resultierende Lösung wurde zentrifugiert (2000 g bei 4ºC, 10 Min.), um Material zu entfernen, das nicht solubilisiert wurde. Das Supernatant dieser Schleuderung wurde bei -40ºC als das solubilisierte Einschlußkörperprodukt aufbewahrt.

(d) Reinigung von SCR3 vom solubilisierten Einschlußkörper

Eine Q-Sepharose-Fast-Flow-Säule (Pharmacia) (ID 32 mm; Höhe 32 mm) wurde präpariert und mit 20 mM Tris/8 M Harnstoff/50 mM 2-Mercaptoethanol, pH 9,0, äquilibriert. 200 ml aufgetauter, solubilisierter Einschlußkörper, präpariert wie im Beispiel 9c, wurde auf die Säule aufgebracht und mit Äquilibrierungspuffer durchgewaschen. Die Säule wurde an ein FPLC-System angeschlossen und über einen Stufengradienten von 0,1, 1,0, 2,0 M NaCl (auch in Äquilibrierungspuffer) entwickelt. Die gesamte Chromatographie fand bei 2,0 ml min&supmin;¹ und bei Raumtemperatur statt.
Eine Analyse per SDS PAGE/Proteinfärbung der während der Chromatographie gesammelten Fraktionen ergab, daß sich fast das gesamte SCR3 nicht an die Säule band. Viele andere Proteine waren jedoch von der Säule absorbiert und von den 0,1 M und 1 M NaCl-haltigen Puffern dissoziiert. Die Reinheit von SCR3 in der unadsorbierten Fraktion lag schätzungsweise bei etwa 80%.

(e) Faltung von SCR3

Q-Sepharose-gereinigtes SCR3, wie im Beispiel 9d beschrieben gereinigt und bei -40ºC gelagert, wurde aufgetaut und durch eine Serie von Verdünnungen mit kaltem Verdünnungsmittel gefaltet. Bei t = 0 wurden 100 ml 20 mM Tris/1 M Harnstoff/5 mM EDTA/3 mM 2-Mercaptoethanol, pH 8,0 (Verdünnungsmittel) in 100 ml SCR3 gegeben. In diesem Stadium sah die Lösung trüb aus. Die Lösung wurde durch sanftes Schwenken gründlich vermischt und abgedeckt in einem kalten Raum (2-3ºC) ruhen gelassen. Bei 1 h wurden 200 ml Verdünnungsmittel zugegeben und vermischt, Endvolumen = 400 ml. Nach 2 Stunden wurden 400 ml Verdünnungsmittel zugegeben und vermischt, Endvolumen = 800 ml. Nach 4 Stunden wurden 800 ml Verdünnungsmittel zugegeben und vermischt, Endvolumen = 1,6 L. Die Lösung wurde weitere 20 Stunden im kalten Raum stehen gelassen. Die Lösung sah nun klar aus und wurde in Aliquoten bei -40ºC gelagert.

(f) Formulierung von SCR3

50 ml SCR3, wie im Beispiel 9e präpariert, wurden aufgetaut und mit einer abgeschnittenen 2000-Da-Membran (Amicon) auf. 3,5 ml ultrafiltriert. 2,5 ml des Konzentrats wurden mit Sephadex G25 (PD 10) in 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; (3,0 ml) puffergetauscht. Eine anschließende Analyse des Proteingehalts mit dem molaren Extinktionskoeffizienten 11.000 ergab, daß diese Probe etwa 0,24 mg/ml enthielt.
Eine Analyse dieses Materials per SDS PAGE/Proteinfärbung ergab, daß das Protein zu etwa 80% rein war. Mit 2- Mercaptoethanol reduzierte Proben hatten eine geringere elektrophoretische Beweglichkeit, was auf die Anwesenheit von Disulfidbindungen in SCR3 schließen ließ.
Eine Analyse dieser Probe im hämolytischen Assay (Verfahren (xvi)) ergab, daß sie einen IH50 von etwa 10 bis 20 ug/ml hatte.

(g) Bestimmung der N-terminalen Sequenz von ausgeprägtem SCR3

200 ul SCR3, präpariert und formuliert in 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; wie im Beispiel 9f beschrieben, wurden 60 Minuten lang mit 800 ul kaltem Aceton in einem Cardice[*5]/Ethanolbad präzipitiert. Die Probe wurde anschließend in einer Eppendorf-Zentrifuge (etwa 10.000 g/20 Min.) geschleudert, und das resultierende Pellet wurde unter Erhitzen in Probenpuffer mit 5% (nach Volumen) 2- Mercaptoethanol resuspendiert. 30 ul Proben wurden in einem 4 bis 20% SDS-haltigen Polyacrylamid-Gradientengel der Elektrophorese unterworfen. Nach Abschluß der Elektrophorese wurden die Proteine zu einer ProBlott-Membran (Applied Biosystems) mit einem Elektroblottinggerät bei 200 mA 2 Stunden lang unter Verwendung von CAPS in 10% Methanol/90% H&sub2;O (nach Volumen) Transferpuffer übertragen. Nach dem Transfer wurde die ProBlott-Membran nach Herstelleranweisungen gefärbt (0,1% (Gew.-Vol.) Coomassie-Blau), entfärbt, gespült und luftgetrocknet. Abschnitte der Membran wurden exzidiert und für die N-Terminal-Sequenzierung verwendet.
Die Sequenz der ersten 20 Aminosäuren der Hauptbande entsprach den Erwartungen für SCR3, mit Ausnahme von Rest 5, der nicht identifiziert werden konnte.

(h) Präparation, Faltung und Formulierung von SCR3

Präparation und Faltung wurden genau wie in den Beispielen 9a-9e beschrieben durchgeführt. 400 ml gefaltetes SCR3 wurden durch einen abgeschnittenen 30-KDa-Filter (Amicon) bei 4ºC ultrafiltriert. Proben des Ultrafiltrats wurden auf zwei Weisen verarbeitet.
1. 50 ml wurden mit einer abgeschnittenen 2-KDA-Membran auf ein Endvolumen von 3,5 ml ultrafiltriert und mit Sephadex- G25(PD10)-Säulen in 0,05 M Ameisensäure (6,7 ml) puffergetauscht. Die anhand der Absorbanz bei 280 nm geschätzte Gesamtmenge von SCR3 betrug 0,6 mg. Eine Analyse per SDS PAGE/Proteinfärbung ergab, daß das Protein eine Reinheit von etwa 95% aufwies. Die Probe wurde gefriergetrocknet und bei - 40ºC gelagert.
2. 100 ml des Ultrafiltrats wurden mit HCl auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt. Die Probe wurde auf eine Mono-S-Säule (1 ml) bei 1,5 ml min-1 aufgebracht und mit Äquilibrierungspuffer (20 mM Tris.HCl pH 5,5) durchgewaschen. Anschließend wurde die Säule mit einem Stufengradienten von 0,1, 1,0 und 2,0 M NaCl (auch in Äquilibrierungspuffer) entwickelt. Die gesamte restliche Chromatographie fand bei 1,0 ml min&supmin;¹ und bei Raumtemperatur statt.
Eine Analyse per SDS PAGE/Proteinfärbung der während der Chromatographie gesammelten Fraktionen ergab, daß die bei 1 M NaCl dissoziierte Hauptbande SCR3 mit einer Reinheit von etwa 95% enthielt.

10. Beispiel Expression, Faltung, Reinigung und Formulierung von MR122-5253 von CR-1 (SCR 3 + 4)

(a) Konstruktion von Plasmid pDB1019, das SCR 3 + 4 kodiert

Die DNA-Kodierung für SCR 3 + 4 wurde von den Plasmiden pBROC435 (2. Beispiel) und pDB1018-1 (11. Beispiel) konstruiert, die jeweils die Genkodierung für SCR3 und SCR 1 + 2 + 3 tragen. Die SCR4-Kodierungseinheit wurde von pDB1018-1 exzidiert und mit dem Ende der SCR3-Kodierungseinheit in pBROC435 ligiert.
pDB1018-1 wurde mit SpeI und HindIII abgebaut und auf einem 1% Agarosegel separiert. Die SCR4 (- 245 bp) kodierende Bande wurde von dem Gel exzidiert und mit dem QIAEX- Extraktionskit gereinigt. Plasmid pBROC435 wurde auch mit SpeI und HindIII zerschnitten, auf 1% Agarose separiert, von der Agarose exzidiert und mit dem QIAEX-Kit gereinigt. Die SCR 4 kodierende DNA wurde dann mit dem zerschnittenen pBROC435 Plasmid ligiert, um pDB1019 zu erhalten. Diese DNA wurde zum Transformieren von E. coli HB101, mit CaCl&sub2; kompetent gemacht, verwendet. Die Transformanten wurden durch Restriktionsanalyse mit EcoRI und HindIII analysiert. Klone, die das Insert mit korrekter Größe trugen, wurden für Expressionsstudien verwendet.

(b) Expression von SCR 3 + 4 von pDB1019-1C

pDB1019 wurde in E. coli BL21(DE3), mit CaCl&sub2; kompetent gemacht, transformiert, und die resultierenden Kolonien wurden durch Restriktionsabbau von Mini-Plasmid-DNA-Präparationen analysiert. Es wurde gefunden, daß Plasmid pDB1019-1C das Insert mit korrekter Größe trug. Einzelne Kolonien von E. coli BL21 (DE3), die pDB1019-1C trugen, wurden in zehn Universalbehälter mit 10 ml NCYZM-Medium und 75 ug/ml Ampicillin inokuliert und über Nacht bei 37ºC, 240 UPM vermehren gelassen. Die Übernacht-Kulturen wurden dann zum Inokulieren von acht 2-L-Erlenmeyer-Kolben (5 ml/Kolben) verwendet, die 500 ml NCYZM-Medium, 150 ug/ml Ampicillin enthielten. Kulturen wurden bei 37ºC, 240 UPM, vermehrt, bis A&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 Absorbanzeinheiten betrug. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen mit 1 mM IPTG induziert und weitere 3 Stunden unter den gleichen Bedingungen vermehren gelassen. Die Kulturen wurden zentrifugiert (etwa 8000 g/10 Min.) und die Supernatanten entsorgt. Die Zellpellets wurden bei -40ºC gelagert.

(c) Isolierung, Reinigung, Faltung und Formulierung von SCR 3 + 4

Die angewendeten Verfahren entsprechen im allgemeinen den zuvor zur Präparation von SCR 1 + 2 + 3 beschriebenen Verfahren.
Die Isolierung von solubilisierten Einschlußkörpern von Zellenpellet, das von einer 2-L-Kultur stammte, wurde wie im Beispiel 2c beschrieben durchgeführt. Das Volumen des Solubilisats betrug 200 ml.
Einige der kontaminierenden (Wirt) E. coli Proteine wurden aus der Präparation durch Adsorption auf S-Sepharose entfernt, und zwar entweder in einem diskontinuierlichen Verfahren oder durch Säulenchromatographie, unter Verwendung von Systemen, die den in Beispiel 2d beschriebenen ähnlich sind. Per SDS PAGE/Färbung wurde festgestellt, daß das in den nicht adsorbierten Fraktionen anwesende Protein bedeutende Mengen an SCR-3+4-Protein enthielt. Etwa die Hälfte dieser Fraktionen wurden mit einer YM1-Membran (Amicon) auf etwa 35 bis 40 ml ultrafiltriert. Dieses Retentat enthielt schätzungsweise etwa 0,3 mg Protein/ml (auf der Basis einer A&sub2;&sub8;&sub0;-Bestimmung einer puffergetauschten Probe, mit = 21.000). 10,5 ml des Retentats wurden mit 325 ml kaltem 20 mM Ethanolamin vermischt und bei 4ºC 1 Stunde lang ruhen gelassen. Anschließend wurde reduziertes Glutathion zu 1 mM gegeben (durch die Zugabe von 3,4-ml 100 mM GSH) und oxidiertes Glutathion wurde zu 0,5 mM gegeben (durch die Zugabe von 3,4 ml 50 mM GSSG). Die Lösung wurde vermischt und bei 4ºC etwa 72 Stunden ruhen gelassen. Die Lösung war klar. Die Lösung wurde dann mit einer YM1-Membran auf ein Retentat von 5 ml ultrafiltriert. Das Retentat wurde zweigeteilt und mit Sephadex-G25(PD10-Säulen) in 20 mM Ethanolamin oder 50 mM Ameisensäure puffergetauscht.
Eine Analyse des Ameisensäure-SCR3+4-Produktes durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen und SDS PAGE, gefolgt von Proteinfärbung, ergab nur eine Hauptproteinspezies (> 90% rein). Die Proteinkonzentration lag unter Anwendung von A&sub2;&sub8;&sub0;-Bestimmungen schätzungsweise bei 0,3 mg/ml. Das Produkt war im hämolytischen Assay (Verfahren (xvi)) aktiv; der IH50-Wert betrug etwa 30 u/ml.

11. Beispiel Konstruktion, Expression, Faltung, Reinigung und Formulierung von MQ1-S253 von CR-1 (SCR 1 + 2 + 3 + 4) Allgemeines

Es wurden zwei Konstrukte präpariert, indem ein Plasmid, das SCR 1 + 2 kodierte, hergestellt, SCR3 eingebaut und schließlich SCR4 hinzugefügt wurde. Die beiden Konstrukte kodierten Konsensus SCR1 bis 4 und die R235H-Mutation von SCR1 bis 4 (12. Beispiel).
Ein Plasmid mit der SCR1+2+3+4-Kodierungseinheit wurde konstruiert, indem die SCR4-kodierende DNA zur Konstruktkodierung für SCR 1 + 2 + 3 (2. Beispiel) hinzugefügt wurde. Für eine praktischere DNA-Manipulation wurde die SCR4- DNA-Kodierungseinheit durch Synthetisieren der DNA hergestellt, die die letzten 17 Aminosäuren von SCR3 kodiert, gefolgt von der DNA-Kodierung für die Linker-Region, gefolgt von SCR4. Diese DNA begann beim SpeI Ort des SCR-1+2+3- Kodierungskonstrukts, der T175 von reifem CR-1 entspricht, gefolgt von der DNA-Kodierung für die Linker-Region, gefolgt, von SCR4, die auf dem S253 entsprechenden Codon endet, gefolgt von zwei Stoppcodonen und einem HindIII Ort. Wie bei den vorherigen Konstrukten wurde die SCR4 kodierende DNA hinsichtlich optimierter Codonnutzung und Restriktionsorte, wie zuvor im 1. Beispiel beschrieben, verändert. Diese DNA-Einheit wurde mit der Plasmidkodierung für SCR 1 + 2 + 3 ligiert, die mit SpeI und HindIII zerschnitten worden war, um eine Konstruktkodierung für SCR 1 + 2 + 3 + 4 zu erhalten.

(a) Konstruktion von Plasmid pDB1018, das SCR 1 + 2 + 3 + 4 kodiert

Oligonucleotide (Tabelle 1; Oligos 21-26, die SCR 4 kodieren) wurden als 3 komplementäre Paare von 68-90meren synthetisiert, die auf einmalige Weise über komplementäre 8-bp- Überhänge zwischen den Oligonucleotidpaaren ligiert werden konnten. Die 3 komplementären Oligonucleotidpaare wurden als Paar E (Oligos 21, 22), Paar F (Oligos 23, 24) und Paar G (Oligos 25, 26) bezeichnet. Paar E, das dem 5 Ende des Gens entspricht, enthielt einen SpeI Restriktionsortüberhang, und Paar G enthielt einen Hind III Restriktionsortüberhang am 3' Ende. Alle Oligonucleotide, mit Ausnahme von 22 und 24, wurden per Elektrophorese durch ein denaturierendes Polyacrylamidgel gereinigt, gefolgt von einer Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen (C&sub1;&sub8;). Die Oligonucleotide 22, 23, 24 und 25 wurden kinasebehandelt, bevor sie mit ihren komplementären Oligonucleotiden reassoziiert wurden. Die Oligonucleotide wurde wie folgt ligiert: Paar E mit Paar F mit Paar G, um die Genkodierung für einen Teil von SCR3 und die gesamte SCR4 zu bilden, die aus praktischen Gründen nachstehend als SCR4-Gen bezeichnet wird.
Die DNA-Kodierung für SCR4 wurde zunächst durch PCR mit zwei Oligonucleotiden (Tabelle 1; Oligos 17 und 18) amplifiziert, die zu den beiden DNA-Strängen komplementär sind. Beide Oligonucleotide enthielten nicht abgeglichene 5' Enden, die 6 bp einer Zufallssequenz enthielten, gefolgt von, der Sequenz von SpeI (Oligo 17) oder Hind III (Oligo 18) Restriktionsorten, gefolgt von 18 bp, komplementär zu dem Gen. Nach der PCR wurde eine Bande von etwa 250 bp mit horizontaler Agarose-Gelelektroporese sichtbar gemacht, die exzidiert und auf DEAE NA45 Membranen gereinigt wurde. Diese DNA wurde für eine zweite PCR-Amplifizierung unter Verwendung von ineinandergeschachtelten Primern verwendet, die an ihren 5' Enden um vier Nucleotide einwärts verschoben waren (Tabelle 1; Oligo 19, Oligo 20). Diese Oligos beinhalteten die SpeI und HindIII Restriktionsorte, wiesen aber nun nur 2 Nucleotide hinter dem Ende jedes Restriktionsortes auf. Nach der PCR wurde eine Bande von etwa 250 bp mit horizontaler Agarose- Gelelektrophorese sichtbar gemacht. Diese Bande wurde exzidiert und mit dem QIAEX-Agarose-Gelextraktionskit gereinigt.
Die DNA für SCR4 wurde nach einer Kinasebehandlung mit sich selbst am Blunt-Ende ligiert. Die gebildeten Multimere wurden durch horizontale Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht und die Banden exzidiert und mit dem QIAEX-Agarose- Gelextraktionskit gereinigt. Die DNA wurde dann mit Spe I und Hind III zerschnitten und mit pDB1013-5-4 ligiert, der mit den gleichen Enzymen zerschnitten worden war, um pDB1018 (Fig. 3) zu produzieren. Der Vektor wurde in E. coli HB101, mit Calciumchlorid kompetent gemacht, transformiert. Es wurden Mini-Plasmid-Präparationen durchgeführt, und Plasmid-DNA wurde durch einen Abbau mit Nde I, Hind III, Stu I, Spe I und Kpn I analysiert. Die Plasmide mit den korrekten Restriktionskarten wurden durch DNA-Sequenzierung beider Stränge über das Gen analysiert, das SCR4 kodiert. Zwei Plasmide wurden für eine weitere Studie ausgewählt. pDB1018-1, das MQ1-S253 (Konsensus SCR1 bis 4) kodierte, und pDB1018-6, das die R235H-Mutante von MQ1-S253 kodierte. Die Aminosäuresequenzen der beiden durch pDB1018-1 und pDB1018-6 kodierten Polypeptide sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Davon ausgehend, daß der erste Rest das A des ATG- Initiationscodons ist, zeigte die DNA-Sequenzierung, daß Rest 600 von pDB1018-6 von G -> A verändert worden war. Dies ist eine stille Mutation, die die Aminosäure in dieser Position nicht verändert.

(b) Expression von MQ1-S253 von pDB1018-1

pDB1018-1, konstruiert wie in Beispiel 11a beschrieben, wurde in calciumchloridkompetente E. coli BL21 (DE3) transformiert. Einzelne Kolonien wurden in Universalbehälter mit 10 ml NZCYM-Medium und 75 ug/ml Ampicillin inokuliert und über Nacht bei 37ºC, 230 UPM vermehren gelassen. 3 ml Übernacht- Kultur wurden zum Inokulieren von jeweils 8 2-Liter-Erlenmeyer- Kolben verwendet, die 500 ml NZCYM-Medium, 150 ug/ml Ampicillin enthielten Kulturen wurden bei 37ºC, 230 UPM, vermehrt, bis A&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 Absorbanzeinheiten erreichte. Die Kulturen wurden mit 1 mM IPTG induziert und weitere 3 Stunden unter den gleichen Bedingungen vermehren gelassen. Die Kulturen wurden zentrifugiert (etwa 7000 g/10 Min./4ºC) und die Supernatanten entsorgt. Die Zellenpellets wurden bei -40ºC gelagert.

(c) Isolierung von solubilisierten Einschlußkörpern

Die gefrorenen Zellenpellets von E. coli BL21 (DE3) (pDB1018-1), die jeweils 1 Liter Kultur entsprachen, die wie in Beispiel 11b beschrieben präpariert wurde, wurden bei 0-4ºC 2 Stunden lang auftauen gelassen. Die Pellets wurden in 50 mM Tris/50 mM NaCl/1mM EDTA/0,1 mM PMSF pH 8,0 resuspendiert; 30 ml für jedes Liter Pellet. Die einzelnen Suspensionen wurden in ein 100 ml Becherglas gegeben und beschallt (Heat Systmes - Ultrasonics W380; 70 Watt, 50 · 50% Impuls, Impulsdauer = 5 Sekunden). Die Beschallungsprodukte wurden zusammengefaßt und sofort zentrifugiert (6.000 g/4ºC/10 Min.), und das Supernatant wurde entsorgt. Das die Einschlußkörper enthaltende Pellet wurde in 20 mM Tris/8 M Harnstoff/50 mM 2-Mercaptoethanol/1 mM EDTA/0,1 mM PMSF, pH 8,5, (400 ml) resuspendiert, gründlich vermischt und bei Raumtemperatur (etwa 23ºC) 1 Stunde lang ruhen gelassen.

(d) Reinigung von MQ1-S253 vom solubilisierten Einschlußkörper

30 ml S-Sepharose FF, die mit daionisiertem Wasser gewaschen und sauggetrocknet worden war, wurde in die in Beispiel 11c beschriebene Einschlußkörperlösung gegeben und 30 Sekunden lang kräftig geschüttelt. Das S-Sepharose-Gemisch wurde bei Raumtemperatur (23ºC) 1,5 Stunden lang ruhen gelassen, anschließend wurde das Supernatant entsorgt. Der restliche Schlamm wurde in eine Säule (ID 4,1 cm) gepackt. Die Säule wurde mit 20 mM Tris/8 M Harnstoff/50 mM 2-Mercaptoethanol/1 mM EDTA/0,1 mM PMSF, pH 8,5, bei 60 cm&supmin;¹, 4ºC äguilibriert. MQ1- S253-Protein wurde mit Äquilibrierungspuffer mit 1 M NaCl eluiert. Eine Analyse per SDS PAGE/Proteinfärbung der während der Chromatographie gesammelten Fraktionen ergab, daß praktisch das gesamte Zielprotein an der Säule adsorbiert und durch die 1 M NaCl Waschung dissoziiert worden war. Die entsprechende Fraktion wurde bei -4ºC gelagert.

(e) Faltung und Formulierung

Auf der Basis eines molaren Extinktionskoeffizienten von 25.000 und in 50 mM Ameisensäure bestimmten A&sub2;&sub8;&sub0;-Werten wurden 60 mg des S-Sepharose-gereinigten, ungefalteten Proteins, das in Beispiel 11d beschrieben wird, wie folgt gefaltet und formuliert:
8,0 ml Lösung (äquivalent zu 60 mg Protein) wurden mit 22 ml kaltem 20 mM Tris/8 M Harnstoff/50 mM 2-Mercaptoethanol/1 M NaCl/1 mM EDTA/0,1 mM PMSF, pH 8,5 verdünnt, um 30 ml einer 2,0 mg/ml Lösung zu erhalten. Die 30 ml wurden rasch unter konstantem Rühren in 930 ml kaltem (0-4ºC), frisch präpariertem 20 mM Ethanolamin verdünnt. Die Lösung wurde bei 0-4ºC 1 Stunde lang ruhen gelassen. Reduziertes Glutathion wurde zu 1 mM gegeben (durch Zugabe von 9,6 ml 100 mM Stamm) und anschließend wurde oxidiertes Glutathion zu 0,5 mM gegeben (durch Zugabe von 9,6 ml von 50 mM Stamm). Die Lösung wurde bei 0-4ºC weitere 48 Stunden ruhen gelassen und dann mit einer Rührzelle (Amicon) und einer YM10-Membran (Amicon, nominell 10.000 Da relative Molekülmasse, abgeschnitten) auf etwa 29 ml ultrafiltriert. Das ultrafiltrierte Retentat wurde in 50 mM Ameisensäure mit Sephadex G25 (ID 26 mm; Höhe 245 mm, Vt 123 ml) und einer Fließgeschwindigkeit von 50 cmh&supmin;¹ auf ein Endvolumen von 40 ml puffergetauscht. Mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 25.000 für das Protein wurden 51 mg Protein wiedergewonnen. Das gereinigte Protein erbrachte einen IH&sub5;&sub0;-Wert (siehe Verfahren xvi) von etwa 2 ug/ml.

(f) Weitere Reinigung und Formulierung von SCR 1 + 2 + 3 + 4

Gefaltetes SCR 1 + 2 + 3 + 4 (nominell 25 mg) in 50 mM Ameisensäure, im wesentlichen wie in Beispiel 11e beschrieben präpariert, wurde lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in 20 mM Ethanolamin (10 ml) resolubilisiert, um eine wolkige Lösung zu erzeugen. Die 10 ml wurden dann in 90 ml 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;/1 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, pH 7,0 gegeben, gründlich vermischt und dann durch Zentrifugation (4000 UPM/20 Min.) geklärt. Das Supernatant (100 ml) wurde dekantiert und auf Butyl Toyopearl (genau wie für SCR 1 + 2 + 3 in Beispiel 3d beschrieben) chromatographiert. Die Peak- A&sub2;&sub8;&sub0;-Fraktionen, die bei etwa 100% des 1 M NaCl-haltigen Puffers eluierten, wurden zusammengefaßt und mit Sephadex G25 in 50 mY Ameisensäure puffergetauscht. Der Vo-Pool (29,5 ml) wurde in Aliquoten lyophilisiert.
Die Reinheit des Proteins wurde mit SDS PAGE, nach Proteinfärbung und C8 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen beurteilt; das Protein wurde mit einer Reinheit von > 95% angesetzt. Eine der lyophilisierten Aliquoten wurde zu 4 mg Prote in/ml in 0,1 M Hepes/ 0,15 M NaCl, pH 7,4, resolubilisiert. Das Produkt zeigte Aktivität im hämolytischen Assay (Verfahren (xvi)); der IH50-Wert wurde mit 0,3 ug/ml berechnet.
Es wurde eine weitere der lyophilisierten Aliquoten mit proteolytischem Abbau und Peptididentifikation durch Aminosäuresequenzierung untersucht, um das Disulfidbrückenmuster zu bestimmen. Es wurden alle acht korrekten Disulfide nachgewiesen (wie auf der Basis eines Konsensus-SCR-Motivs vorhergesagt).

12. Beispiel Expression, Isolierung, Faltung und Formulierung von gereinigtem MQ1-S253 (R235H)

(a) Expression von MQ1-S253 (R235H)

pDB1018-6 (wie in Beispiel 11a beschrieben präpariert) wurde in calciumchloridkompetente E. coli BL21 (DE3) transformiert. Einzelne Kolonien wurden in Universalbehälter mit 10 ml NCYZM-Medium und 50 ug/ml Ampicillin inokuliert und über Nacht bei 37ºC, 220 UPM, vermehren gelassen. Die Übernacht- Kulturen (etwa 3 ml) wurden zum Inokulieren von jeweils 2-L- Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 500 ml NCYZM-Medium, 150 ug/ml Ampicillin enthielten; Kulturen wurden bei 37ºC, 220 UPM, vermehrt, bis A&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 Absorbanzeinheiten betrug. Kulturen wurden mit 1 mM IPTG induziert und weitere 3 Stunden unter den gleichen Bedingungen vermehren gelassen. Die Kulturen wurden zentrifugiert (etwa 8000 g/10 Min./4ºC) und die Supernatanten entsorgt. Die Zellenpellets wurden bei -40ºC gelagert.

(b) Isolierung solubilisierter Einschlußkörper und Reinigung von ungefaltetem MQ1-S235 (R235H)

Gefrorenes Zellenpellet von E. coli BL21 DE3 (pDB1018-6) (2-Liter-Kultur), das in Beispiel 12a beschrieben wurde, wurde bei 4ºC 2 Stunden lang auftauen gelassen und dann in 50 mM Tris/50 mM NaCl/1 mM EDTA/0,1 mM PMSF, pH 8,0 (66 ml) resuspendiert. Die Suspension wurde in ein 250 ml Becherglas gegeben und beschallt (Heat Systems - Ultrasonics W380; 70 Watt, 30 · 50% Impulsdauer = 5 Sekunden). Das Beschallungsprodukt wurde sofort zentrifugiert (6000 g/4ºC/10 Min.) und das Supernatant entsorgt. Das die Einschlußkörper enthaltende Pellet wurde durch kräftiges Schwenken in 20 mM Tris/8 M Harnstoff/50 mM 2-Mercaptoethanol/1 mM EDTA/0,1 mM PMSF, pH 8,5 (200 ml) resuspendiert und Wei Raumtemperatur (etwa 23ºC) 1,5 Stunden lang ruhen gelassen. Mit Wasser gewaschene, sauggetrocknete S-Sepharose (äquivalent zu etwa 25 ml Festbettvolumen) wurde in den 200 ml solubilisierten Einschlußkörper gegeben, und das Gemisch wurde kräftig geschwenkt, um die Sepharose-Perlen gründlich zu befeuchten. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang ruhen gelassen. Das Supernatant (etwa 150 ml) wurde dekantiert und entsorgt. Der restliche Schlamm wurde durch Schwenken zu einer einheitlichen Suspension resuspendiert und dann in einen 32 mm (ID) Glasmantel gegossen und absetzen gelassen. Das Gelbett wurde an ein Niederdruck-Chromatographiesystem angeschlossen und mit 20 mM Tris/8 M Harnstoff/1 mM EDTA/50 mM 2- Mercaptoethanol, pH 8,5 bei 4ºC äquilibriert, bis sich die A&sub2;&sub8;&sub0;- Basislinie stabilisierte. Die Säule wurde dann mit einem 1 M NaCl-haltigen Äquilibrierungspuffer entwickelt. Die gesamte Chromatographie fand bei etwa 1 ml min&supmin;¹ statt. Eine Analyse durch SDS PAGE/Proteinfärbung der während der Chromatographie gesammelten Fraktionen ergab, daß der Großteil des MQ1-S253 (R235H) Polypeptids an der Säule adsorbiert und durch die 1 M NaCl-haltige Pufferwäsche dissoziiert worden war, und daß die Reinheit des Materials etwa 90% betrug.
Eine Probe des Pools wurde mit einer Sephadex-G25-Säule in 50 mM Ameisensäure puffergetauscht, damit einige Untersuchungen durchgeführt werden konnten.
Eine Aminosäureanalyse des Pools der MQ1-S253(R235H)- haltigen Fraktionen erbrachte einen Gesamtproteingehalt von etwa 120 mg.

(c) Faltung und Formulierung von SCR 1 + 2 + 3 (R235H)

Auf der Basis von A&sub2;&sub8;&sub0;-Werten und einem molaren Extinktionskoeffizienten von 25.000 für das Protein in 50 mM Ameisensäure wurden 20 mg des S-Sepharose-gereinigten, ungefalteten Proteins, das in Beispiel 12b beschrieben wurde, wie folgt gefaltet und formuliert.
5,2 ml Proteinlösung (äquivalent zu 20 mg) wurden mit 4,8 ml kaltem 20 mM Tris/8 M Harnstoff/50 mM 2-Mercaptoethamol [*6] / 1 M NaCl, pH 8,5 verdünnt, um 10 ml einer 2,0 mg/ml Lösung zu erzeugen.
Die 10 ml wurden rasch unter konstantem Rühren in 310 ml frisch präpariertem, kaltem (etwa 0-4ºC) 20 mM Ethanolamin verdünnt. Die Lösung wurde bei 0-4ºC 1 Stunde lang ruhen gelassen. Anschließend wurde reduziertes Glutathion zu 1 mM gegeben (durch Zugabe von 2,56 ml 125 mM GSH). Dann wurde oxidiertes Glutathion zu 0,5 mM gegeben (durch Zugabe von 3,2 ml 50 mM GSSG). Die Lösung wurde in dem kalten Raum (-2-3ºC) weitere 48 Stunden ruhen gelassen. Die Lösung wurde dann mit einer Rührzelle und einer YM10-Membran (nominell 10.000 relative Molekülmasse, abgeschnitten) auf etwa 2 ml ultrafiltriert. Die Lösung war klar. Die Ultrafiltrationszelle wurde mit etwa 2 ml 20 mM Ethanolamin gewaschen, und die Waschflüssigkeit und das ultrafiltrierte Retentat wurden zu einem Endvolumen von 3,7 ml zusammengefaßt.
2,2 ml dieser Lösung wurden mit Sephadex G25 (PD10) in 3,2 ml 50 mM Ameisensäure puffergetauscht. Das puffergetauschte Material wurde als das Produkt angesehen und bei -40ºC gelagert. Eine Analyse einer Aliquote des Produktes ergab, daß es 1,6 mg Protein/ml enthielt, daß durch SDS PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen eine einzelne Hauptbande von Mr 28.000 präsent war und daß eine N-Terminal-Sequenzierung der Bande (MQXNAPE) mit der erwarteten Sequenz übereinstimmte. Darüber hinaus erbrachte die Präparation einen IH&sub5;&sub0;-Wert (siehe Verfahren (xvi)) von etwa 1 ug/ml.

DIE FIGUREN

Fig. 1 Plasmid pBROC413. bla zeigt das Ampicillin- Resistenzgen ø10, den T7 RNA Polymerase-Promoter und den Ribosomenbindungsort rbs. Die Pfeile für ab und b3a geben die Transkriptionsrichtung an. Der Polylinkerort wird angezeigt.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion von pDB1010-D11 und pBROC435 von Plasmid-pDB1013-5-4-Kodierung für SCR 1 + 2 + 3. Plasmidgrößen sind Näherungswerte und nicht maßstabsgerecht gezeichnet.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion von pDB1013-5-4 von pDB1018- Kodierung für SCR 1 + 2 + 3 + 4. Die Plasmidgrößen sind Näherungswerte und nicht maßstabsgerecht gezeichnet.

IN BEISPIELEN ODER ALLGEMEINEN VERFAHREN VERWENDETE QUELLENANGABEN

1. Chen G-F. und Inouye M. (1990). Unterdrückung des negativen Effektes von minderwertigen Arginin-Codonen auf die Genexpression; bevorzugte Nutzung minderwertiger Codone innerhalb der ersten 25 Codone der E. coli Gene. Nuc. Acids. Res. 18 (6): 1465-1473.
2. Dacie, J. V.& Lewis S. M., (1975) Practical haematology (praktische Hämatologie), fünfte Auflage, Hrsg. Churchill Livingstone, Edinburgh & New York, S. 3-4.
3. Devereux, Haeberli und Smithies (1984). Eine umfassende Reihe von Sequenzanalyseprogrammen für den Vax. Nuc.Acids.Res. 12 (1): 387-395.
4. Hourcade D., Miesner D. R., Atkinson J. P. & Holers V. M. (1988). Identifikation eines alternativen Polyadenylierungsortes in der humanen C3b/C4b-Rezeptor- (Komplementrezeptor Typ 1)-Transkriptionseinheit und Vorhersage einer sekretierten Form von Komplementrezeptor Typ 1. J. Exp. Med. 168 1255-1270.
5. Low. B (1968). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 160.
6. Sambrook J., Fritsch E. F. und Maniatis J. (1989). Molekulare Klonierung: Ein Laborhandbuch, 2. Auflage. Cold Spring Harbour Laboratory Press.
7. Studier F. W. und Moffat B. A. (1986). J. Mol. Biol. 189: 113.
8. Tabor S. (1990). Expression mit dem T7 RNA Polymerase/Promoter-System. In Current Protocols in Molecular Biology (F. A. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman. J. A. Smith und K. Struhl, Hrsg.), S. 16.2.1- 16.2.11. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York.

TABELLE 1

OLIGO 1 = SEQ ID NR.: 1
OLIGO 2 = SEQ ID NR.: 2
OLIGO 3 = SEQ ID NR.: 3
OLIGO 4 = SEQ ID NR.: 4
OLIGO 5 = SEQ ID NR.: 5
OLIGO 6 = SEQ ID NR.: 6
OLIGO 7 = SEQ ID NR.: 7
OLIGO 8 = SEQ ID NR.: 8
OLIGO 9 = SEQ ID NR.: 9
OLIGO 10 = SEQ ID NR.: 10
OLIGO 11 = SEQ ID NR.: 11
OLIGO 12 = SEQ ID NR.: 12
OLIGO 13 = SEQ ID NR.: 13
OLIGO 14 = SEQ ID NR.: 14
OLIGO 15 = SEQ ID NR.: 15
OLIGO 16 = SEQ ID NR.: 16
OLIGO 17 = SEQ ID NR.: 17
OLIGO 18 = SEQ ID NR.: 18
OLIGO 19 = SEQ ID NR.: 19
OLIGO 20 = SEQ ID NR.: 20
OLIGO 21 = SEQ ID NR.: 21
OLIGO 22 = SEQ ID NR.: 22
OLIGO 23 = SEQ ID NR.: 23
OLIGO 24 = SEQ ID NR.: 24
OLIGO 25 = SEQ ID NR.: 25
OLIGO 26 = SEQ ID NR.: 26

TABELLE 2 Aminosäuresequenzen von Proteinen, abgeleitet von den cDNA Konstrukten

Die vollständig abgeleitete Sequenz der Proteine in den Beispielen lautet wie folgt:
MQ1-> K196 von CR-1 ist in SEQ ID Nr.: 27 enthalten
MR122-> K196 von CR-1 ist in SEQ ID Nr.: 28 enthalten
MQ1-S253 von CR-1 ist in SEQ ID Nr.: 29 enthalten
Die R235H-Mutante von MQ1-S253 von CR-1 ist in SEQ ID Nr.: enthalten
MR122-5253 von CR-1 ist in SEQ ID Nr.: 31 enthalten.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER: SmithKline Beecham p.l.c.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Neuartige Verbindungen
(iii)ANZAHL DER SEQUENZEN: 31
(iv) POSTADRESSE:
(A) EMPFÄNGER: SmithKline Beecham Corporate Patents
(B) STRASSE: Great Burgh, Yew Tree Bottom Road
(C) STADT: Epsom
(D) GRAFSCHAFT: Surrey
(E) LAND: England
(F) POSTLEITZAHL: KT18 5XQ
(v) MASCHINENLESBARES FORMULAR:
(A) MEDIENTYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-kompatibler PC
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patent in Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) REGISTRIERUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANWALT-/VERTRETER-INFORMATIONEN:
(A) NAME: Valentine, Jill B.
(B) ZULASSUNGSNUMMER: G. A. 26758
(C) REFERENZ-/PATENTAMTSBEGLAUBIGUNGSNR.: P30423
(ix) FERNMELDEINFORMATIONEN:
(A) TELEFON: 0737364158
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 87 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 1:
TATGCAGTGC AACGCTCCGG AATGGCTGCC GTTCGCGCGC CCGACCAACC TGACTGATGA 60
ATTTGAGTTC CCGATCGGTA CCTACCT 87
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 93 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 2:
CGTAGTTCAG GTAGGTACCG ATCGGGAACT CAAATTCATC AGTCAGGTTG GTCGGGCGCG 60
CGAACGGCAG CCATTCCGGA GCGTTGCACT GCA 93
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 101 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 3:
GAACTACGAA TGCCGCCCGG GTTATAGCGG CCGCCCGTTT TCTATCATCT GCCTGAAAAA 60
CTCTGTCTGG ACTGGTGCTA AGGACCGTTG CCGACGTAAA T 101
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 101 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 4:
ACGACAAGAT TTACGTCGGC AACGGTCCTT AGCACCAGTC CAGACAGAGT TTTTCAGGCA 60
GATGATAGAA AACGGGCGGC CGCTATAACC CGGGCGGCAT T 101
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 101 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 5:
CTTGTCGTAA TCCGCCAGAT CCGGTTAACG GCATGGTGCA TGTGATCAAA GGCATCCAGT 60
TCGGTTCCCA AATTAAATAT TCTTGTACTA AAGGTTACCG T 101
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR. 6:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 101 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 6:
CCAATCAGAC GGTAACCTTT AGTACAAGAA TATTTAATTT GGGAACCGAA CTGGATGCCT 60
TTGATCACAT GCACCATGCC GTTAACCGGA TCTGGCGGAT T 101
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr. 7:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 94 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 7:
CTGATTGGTT CCTCCAGCGC TACATGCATC ATCTCTGGTG ATACTGTCAT TTGGGATAAT 60
GAAACACCGA TTTGTGACCG AATTCAGTAA TAAA 94
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 8:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 90 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 8:
AGCTTTTATT ACTGAATTCG GTCACAAATC GGTGTTTCAT TATCCCAAAT GACAGTATCA 60
CCAGAGATGA TGCATGTAGC GCTGGAGGAA 90
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 9:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 9:
TATGCGAATT CCGTGTGGTC TGCGGCCGAC CATCACCAAC GGTGATTTCA TCTCTACCAA 60
TCGCGAGAAT TT 72
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 10:
(1) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 78 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 10
CATAGTGAAA ATTCTCGCGA TTGGTAGAGA TGAAATCACC GTTGGTGATG GTCGGCGGCA 60
GACCACACGG AATTCGCA 78
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 11:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 85 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 11
TCACTATGGT TCTGTGGTGA CCTACCGCTG CAATCCGGGT AGCGGTGGTC GTAAGGTGTT 60
TGAGCTCGTG GGTGAGCCGT CCATC 85
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 12:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 85 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 12:
GTGCAGTAGA TGGACGGCTC ACCCACGAGC TCAAACACCT TACGACCACC GCTACCCGGA 60
TTGCAGCGGT AGGTCACCAC AGAAC 85
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 13:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 79 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 13:
TACTGCACTA GTAATGACGA TCAAGTGGGC ATCTGGAGCG GCCCGGCACC GCAGTGCATC 60
ATCCCGAACA AATAATAAA 79
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 14:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 14:
AGCTTTTATT ATTTGTTCGG GATGATGCAC TGCGGTGCCG GGCCGCTCCA GATGCCCACT 60
TGATCGTCAT TACTA 75
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 15:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 15
GAGACTGATA TGCAGTGCAA CGCTCCGGAA 30
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 16:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 16:
GTCAGCAAGC TTTTATTACT GAATTCGGTC 30
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 17:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 17:
ATCGTAACTA GTAACGACGA TCAAGTGGGC 30
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 18
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 18:
ATGACTAAGC TTTTATTATG AGCAGCTCGG 30
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 19:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 19:
TAACTAGTAA CGACGATCAA GTGGGCATCT GG 32
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 20:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 20:
CTAAGCTTTT ATTATGAGCA GCTCGGGAGT TCC 33
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 21:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 81 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 21:
CTAGTAACGA CGATCAAGTG GGCATCTGGA GCGGCCCGGC ACCGCAGTGC ATCATCCCGA 60
ACAAATGCAC GCCGCCAAAT G 81
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 22:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 85 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 22:
GTTCTCCACA TTTGGCGGCG TGCATTTGTT CGGGATGATG CACTGCGGTG CCGGGCCGCT 60
CCAGATGCCC ACTTGATCGT CGTTA 85
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 23:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 90 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 23:
TGGAGAACGG TATCCTGGTA TCTGACAACC GTTCTCTGTT CTCTTTAAAC GAAGTTGTAG 60
AGTTTCGTTG TCAGCCGGGC TTTGTTATGA 90
(2) INFORMATIONEN FUR SEQ ID NR.: 24:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 90 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 24:
CGGACCTTTC ATAACAAAGC CCGGCTGACA ACGAAACTCT ACAACTTCGT TTAAAGAGAA 60
CAGAGAACGG TTGTCAGATA CCAGGATACC 90
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 25:
(1) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 25:
AAGGTCCGCG CCGTGTGAAG TGCCAGGCCT TGAACAAATG GGAGCCGGAA CTCCCGAGCT 60
GCTCATAATA AA 72
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 26:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 68 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 26:
AGCTTTTATT ATGAGCAGCT CGGGAGTTCC GGCTCCCATT TGTTCAAGGC CTGGCACTTC 60
ACACGGCG 68
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 27:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 197 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: N-terminal
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 27:
(2)
INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 28:
(1) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 76 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: intern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 28
(2) INFORMATIONEN FUR SEQ ID NR.: 29
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN
(A) LÄNGE: 254 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: N-terminal
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 30
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 254 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.: 31:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 133 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: intern
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 31:

Claims

1. Lösliches Polypeptid, umfassend der Reihe nach ein bis vier kurze Konsensus-Wiederholungen (SCR), ausgewählt aus SCR 1, 2, 3 und 4 einer langen homologen Wiederholung A (LHR-A), als die einzigen strukturell und funktionell intakten SCR-Domänen von CR1, und wenigstens SCR3 beinhaltend, wobei SCR 1, 2, 3 und 4 jeweils aus den Resten 2-58, 63-120, 125-191 und 197-252 von reifem CR1 besteht.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend der Reihe nach SCR 1, 2 und 3 von LHR-A als die einzigen strukturell und funktionell intakten SCR-Domänen von CR1.

3. Polypeptid nach Anspruch 2 der Formel (I):

NH&sub2;-V¹-SCR1-W¹-SCR2-X¹-SCR3-Y¹-OH (I)

wobei SCR1 die Reste 2-58 von reifem CR1 repräsentiert, SCR2 die Reste 63-120 von reifem CR1 repräsentiert, SCR3 die Reste 125-191 von reifem CR1 repräsentiert und V¹, W¹, X¹ und Y¹ Bindungen oder kurze Verknüpfungssequenzen von Aminosäuren repräsentieren, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 5 Resten und vorzugsweise von nativen Zwischendomänen-Sequenzen in CR1 abstammend.

4. Polypeptid nach Anspruch 3, bei dem W¹, X¹ und Y¹ jeweils die Reste 59-62, 121-124 und 192-196 von reifem CR1 repräsentieren und V¹ Rest 1 von reifem CR1 repräsentiert, bei Bedarf über seinen N-Terminus mit Methionin verknüpft.

5. Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend der Reihe nach SCR 1, 2, 3 und 4 von LHR-A als die einzigen strukturell und funktionell intakten SCR-Domänen von CR1.

6. Polypeptid nach Anspruch 5 der Formel (II):

NH&sub2;-V²-SCR1-W²-SCR2-X²-SCR3-Y²-SCR4-Z²-OH (II)

wobei SCR1, SCR2 und SCR3 der Definition in Anspruch 3 entsprechen, SCR4 die Reste 197-252 von reifem CR1 repräsentiert und V², W², X², Y² und Z² Bindungen oder kurze Verknüpfungssequenzen von Aminosäuren repräsentieren, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 5 Resten und vorzugsweise von nativen Zwischendomänen-Sequenzen in CR1 abstammend.

7. Polypeptid nach Anspruch 6, bei dem W², X², Y² und Z² jeweils die Reste 59-62, 121-124, 192-196 und Rest 253 von reifem CR1 repräsentieren und V² Rest 1 von reifem CR1 repräsentiert, bei Bedarf über seinen N-Terminus mit Methionin verknüpft.

8. Polypeptid nach Anspruch 7, bei dem Arginin 235 durch Histidin ersetzt ist.

9. Polypeptid nach Anspruch 1 der Formel (III):

NH&sub2;-X³-SCR3-Y³-OH (III)

wobei SCR3 der Definition in Anspruch 3 entspricht und X³ und Y³ Bindungen oder kurze Verknüpfungssequenzen von Aminosäuren repräsentieren, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 5 Resten und vorzugsweise von nativen Zwischendomänen-Sequenzen in CR1 abstammend.

10. Polypeptid nach Anspruch 9, bei dem X³ die Aminosäuren 122-124 von reifem CR1 repräsentiert, bei Bedarf mit Methionin an seinem N-Terminus verknüpft, und Y&sup4; die Aminosäuren 192-196 von reifem CR1 repräsentiert.

11. Polypeptid nach Anspruch 1 der Formel (IV):

NH&sub2;-X&sup4;-SCR3-Y&sup4;-SCR4-Z&sup4;-OH (IV)

wobei SCR3 und SCR4 der Definition in Anspruch 6 entsprechen und X&sup4;, Y&sup4; und Z&sup4; Bindungen oder kurze Verknüpfungssequenzen von Aminosäuren repräsentieren, vorzugsweise mit einer Länge von 1 bis 5 Resten und vorzugsweise von nativen Zwischendomänen-Sequenzen in CR1 abstammend.

12. Polypeptid nach Anspruch 11, bei dem X&sup4; die Aminosäuren 122-124 von reifem CR1 repräsentiert, bei Bedarf mit Methionin an seinem N-Terminus verknüpft, und Y&sup4; und 24 jeweils die Aminosäuren 192-196 und 253 von reifem CR1 repräsentieren.

13. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in SEQ ID Nr. 27, SEQ ID Nr. 28, SEQ ID Nr. 29, SEQ ID Nr. 30 oder SEQ ID Nr. 31 angegebenen Aminosäuresequenz.

14. DNA-Molekül, das ein lösliches Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.

15. DNA-Polymer nach Anspruch 14 mit der in der folgenden SEQ ID Nr. 32 oder SEQ ID Nr. 33 angegebenen Nucleotidsequenz:

SEQ ID Nr. 32

1 TATGCGAATT CCGTGTGGTC TGCCGCCGAC CATCACCAAC GGTGATTTCA

51 TCTCTACCAA TCGCGAGAAT TTTCACTATG GTTCTGTGGT GACCTACCGC

101 TGCAATCCGG GTAGCGGTGG TCGTAAGGTG TTTGAGCTCG TGGGTGAGCC

151 GTCCATCTAC TGCACTAGTA ATGACGATCA AGTGGGCATC TGGAGCGGCC

201 CGGCACCGCA GTGCATCATC CCGAACAAAT AATAAA.

SEQ ID Nr. 33

1 TATGCAGTGC AACGCTCCGG AATGGCTGCC GTTCGCGCGC CCGACCAACC

51 TGACTGATGA ATTTGAGTTC CCGATCGGTA CCTACCTGAA CTACGAATGC

101 CGCCCGGGTT ATAGCGGCCG CCCGTTTTCT ATCATCTGCC TGAAAAACTC

151 TGTCTGGACT GGTGCTAAGG ACCGTTGCCG ACGTAAATCT TGTCGTAATC

201 CGCCAGATCC GGTTAACGGC ATGGTGCATG TGATCAAAGG CATCCAGTTC

251 GGTTCCCAAA TTAAATATTC TTGTACTAAA GGTTACCGTCT GATTGGTTC

301 CTCCAGCGCT ACATGCATCA TCTCTGGTGA TACTGTCATT TGGGATAATG

351 AAACACCGAT TTGTGACCGA ATTCCGTGTG GTCTGCCGCC GACCATCACC

401 AACGGTGATT TCATCTCTAC CAATCGCGAG AATTTTCACT ATGGTTCTGT

451 GGTGACCTAC CGCTGCAATC CGGGTAGCGG TGGTCGTAAG GTGTTTGAGC

501 TCGTGGGTGA GCCGTCCATC TACTGCACTA GTAATGACGA TCAAGTGGGC

551 ATCTGGAGCG GCCCGGCACC GCAGTGCATC ATCCCGAACA AATAATAAA

16. Replizierbarer Expressionsvektor, der in einer Wirtszelle das DNA-Polymer von Anspruch 14 oder 15 ausprägen kann.

17. Wirtszelle, transformiert mit dem replizierbaren Expressionsvektor von Anspruch 16.

18. Verfahren zum Präparieren eines CR1-Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend das Ausprägen von DNA, die das genannte Polypeptid kodiert, in einer rekombinanten Wirtszelle, und Wiedergewinnen des Produktes.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Trägerstoff.

20. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung in Verbindung mit Inflammation oder unangemessener Komplementaktivierung.

21. Polypeptid nach Anspruch 1 für den Gebrauch als aktive therapeutische Substanz.