JPH02117700A - 生物学的に活性な蛋白質 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は腫瘍壊死因子ａ−媒介活性の抑制作用を有する
新しい蛋白質、天然原料からのこのような濯白質の単離
および精襄、ＤＮＡ操作（二よるその調製、および、　
ＴＮＦσ生成の過剰および不調に関連する症状の治療（
二おけるこのような蛋白の使用に関する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は少なくとも２つの蛋白質、即
ちαどβの群が示す活性であり、これは腫瘍細胞に対す
る細胞毒性を有し、培誉細胞の生育を抑制する（Ｅ、Ｃ
ａｒεｗｅｌ１等、′腫瘍壊死を起こす内性９素誘発血
清因子”、ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａ、ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡＪ、７２、ｐ３６６６（１
９７５ン）。

腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は［カシェクチイン（ｃａ
ｃｈθｃｔｉｎ：悪液質物質）」とも呼ばれており、細
菌、ウィルス、腫瘍および他の毒素のような侵入性刺激
に伴う「ストレス」信号に応答する単細胞／マクロファ
ージ系統の細胞により主に産生される。ＴＮＦβは、−
船釣（：「リンフォトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ
；　９ンバ性毒素月と呼ばれており、リン・ぞ法線細胞
から主に産生される。

ＴＮＦβＦｉＴＮＦａと同様の活性を多く有しているが
、純粋なＴＮＰ’βを調製することが１雌であることが
原因と考えられるものの、その活性は低いと考えられて
いる。

’ｒｔ拝゛ｑけ広範囲の生物活性を媒介したり、これに
関与しており（Ｂ、［１８ｕｔｔｅｒ等、“腫瘍壊死因
子とマクロファージ選択因子カシェクチインの特徴”、
ｒＮａｔｕｒａＪ、３１６、Ｔ’＋５５２（１９８５）
）。

そのいくつかはインターロイキン１（ＩＬ−１）と共■
のものである（Ｊ、Ｌｅ等、−■壊死因子とインターロ
イキン１：多くのｉＷＬ、た生物活性を有するナイトカ
イｙ　（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）”、ｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＩｎｖｅｓｔ、上５６、ｐ２３４（１９８７））
。例えばｊま癌細胞の誘発によりＴＮＦａ値が上昇する
と体重が減少したり悪液質を起こすことがあり、また。

ＴＮＦｕは致命的な内毒素ショック（菌ショック）の主
な媒介物質であることも示唆されている。

ＴＮＦａの他の生物作用には、低血圧、発熱（視床下部
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）合成の刺激により
誘発される）、凝血障害（例えば組織因子を放出する血
管内皮細胞の刺激により誘発される）およｑｍ―破ｐ（
例えば一連のプロディナーゼの刺激、（、二より誘発５
、皮膚僚維芽細胞および骨膜細胞によるコラゲナーゼ産
生を包含）が含まれる（Ｃ，Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ等の１
腫瘍壊死因子（カシェクチイン）は内因性発熱物質であ
りインターロイキン１の生成を誘発する”、　ｒＪ、　
Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、玉１６３、ｐ１４３３（１９８６）
；　Ｊ、Ｄａｙｅｒ等の“カシェクチイン／腫瘍壊死因
子はヒト皮膚繊維芽細胞および骨膜細胞によるコラゲナ
ーゼとプロスタグランジンＥ２の生成を促進する”、ｒ
、ｒ、　Ｅｘｐ。

ｊｌｅｄ、Ｊ、１６２、り２１＜５３（１９８５））。

従って、内毒素ショック、悪液質および他の前記した有
害作用を防止するカシェクチイン／ＴＮＦａの抑制剤の
開発が望まれる、カシエクティン：二対して動物を受動
免疫化することにより。

ＴＮＦａ抗体媒介内１ｌｌｌ：誘発死を防止できること
がわかった（Ｂ、Ｂｅｕｔｌｅｒ等、　ｒＮａｔｕｒｅ
　Ｊ、　５１６、前記）。

今回我々は、Ｈ，−１−媒介活性の明らかな同時抑制を
伴わないＴＮＦＱ−媒介活性の強力な抑制作用を有する
新しい蛋白質を発見した。この蛋白質を今後はＭ　１ｙ
Ｊｍ死因子α抑制剤（ＴＮＦａ工ＮＨ）と称する。

即ち、本発明の１つの特徴として、腫瘍壊死因子α−媒
介活性を選択的）二抑制する蛋白質が提供される。

本明細書中では１本発明の抑制剤により示される選択的
抑制は、ＴＮＦ−媒介活性をブロックする能力、ただし
、　ＴＮＦの生物活性の一部ではあるが全てではないも
のをＴＮＦと共通して有する他の蛋白質、例えばＩＬ−
１をブロックする能力は欠いたものとして認識するもの
とする。

好ましくは本発明の腫瘍壊死因子ａ抑制剤は実質的に均
質な状態のものであり、主な混入物質を実質的に含まず
、モして／または、他の蛋白質様の物質を実質的に含ま
ないものである。

本発明の７ｉＩ５Ｊ壊死因子ａ抑制剤は下記の特徴：（
ａ）　　モレキュラーシープクロマトグラフィーで測定
した分子量が、４０〜６０ｋＤａの範囲にあり；ｔｂ）
　　クロマト集束法で測定した等電点（ｐＩ）が、５．
５〜６．１の範囲にあり； （Ｃ）　　アクチノマイシンＤで処理したネズミＬ９２
９細胞に対する選択的細胞毒性（ｃｌ−１ｆｆｅｒｅｎ
ｔｉａｌｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の標準’ｒＮＦア
ッセイの抑制（１ｎ−ｈｉｂｉｔｉｏｎ）　； ０１つ以上を有することがわかっている（　Ｇ。

Ｎｅｄｗｉｎ等、。腫瘍壊死因子αおよびβの生成に対
するインターロイキン２、インターフェロン−γおよび
ミトゲンの作用”、　「Ｊ、Ｔｍｍｕｎｏｌ、Ｊ、１３
５、ｐ２４９２（１９８５））。この抑制はさらにＴＮ
ＦＱを添加することにより克服されることから、抑制は
拮抗的であることが示される。ＴＮＦβの抑制よりＴＮ
ＦＱの抑制の方が本アッセイではより効率的ではあるが
、この抑制剤はＴＮＦβ活性の抑制剤でもあり、以下の
特徴を有している。

（ｄ）　　ヒト繊維芽細胞および骨膜細胞からのＴＮＦ
誘導ＰＧＥ２放出の抑制； （ｅ）　　抑制剤がＴＮＦＱのＵ９３７細胞（単細胞腫
瘍系統）への結合を訪客することが、放射標識醪ａ（１
２５Ｉ−ＴＮＦＱ）の結合の抑制により明らかであるこ
と； （ｆ）　　前形成されたＴＮＦＱ：Ｕ９５７細胞複合体
の解離が温度依存的に抑制剤により促進されること；（
→　抑制剤は蛋白分解によりＴＮＦを分解しないこと； （ｈ）　　抑制剤はＩＬ−１受容体結合活性、例えば、
放射標識ＩＬ−１（＋　２５Ｉ−ＩＬ−１ａ）のネズミ
胸腺腫細胞準系統ＥＬ４−６　、’ｌ　、への結合を抑
制しないこと。

本発明の蛋白質はさらζ１精製すると、ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＣ）Ｅ）で測定した場合約３３０００ダルトンの分子
ｔを有することがわかった。

即ち、本発明の別の特徴として、ＴＮＦａ媒介活性を選
択的に抑制する蛋白質が提供されるが、これは下記の特
徴： （ａ）　　Ｓｔ”）Ｓ−ＰＡＧＥで測定した分子量的３
３　ｋＤａ　；＜ｅ　　りａマド集束法）二より測定し
た等電点（ｐＩ）が、５，５〜６１の範囲； （Ｃ）　　アクチノマイシンＤ処理ネズミＬ９２９細胞
（二対する選択的細胞毒性の標準ＴＮＦアッセイの抑制
： の１つ以上を有することがわかっている（０゜Ｎｅｄｗ
ｉｎ等、″’＠ｇ１壊死因子ａおよびβの生成（こ対す
るインターロイキン２、インターフェロン−γおよびミ
トゲンの作用”、［Ｊ　、Ｉｍｍｕｎｏｌ　、　Ｊ、１
５５、ｐ２４９２ｃ１９８５））、この抑制はさらにＴ
ＮＦａを添加することにより克服されることから、抑制
は拮抗的であることが示される。ＴＮＦ’βの抑制より
ＴＮＴ？ａの抑制の方が本アッセイではより効率的では
あるが、この抑制剤はＴＮＦβ活性の抑制剤でもあり、
以下の特徴を有している。

（→　ヒト繊維芽細胞および骨膜細胞からのＴＮＦ誘導
ＰＧＥ２放出の抑制； （ｅ）　　抑制剤がＴＮＦｎのＵ９６７細胞（単細胞腫
瘍系統）への結合を妨害することが、放射標識ＴＮＦａ
（１２５Ｉ−ＴＮＦａ）の抑制により明らかであること
；（Ｄ　前形成されたＴ’ＮＦα：Ｕ９３７細胞複合体
の解離がｍ度依存的に抑制剤により促進されること；（
ラ　抑制剤は蛋白質分解によりＴＮＦを分離しないこと
； （ｈ）抑制剤はＩＬ−１受容体結合活性、例えば、放射
標識ＴＬ−１（’　２５Ｉ−ＩＬ−１σ）のネズミ胸腺
肺細胞準系統ＥＬ４−６．１　、への結合を抑制しない
こと。

好ましくは本発明のＴＮＦ（ＩＩＮＨは特徴（ｐｒ）お
よび（旬の両方および特徴（Ｃ）〜（ｈ）の１つ以上を
有する。

特に、本発明のＴＮＦａＩＮＨは特徴（ａ）〜（ｈ）の
全てを有する。

本発明の蛋白質は下記： Ａｓｐ−３ｓｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃ）ｉｎ−
Ｃ）ｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ−１１ｅ　−Ｈｌｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ−Ｃｖｓ−Ａｓｎ−８ｅｒ−１１ｓのアミノ
末端アミノ酸配列を有する。

隣接する３つのアミノ酸がグリコジル化部位を与え、即
ち、その配列は、配列Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｔｈｒ　−Ｌｙ
ｓ　を二つらなることも考えられる。

本発明のＴ’ＮＦα抑制剤は天然のＴＮＦａＩＮＨの配
列に実質的に相当し、前記したものと実質的に等しいア
ミノ末端配列を含むようなアミノ酸配列を有しているも
のと理解されたい。即ち本発明のＴＮＦａ抑制剤の配列
は、天然ＴＮＦａ　Ｉ　ＮＨの配列と同一であるか、ま
たは、１つ以上の欠失、置換、挿入、逆位または対立型
由来のその他の付加を含んでいるが結果的には、配列は
少なくとも８０％、好ましくは９０％、天然ＴＮＦａＩ
ＮＨ配列との相同性を有しており、そしてその蛋白質と
本質的（二同じ生物学的特性を維持している。

本発明のＴＮＦα抑制剤は時間・温度依存的に熱により
不活性化されトリプシンまたはプロナーゼによる処理に
より破壊されることがら、蛋白質様であることが示され
ている。

また本発明のＴＮＦａ　ＴＮＨは、酵素エンドグリコシ
ダーゼＦで処理することにより分子量が７〜８　ｋＤａ
減少することから、塘蛋白質であることもわかっている
。

即ち、本発明の別の特徴として、前述したものであるが
実質的に未グリコジル化状態にあるＴＮＦａ抑制剤が提
供される。

本発明の抑制剤はＴＮＦａ活性を抑制するのが望ましい
ような症状、例えば、体重減少、ショック、悪液質、お
よび慢性局所炎症、リウマチ関接炎、散在住血管内凝血
および腎炎のような。

ＴＮＦαの作用から生じる症状の治療に有利である。

即ち、本発明のもう１つの特徴として、特に、ＴＮＦａ
生成の過剰または不調に関わる症状の治療における活性
治療薬として使用するための、前記したＴＮＦα抑制剤
または薬学的に許容されるその誘導体が提供される。

本発明のさらに別の特徴として、前記したＴＮＦａ抑制
剤または薬学的に許容されるその誘導体の有効量を投与
することを包含するヒトを含む哺乳類の過剰ないしは制
御されてないＴＮＦｆｆ生成に関わる症状の治療方法が
提供される。

さらに別め本発明の特徴として、ＴＮＦａ生成の過剰ま
たは不調に関わる症状の治療薬の製造における前述のＴ
ＮＦａ抑制剤または薬学的に許容されるその誘導体の使
用が提供される。

ここでいう治療とは、すでに発現した症状または徴候の
治療と同様に予防も含まれることを、当業者は理解され
たい。

また、治療に必要な本発明のＴＮＦａ抑制剤の童は投与
経路のみならず、治療の対象となる症状の性質、恵者の
年齢および症状により変化するものであり、最終的には
担当医または専門家の判断によるものである。しかしな
がら、−船釣には、適当な投与量は約５．０〜５００μ
ｇ／ｋｇ体重７日、例えば、３０〜３００μｇ／ｋｇ／
日、好ましくは５０〜１５０μｇ／ｋｇ／日の範囲であ
る。

所望の投与量を単回投与するか、または、適切な間隔を
あけて１例えば１日あたり２．３．４治療に用いる場合
は１本発明のＴＮＦａ抑制剤を生蛋白質として投与して
もよいが、薬学的製剤として活性蛋白質を与えるのが好
ましい。

さらに本発明は、１つ以上の薬学的（二許容される担体
、および、場合により他の治療・予防薬とともに、前記
した°ＴＮＦａ抑制剤または薬学的に許容されるその誘
導体を含有する薬学的組成物を提供する。担体は組成物
の成分と相溶性を有し、投与対象４二有害とならないと
いう意味ζ二おいて「許容される」ものでなければなら
ない。

従って、本発明の抑制剤は非経腸投与（例えば注射、例
えば単回注射または連続注入）のために製剤されてよく
、アンプル、充填済注射器、少量注入のための単位投与
形態か、または、保存料を添加して複合投与量容器中で
提供してよい。組成物は、水性担体中の懸／Ｉｔ液また
は溶液のような形態であってよ＜、Ｓ％濁剤、安定剤お
よび／または分散剤のような製剤用試薬も含有してよい
。また、活性成分は、滅菌固体の無菌的単離か、または
溶液の凍結乾燥（＝より得た粉末形態であってもよく、
この場合は、適当な担体１例えば滅菌済発熱物質除去水
で使用前に希釈再調製して用いる。

本発明のＴＮＦａ抑制剤は他の治療薬、例えば他のサイ
ト力インまたはその抑制剤と組み合わせて使用すること
もできる。

即ち１本発明は、別の特徴において、他の治療上の活性
を有する薬、例えば他のサイト力インまたはその抑制剤
とともに前述したＴＮＦα抑制剤または薬学的に許容さ
れるその誘導体を含有する複合体も提供する。

本発明の蛋白質は天然原料から精製、そして適切（＝は
その後の化学修飾によりＤ４ｉｎてよく、また、例えば
組換えＤＮＡ技術による蛋白質調製のための従来法によ
りｖ４製してもよい。

本発明の別の特徴によれば、天然原料、特にヒト発熱患
者の尿から精製すること（二よる本発明の腫瘍壊死因子
ａ抑制剤の製造方法も提供される。このような精製は、
例えば、発熱患者の未精製尿を濃縮し、尿から粗製ＴＮ
）１’ａＩＮＨを析出させ、この沈殿中の他の蛋白質か
ら、例えば、イオン又換カラムクロマトグクフイー　ゲ
ル濾過クロマトグラフィー　疎水クロマトグラフィー免
疫吸着法および固定化ＴＮＦａ上のアフ、ｆニテイーク
ロマトグラフイーのうちの１つ以上を用いて、ＴＮＦａ
ＩＮＨを分別するという段階を包含する。

また本発明の呻瘍壊死因子ａ抑制剤は、マクロファージ
含有ヒト組織、例えば、肺洗浄物およびヒト肝抽出液か
らも得ることができ、このような材料からは、前記した
ような標準的な精製方法により得てよい。

ここに記載した方法により得られた天然および組換えＴ
ＮＦα工ｋＴｆ工は前記した一連の段階を経て精製して
よい。各精製段階の後、ＴＮＦａＩＮ）Ｔの存在と純度
は、前記したＧ、　Ｎｅｄｗｉｎ等ＯｆＪ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、Ｊ１３５、の記載に従い、ＴＮＦ−感受性細胞
系統を用いて、アクチノマイシンＤ　（ａｃｔｉ　Ｄ）
の存在下。

細胞實性検定において測定してよい。

この方法の好ましい実施態様においては、まず、標準的
な濃縮方法、例えば限外濾過法を用いて、尿路感染症の
無い発熱患者（３８，５℃より高熱）より採取した未処
置の尿から、　ＴＮＦ（ＩＩＮＦを単離する。次に硫酸
アンモニアを用いて、例えば、攪拌しながら４℃で８０
％（ｗ／ｖ）の濃度になるように硫酸を添加するなどし
て、粗製の尿から粗製画分を沈殿させてよい。好ましく
は硫酸アンモニウムは段階的（二添加し、例えば４０％
　（ｗ／ｖ）のような低濃度で沈殿した物質は捨てる。

硫酸アンモニウムは透析により除去してよく、得られた
画分を種々のクロマトグラフィー法により精製して他の
蛋白からＴＮＦαＩＮＩ’ｉ”を分離する。

即ち、ＴＮＦａ　ｒｌＪＨ濃縮液をイオン交換クロマト
グラフィーで精製してよく、この精製方法は荷電の差に
より蛋白質を分離する方法であり、蛋白質の酸／塩基性
質を反映したものである。陰イオン交換クロマトグラフ
ィーに適する物質はアミノエチルセルロース誘導体、例
えば広く市販されている第４アミノエチルセルロース（
ＱＡＥ−セルロース）またはジエチルアミノエチルセル
ロース（ＤＥＡＥ−セルロース）を包含する。陰イオン
交換カラムは濃縮物を適用する前に、場合によりＥＤＴ
Ａのようなキレート剤を含有するトリス−塩酸のような
適当な緩衝液を用いて、平衡させておかなければならな
い。結合物質は塩溶液（例えば平衡緩衝液で作成した０
、　８　Ｍ塩化ナトリウム）を用いてカラムから溶離し
てよい。

陰イオン交換クロマトグラフィーの活性成分画分に合わ
せる。陽イオン交換クロマトグラフィー（１適する物質
は、カルボキシメチル（ＣＭ）セルロースまたはスルホ
プロピルセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐ
ｓａｌａ　、スエーデン）のようなセルロース誘導体を
包含する。カラムは酢酸ナトリウムのような適当な緩ｖ
Ｊ液で平衡させることが必要であり、結合物質は例えば
０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する平衡緩衝液で溶離し
てよい。

合わせた活性画分を、例えばミニリーグアガロース（Ｋ
ｅｎ　Ｅｎ　Ｔｅｃ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　
Ｃｏｒｐ、デンマーク）のような適当なマトリクスに結
合させた結合組換えヒ）　ＴＮＦａ（ｒｈＴＮＦａ）上
のアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製
する。

カラムは例えばリン酸塩緩衝液（例えば０．８Ｍリン酸
カリウム、ｐＨ８，６）を用いて緩衝させなければなら
ない。ｒｈＴＮＮ’ａに結合されない活性基はエタノー
ルアミン−塩酸（ｐＨ８，５）緩衝液でブロックする。

カラムは適当な緩衝液１例えば場合により埴化ナトリウ
ムを含有するトリス塩酸で平衡させ、ＴＮＦａＩＮＨは
酸性（ｐＨ３，５）グリシン緩衝液で溶離する。溶離し
た画分は例えばトリス塩基を添加して即座にｐＨ７，Ｏ
Ｅ調節する。

合わせた活性画分は好ましくは凍結乾燥した後に逆相Ｆ
ＰＬＣ（高速蛋白質液体クロマトグラフィー）の最終精
製段階に付す。ＦＰＬＣカラム（二連用する前に、凍結
乾燥ＴＮＦａ　ＩＮＨ画分をトリフルオロ酢酸（Ｔ、Ｆ
Ａ）　（Ｆｕｌｋａ、　Ｂｕｃｈｓ、スイス）、ヘプタ
フルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）または酢酸のような適切な緩
衝液で緩衝する。ＦＰＬＣカラムからのＴＨＦａＩＮＨ
の溶離は、従来の方法、例えば場合によりアルコール例
えばＮ−プロパツールを含有する前記した適当な緩衝液
を用いるなどして行なってよい。

溶離した画分は例えば重炭酸アンモニタムで直ちに緩衝
し、凍結乾燥する。この時点でＴＮＦａＩＮＨは実質的
に均質な状態となり、その後の生物活性検定および治療
用途の適切な形態への展剤のために適したものとなる。

即ち、本発明のさらに別の特徴として、前記した方法で
得たものと実質的に同一のＴＮＦａ−媒介活性選択的抑
制蛋白質が提供される。

本発明のＴＮＦａＩＮＨを精製して均質（二する能力に
より、この蛋白質分子のＮ末端部分の配列決定が可能に
なる。この配列はＴＮＦａ　Ｉ　ＮＨの遺伝子コードの
クローニングに寄与し、これにより、より進んだ生物学
的研究および最終的には治療上の試験および使用のため
の純粋な形態のＴＮＦａＩＮＨの大証生産が可能になる
。

本発明の均質なＴＮＲ”ａＩＮＨの試料は従来の方法、
例えば、ニンヒドリンまたはガス相検知を用いた市販の
自動シーケンサ−を用いて配列決定できる。ここで定義
されるヒトＴＮＦαＩＮＨのアミノ末端部分の最初の１
７残基は以下の配列：Ａｓ　ｐ−３ｅ　ｒ−Ｖａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−４１ｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉ　
１ｅ　−Ｈｌｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−８
ｅｒ−Ｉ　１ｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社の自動シーケンサ−４７７Ａ型を用いて決定）を有
している。

それにつづく３つのアミノ酸はグリコジル化部位を与え
、即ち、配列はＡｓｎ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓと続く
と考えられる。

純粋な形態でＴＮＦａ　Ｉ　ＮＨを大量に得る１つの可
能な方法は良く知られた組換えＤＮＡによるものである
と考えられる。しかしながら、このような方法を有効に
使用するためには、天然およびｍ換えのＴＮＦａＩＮｒ
（または活性の正確な測定が必要になるだけでなく、天
然および組換えの生成物が均質化できるほど精製可能な
ものでなくてはならない。

本発明のさらに別の４７徴によれば、本発明の肺瘍壊死
因イ抑制剤またはその誘導体の製造方法が提供され、こ
の方法は、過当な形質転換宿主中で、このような抑制剤
をコードするＤＮＡ配列を表現させることによる。この
ような方法は適当なベクター（二挿入した抑制剤なコー
ドするＤＮＡ配列をＳむ組換えＤＮＡ分子で形質転換し
た宿主細胞の培養を包官する。

適当な真核細胞および原核細胞の宿主は、例えば菌株、
酵母、その他のカビ、および動物細胞（昆虫細胞を含む
）および組織中の植物細胞の細胞系統であってよい。特
に好ましい宿主細胞は酵母菌体、Ｅ、　ｃｏｌｉ　＠体
および動物細胞である。

腫瘍壊死因子抑制活性を有する蛋白質の表現は適当な生
育培地中での形質転換された宿主細胞の培養により行な
う。通常はこのような培地は硫酸アンモニウムのような
窒素源、ブドウ糖またはグリセロールのような炭素源お
よびエネルギー源、微量元素および特定の宿主細胞の生
育に必須な因子を含有する。この厳密な培養条件は選択
された宿主により異なり、例えばＥ。

ｃｏｌｉの場合は浸水好気的醗酵を好ましくは３７℃で
行なうのが好ましい。

さらに、表現は例えば表現ベクター中で用いたプロモー
ター系のインデューナーを添加するか透導条件を用いる
かして誘導してよい。

宿主の如何に応じて、　ＴＮＦ’αの抑制剤は顆粒含有
体として製造してよく、これは細胞溶解後に分画遠心に
より回収でき、これらは従来の方法で可溶化できそして
ここで記載した尿由来ＴＮＦａＩＮＨの精製方法により
ＮＭできる。また、ＴＮＦａ抑制剤は原形質周囲間隙ま
たは好都合には培地中に分泌された細胞質ゾル中の溶液
であってよい。

宿主細胞は表現ベクターに挿入したＴＮＦａ抑制剤をコ
ードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子により形
質転換する。

このような表現ベクターは染色体、非染色体および合成
のＤＮＡ配列の断片、例えば、　５Ｖ−４０の桟々の知
られたり導体および知られた細菌プラスミド、例えば「
天然の」プラスミド、例えばＣｏ１Ｅ１、ｐＳＣ工Ｏ■
またはわＲ８Ｆ’２１２４およびファージＤＮＡ　、ま
たは「人工の」プラスミド（１ｎｖｉｔｒｏで作成）例
えばｐＢＰ、３２２　、　ＴＩＭＢ９またはｎＡＴ１５
３のようなものよりなる。ファージＤＮＡには、例えば
λファージの多くの誘導体、および他のＤＮＡファージ
、例えばＭ１′５、および他の線状−本領ＤＮＡファー
ジが包含される。酵母中で用いるベクターとしては、２
μプラスミドカー包古され、動物＃１ｌｌｌ胞の１うな
真核細胞中で用いるベクターには５ｖ−４ｏアデノウイ
ルスおよびレトロウィルスを含有するものが含まれる。

このような表現ベクターはまた、クローンＤＮＡ配列の
表現を制御したり調節したりするようにＴＮＦ抑制ＤＮ
Ａ配列（ニオはレータ−として結合する少なくとも１つ
の表現制御配列により特徴付けられる。有用な表現制御
配列の例には。

ＬａＣ，ｔｒｐ、　ｔａＣおよびｔｒｃ系、λファージ
の主なオー？レータ−およびプロモーター領域（熱分解
性ｔｓ　ｃＴ８５７　’）プレツナ−の制御下のＰＬプ
ロモータ等）　、ｒＬｉコート蛋白の、制御領域、酵母
の解糖系プロモークー（例えば６−ホスホグリセレート
キナーゼのプロモーター）、酵母酸ホスファター・ゼの
プロモーター（例えばＰｈｏ　５　）　。

酵母α−交配因子のプロモーター　および、ポリオーマ
ウィルス、アゾノウ・ｒルス、レトロウィルスおよびナ
ルウィルス（３１ｍ１．ａｎ　ｖｉｒｕ３）より誘導し
たプロモーターが包含される。

また、このような表現ベクターは本発明のｒＮＦα抑制
ＤＮＡ配列の挿入のための伸々の部位をイする。これら
の部位はそれらを切断する特異的１ムリ限エンドヌクレ
アーゼにより特徴付けられる。このような切断部位は当
業者の良く知るところである。表現−にフタ−ＪＳよび
特に選択されたＤＮＡ断片の挿入のために選択されるそ
の部位、および表現制御配列へのオぼレータ−重結合は
、↑１々の特徴的要因、例えば、特定の制限酵素に感受
性の部位の数、表現される蛋白質の大きさ、精製時に除
去するのが困難な宿主細胞蛋白質により表現される蛋白
質の混圧または結合、開始／終止コドンの位置、および
他の当業者の知る要因により決定する。即ち、ベクター
およびＤＮＡ配列挿入部位の選択はこのような要因の調
和により決定され、全ての選択が特定の場合に同等にＭ
効なわけではない。

同じく、全ての宿主／ベクターの問合わせが本発明のＤ
ＮＡ配列の表現において同等に効果的に機能するわけで
はない。宿主とベクターの適合性、所望の蛋白質の回収
し易さ、　ＤＮＡ配列の表現特性およびそれにオはレー
タ−的に結合している表現制御配列、または所望の蛋白
質の表現後の修飾の必要性を含む種々の要因に応じて選
択を行なう。

ＴＮＦａ抑口１活性を有する蛋白質を表現においてコー
ドする本発明のＤＮＡ配列は一連のＤＮＡプローブを用
いてこのようなり！払配列の種々のＤＮＡライブラリで
スクリーニングすることにより単離してよい。ＤＮＡプ
ローブはアミノ酸配列決定の情報源として用いられてい
る精製天然蛋白質から調製してよい。ｎ製天然蛋白質は
例えば前述した発熱患者の尿から調製してよい。種々の
蛋白質およびアミノ酸配列断片をコードする同義性ＤＮ
Ａ配列を、例えば、レーダ（ｔ、ａｔｈｅ）プローブと
組合わせて、ＤＮＡプローブの設計に用いる。

即ち、種々のＤＮＡライブラリを検索して本発明のＴＮ
Ｆｎ抑制剤をコードするＤＮＡ配列を得る。

このようなライブラリには、染色体遺伝子バンク、およ
びＴＮＦａを産生することが示されている細胞系統また
は組織、例えば肺胞マクロファージまたは肝Ｍｉ鎗より
磨製したｃＤＮＡまたはＤＮＡのライブラリを包含する
。検索は例えばλ）＜ｔｌ　１または類似の系統（二お
ける直接の免疫表現により行ってよく、また、　ＴＮＦ
ａＩＮＨ産生細胞がわかっている場合は、ｘｅｎｏｐｕ
ｓ卵母細胞での直接表現によるＴＮＦａＬｔＪＨ％異的
ｍＲＮＡの同定により行ってよい。

攬々の従来のクローニング技術および選択技術を用いて
、本発明のＴＮＦａ抑制剤のための適切な真核細胞また
は原核細胞の宿主内での表現においてコードするＤＮＡ
配列の位置を特定してよい。これらの選択されたＤＮＡ
配列はそれ自体ＴＮＦａ抑制剤をコードする他のＤＮＡ
配列を選択するために用いてよく、また、それがコード
するＴＮＦａ　ＩＮＨの製造のための適切な真核細胞ま
たは原核細胞の宿主を形質転換するため（−適切な組換
えＤＮＡ分子中で用いてもよい。

本発明はその範囲内に、ＴＮＦ（ＩＩＮＨなコードする
一本鎖および二本鎖のＤＮＡ配列、宿主生物の形質転換
に適するこのような配列を有するベクターおよびこのよ
うなりＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を包含する。

本発明の別の特徴によればＴＮＦａ抑制剤蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列で形質転換された宿主の表現により生
じた選択的ＴＮＦα抑制活性を有する蛋白質が提供され
る。形質転換宿主内でこのような抑制剤をコードするＤ
ＮＡ配列の表現により産生される本発明のＴＨＥ抑制剤
は天然のＴｈＪＦａ　ＩＮＨと同一であるか、または、
１つ以上の欠失、置換、挿入、逆位または対立型由来ま
たはその他による付加を伴っているか、最終的（：は配
列は少なくとも８０％、好ましくは９０チのレベルで天
然ＴＮＦｄ　ＩＮＨＮＨ２Ｏ相同性を有しており、同様
の生物学的特性を維持している。特に本発明のＴＮＦ抑
制剤はＮ末端メチオニンを有していてよい。また、例え
ばＴＮＦ（Ｉ　ＩＮＨなコードする本発明のＤＮＡ配列
を表現ベクターにおいて′ＩＩＮＦａＩＮ！（コードＤ
ＮＡ配列の表現を補助するか、または宿主からのＴＮＦ
ａ　ＩＮＨの分泌、成熟または精製を助けるような真核
細胞または原核細胞のポリハプテドをコードするＤＮＡ
配列の一部と融合してよく、融合ボリホプテドは細胞内
または細胞外で、知られた方法により除去するか、また
はＴＮＦ（Ｉ　ＩＮＨな融合ボリハプチドとともに用い
てよい。

ＴＮＦ（Ｉ　ＩＮＨをコードするＤＮＡ配列で形質転換
した真核細胞および原核細胞の培養により産生されたＴ
ＮＦａＩＮＨは１次に、精製して本発明の薬学的組成物
（二相いることができる。

動物細胞で作成した場合本発明のＴＮＥａＩＮＨは糖蛋
白質であると理解されたい。しかしながら、原核細胞表
現系は未グリコジル化状態の蛋白質を産生する。さらに
、グリコジル化された蛋白質は知られた方法、例えばエ
ンドグリコシダーゼ酵素の使用により実質的に脱グリコ
ジル化してよい。

以下の制限しない実施例で本発明を説明する。

温度は全て℃であり、パーセント濃度は重ｔ／容量（Ｗ
／Ｖ　”）で示す。

ＴＮＦａ抑制検定 実施例に記載した画分のＴＮＦｎＴＮＨ活准のパーセン
トは、アクｔノマイシンＤ　（ａｃｔｉ　Ｄ）で刺激し
たネズミＬ９２９細胞による光学密ｆ　（ＯＤ）が１０
０チ抑制に相当し、アクチノマイシンＤとＴＮＦａｌＮ
Ｈとともに培養した細胞によろＯＴ）が０％ＴＮＦ抑制
の最大細胞致死に相当すると仮定して測定した。検定に
用いたＴＮＴｉ’ａけＡ、　Ｍａｒｍｅｎｏｕｔ等の「
ヒトＨ瘍１’４死因子の分子クローニングと表現および
マウス線傷壊死因子との比較」、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、　１５２、ｐ５１５（１９８５）の記載に従
い、Ｅ、　ｃｏｌｉ中で作った組換えヒトＴＮＴ？ａ　
（ｒｈＴＮＦａ　）であった。即ち、細胞毒性検定にお
けるＴＮＦａ抑制のパーセントは式（１）により計算し
た。

ＴＮＦａＩＮＨ活性のパーセント＝ 実施例　１ 尿ＴＮＦａ　Ｉ　ＮＨの精製 ａ）人尿からの蛋白質の濃縮 処置を受けない患者５人より新しく採尿して合わせた（
１５リツトル）。患者のうち２人は小細胞ａｉ惰、１人
は悪性組織球増殖症、１人は多発性筋炎、そして１人は
敗血症を有していた。

全員高熱（＞３８．５℃）を有し、尿路感染症は伴って
いなかった。尿を、分子量カットオフ約５ｋｒ＞ａのＡ
ｍ１ｃｏｎ限外濾過中空繊維上で４℃でＩ！に縮した。

ｂ）人尿からの蛋白質の沈殿 濃縮した尿を合わせて、硫酸アンモニウム濃度４０チに
なるまで４℃で一定に攪拌しながらゆっくりと硫酸塩を
添加し、固体硫酸アンモニウムで飽和させた。沈殿を遠
心分離で除去し、捨て、上澄みにさらに硫酸ナトリウム
を添加して８０％飽和にｖ４整した。遠心分離してはレ
ット状物を得て、これを２０　ｍＭリリンナトリウム（
ｐＨ７，２）および１５０ｍＭ塩化ナトリウムの１５０
−中に再懸濁した。硫酸アンモニウムを１［］］ｍＭト
リスー塩酸ｐＨ７４，２ｍＭ　Ｆ、Ｄ’ｒＡおよび５　
ｍＭ塩酸ベンズアミジンを用いて４℃で透析することに
より除去した。

ｃ　）　　ＴＮＩｉ’ａ　Ｉ　ＮＨ活性の同定実施例１
（ｂ）の半ｎ！！！画分を用いて、アクテノマイシンＤ
の存在下’ｒＮＦ感受性細胞系統Ｌ９２９における細胞
毒性検定を行なった。半精製画分を１＝２０に希釈した
場合、観察されたｒ　ｈＴＮＦα誘発細胞毒性作用の総
抑制はＯＤ５７０ｎ、Ｉｌ値がアクテノマイシンＤのみ
の存在下で測定したもの（ＯＤｓ７ｏｎｍ　＝　１．５
）と等しくなる程のものであった。

さらに、細胞上で１：１６０まで希釈した両分に対して
も抑制作用が観察された（ＯＤｓ７ｏｎｍ　＝０．８３
）が、アクチノマイシンＤ存在下で測定された最終濃度
０．２０νｍｌにおけるｒｈＴｈＪＦａの対照値はより
低く　（ＯＤ５ｙｏｎｍ＝０．７５　）、５０チ抑制は
約ｉ：ｉｏｏの希釈で観察された（：ＯＩ）ｓ７０ｎｍ
＝　１．１０）。

アクテノマイシンＤを用いない試験において。

ＴＮＦａＩＮＨの細胞生存力に対する影響はなかった。

ｄ）　　ＴＮＦａおよびβ誘発性の細胞毒性に対するＴ
ＮＦ’（Ｉ　ＩＮＨ作用の比較 細胞毒性作用を誘発するためにある範Ｈの濃度のＴＮＦ
ａおよびＴＮＦβを用いてアクテノマイシンＤ存在下で
ＴＮＦ感受性細胞系統Ｌ９２９を用いて細胞毒性検定を
行なった。実施例１（ｂ）の半精製画分を１＝２０．１
：５０および１：８０の希釈で試験した。対照試験は、
ＴＮＦａまたはＴＮＦβサイト力インの非存在下、およ
び抑制剤の非存在下で行なった。結果は表１に示されて
おり、本発明の抑制剤はＴＮＦβ濃置が装昇するに従い
、　ＴＮＦα抑制の約５０〜２％の範囲で’ｒＮＦ”β
媒介細胞毒性に対する抑制作用もある程度示すことがわ
かる。

表　　１ ＞１．９０　　＞１．９０ ＞１．９０　　＞１．９０ Ｏ ＮＤ　　　　　ＮＤ　　　　　　１＝ＪＤ　　　　ＮＤ
ｌ、１６　　　＋６６　　　　１．４６　　　１．５９
１．３０　　＞１．９０ １．０２　　１．５１ １．７２　　　１．６８ １．２１　　　１．２２ １．０２　　＞１．９０　　　　１．７２　　　１．６
８０、＋５５　　１．０３　　　０．８４　　０．６８
０．７３　　１．７８　　　　１，６９　　　１．５１
０．５７　　０．７１　　　　０．５９　　　０．５２
０．３８　　１．７０　　　　１．７０　　　　＋３３
０．２４　　０゜４４　　　　０，５１　　　０．２４
０．３０　　１５２　　　　１．４９　　　１．１１０
．１７　　０゜５０　　　０．２６　　　０．１８２５
Ｇ ０．１９　　１．０？　　　　　１，１０　　　０．７
６０．１１　　０．１３　　　　０．１９　　　０．１
３０．０６　　１．０３　　　０．８０　　０．４７Ｍ
Ｄ　　　　ＮＤ　　　　　　ＮＤ　　　　　ＮＤ実施例
　２ 尿ＴＮＦαＩＮＨのゲル濾過 １００ｍＭ塩化ナトリウム含Ｍ５０ｒｎＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，４）で平衡させたセファクリルＳ−２０
０カラム（０，９Ｘ　６０　ｃｗｔ％Ｐｈａｒｍａｃ１
ａ　、ｔ７ｐｐｓａｌａ、スエーデン）上での４℃のゲ
ル濾過クロマトグラフィーにより精製した。蛋白質画分
試料（２０属９．０．８　ｍＡ　）をカラムに適用し、
５．４ｍＺ／時間のｆｌ′！ｉｋで同じ緩衝液で溶離さ
せた。画分（＋６５ゴ）を採取し、ＴＮＦａＩＮＨ活性
を試験した。ＴＮＦａＩＮＨ活性画分は単一ピークでゲ
ルから溶離した。

抑制活性物質は見かけの分子量が４０〜６０ｋＤａであ
った（第１図）。

実施例　３ 尿ＴＮＦａ　ｒＮＨのり（ｆｆ？ト集束イミド２酢酸（
Ｆｌｕｋａ、　Ｂｕｃｈｓ、スイス）でｐ）１７．５に
謂整した２５ｍＭビス−トリス緩衝液で平衡させたＭｏ
ｎｏ−Ｐ前充填カー）　Ａ　（ＨＲ５／２０，５ｘ２０
０ｍ　）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ｔＪｐｐｓａｌａ　
、スエーデン）上で４℃で、鋲施例１（ｂ）の半精製Ｔ
ＮＦａＩＮＩ（をクロマト集束１：付した。実施例１（
ｂ）の蛋１白画・・分１試料（５０Ｑ）をカラムに適用
しｐＨ４，０でポリ緩衝液７４／イミド２酢酸で溶離さ
せた。カラム画分（１−）を１＝１０希釈で、アクテノ
マイシンＤ（１ｐｇ７’ｍｌ　）存在下ｒｈＴＮ）ｉ’
ａ　（０，２ｎｇ／ｍｌ　）細胞毒性に対する作用を調
べた。各カラム画分の実際のｐＨは−メーターで測定し
、ＴＮＦα工ＮＨ活性の大部分はｐＨｓ、ｓ〜６１の溶
離画分に含まれていた。

これをＴＮＦａ　Ｉ　ＮＨ蛋伯Ｏ等電点と等しい。

実施例　４ 尿ＴＮＦａ　ＩＮＨのイオン交換クロマトグラフィー２
　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（−８
，０）で平衡させたＤＥＡＥセファデックスカラム（２
，６Ｘ　２０　ｃｍ、　　Ｐｈａｒｔｎａｃｉａ　、　
Ｕｐｐｓａｌａ　、スエーデン）上の４℃の陰イオン交
換クロマトグラフィーにより実施例１（ｂ）の半精製Ｔ
Ｎ、Ｆａ　Ｉ　ＮＨを精製した。０．８Ｍ塩化ナトリウ
ム含有平衡緩衝液でカラムから結合物質を溶離させた。

両分（８，０ｄ）を集め、ＴＮＦａＩＮＨ活性を試験し
、抑制画分を合わせ（１６０ｒｎｔ）、１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５，０，４×２リツトル）で透析
した０ＴＮＦａ　ｔＮＨを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐｉｆ５．０）平衡スルホプロピルセファデック
スカラム（Ｑ、８Ｘ　１５　ｅ、＊　、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　、１Ｕｐｐｓａｌａ　、スエーデン）上の４℃の
Ｉｌｌイオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した
。０．５　Ｍ塩化ナトリウム含有平衡緩衝液で結合物質
なカラムから溶離させた。両分（７，５ｒｎｔ）を集め
、ＴＮＦａＩＮＨ活性を試験し、抑制画分を合わせ、分
子量カットオフ約１０　ｋｒ）ａのＡｍ１ｃｏｎ限外ｐ
過装置で２０倍に濃縮した。

実施例　５ 尿ＴＮＦａ工ＮＨのゲル濾過 実施例４１７）　ＴＮＦｎ！ＮＨ濃縮液を、１Ｑ　Ｑｍ
Ｍｋｊｉ化ナトリウム含有５０ｍＭ）リス塩酸１）ｉ（
７，４緩衝液平衡セファクリルＳ−２００カラム（２，
６Ｘ１００α、Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　、　Ｕｐｐｓａ
ｌａ、スエーデン）上の４℃のゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより精製した。実施例４の蛋白画分試料（２００
＋ｇ）をカラムに適用し、２７ゴ／時間の流量で平衡緩
衝液で溶離した。両分（９，０ｍ１）を集め、ＴＮＦα
ＩＮＨ活性を試験し、抑制画分を合わせた。カラムは、
デキストランブルー（ＤＢ）、２０００ｋＤａ　；　ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、　６７　ｋＤａ　；卵
アルブミン（ＯＡ）、　　４５　ｋＤａ　；α−キモト
リプシノーゲン−Ａ　（ａｃＴ）　、２５　ｋＤａ　；
およびリボヌクレアーゼＡ　（ＲＮａｓｅ）、１５．５
　ｋＤａで表４に示すようにカリブレーションした。

実施例　６ 尿ＴＮＦａ　ＩＮＨのアフィニイティークロマトグラフ
イー ０．８Ｍリン酸カリウム緩衝液（…８６）中、ミリニー
クアガロース（Ｋｅｍ　Ｆｎ　Ｔｅｃ、　Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐ、、デンマーク）へ組換えヒト
ＴＮＦＱ　（１，０８９’）を結合させることによりＴ
ＮＦａアフィニティーカラムを調製した。残りの活性基
は、０．１　Ｍエタノール・アミン−塩酸膜ｇｒ１１灰
（−８，５ン中でインキュベートすることによりブロッ
クした。ゲルを、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有５０ｍ
Ｍ）リス塩酸（ｐＨ７，４）緩衝液で洗浄した（３Ｘ５
０顎）。実施例５のＴＮＦａＩＮＨ１１ｋｉ分試料（１
５＃ｌ／りをカラムに適用し、０．２　Ｍグリシ／−塩
酸（−３，５）緩衝液で溶離した。画分（１，０ｍ１）
を採取し、即座にＩＭ）すｘ　（５〜４０ｔｔｌ　）を
添加し−（ｐＨ７，０とし、ＴＮＦａ　Ｉ　ＮＨ活性を
試験した。

実施例　７ 尿ＴＮＦａＩＮＨの逆相ＦＰＬＣ 実施例６のＴＮＦａＩＮＨ画分を凍結乾燥し、０．１チ
ドリフルオロ酢酸（２，０ｍ）に溶解し、Ｑ、１チドリ
フルオロ酢酸で平衡させたＰｒｏＲＰＣ逆相ＦＰＬＣカ
ラム（５Ｘ２０ｆｉ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓ
ａｌａ、　スｚ−デン）に適用した。０゜５ｍ１分の流
量で０．１チドリフルオロ酢酸中０〜１００俤のアセト
ニトリル濃度勾配で結合物質を溶離させた。各両分（０
，７５ｍｇ）に、０．５Ｍ重炭酸アンモニウム（１０μ
／）を添加し、溶離物質を凍結乾燥した。

逆相ＦＰＬＣクロマトグラフィーはＴＮＦａＩＮＨ活性
１：相当する１つの主ピークを示した。この活性を有す
る凍結乾燥画分を２　ｍＭ　ＥＤＴＡ含１！　１０　ｍ
Ｍトリス−塩酸−Ｚ４緩衝液中に溶解し、Ｕ。

Ｌａｅｍｍｌｌ等の「ＮａｔｕｒｅＪ、２７７、ｐ６８
０（１９７０）に記載の方法を用いて、ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（８Ｄ８　Ｐ
ＡＧＥ）で分析した。ＴＮＦａ　ＴＮＨは分子量５５　
ｋＤａで溶離することかわかった（第４図）。非還元条
件で泳動した試料のＴＮＦＩ！　ＩＮＨ活性を１：１０
希釈で、ｒｈＴＮＦａ　０．１５８９存在下、Ｌ９２９
細胞に対して調べた。ｒｈＴＮＦａに対する活性物質は
、還元条件下で泳動したゲル上、５５　ｋＤａに等しい
見かけの分子量で泳動した。

実施例　８ 尿ＴＮＦ（ＩＩＮＨの蛋白質配列決定 逆相ＦＰＬＣクロマトグラフィーで単離した’ＭＦａＩ
ＮＨ画分を真空下に濃縮し、コンディショニングしたシ
ーケンサ−フィルターにスポットした。

蛋白質はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｒ１ｏｓｙｓｔｅｍｓ製４７
７Ａ型蛋白質シーケンサ−で分析した。配列決定サイク
ルの両分を蒸発乾固し、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミンアセテートおよびアセトニトリルの中に再懸濁し
、次（＝ＨＰＬＣカラムに注入して残基な同定した。

Ｎ末端の最初の１７アミノ酸残基が同定され、これは以
下の配列：　Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｎ−ａ　１　ｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−ｒ　ｌ　ｅ−
Ｈｌ　ｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｇｌ　ｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−８ｅ
ｒ−１１ｅを有していた。さらに隣接する６つのアミノ
酸がグリコジル化部位を有し、即ち、配列はＡｓｎ−８
ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓと続くものと考えられる。この配
列はＮＢＲＦ蛋白質配列データベース（１９８８年１１
月）中に含まれるどの蛋白質配列とも明らかな相同性を
有していない。

実施例　９ ＴＮＦａｌＮＨが蛋白質であることの確認ａ）時間依存
性および熱依存性 活性画分の試験管を合わせて得た実施例２のセファクリ
ル８−２００精製ＴＮＦａ　ＩＮＨを、５６℃、び６０
分後、ＴＮＦａＩＮＨ活性を測定し、未処理の試料と比
較することによりＴＮＦａ工ＮＨ活性パーセントを式（
１）に従って計算した。表２に示す結果によれば、　Ｔ
ＮＦａＩＮＨ活性が時間および温度に依存して低下して
いる。

熱不活性化 ｂ）トリプシン消化に対する感受性 １ｍＭ塩化カルシウム含有０．２　Ｍ　）リス−塩酸７
５℃および９５℃（二加熱した。１０．２０お上緩衝液
（ｐＨ８，０）中のトリプシン（５００μｇ、８１弾。

８ｔ、　Ｌｏｕｉｓ　％ＭＯ）を、実施例２のセファク
リルＳ−２００精製尿ＴＮＦａ　ＩＮＨの画分な合わせ
たものＣ二添加し、４時間３７℃でインキュベートした
。

さら４ニトリプシン（５’ＯＯμｇ）を加え、さらに２
０時間消化を継続した時点で、大豆トリプシン阻害剤（
２１ｇ、Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　、ＭＯ）を
添加して反応を終了させた。トリプシン消化物と対照群
のＴＮＦａ　ＩＮＨ抑制活性のパーセントは、アクチノ
マイシンＤ存在下ｒｈＴＮＦａ刺激Ｌ９２９細胞上、合
わせた画分の最終希釈度を１＝２０として１式（１）に
従って求めた。結果を以下の表５に示す。

トリプシン不活性化 緩衝液のみ ０．７１ ８−２００尿 トリプシン消化部分精製セフ　　　　２５　　　　１．
０５アデツクス８−２００尿 Ｃ）尿素による処理 実施例２のセファクリル８−２００ｎＩ製ＴＮＦａＩＮ
Ｈを２Ｍ尿素に調整し、２Ｍ尿素含有リン酸塩緩衝食塩
水（ＰＢＸ）で４℃で広範囲に透析した。

ＰＢＳに対する透析を反復した後、生物学的検定を行な
った。ＴＮｆｉ’αｒＮＨ活性は損なわれていないこと
がわかり、これは、抑制活性が蛋白に８．結合した低分
子量分子により媒介されないことを示している。

実施例　１０ 拮抗抑制の確認 実施例２のセファクリル８−２００精製ＴＮＦａＩ’Ｍ
Ｈを、Ｌ９２９細胞上漸増量のｒｈＴＮＦａに対して、
１：１０希釈で試験した。アッセイ中に存在するｒｈＴ
ＮＦａの量と抑制の程度との間には逆相関が観察された
（第３図）。即ち、抑制活性はｒｈＴＮＦａのａＫを上
昇させることにより拮抗的におさえられた＠ 実施例　１１ 皮膚繊維芽細胞によるＴＮＦａ−媒介ｐＧＥ２産生の抑
制 ヒト皮膚繊維芽細胞を２．０Ｘ１０’細旭／クエルの濃
度で接種し、４８時間培養した。次に細胞を、１０　％
　ＦＣ３添加ＤＭＥＭ緩衝液で刺激し、対照群とした。

また濃度範囲０．５〜５１９／−のｒｈＴＮＦａで細胞
を刺激し、実施例５のＴＮＦａｒＮＨの作用な上記した
緩衝液中３通り（１：２０．１：５０および１：８０）
の希釈で調べた。７２時間インキユベートシた後、ＰＧ
Ｅ２抗血清を用いたラジオイムノアッセイにより上澄中
のＰＥ０２生・酸量を測定した（Ｊ、　Ｍ、　Ｄａｙｅ
ｒ等、ｒＪ、　ｃｌｉｎ、　ｔｎｖｅｓｔ、Ｊ、６７、
ｐ１３８６（１９７９）参照）。

結果を下記の表４に示すが、これにより、皮膚繊維芽細
胞のＰＧＥ２産生な促進するｒｈＴＮ）ｉ’ａの能力は
全ての希釈度（二おいてＴＮＦａ　ＩＮＨ添加により抑
制されることがわかる。ＴＮＦａ　Ｉ　ＮＨの１：８０
希釈では、抑制活性はｒｈＴＮＦａ　Ｑ度の上昇により
部分的におさえられている。

０　　　５０．６±　７．４　　８８．８±　５．６　
１０３．０±　８．９５００　　　１Ｓα０±１４．１
　１２４０±　９．３　１１５．９±６．６２．０００
　　３３１．７±２８．４　２１７．肚１０．７　１５
＆７±１０．７５．０００　　３８１．７±１９．６　
２５７．２±１３．７　２５３．１±２１．２１１１．
０±９４ １１＆９−１＝７．１ １１５．３±２１．３ ２２１．６±１６０ 同じ系統の繊維芽細胞を用いて３つの異なる実験を行な
った。緩衝液またはＴＮＦａ、ＩＮＨな種々の＃＆度の
ｒｈＴＮＦｄの存在下または非存在下で１種々の濃度で
インキュベートした。培養ヒト皮膚繊維芽細胞のＰＧＥ
２産生け３８後Ｅ測定した。値は６つの培養の６恵平均
士ＳＥＭ（Ｎ＝３）である。

実施例　１２ ｒｈ’ｒＮＦ結合抑制検定 組換えヒトＴＮＦ＋”ａを、Ｆｒａｋｅｒと５ｐｅｃｋ
　’ＪｒのｒＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ
ｅｓ、　Ｃｏｍｍ、上８０、ｐ８４９（１９７８）のヨ
ートゲｙ　（ｉｏｄｏｇｅｎ）法を用いてヨウ素化した
。（１２５ｘ）−ＴＮＦａの比活性は２．２Ｘｂ１７　
ｋＤａの単一バンドを生じた。１０６細胞ずつのヒトマ
クロファージ細胞系統Ｕ９３７を、ストレプトマイシｙ
　（１００ｐｇ／ｍｌ）、ベニシリｙ（１００Ｕ／＋ｄ
）、　ｔ　Ｏ＊グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清を
加えたＲＰＭ１１６４０（Ｇｉｂｃｏ、　Ｐａ１ｓｌｅ
ｙ、スコツトランド）を含有し、さら１ｍ　０．０４　
％アジ化ナトリウムおよび（１２ｓ工）−′ＩＩＮＦａ
　Ｑ、５ｍｇを含有する培地（２００μ））中で２時間
４℃で培養した。

結合抑制は種々の濃度のＴＮＦａＩＮＨ（１：　２０１
：２００および１：２０００）を添加することにより行
なった。

非特異的結合は１００倍過剰の未標識ｒｈＴ’ｂｒＦａ
の存在下で測定し、遊離の放射能物質は、　Ｒｏｂｂ等
のｒＪ、　Ｆｘｐ、　Ｍｅｄ、　Ｊ、１５４、ｐ１４５
５（１９８９）の記載に従って油混合物を介して遠心分
離することにより結合型（１２５工）−ＴＮＦａと分け
た。細胞結合（１２５工）−ＴＮＦａはガンマカウンタ
ー（ＬＫＢ。

ＢｒＯｍｍａ、スエーデン）で測定し、以下の式（ＩＩ
）により結合抑制／セーセントを求めた。

結合抑制パーセント＝ 実施例　１３ Ｕ９３７細胞への（”　５Ｉ　］−ＴＮＦＱ結合に対す
るＴＮＦａＩＮＨの作用 〔１２５工〕−ＴＮＦａのみ、または、〔１２５工〕−
ＴＮＦａと１００倍過剰未標織ｒｈ’ｒＮＦαの存在下
、実施例１２の培地中、２０Ｃで１時間、Ｕ９３７細胞
を前インキュベートした。次にＵ９５７細胞をリン酸塩
緩衝食塩水（３Ｘ５０＋ｄ）で４℃で洗浄した。

［”２５工〕−ＴＮＦａのみとともにインキュベートし
た細胞を４パツチに分け、それぞれ実施例５のＴＮＦａ
ＩＮＨ（１：　２０．１：２００および１：２０００希
釈）および緩衝液のみとともにインキュベートした。

Ｕ９３７細胞への（１２５工’）−ＴＮＦａの特異的結
合はＴＮＦａ　（１）　５　つ（１）希釈度、１：２０
．１：２００および１　：２０００において、４℃で、
それぞれ１００チ、ａＯＳおよび６５％抑制されたこと
がわかった（Ｍ５図）。ＴＮＦａＩＮＨを含まない対照
バッチは抑制活性を示さなかった。より弱い希釈度の２
つにおける結合抑制剤は、（１２５工）−ＴＮＦａを希
釈［１：２００および１：　２０００のＴＮＦａＩＮＨ
とともに前インキュベートした後（二細施添加した場合
、それぞれ、９（ｌおよび６０チ増加したことがわかっ
た。

（１２５Ｉ）−ＴＮＦａおよび１００倍過剰の未標識Ｔ
ＮＦａの存在下で前インキュベート１−だ細胞な用いて
実験を反復し、結合抑制・セーセントを非特異的結合（
二対して補正した。

実施例　１４ 予備形成ＴＮＦａ：Ｕ９５ｎ１合体の解離実施例１２の
記載（二従い、（ｔ２５Ｉ）−ＴＮＦａの存在下で１時
間、Ｕ９３７細胞を前インキュベートした。細胞を洗浄
し、実施例５のＴＮＦａ　Ｉ　ＮＨの存在下または非存
在下で、４℃または５７℃でインキュベートした。細胞
表面結合〔１２５Ｉ〕−ＴＮＦａは、ＴＮＩ？αＩＮＨ
の非存在下よりも存在下においてより速く解離すること
がわかり、これは時間依存的および温度依存的に起こっ
た（第６図）。

実施例　１５ ＴＮＦａＩＮＨはｈｒＴＮＦαに対して蛋白分解性を有
さないことの確認 ３ｓ類の希釈度（１：２０．１：２００および１　：　
２０００）のＴＮＦ’ａＩＮＨの存在下および緩衝液の
みの存在下で１時間２０℃で〔１２５工〕−ＴＮＦａを
インキュベートした。Ｓ　ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオート
ラジオグラフィーで分析したところ　（１２５１：１−
ＴＮＦａはＴＮＦａｌＮＨの非存在下および存在下の両
方で、単一バンドとして泳動することがわかり、これに
より、抑制剤が蛋白質分解作用を有さないことが示され
た。

実施例　１６ ＩＬ−１受容体結合活性に対するＴＮＦ’αＩＮＨの作
用実施例５のＴＮＦａ　ＩＮＨの活性を、ＩＬ−１ｑま
たはＩＬ−１βにより誘発された場合のＩＬ−１／ＬＡ
Ｆ（’）ンバ細抱活性化因子）検定により調べた〔この
検定法は１つのＩＬ−１抑制蛋白質（二対して、Ｐ。

Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ等の「Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｊ、
１３９、ｐ　１５４１（１９８７）に記載されている〕
。〔５Ｈ〕−チミジン取り込みの投与量応答（胸腺細胞
増殖に応じたもの）はＩＬ−ａとＩＬ−βの両方につき
２００ｐシーまでの濃度で観察された。ｒｈＴＮＦａの
抑制が観察された濃度のＴＮＦａＩＮＨの添加によって
もＩＬ−１誘発胸腺細胞増殖に対して顕著な作用は示さ
れず、抑制がＴＮＦａのみに特異的であることが証明さ
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図は七フアクリルＳ−２００ゲル濾過による尿ＴＮ
ＦａＩＮＨ活性の特徴を示す。カラム画分（１−）はア
クチノマイシンＤ　（１，Ｏｐｇ／ｍｌ）存在下のｒｈ
ＴＮＦａ　（１，０ｎｇ／ｍｌ　）細胞毒性検定（二お
いて、その作用を１：１０希釈で試験した（〇−〇）。 線（−）は両分のＯＤ２８０ｎｍを示す。棒グラフはア
クチノマイシンＤ（（２））およびアクチノマイシンＤ
＋　ｈｒＴＮＦα（珍）の尿を含まないものに応答した
染料とり込みにより測定した細胞溶解を示している。分
子量マーカーは、デキストランブルー（ＤＢ　）、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）　、卵アルブミン（ＯＡ）、
α−キモトリプシノーゲン（ＯＣＴ）、リボヌクレアー
ゼＡ　（ＲＮａｓｅ）およびフェノールレッド（ψ−ｒ
ｅｄ）である。 第２図はＭＯｎｏ−Ｐカラム上のクロマト集速による尿
ＴＮＦαＩＮＦ活性の特徴を示す。アクチノマイシンＤ
　（１，Ｏｐｇ７ｍｌ　）の存在下ｒｈＴＮＦａ（Ｄ、
　２　ｎｇ７ｍ／）細胞毒性検定において、　１：１０
希釈で作用を調べた（○−Ｏ）。線（−）は両分のＯＤ
２８０ｎｍを示シ、＜−−−−）はその…を示す。棒グ
ラフは第１図と同様である。 第６図は、ＴＮＦａＩＮＨ活性の可逆性を示す。白まる
（○−○）はアクテノマイシンＤ　、　ｒｈＴＮＦａと
ＴＮＦａＩＮＨの存在下で測定したＯＤ５７０ｎｍを示
し。 黒まる（ｅ−４））はアクテノマイシンおよびｒｈＴＮ
Ｆａのみの存在下で測定したＯＤ５７０ｎｍを示してお
り、棒グラフ（ロ）はアクテノマイシンＤ（１，０μｇ
７’ｍｌ　）のみの存在下のＯＤ５７０ｎｍを示してい
る。 第４図は、実施例５の精製ＴＮＦａＩＮＨのセファクリ
ルＳ−２００ゲル濾過による溶離液の特徴を示す。カラ
ム画分（９−）を滅菌し、Ｌ９２９細胞毒性においてア
クチノマイシンＤ（１，０μｇ／ｍｌ＞の存在下ｒｈＴ
ＮＦａ　（１，ＯＱ／ｌｄ　）に対して、１：５０希釈
で試験した（〇−〇）。線（−）は画分のＯＤ２ｅｏｎ
ｍを示している。棒グラフは第１図と同様である。 第５図は実施例７の精製ＴＮＦａＩＮＨの５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析を示す。５ＤＳ−ＰＡＧＥはＶ、　Ｌａｅｍｍ
ｌｉ等（ｒｆｔｈｔｕｒｅＪ、２７７（前出）の記載に
従って行った。６％積層（スクッキング）ゲルとともに
１５チポリアクリルアミドゲル上に試料を適用し、ゲル
はＣｏＭｅｒｒｉｌ等のｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ　。 ７６、ｐ４３３５（１９７９）に記載のとおり、銀染色
した。非還元条件で泳動した試料の生物活性は、ゲルを
２１１Ｉにスライスし、２　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有１０ｍ
Ｍ）リス塩酸−７，４（総量２００μ））中で一夜イン
キユベートして蛋白質を溶離させることにより調べたｏ
　ｒｈＴＮＦａ　（（Ｌ　１５　ｎｇ／’ｍＪ　）の存
在下Ｌ９２９細旭上１：１０希釈で両分を試験した。 第６図はＵ９３７細廁への（１２５Ｉ］−ＴＮＦα結合
Ｃ：対する’ｒＮＦａＩＮＨの作用を示す。実施例１３
（二記載したようにＵ９３７細胞系統とともに［１２５
工］−ＴＮＦａの存在下３つの異なる希釈でＴＮＦａＩ
ＮＨをインキュベートした。白四角（ローロ）はＴＮＦ
αＩＮＨ存在下のインキュベーションな示し、白三角（
Δ−Δ）は対照群を示す。黒いマークは細胞添加前（二
項地中（１２５Ｉ）−ＴＮＦａとともに２０ＣでＴＮＦ
ａＩＮＨを３０分間前インキュベートした試料を示して
いる。 第７図は前形成ＴＮＦＩ’α：　Ｕ９５７複合体の解離
を示す。Ｕ９３７細胞を（’　２５Ｉ　）−ＴＮＦａと
とも孟二前インキュヘートし、洗浄し、４℃（ローロ）
または３７℃（−一■）で、実施例１４の記載のとおり
ＴＮＦａ　ＩＮＨとともにインキュベートした。示され
た時間に、細胞結合放射能を測定し、パーセント特異的
結合を測定した。グラフ上で、抑制剤を含まない対照群
で得られた数値は２つの温度において得られた値から差
し引かれており、従って、１００％は、ＴＮＦａｌＮＨ
無添加で得られた値に相当する。 特許出願人　　グラクン・グループ・リミテッド外２名 ００５７０ｎｎｎ　【測定したＴＮＦα纒乾膚幡の抑制
００２ＥＩＯｎｒｎ−一一一 ％ＴＮＦαＩＮＨ １／２゜ １／２００ １／２ｏＯ０ ＩＧ　７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α−媒介活性を抑制するが
   ＴＮＦの生物学的活性のある特定のものであるが全てで
   はないものをＴＮＦと共通して持つている他の蛋白質を
   ブロックはしない蛋白質。 ２）腫瘍壊死因子α−媒介活性を選択的に抑制し、下記
   の特徴： （ａ）モレキユラーシーブクロマトグラフイーで測定し
   た分子量が４０〜６０ｋＤａの範囲にあり； （ｂ）クロマト集束法（クロマトフォーカス）により測
   定した等電点（ｐＩ）が５．５〜６．１の範囲にあり； （ｃ）アクチノマイシンＤで処理したネズミＬ９２９細
   胞に対する特異的細胞毒性の標準ＴＮＦアツセイの抑制
   ； （ｄ）ヒト繊維芽細胞および骨膜細胞からのＴＮＦ誘導
   ＰＧＥ＿２放出の抑制； （ｅ）抑制剤がＴＮＦαのＵ９３７細胞（単細胞腫瘍系
   統）への結合を妨害することが、放射標識ＴＮＦα（１
   ２５＿Ｉ＿−＿Ｔ＿Ｎ＿Ｆ＿α）の結合の抑制により明
   らかであること； （ｆ）前形成されたＴＮＦα：Ｕ９３７細胞複合体の解
   離が温度依存的に抑制剤により促進されること； （ｇ）抑制剤は蛋白質分解によりＴＮＦを分解しないこ
   と； （ｈ）抑制剤はＩＬ−１受容体結合活性、例えば、放射
   標識ＩＬ−１（＾１＾２＾５Ｉ−ＩＬ−１ａ）のネズミ
   胞腺腫細胞準系統ＥＬ４−６．１．への結合を抑制しな
   いこと； の１つまたはそれ以上を有する蛋白質。 ３）腫瘍壊死因子α−媒介活性を選択的に抑制し、下記
   の特徴： （ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量約３３ｋＤａ
   ； （ｂ）クロマト集束法（クロマトフォーカス）により測
   定した等電点（ｐＩ）が５．５〜６．１の範囲にあり； （ｃ）アクチノマイシンＤで処理したネズミＬ９２９細
   胞に対する特異的細胞毒性の標準ＴＮＦアツセイの抑制
   ； （ｄ）ヒト繊維芽細胞および骨膜細胞からのＴＮＦ誘導
   ＰＧＥ＿２放出の抑制； （ｅ）抑制剤がＴＮＦαのＵ９３７細胞（単細胞腫瘍系
   統）への結合を防害することが、放射標識ＴＮＦα（１
   ２５＿Ｉ＿−＿Ｔ＿Ｎ＿Ｆ＿α）の結合の抑制により明
   らかであること； （ｆ）前形成されたＴＮＦα：Ｕ９３７細胞複合体の解
   離が温度依存的に抑制剤により促進されること； （ｇ）抑制剤は蛋白質分解によりＴＮＦを分解しないこ
   と； （ｈ）抑制剤はＩＬ−１受容体結合活性、例えば、放射
   標識ＩＬ−１（＾１＾２＾５Ｉ−ＩＬ−１α）のネズミ
   胸腺腫細胞準系統ＥＬ４−６．１．への結合を抑制しな
   いこと；の１つまたはそれ以上を有する蛋白質。 ４）特徴（ａ）〜（ｂ）を特徴（ｃ）〜（ｈ）のうちの
   １つ以上とともに有するような請求項２または３のいず
   れかに記載の蛋白質。 ５）特徴（ａ）〜（ｈ）を全て有する請求項２または３
   のいずれかに記載の蛋白質。 ６）天然に存在するＴＮＦα抑制剤に相当する請求項１
   〜５のいずれか１項に記載の蛋白質。 ７）下記： Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌ
   ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｃｙ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅのアミノ末端アミノ酸配列
   を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋白質。 ８）下記： Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇ
   ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
   ｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ
   −Ｔｈｒ−Ｌｙｓのアミノ末端アミノ酸配列を有する請
   求項７記載の蛋白質。 ９）アミノ酸配列が１つまたはそれより多い欠失、置換
   、挿入、逆位または対立型由来またはその他の付加を含
   み、形成した配列は親蛋白質とは少なくとも８０％の相
   同性を有しており、そして親蛋白質と実質的に同じ生理
   学的特性を維持している請求項１〜８のいずれか１項に
   記載の蛋白質。 １０）親蛋白質との相同性を少なくとも９０％有してい
   る請求項９記載の蛋白質。 １１）実質的に均質である請求項１〜１０のいずれか１
   項記載の蛋白質。 １２）組み換え蛋白質である請求項１〜１１のいずれか
   １項に記載の蛋白質。 １３）グリコシル化蛋白質である請求項１〜１２のいず
   れか１項に記載の蛋白質。 １４）実質的に未グリコシル化状態の請求項１〜１２の
   いずれか１項に記載の蛋白質。 １５）請求項１〜１１のいずれか１項に記載した蛋白質
   のヌクレオチド配列コードを有する外因性ＤＮＡ。 １６）請求項１〜１１のいずれか１項に記載した蛋白質
   のヌクレオチド配列コードを有するｃＤＮＡ。 １７）請求項１５または１６のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡからなる組換え表現型ベクター。 １８）請求項１７記載の表現型ベクターで形質転換され
   た寄主細胞。 １９）請求項１８記載の細胞を培養し、ＴＮＦαＩＮＨ
   蛋白質を単離することを包含するＴＮＦαＩＮＨ蛋白質
   の製造方法。 ２０）請求項１９の方法により産生した組換え蛋白質。 ２１）下記段階： （ａ）発熱患者から得た尿の濃縮； （ｂ）硫酸アンモニウム沈殿； （ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー； （ｄ）陽イオン交換クロマトグラフィー； （ｅ）ゲルろ過； （ｆ）アフイニテイークロマトグラフイー；および （ｇ）逆相ＦＰＬＣ を包含するＴＮＦαＩＮＨ蛋白質調製方法。 ２２）請求項２１の方法により得た蛋白質と実質的に同
   一であるという特徴を有する蛋白質。 ２３）請求項１〜１４または請求項２２のいずれか１項
   で定義したＴＮＦα抑制剤または薬学的に許容されるそ
   の誘導体および薬学的に許容されるその担体を含有する
   薬学的組成物。 ２４）治療に用いるための請求項１〜１４または２２の
   いずれか１項に記載の蛋白質。 ２５）ＴＮＦα生産の過剰または不調が関与した症状の
   治療薬の製造に用いるための、請求項１〜１４または２
   ２のいずれか１項に記載のＴＮＦα抑制剤または薬学的
   に許容されるその誘導体を含有する薬学的製剤。