JPH03163099A - 腫瘍壊死因子（ｔｎｆ）インヒビターおよびその製造方法 - Google Patents

腫瘍壊死因子（ｔｎｆ）インヒビターおよびその製造方法

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JPH03163099A
JPH03163099A JP2190372A JP19037290A JPH03163099A JP H03163099 A JPH03163099 A JP H03163099A JP 2190372 A JP2190372 A JP 2190372A JP 19037290 A JP19037290 A JP 19037290A JP H03163099 A JPH03163099 A JP H03163099A
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tnf inhibitor
kda
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Michael T Brewer
マイクル　ティー．ブリューワー
Karin K Hale
カリン　ケイ．ヘイル
Michael W King
マイクル　ダブリュ．キング
Tadahiko Kohno
タダヒコ　コウノ
Charles Squires
チャールズ　スクワイアーズ
Robert C Thompson
ロバート　シー．トンプソン
Rebecca W Vanderslice
レベッカ　ダブリュ．バンダースライス
James Vannice
ジェームス　バニス
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皿連旦皿史豆肛 本出願は、１９９０年２月７日出願の係属中の特許出１
ｉｉＩ　ＳＮ　０７／４７９．６６１号の部分継続出願
であり、一方この出願は、１９８９年７月ｌ８日出願の
特許出願ＳＮ　０７／３８１，０８０号および１９８９
年１２月１１日出願の特許出願ＳＮ　０？／４５０，３
２９号「腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）インヒビターおよびそ
の取得方法」の部分継続出願である。
全凱夏皇且 腫瘍壊死因子は、単球およびマクロファージを含む多く
の細胞種によって産生される一群の蛋白質である。少な
くとも２種のＴＮＦ　，とくにＴＮＦαおよびＴＮＦβ
（リンホトキシン）がこれまでに報告されている。
これらの既知ＴＮＦは、炎症反応に関与する多数の様々
な標的細胞に対して重要な生理作用を有する。この蛋白
質は、線維芽細胞および滑液細胞の両者に潜在コラーゲ
ナーゼおよびプロスタグランジンＥ２を分泌させ、破骨
細胞に骨吸収を行わせる。これらの蛋白質は好中球に対
する内皮細胞の表面付着性を増大する。これらはまた内
皮細胞に凝固活性を分布させ、これらの血絣溶解能を低
下させる。さらに、これらは、酵素リボプロテインリパ
ーゼの発現を阻止することにより、脂肪細胞の活性を脂
質の貯蔵の方向から転換させる。ＴＮＦは、肝細胞に「
急性相反応物質」として知られる一群の蛋白質を合威さ
せ、またそれらは視床下部においてパイロジエンとして
働く。これらの活性を介して、ＴＮＦは、ストレス、感
染および傷害に対する生体反応に重要な役割を果たして
いると考えられてきた。たとえば、Ｐ．Ｊ．Ｓｅｌｂｙ
ら：　Ｌａｎｃｅｔ，２月２７日、１９８８年、４８３
頁；　ｌ．ｐ，　Ｓｔａｒｎｅｓ，Ｊｒ．ら：　Ａｍ．
　Ｊ．　ＣＩｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　８２　：　１
３２１（１９８８）　；Ａ．Ｏｌｉｆｆら：　Ｃｅｌｌ
，　５０　：　５５５　（１９８７）　；および八．Ｈ
ａａｇｅら：　Ｌａｎｃｅｔ＋　　２月１４日，　１９
８７年、３５５頁参照。
しかしながら、それらは正常時には有益な作用を示すに
もかかわらず、ＴＮＦの作用が有害になるような場合の
あることが明らかにされた。たとえば、動物にＴＮＦα
を注射すると敗血症性ショックの症状を起こし、細菌ま
たは細菌細胞壁の注射後には内因性ＴＮＦレベルの上昇
が認められている。
ＴＮＰはまた、腸の壊死や急性肺損傷を引き起こし、筋
蛋白質の異化を促進する。さらに、関節炎関節における
コラーゲナーゼのレベルを上昇させ、また白血球やリン
パ球の走化性や遊走を導＜　ＴＮＦの作用は、この疾患
における軟骨の崩壊や滑膜組織の増殖に関与する。した
がって、ＴＮＦは、慢性関節リウマチにおける急性期お
よび慢性期両者の免疫学的病因のメディエーターとして
働くことが考えられる。ＴＮＦはまた、内皮細胞機能を
変えることにより、ある種の凝血障害に関与する。さら
に、過剰のＴＮＦ産生がＡＩＤＳ患者に認められ、この
疾患や白血病にみられる一部の発熱、急性相反応お゜よ
びカヘキシーに関与する。
ＴＮＦが有害な作用を示すこれらのおよび他の．環境で
は、ＴＮＦ作用の阻害剤の臨床的必要性が明らかである
。全身投与するとＴＮＦインヒビターは、敗血症性ショ
ックやカへキシーに対する治療に有用である。局所的に
適用すると、このようなＴＮＰインヒビターは炎症関節
や他の炎症部位における組織崩壊を予防する。実際、こ
のようなＴＮＦインヒビターは、インターロイキンー１
　　（ＩＬ−１）インヒビターとともに投与するとさら
に有効である。
ＴＮＦの作用に対する治療的干渉のひとつの可能性は、
この蛋白質に対する標的細胞の反応のレベルにある。Ｔ
ＮＦは一般的な受容体仲介経路を介して作用するものと
思われる。すなわち、ＴＮＦがその受容体に結合する能
力を、受容体の遮断またはＴＮＦの遮断のいずれかによ
って妨害する分子であれば、ＴＮＦの作用を調節できる
と考えられる。これらの理由から、本発明者らは、この
ような様式でＴＮＦを阻害できる蛋白質および小分子を
探索してきた． 見困立隻玖 上述したように、本発明は、一般的にはＴＮＦインヒビ
ターに関し、さらに詳しくは尿由来のＴＮＦインヒビタ
ーに関する。さらに、本発明はこのインヒビターの生物
活性類縁体に関する。
本発明の目的は、ＴＮＦαに対して活性な、精製された
形のＴＮＦインヒビターを提供することにある．本発明
の他の目的は、これらのインヒビターのアミノ酸配列を
決定できる、精製された形のこれらのインヒビターを提
供することにある。さらに他の目的はある種のＴＮＦイ
ンヒビターのアミノ酸配列を提供することにある。さら
に、ＴＮＦインヒビターをコードするｍＲＮＡの細胞源
およびそのインヒビターのｃＤＮ＾を含有するｃＤＮＡ
ライブラリーを提供することが本発明の目的である。さ
らにまた、ＴＮＦ　’＜ンヒビターをコードするＤＮＡ
のゲノムクローン、およびそのＤＮＡのコード配列を提
供することが本発明の目的である。
このようなＴＮＦインヒビターの、より強力なまたは同
等な作用をもつ生物活性類縁体の同定もまた、本発明の
目的のひとつである． さらに、本発明の目的は、本明細書の述べるＴＮＦイン
ヒビターの製造のための組換えＤＮＡ系を提供すること
にある。本発明の他の目的は、ＴＮＦに対して活性を示
す医薬製剤として有用な、精製された形のＴＮＦインヒ
ビターの提供を包含する。
本発明のさらに他の目的は、ＩＬ−１およびＴＮＦの両
者に対して活性を示す医薬製剤として有用な、精製され
たＴＮＦインヒビターとＩＬ−１インヒビターの配合物
の提供を包含する。
本発明の発明者らは、ＴＮＦ阻害活性を有する少なくと
も２種のＴＮＦインヒビター蛋白質を単離した。３０ｋ
Ｄａ蛋白質と４０ｋＤａ蛋白質が精製された形で得られ
た。３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター蛋白質のアミ
ノ酸配列が得られている．４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒ
ビター蛋白質のアミノ酸配列データも得られている。３
　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターも４０ｋＤａＴＮＦ
インヒビターもいずれも新規であり、これまで記載され
ていない蛋白質である。
３０ｋＤａ蛋白質に対する遺伝手を含有するヒトゲノム
ＤＮＡクローンが得られている。この蛋白質の細胞源が
同定され、ｃＤＮＡクローンが得られ、この蛋白質に対
する遺伝子のアミノ酸配列が決定されている．さらに、
遺伝子クローンは、その蛋白質を宿主細胞中で発現させ
ることが見出されたベクター中に配置された．この蛋白
質を活性型で精製する方法も開発された． ４０ｋＤａ蛋白質を産生ずる細胞源が同定され、ｃＤＮ
Ａクローンが得られ、４０ｋＤａ蛋白質の遺伝子の核酸
配列が決定された。３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビタ
ー前駆体および４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター前
駆体の両者をコードする完全なｃＤＮＡクローンを噛乳
動物細胞中で発現させ、その細胞表面上のＴＮＦ結合部
位の増加を生じさせた。
３０ｋＤａ蛋白質の戒熟型をコードする遺伝子を大腸菌
内で発現させた。成熟４０ｋＤａ蛋白質のすべてまたは
部分をコードする３種の別個の遺伝子も大腸菌内で発現
させた。発現された３種の４０ｋＤａ蛋白質、成熟４　
０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター４　０　ｋＤａ　ＴＮ
ＦインヒビターΔ５ｌおよび４０ｋｌ）ａＴＮＦインヒ
ビターΔ５３は、それぞれＴＮＦ阻害作性を示す。ヒ｝
　［１９３７細胞により調整培地から単禽．された戒！
＄．４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターならびに４　
０　ｋＤａ　ＴＮＰインヒビター５１および４０ｋＤａ
ＴＮＦインヒビター５３を合わせて、４　０ｋＤａ　Ｔ
ＮＦインヒビターという． ３　０　ｋＤａ　ＴＮＰインヒビターはＴＮＦαを阻害
すＺ活性を示した。４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビタ
ーはＴＮＦαおよびＴＮＦβの両者に対して阻害活性を
示す。
これらの↑ＮＦインヒビターは組換えＤＮＡ技術による
大量生産が可能である。これらのインヒビターは、ＴＮ
Ｆによって仲介される病的状態の処置に有用な医薬組戒
物への使用に適している。
園園立五垂星説服 第１図はＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）の不為在下
（−・一・）および存在下（−Ｘ−Ｘ）によけるＴＮＰ
の細胞毒性検定を示す図である。様々ね濃度のＴＮＦを
、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）とともにまたはそ
れを加えないでインキユベートして、細胞毒性検定を例
ｌに記載したように実施した。
第２図は、未変性ゲルシフト検定を示し、ｒａＪはＴＮ
Ｆ単独、ｒｌ）ＪはＴＮＦ　＋　ＴＮＦインヒビター（
３０ｋＤａ）の場合である。
第３図はＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のＣｏｒ＋
Ａ−ベルオキシダーゼ染色を示す。各蛋白質約２００ｎ
ｇをｌ４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、ニトロセルロース
濾紙に移した。糖蛋白質がＣｏｎＡ−ベルオキシダーゼ
染色を用いて確認された。この図では、「ａ」は分子量
マーカー　「ｂ」はオバルブミン、「ｃ」はウシ血清ア
ルブミン、「ｄ」はＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）
である。
第４図はＴＮＰインヒビター（３０ｋＤａ）の化学的な
脱グリコシル化を示す。約２００ｎｇのＴＮＦインヒビ
ター（３０ｋＤａ）が例１に記載したようにして化学的
に脱グリコシル化された（レーンＣ）。
第５図はＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のＮーグリ
カナーゼ処理を示す。精製されたＴＮＦインヒ？ター（
３０ｋＤａ）はＢｏｌｔｏｎ−｝１ｕｎｔｅｒ試薬によ
って単離され、変性−ヨード化ＴＮＦインヒビター（３
０ｋＤａ　）は３７℃で６時間、Ｎ−グリカナーゼによ
って処理された。この図では「ａＪは未変性ＴＮＰイン
ヒビター（３０ｋＤａ）、「ｂ，は脱グリコシル化ＴＮ
Ｆインヒビター（３０ｋＤａ）である。
第６Ａ図は、２０Ｎの尿のＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　ＣＬ−６８クロマトグラフィーのＯＤｇａｏ像を示
す。
第６Ｂ図は、未変性ゲルシフト検定において、ＴＮＦイ
ンヒビター（３０ｋＤａ）がピークを示す８　０ｍＭ　
ＮａＣｌ、分画５７〜６３に相当する部分のオートラジ
オグラフィーである。
第７図は、ＴＮＦアフィニティーカラムからの０．　０
　５　Ｍリン酸ナトリウムｐＨ２．５での溶出液のＯＤ
ｔｓ。像である。
第８Ａおよび８Ｂ図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤ
ａ　）のＲＰ８精製のクロマトグラフィー像（ＯＤｚ＋
ｓおよび００■。）で、アセトニトリル約１８％の分百
２８〜３１およびアセトニトリル約２１％の分画３５お
よび３６におけるＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ　）
ピークでの分画のＬ９２９生物検定によるものである。
第８Ｂ図はＲＰ８プールノ銀染色１５％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅであり、３０ｋＤａに単一のバンドが認められる。
第９Ａ図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のＬｙ
ｓ−Ｃ消化物のべブチド精製を示す。
第９Ｂ図は、ＴＮＦインヒピター（３０ｋＤａ）のアル
キル化（＊）Ｌｙｓ−Ｃ消化物のペプチド精製を示す． 第１０図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）の２種
のアルキル化（＊）＾ｓｐ−Ｎ消化物のべブチド精製を
示す。
第１１Ａおよび第１１Ｂ図は、還元カルボキシメチル化
ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のエンドペプチダー
ゼｖ８消化物のペプチド精製を示す。
第１２図はＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のアξノ
酸配列を示す。配列中の空白は、蛋白質配列決定によっ
て残基が明確には確認されていないことを示す。Ｃ“は
残基中の３Ｈの存在によりカルボキシメチルシステイン
が確認されたことを示す。
第１３図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）の少な
くとも部分をコードするゲノムクローンのＤＮＡ配列を
示す。
第ｌ４図は、好ましいＴＮＦインヒビターの威熟アミノ
酸配列の少なくとも７０％を示している。
第１５図はＵ９３７上清中のＴＮＦインヒビターのゲル
シフト検定による検出を示す図である。
第１６図は、Ｕ９３７上清からのｈｐｆｃ分画における
ＴＮＦインヒビターの検出を示す図である。
第１７図は、例４によるノーザンプロットを示す。
第１８図は、ＴＮＦに対する脱グリコシル化ＴＮＦイン
ヒビター（３０ｋＤａ）の結合を示す。グリコシル化お
よび脱グリコシル化ＴＮＦインヒビターをＴＮＰアフィ
ゲルとインキユベートし、素通り物質とゲルの溶出液を
ＳＯＳ−ＰＡＧＥで分析した。この図においては、（１
１）は還元および酸化、素通りＴＮＦＩＮＨ　、（２１
）は還元および酸化、素通り脱グリコシル化ＴＮＦ−Ｉ
ＮＨ，　（５１）は素通り、未変性ＴＮＦ−ＩＮＨ，（
１２）は還元および酸化、ＴＮＰ−　ＩＮＨの溶出液、
（２２）は還元および酸化、脱グリコシル化ＴＮＦ−Ｉ
ＮＨ、ならびに（５２）は未変性ＴＮＦ−ＩＮＨの溶出
液を示す。
第ｌ９図は、３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの完
全アミノ酸配列を示す。
第２０図は、第１９図に示されたアミノ酸配列をコード
するｃＤＮＡ配列を示す。
第２１図は、３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの前
駆体の全ｃＤＮＡ配列を示す。
第２２図は、プラスミ｝’　ｐＴＮＦＩＸ−１中（７）
ＴＮＦ　インヒビター遺伝子の開始部付近のＤＮＡ配列
を示す。
第２３図は、ブラスクドｐＣＭＶＸＶ　βＴＮＦＢＰ−
ｓｔｏｐＡを示す。
第２４図は、プラスミ｝’　ｐＳＶＸＶＴＮＦＢＴｓｔ
ｏｐＡを示す． 第２５図は、大腸菌からの３　０　ｋＤａ　ＴＮＦイン
ヒビターのＲＰ８カラムのクロマトグラフィーにおける
ＯＤｇ＋ｓ像を示す。
第２６図は、第２５図におけるＲＰＢ分画の銀染色１４
％ＳＯＳ−ＰＡＧＥを示す。
第２７図は、ｔｌ９３７！［１胞からのＴＮＦインヒビ
ターのＲＰ８精製のクロマトグラフィーにおけるＯＤｚ
＋ｓ像を示す。Ｌ９２９生物検定の結果も棒グラフで示
す。
２個の判然としたＴＮＦインヒビターのピークが認めら
れる。
第２８図は、ＲＰＢ分画の銀染色ｌ４％ＳＯＳ−ＰＡＧ
Ｅを示す。分画番号３０は３　０　ｋＤａ　ＴＮＦイン
ヒビターを含有し、分画番号３５は４　０　ｋＤａ　Ｔ
ＮＦインヒビターを含有する。
第２９図は、尿４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの
精製のクロマトグラフィーにおける００ｍＩｓ像を示す
。
数回のＲＰ８クロマトグラフィーの第２のＴＮＦインヒ
ビターピークを合して、ＲＰ８カラムで再分析した。Ｔ
ＮＦ阻害活性は棒グラフで示す。ＯＤｚ＋ｓピークと活
性ピークの差は、検出器とフラクションコレクターの間
の間隙容量を反映している。
第３０図は、尿のＲＰＢ分画の銀染色ｌ４％ＳＯＳ−Ｐ
ＡＧＥを示す。分画番号３２は４　０ｋＤａ　ＴＮＦイ
ンヒビターを含有する． 第３ｌ図は、Ｕ９３７由来インヒビター（３０ｋＤａお
よび４０ｋＤａ）、ならびに尿由来４　０ｋＤａ　ＴＮ
Ｆィンヒビターのアミノ末端配列を示す。
第３２図は、エンドペプチダーゼｖ８消化４０ｋＤａ　
ＴＮＦインヒビターのペプチド精製を示す。
第３３図は、エンドペプチダーゼＡｒｇ−Ｃ消化４　０
　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターのペプチド精製を示す。
第３４図は、トリプシン消化＾ｒｇ−Ｃ１６ベプチドの
ペプチド精製を示す。
第３５図は、キモトリブシン消化Ａｒｇ−Ｃ１６ペプチ
ドのべブチド精製を示す。
第３６図は、４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの一次
構造を示す。
第３７図は、４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターのｃ
ＤＮＡ配列の一部と、その予想されるアミノ酸翻訳生戒
物を示す。
第３８図は、４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの全ア
ミノ酸配列を示す。
第３９図は、４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター前駆体
の全ｃＤＮＡ配列と、その予想される翻訳生成物を示す
。
第４０図は、４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター（○
−○）　、３　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター（●−●
）ノ存在下、およびインヒビターの不存在下（　Ｘ　−
　Ｘ　）におけるＴＮＦβ（リンホトキシ）の細胞毒性
検定である。
第４１図は、第２１図に示した３　０　ｋＤａ　ＴＮＦ
インヒビターｃＤＮＡ配列のＣＯＳ　７細胞中での発現
を示す，　ＣＯＳ細胞をＦｅｉｇｎｅｒら（Ｐｒｏｃ．
　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　８４　：
　７４１３．　１９８７）のりポフェクション法を用い
てプラスミドでトランスフエクトした。
３Ｘ１０’個の細胞を比活性５．　６　Ｘ　１　０　’
ｃｐＩＩＩ／　ｎｇで（　”’１）ＴＮＦ　ａの指示量
のインキエベートし、細胞への結合量を測定した．白い
記号は、４゜Ｃで４時間インキエベートしたのちに細胞
と会合した総ｃｐｓである．黒い記号は、１８０倍過剰
の非標識、コールドＴＮＦａの存在下の結合（　”’　
Ｉ　）　ＴＦＮａを示す． 第４２図は、第３９図に示した４　０ｋＤａ　ＴＮＦイ
ンヒビターｃＤＮＡ配列のＣＯＳ　Ｔ中での発現を示す
。
検定条件は第４１図の場合と同じであった。黒い記号は
１８０倍過剰の非標識、コールドＴＮＦａの存在下に結
合した（　”Ｊ　）　ＴＮＦａを示す．第４３図は、Ｐ
ＭＡおよびＰＨＡで２４時間処理したヒト単球のＨＰＬ
Ｃ　ＲＰＣ−８分画の細胞毒性検定である． 第４４図は、４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターΔ５
１のＲＰＣ−８クロマトグラフィーのパターン、（Ｂ）
分画のＳＤＳ−ポリアクリルア稟ドゲル分析、および（
ｃ）Ｌ！）２９細胞での細胞毒性検定を示す。
第４５図は、（Ａ）　４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビタ
ーΔ５３のＲＰＣ−８クロマトグラフィーのパターン、
（Ｂ）分画のＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル分析、お
よび（ｃ）Ｌ９２９細胞での細胞毒性検定を示す。
い誼　のｉ１日 本発明の現時点における好ましい態様を掲げる。
これとそれに続く実施例により、本発明の原理が明瞭に
なるものと考える。
１，　　　　　　　　るインヒビ 上述のように、本発明は、精製された形に単離されたＴ
ＮＦインヒビターに関する。本発明の一態様においては
、ＴＮＦは好ましくは尿から誘導される。さらに、本発
明は、任意の起源からの実質的に精製された、尿から単
離されたインヒビターと生物学的に同等なＴＮＦインヒ
ビターを包含する。
本明細書を通じて、ＴＮＦインヒビターまたは単にイン
ヒビターといった場合は、本明細書において同定され、
記述された各インヒビターを指すものである。
本明細書および特許請求の範囲を通して用いられる「生
物学的に同等」の語は、ＴＮＦ作用を同じ様式で妨害で
きる本発明の性質を意味するが、これは必ずしも尿から
単離される天然ＴＮＦインヒビターと同程度である必要
はない。本明細書および特許請求の範囲を通して用いら
れる「実質的に相同」の語は、以前に報告されているＴ
ＮＦインヒビターの場合以上の、尿から単離された天然
ＴＮＦインヒビターに対するホモロジーの程度を意味す
る。
ホモロジーの程度は、好ましくは７０％以上、とくに好
ましくは８０％以上、さらに好ましくは、９０％，９５
％もしくは９９％以上である。とくに好ましくはＴＮＦ
インヒビター群は、天然インヒビターと９５％以上のホ
モロジーを示す。本明細書に記述するホモロジーの百分
率は、比較される配列中の同一のアミノ酸残基が整うよ
うに並べた２つの配列の小さな方に見出されるアξノ酸
残基の百分率として計算され、この場合、Ｄａｙｈｏｆ
ｆ（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５ｔ！、１２４
頁、１９７２年、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，　Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ＋　Ｄ．Ｃ．）に記載されたように
１００個のアミノ酸中４個までの空所が整列を助けるた
めに導入できる。この記載は参考として本明細書に導入
する。また、実質的に相同の語には、記載されたインヒ
ビターに対する交差反応性によって単離される、または
その遺伝子が記述されたインヒビターの遺伝子もしくは
そのセグメントとのハイブリダイゼーションによって単
離されるＴＮＦインヒビターも包含される。
本発明の好ましいＴＮＦインヒビターは、尿から誘導さ
れ、はじめて純粋な形に単離された。本発明の適用の目
的において、本明細書に開示されたＴＮＦインヒビター
に関連して用いられる「純粋な形」または「精製された
形」の語は、ＴＮＦインヒビターではない他の蛋白質を
実賞的に含まないプレパレーションを意味する。好まし
くは、本発明のＴＮＦインヒビターは少なくとも５０％
の純度であり、さらに好ましくは７５％の純度、とくに
好ましくは８０％，９５％もしくは９９％の純度を有す
る。本発明の一態様においては、ＴＮＦインヒビター蛋
白質プレパレーションは、まずさらに精製工程を実施す
ることなく、本技術分野の熟練者がそのアミノ酸配列を
決定可能な程度に純粋である。
少なくとも２種のＴＮＦインヒビターが、例に記載した
方法によって単離された。この２種のインヒビターは、
ＳＯＳ−ＰＡＧＥで約３０ｋＤａおよび４０ｋＤａの分
子である。３０ｋＤａインヒビターは、ＤＥＡＥＣ１６
Ｂカラムから、Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中約８０１
ＩＩＭＮａＣ　ｌで溶出される。３０ｋＤａインヒビタ
ーのアミノ酸配列は第１９図に、４０ｋＤａインヒビタ
ーのアξノ酸配列は第３８図に示す。３　０　ｋＤａ　
ＴＮＦインヒビターは、ＴＮＦαの活性を阻害すること
が明らかにされた，　ＴＮＦβの活性にはほとんど影響
しない。４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターは、ＴＮ
Ｆ　ｒｘおよびＴＮＦβ（リンホトキシン）の両者に対
して有意な阻害作用を示すことが明らかにされている。
０７　　　　　　”　　　　　　インヒビ本発明の別の
態様においては、ＴＮＦインヒビターは、ヒ｝　Ｕ９３
７細胞により調整培地から単離される．２種のＴＮＦイ
ンヒビター蛋白質がこの調整培地からＷｉ認され、単離
されている。２種のＴＮＦインヒビターは３０ｋＤａお
よび４０ｋＤａ蛋白質で、これらは尿から単離された３
０ｋＤａおよび４０ｋＤａＴＮＦインヒピターと実質的
に相同であり、これらの蛋白質と生物学的に同等である
。
３　　　０ｋＤａＴＮＦインヒビ　ーの尿から単離され
た３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターは少なくとも１
個の炭水化物残基を含有する糖蛋白質である。本発明の
一態様においては、天然の３　０　ｋＤａ　ＴＮＦイン
ヒビターは脱グリコシル化される。ＴＮＦへの結合能を
維持する脱グリコシル化ＴＮＦインヒビターは本発明の
範囲に含まれる。完全または部分脱グリコシル化３　０
　ｋ”Ｄａ　ＴＮＦインヒビターが本発明に包含される
。尿から単離される脱グリコシル化３　０　ｋＤａ　Ｔ
ＮＦインヒビターは約ｌ８　ｋＤａの蛋白質である。
３０ｋＤａ蛋白質をコードすることがモ奮認された遺伝
子配列には、１８ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列から期待
される停止コドンを含んでいない。発明者らは、ｉｎ　
ｖｉｖｏ　　で生戒される蛋白質は付加的なアミノ酸配
列を含むものと考えているが、この理論はどのような限
定を意味するものでもない。
この理論によれば、コードされている蛋白質はＴＮＰ受
容体分子と思われる，　ｃＤＮＡによってコードされる
インヒビター蛋白質は、細胞膜との間隙領域に適合する
と思われる疎水性配列、および細胞膜から細胞外に延び
ると考えられるＴＮＦ結合部分を有する。この仮説に一
致し、例ｌ９に記述するように、このｃＤＮＡはＣＯＳ
細胞中で発現し、細胞上のＴＮＦ結合部位数を増大させ
る。本発明のＴＮＦインヒビターは、したがって、受容
体フラグメントまたは受容体分子の部分である。このよ
うな結合フラグメントは、他の結合／阻害分子（たとえ
ば、ＩＬ−２インヒビター）でも確認されていて、可溶
性受容体と呼ばれている。
この理論は、単離されたＴＮＦインヒビター因子の既知
配列から予想されるタンパク質の末端に相当する停止コ
ドンをヌクレオチド配列中に欠くことと一致する．これ
はまた、停止コドンがあるべき点を越えたヌクレオチド
配列が一連の疎水性アミノ酸をコードするという事実と
も一致する。
したがって、本発明は、確認され記述されたＴＮＦイン
ヒビタ一部分のみでなく、確認され本明細書に記述され
たｃＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列の任
意の部分を含むすべての蛋白質を包含する。
ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ　ーの　゜６ ヒｌ−　０９３７細胞により調整培地から単離された、
また尿中に確認された４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ
ターは、少なくともｌ個の炭水化物残基を含有する糖蛋
白質である。本発明の一態様においては、天然の４　０
　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターは脱グリコシル化される
。ＴＮＦ　αおよびＴＮＦβ（リンホトキシン）σ両者
に対する結合能を維持する脱グリコシル化ＴＮＦインヒ
ビターは本発明の範囲に含まれる。ヌ全または部分脱グ
リコシル化４０ｋＤａインヒビ多一が本発明に包含され
る。本発明者らは、４０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターは
また、可溶性受容体で主あると考えている．４０ｋＤａ
蛋白質をコードすＺことが確認されている遺伝子配列に
は、脱グリニシル化４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビタ
ーのアミノ酸配ク１から期待される停止コドンを含んで
いない。例２０に述べるように、ｃＤＮＡはＣＯＳ細胞
中で発現して、細胞上のＴＮＦ結合部位数を増大させる
。
本発明は、ヒトυ９３７細胞により調整培地からヰ離さ
れ、また尿中に確認される戒熟４０ｋＤａの且白質をコ
ードする遺伝子、ならびに、このようね遺伝子の、コー
ドされる蛋白質のＴＮＦ阻害活性力影響されない程度に
長いまたは短い部分を包含づる。第３８図を参照すれば
明らかなように、戒象４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ
ターはこの蛋白質のＣ末酪と予想される付近にプロリン
に冨んだ領域を有づる。このプロリンに冨んだ領域のす
べてまたは一部を蛋白質中に含まない４　０　ｋＤａ　
ＴＮＦインヒビターもＴＮＦインヒビターとして活性で
、本発明の範囲に包含される。このような短い蛋白質２
種を以下の例１７および２２に記述するが、これらは４
　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターΔ５１および４０ｋＤ
ａＴＮＦインヒビターΔ５３と呼ぶ。この出願に関して
一般的に４　０　ｋＤａ　ＴＮＰインヒビターといった
場合はすべて、ヒトυ９３７細胞により調整培地から単
離され、また尿中に確認される成熟４０ｋＤａ蛋白質、
ならびに４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターΔ５１お
よび４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターΔ５３を包含
する。
一般的に、少なくとも１種のＴＮＦ受容体はＴＮＦαお
よびＴＮＦβの両者を結合できるが、一方、一部のＴＮ
Ｆ受容体はＴＮＦαのみと結合できると考えられている
。これは両者ともＴＮＦ受容体部位の活性フラグメント
であると考えられる２種のＴＮＦインヒビターが確認さ
れたが、一方はＴＮＦαのみに対して活性で、他方はＴ
ＮＦαおよびＴＮＦβの両者に対して活性であるという
本発明における所見と一致する。
ＴＮＦインヒビターの組換えＤＮＡ法による製造方法を
開示する。本発明の一態様においては、活性部位は、尿
から単離されたＴＮＦインヒビターの場合と生物学的に
同等な様式で機能する。天然または合戊ＤＮＡ配列は、
このようなＴＮＦインヒビターの製造に直接使用できる
。この方法は、（ａ）　　宿主細胞にＴＮＦインヒビク
ー活性を有する蛋白質またはその前駆体の産生を指図で
きるＤＮＡ配列の製造、 （ｂ）　　宿主細胞中にトランスフエクトさせ複製させ
ることが可能で、そのＤＮＡ配列またはその前駆体の発
現に必要な作動要素を含有するベクター中へのＤＮＡ配
列のクローニング、 （ｃ）　　合或［ＩＮＡと作動要素を含有するベクター
の、ＴＮＦインヒビターまたはその前駆体をコードする
ＤＮＡを発現できる宿主細胞への移入、（２）　　ベク
ターの増幅およびインヒビターまたはその前駆体の発現
に適当な条件下での宿主細胞の培養、 （ｅＪ　　インヒビターまたはその前駆体の収穫、およ
び （ｆ）　　ＴＮＦ阻害活性をもつ蛋白質であるかまたは
処理してその蛋白質に導いたインヒビターに、活性三次
構造を取らせること、 からなる。
本発明の一態様においては、ＴＮＦは宿主細胞により前
駆体蛋白質の形で産生される。この蛋白質は、本技術分
野の通常の熟練者には一般的に知られている方法を用い
、１または２工程である蛋白質へ処理し、正しく折り畳
まれた活性ＴＮＦインヒビターに導かれる。
盤一川Ｌ配剋 この方法において使用が意図されるＤＮＡ配列について
は例６．１４Ａおよび１７にも一部述べる。
これらの配列には、合戒および天然のＤＮＡ配列ならび
にそれらの組合せが包含される。天然配列にはさらにｃ
ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡセグメントが包含される。ｃ
ＤＮＡまたはゲノムボリヌクレオチド配列によってコー
ドされる蛋白質と同一の蛋白質をコードするポリヌクレ
オチド配列を合成的に作成する手段は、本明細書の教示
に照らして、本技術分野の通常の熟練者には一般的に自
明である。ポリヌクレオチドの合戒に関する現在の技術
状態を示す例としては、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，　Ｍ．Ｄ
．＆　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．　：　Ｊ．　Ａｍ
．　ＣｈｅＩＩＩ．　Ｓｏｃ．，　１０３　：　３１８
５　（１９８１），Ｂｅａｕｃａｇｅ，　Ｓ．Ｌ．　＆
　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，　Ｍ．Ｈ．：Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎＬｅｔｔ．．　２２　．　１８５９　（１９８１
）　，　ＡＢｒオリゴヌクレオチドシンセサイザーとと
もに供給される指示書を挙げることができる。これらの
各記載は参考として本明細書に導入する。
これらの合成配列は、以下に詳述する天然配列と同一で
あるか、また異なるヌクレオチドを含有していてもよい
。一態様においては、合或配列が本発明の天然ＤＮＡ配
列に見出されるヌクレオチドと異なるヌクレオチドを含
んでいても、これらの異なる配列が尿から単離されるＴ
ＮＦインヒビターと同し一次構造を有するポリペプチド
をコードしていることが意図されている。他の態様にお
いては、異なるヌクレオチドを含有する合戒配列は、本
明細書に述べるＴＮＦインヒビターと同一の生物活性を
有するポリペプチドをコードするものである。
さらに、ＤＮＡ配列は、天然配列のフラグメント、すな
わち天然に生じ、本発明によってはじめて単離、精製さ
れたポリヌクレオチドのフラグメントであってもよい。
一態様においては、ＤＮＡ配列はｃＤＮＡライブラリー
から単離される制限フラグメントである。
別の態様においては、ＤＮＡ配列は、ヒトゲノムライブ
ラリーから単離される。この態様において有用なライブ
ラリーの例はＷｙｍａｎ　ら（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ｕｓＡ，　８２　：　２Ｂ８０
〜２８８４．　１９８５）によって記載されている。
，この態様の好ましい様式においては、天然ＤＮＡ配列
は、次の方法、 （ａ）　　ＴＮＦインヒビターを発生できる細胞好まし
くはｕ９３７細胞からのヒトｃＤＮＡライブラリーの、
そのｃＤＮＡのすべてまたは一部を増幅および発現でき
るベクターおよび細胞中での調製、 （ｂ）　　ＴＮＦインヒビター遺伝子またはその蛋白生
成物に結合できる少なくとも１種のブローブによるヒト
ＤＮＡライブラリーの試験、 （ｃ）　　インヒビターをコードする遺伝子を含有する
少なくとも１個のクローンの、その遺伝子またはその蛋
白生威物に対する少なくとも１種のプローブへの結合能
による確認、 （２）　　選ばれた１個または２個以上のクローンから
インヒビターをコードする遺伝子または遺伝子の部分の
単離、 （ｅ）　　遺伝子またはその適当なフラグメントの、そ
の遺伝子の宿主細胞中での維持および発現に必要な作動
要素への連結、 によって得られる。
上述の過程に有用な天然ＤＮＡ配列はまた次の方法、 （ａ）　　ｒｅｃ　ＢＣ＋　ｓｂｃ宿主、好ましくはＣ
ＢＳ　２　０　０中で好ましくは増殖させたヒトゲノム
ライブラリ一のｊ周製＼ （ｂ）　　ＴＮＦインヒビター遺伝子またはその蛋白生
戊物に結合できる少なくとも１種のプローブによるヒト
ゲノムライブラリーの試験、 （ｃ）　　インヒビターをコードする遺伝子を含有する
少なくとも１個のクローンの、その遺伝子またはその蛋
白生成物に対する少なくとも１種のプロープへの結合能
による確認、 （２）　　確認された１個または２個以上のクローンか
らインヒビターをコードる遺伝子の単離、（ｅ）　　遺
伝子またはその適当なフラグメントの、その遺伝子の宿
主細胞中での維持および発現に必要な作動要素への連結
、 によって確認、単離できる。
上述の過程に有用な天然ＤＮＡ配列を確認、単離する第
三の可能性のある方法は、以下の工程、すなわち、 （ａ）　　ＴＮＦインヒビターを産生ずる細胞からのｍ
ＲＮＡの調製、 （ｂ）　　このｍＲＮＡからｃＤＮＡ　（一本鎖または
二本鎖）の合戒、 （ｃ）　　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列のこの混合物中に存在す
るＴＮＦ’　Ｓンヒビター特異的ＤＮＡ配列の、第５表
に示すよピなプライマーとともにポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣを用いた増幅、 （（１）　　第５表に示す他のオリゴヌクレオチド中４
Ｓ存在する配列を含むＰＣＲ生成物のサザンブ口ッライ
ング解析を用いた確認、 （ｅ）　　このようにして確認されたＤＮＡフラグメ〉
トの、直接ＤＮＡ配列の決定を可能にするＭ１３ベクタ
ー中へのサブクローニング、 （ｆ）　　ｃＤＮ＾ライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンをヰ離するためのこれらの配列の使用、および（樽　
遺伝子またはその適当なフラグメントの、その遺伝子の
宿主動物中での維持および発現に檀要な作動要素への連
結、 を包含する。
上述の方法に使用するのに適当なＤＮＡ配列をヰ離する
には、天然蛋白質またはそのフラグメントをコードする
適当な遺伝子またはその遺伝子のセクシゴンの内側、末
端部に接近して位置する２個の制限部位を同定すること
が好ましい。次に、適当な遺伝子または遺伝子セクショ
ンを含むＤＮＡセグメントをゲノム物質の残部から適当
な制限エンドヌクレアーゼを用いて取り出す。切断後、
ＤＮＡ配列の３′および５′末端ならびイントロンエキ
ソン接合を再構築し、ＴＮＦインヒビター蛋白質のＮ一
およびＣ一末端ならびに本体をコードできて、それにそ
の作動要素を融合できる適当なＤＮＡ配列を与える。
以下の例ｌ７に記載するように、４　０ｋＤａ　ＴＮＦ
インヒビターの発現に用いられるＤＮＡ配列は、ヒ｝　
Ｕ９３７細胞により調整培地から単離され、尿中に確認
される威熟４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターをコード
する遺伝子配列から１５３または１５９個の塩基対を除
去することにより修飾できる。△５３遺伝子は完全遺伝
子のＣ末端からプロリン領域を除去して製造され、Δ５
ｌ遺伝子は３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターをコー
ドする遺伝子のＣ一末端に近づけて製造される。
これらの方法によってｃＤＮＡライブラリーから単離さ
れ、本明細書に記載の３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ
ターの少なくとも部分をコードするＤＮＡ配列は、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ．ＭＯに受付番号第
４０６４５号として寄託された。
これらの方法によってヒトゲノムＤＮＡ　ライブラリー
から単離され、本明細書に記載の３０ｋＤａＴＮＦイン
ヒビターの少なくとも部分をコードするＤＮＡ配列は、
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎＲｏｃｋｖｉｌｌｅ．　Ｍロに受付番号
第４０６２０号として寄託された． これらの方法によってｃＤＮＡライブラリーから単離さ
れ、本明細書に記載の４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ
ターの少なくとも部分をコードするＤＮＡ配列は、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，問に受付番号第６
８２０４号として寄託された。
本発明における使用が考慮されるベクターは、上述のＤ
ＮＡ配列を、好ましいまたは必要な作動要素とともに挿
入することが可能で、ついで宿主細胞に移入されこのよ
うな細胞中で複製できる任意のベクターを包含する。好
ましいベクターは、その制限部位がよく調べられていて
、そのＤＮＡ配列の転写に好ましいまたは必要な作動要
素を含有するベクターである。しかしながら、本発明の
あるＢ様では、本明細書に記載の１種もしくは２種以上
のＤＮＡ配列を含有する現時点では未発見のヘクターの
使用も想定される。とくに、これらのベクターは、以下
の特性の一部またはすべてをもっことが好ましい。すな
わち、（１）最小数の宿主生物配列を有する、（２）所
望の宿主中で安定に維持され、増殖される、（３）所望
の宿主中に高コピー数で存在できる、（４）興味ある遺
伝子を促進するように配置された調整可能プロモーター
を有する、（５）　ＤＮＡ配列が挿入される位置から離
れたプラスくド部分に存在する、選択可能な形質をコー
ドするマーカーＤＮＡ配列少なくとも１個を有する、お
よび（６）転写を停止できるＤＮＡ配列を有する、であ
る。
様々の好ましいＢ様においては、本発明のＤＮＡ配列を
含有しそれを発現できるこれらのクローニングベクター
は、様々の作動要素を含有する。本明細書に述べるこれ
らの「作動要素」には、少なくとも１つのプロモーター
、少なくともＬ個のシャイン・ダルガノ配列および開始
コドン、ならびに少なくとも１個の停止コドンが包含さ
れる。好ましくは、これらの「作動要素」にはまた少な
くとも１個のオペレーター、蛋白質を細胞内空間から排
出するための少なくとも１個のリーダー配列、レギュレ
ーター蛋白質の少なくとも１個の遺伝子、およびベクタ
ーＤＮＡの適当な転写と以後の翻訳に必要なまたは好ま
しい任意の他のＤＮＡ配列も包含する。
本発明の好ましいベクターのそれぞれには、これらの作
動要素のある種のものが存在する。必要な他の作動要素
は、本明細書の教示に基づいて本技術の通常の熟練者に
知られている方法を用い、これらのベクターに付加する
ことが意図されている。
実行に際しては、これらの各ベクターは、容易な単離、
集合、交換が可能なように構築できる．これによって、
これらの要素の組合せからの多数の機能遺伝子とＤＮＡ
配列のコード領域の集合が容易になる。さらに、これら
の要素の多くは、２種以上の宿主に適用することができ
る。また、ある好ましい態様においては、ベクターに、
レギュレーター（オペレーター）として機能できるＤＮ
Ａ配列、およびレギュレーター蛋白質をコードできる他
のＤＮＡ配列を含有させることも考慮される。
ユ土Ｌ２玉工２二ｌニ 一Ｂ様においては、これらのレギュレーターは、ある環
境条件の存在下にはＤＮＡ配列の発現を防止するように
働き、他の環境条件の存在下には、転写ついでそのＤＮ
Ａ配列によってコードされる蛋白質の発現を行わせる。
とくに、調節セグメントは、たとえばイソプロピルチオ
ーβ−Ｄ−ガラクトシドの不存在下にはＯＮ＾配列の発
現は全く起こらないかまたは起こってもきわめて低レベ
ルであるようにベクターに挿入されるのが好ましい。こ
の場合には、ＤＮＡ配列を含有する形質転換微生物は、
ＴＮＰインヒビターの発現を開始する前に所望の濃度ま
で増殖させることができる。この態様においては、所望
の蛋白質の発現は、微生物が所望の濃度に達したのちＤ
ＮＡの発現を引き起こすことができる？Ｉ質を微生物環
境に添加することによって誘導される。
ｊ　　プロモー　− 発現ベクターは、宿主生物によってそれ自身の蛋白質の
発現に使用されるプロモーターを含有しなければならな
い。ラクトースプロモーター系が通常用いられるが、他
の微生物のプロモーターも単離され、性質が明らかにさ
れていて、本技術分野の熟練者によれば、組換えＴＮＦ
インヒビターの発現に使用することが可能である． ｉＬＩＪ″　　一くネ一　一 転写ターミーネーターはこの場合、ベクターを安定化す
る働きを考慮されている。とくに、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
，　Ｍ．　＆　Ｃｏｕｒｔ＋　Ｄ．　：　Ａｎｎ．　Ｒ
ｅｖ．　Ｇｅｎｅｔ．＋４３　：　３１９〜３５３　（
１９７９）に記載されている配列の本発明への使用が考
慮できる。この記載は参考として本明細書に導入する。
ｉｖ　　　　’　　　Ｉ 好ましい態様においては、暗号領域の３′または５′末
端を、遺伝子転写体に３′または５′非翻訳配列の導入
が可能になるように再構築することが望ましいことに注
意すべきである。これらの非翻訳配列には、Ｓｃｈｍｅ
ｉｓｓｎｅｒ，　Ｕ．　＋　Ｍｃｋｅｎｎｅｙ＋　Ｋ．
，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，　Ｍ．　＆　Ｃｏｕｒｔ＋　Ｄ
．　：　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ。
１１ｆｉ：３９〜５３　（１９８４）によって同定され
たような、ｍＲＮＡを安定化する配列が包含される。こ
の記載は参考として本明細書に導入する。
ｖ　ｉボゾーム　Ａｔ 異種蛋白質の微生物発現にはある種の作動要素が必要で
ある。これには、それに限定されるものではないが、リ
ボゾーム結合部位が包含される。
リボゾーム結合部位は、Ｇｏｌｄ，　Ｌ．ら：　　Ａｎ
ｎ．　Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．，　３５　：　５５
７〜５８０　　；またはＭａｒｑｕｉｓ，Ｄ．　Ｍ．　
　ら：　Ｇｅｎｅ，　Ｑ　：　　１７５〜１８３　（１
９８６）に記載されているように、蛋白質合戒開始時に
リボゾームが認識し結合する配列であるやこの両記載は
参考として本明細書に導入する。好ましいりポゾーム結
合部位は、ＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡ　（ＡＴＧ）であ
る。
！一　一　　および　ーカプ一一 さらに、蛋白質を細胞質から分泌させるためには、適当
な分泌リーダー（シグナル）配列を、Ｗａｔｓｏｎ，　
Ｍ．　Ｅ．　：　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．＋
　１２　：　５１４５〜５工６３に記載されているよう
にＤＮＡ配列の５′末端に存在させることが好ましい。
この記載は参考として本明細書に導入する。リーダー配
列のＤＮＡは、リーダー配列がインヒビターに直接隣接
し、共有結合で連結する融合蛋白質を生戒させる位置に
、すなわち２種のＤＮＡ暗号配列の間に転写または翻訳
停止シグナルをはさまないで配置されなければならない
。リーダー配列の存在は、一部分、以下の１または２以
上の理由によって望ましい。
第一に、リーダー配列の存在は、ＴＮＦインヒビターの
宿主プロセッシングを容易にする。とくに、リーダー配
列は、最初の翻訳生成物のリーダーペブチダーゼによる
切断を指図し、リーダー配列を除去し、蛋白質活性をも
つ可能性があるアξノ酸配列を有するポリペプチドを残
す。第二に、リーダー配列の存在は、蛋白質を細胞の細
胞質から放出させることにより、ＴＮＦインヒビターの
精製を容易にする。宿主微生物の一部の種では、適当な
リーダー配列の存在が、大腸菌の場合のように、完威さ
れた蛋白質のべリプラスム間隙への移送を可能にする。
ある種の大腸菌、サツ力ロξセスならびにバチルスおよ
びシュードモナスの株では、適当なリーダー配列は蛋白
質の細胞膜の通過、細胞外培地への移送を可能にする。
この場合には、蛋白質は細胞外蛋白質から精製すればよ
い。第三に、本発明によって製造される一部の蛋白質の
場合、リーダー配列の存在は、完威された蛋白質が適当
な蛋白質活性をもつその活性構造を取るように折り畳ま
れる環境に置くために必須である。
本発明の好ましい一態様においては、ＴＮＦインヒビタ
ーをコードするＤＮＡ配列の直前に付加的ＤＮＡ配列が
配置される。付加的ＤＮＡ配列は翻３尺カプラーとして
機能できる。すなわち、これは、それと連続しているイ
ンヒビターＲＮＡのリボヅーム結合部位に直接隣接して
リボゾームを配置させる働きをするｌ？ＮＡをコードす
るＩ）ＮＡ配列である。本発明の一態様においては、翻
訳カプラーは、ＤＮＡ配列 ＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧ
ＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧ
ＡＴＴＡＡＡＴＧ および翻訳カプラーに関連した技術分野における通常の
熟練者に現在知られている方法を用いて誘導できる。
傭　　ラ　　ーミ　、一一 翻訳ターミネーターには、ここではｍＲＮＡの翻訳を停
止させる働きが考慮される．これらは．Ｋｏｈｌｉ：Ｊ
．　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．＋　ＪＪＪ：　
：　４３０〜４３９に記載されているような天然のもの
でも、またＰｅｔｔｅｒ−ｓｓｏｎ，　Ｒ．　Ｆ．　：
　Ｇｅｎｅ．　’ｉ，４　：　１５〜２７　（１９８３
）に記載されているような合成のものでもよい。この両
記載は参考として本明細書に導入する。
暢　゛　　マーカー さらに、クローニングベクターには、宿主微生物に選択
可能な性質を発現させる、たとえば薬物抵抗性マーカー
または他のマーカーのような選択可能マーカーを含有さ
せることが好ましい。本発明の一態様においては、アン
ピシリン抵抗性の遺伝子をベクター中に含有させ、一方
、他のプラスミドには、テトラサイタリン抵抗性の遺伝
子またはクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子を含有さ
せる。
このような薬物抵抗性または他の選択可能マーカーは、
一部には、形質転換体の選択を容易にすることを意図し
ている。さらにこのように選択可能マーカーのクローニ
ングベクター中における存在は、培養培地中での夾雑微
生物の増殖を防止するために利用できる。この態様にお
いては、誘導された表現型を生存のために要求する条件
下に微生物を培養することにより、形質転換宿主微生物
の純粋な培養が達成される。
本明細書に述べる作動要素は、先行文献および本明細書
の教示に基づいて、本技術分野の通常の熟練者により定
常的に選択できるものである。これらの作動要素の一般
例は、Ｂ．　Ｌｅｎｉｎ　：　　むｎｅｓ　，Ｗｉｌｅ
ｙ　＆　Ｓｏｎｓ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８３）
に記載されている。この記載は参考として本明細書に導
入する。
適当な作動要素の様々な例が上述のベクターについて見
出すことができ、また上述のベクターの基本的な性質を
論じた文献の再検討によって明らかにされる。
上述のベクターのすべての必要なまた所望の戒分部分の
合或および単離についで、本技術分野の通常の熟練者に
一般的に知られている方法によって、ベクターが組立て
られる。このようなベクターの組立ては、本技術分野の
通常の熟練者には当然の仕事、課題の範囲内にあり、多
くの実験は行わないで実行できるものと考えられる。た
とえば、類似のＤＮＡ配列がＭａｎｉａｔｉｓら：　　
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　｝！ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（
１９８４）に記載されているように、適当なクローニン
グベクターに連結されている。この記載は参考として本
明細書に導入する。
本発明のクローニングベクターの構築に際しては、ＤＮ
Ａ配列およびその付属作動要素の多重コピーが各ベクタ
ーに挿入されることに注目すべきである。このようなａ
様においては、宿主生物は、ベクターあたり、所望のＴ
ＮＦインヒビターを大量に産生ずる。ベクターに挿入さ
れるＤＮＡ配列の多重コピー数は、適当な宿主細胞に移
入され、複製、転写される得られたベクターの、そのサ
イズによる能力によってのみ限定される。
（ｂ）　　他の微生物 大腸菌以外の微生物への使用に適したベクターも本発明
では考慮される。このようなベクターを第１表に掲げる
。さらに、一部の好ましいベクターについて、以下に説
明する。
５＋ Ｈａｌｌａｗａｌｌ，Ｒ．入． シ Ｅｍｔａｇａ，　Ｓ．　Ｇａｎｇ　ｌ，　２７−４７　
（１９８０）．３７４１　　（１９７８）． １５．　Ｐａｄａｎ，　Ｋ．Ｗ．Ｃ．Ｇｅｎｅ　ｌｌ，
２７７−２８０　　（１９８３）． ２８．　Ｌｏｒｙ，　Ｓ．， ｋ Ｔａｉ， Ｐ．Ｃ．　Ｇａｎｇ　２２．　９５−１０１　（１９８
３）．（１９８４）． ｉ　シュー　モ　スベタ　ー 広範囲のダラム陰性菌内で自律複製する数種のベクター
プラスミドがシュードモナス属の宿主中のクローニング
ビヒクルとして使用するのに好ましい。これらの一部は
、Ｔａｉｔ，　Ｒ．　Ｃ．，　Ｃｌｏｓｅ，　Ｔ．Ｊ１
Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ，　Ｒ．　Ｃ．＋　ｆｌａｇｉｙａ
，　Ｍ．，　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．　Ｃ．　＆　Ｋ
ａｄｏ，　Ｃ．　Ｉ，　：　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，　１９３３年５月号、２６９　〜２７５頁、Ｐａｎ
ｏｐｏｕｌｏｓ，　Ｎ．　Ｊ．　二Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ
ｎ　ｉｎｅｅｒｉｎ　　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓＰｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．　Ｎ．Ｙ．＋　１６３〜ｌｌ３
５頁（１９８１）　、およびＳａｋａｇｕｃｈｉ，　Ｋ
．：　ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　９
６　　：３１〜４５　（１９８２）に記載されている。
各記載は参考として本明細書に導入する。
とくに好ましい構築には、Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，　
Ｍ．＋Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ＋　Ｍ．　Ｍ．，　Ｃｏ
ｌｅｍａｎ，　Ｓ．　＆　Ｔｉｍｍｉｓ，　Ｋ，Ｎ．　
：　　Ｐ１ａｓ＋＊ｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅ
ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄＣｏ＋ｕ＋＋ｅｒｃ
ｉａｌ　ｌｍ　ｏｒｔａｎｃｅ＋　Ｔｉｍｍｉｓ，　Ｋ
．　Ｎ．　＆　Ｐｕｈｌｅｒ，＾．鳩、Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉ−ｃ
ａｌ　Ｐｒｅｓ！＋（１９７９）に記載されているプラ
スミドＲＳＦ　１０１０およびその誘導体が用いられる
。この記載は参考として本明細書に導入する。ＲＳＦ　
１０１０の利点は、比較的小さな、高コピー数プラスミ
ドであって、大腸菌およびシュードモナス種の両者に容
易にトランスホームされ、安定に維持される点である。
この系では、大腸菌ｔｒｐプロモーターがＳａｋａｇｕ
ｃｈｉ，　Ｋ．：Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ．　９６：　３１〜４５　（１９Ｂ２）およびＧｒ
ａｙ＋（；，　ｌ，Ｍｃｋｅｏ％１ｎ，　Ｋ．＾．，　
Ｊｏｎｅｓ，　Ａｊ．Ｓ．，　Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．Ｈ
．　＆　Ｈｅｙｎｅｋｅｒ，　ｌ｛．Ｌ．　：　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１９８４年２月号、１６１〜
１６５頁に記載されているようにシュードモナスｌ？Ｎ
Ａポリ−メラーゼによって容易に認識されると思われる
ことから、大腸菌属について記載されているＴａｃ発現
系を使用するのが好ましい。これらの両記載は参考とし
て本明細書に導入する．転写活性は、プロモーターをた
とえば大腸菌または緑膿菌ｔｒｐプロモーターで交換す
ることによってさらに増大させることができる。さらに
、大腸菌のｌａｃ　Ｉ遺伝子も調節を行うためにプラス
ミド中に包含される． 翻訳は、任意のシュードモナス蛋白質の翻訳開始、なら
びにインヒビターの細胞内発現に起こすように選ばれた
種類の任意の高発現蛋白質の開始部位にカップリングさ
れる。
宿主シュードモナス種の制限マイナス株が利用できない
場合には、大腸菌から単離されるプラスξド構築体での
形質変換効率は低い。したがって、所望の宿主の形質転
換に先立って、Ｂａｇｄａｓａｒｉａｒ＋＋Ｈ．ら：　
Ｐｌａｓｏ＋ｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｅｎｖ
ｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄＣｏｍｍｅｒｃｉａｌ　
ｌｍ　ｏｒｔａｎｃｅ＋　Ｔｉｍｍｉｓ　＆　Ｐｕｈｌ
ｅｒ　’ｔ４、４１１〜４２２頁、Ｂｌｓｅｖｉｅｒ／
Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅ−ｄｉｃａｌ
　Ｐｒｅｓｓ　（１９７９）に記載されているように、
他の種のｒ）４株によるシュードモナスクローニングベ
クターの継代が望ましい。この記載は参考として本明細
書に導入する． ｉｉ　　バチルスベタ　ー さらに、バチルス属の宿主における好ましい発現系には
、クローニングビヒクルとしてプラスミドｐｔｌＢｌ１
０を用いる系がある．他の宿主ベクター系におけるよう
に、バチルス中で本発明のＴＮＦインヒビターを細胞内
または分泌蛋白質のいずれかとして発現させることがで
きる。本態様は両システムを包含する。バチルスおよび
大腸菌の両者で複製するシャトルベクターが、Ｄｕｂｎ
ａｕ，　Ｄ．　，　Ｇｒｙｃｚａｎ＋Ｔ１Ｃｏｎｔｅｎ
ｔｓ＋　Ｓ＋およびＳｈｉｖａｋｕｍａｒ，　Ａ．　Ｇ
．　：Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　ｉｎｅｅｒｉｎ　，第２
巻、Ｓｅｔｌｏｗ　＆｝１ｏ１１ａｎｄｅｒ　’ｔＡ、
Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　Ｎ
．　Ｙ．＋１１５〜１３１頁（１９８０）に記載されて
いるように、様々な遺伝子の構築および試験に利用でき
る。この記載は参考として本明細書に導入する。枯草菌
からのＴＮＦインヒビターの発現および分泌のためには
、α−アミラーゼのシグナル配列を好ましくは蛋白質の
暗号領域にカップリングさせる。細胞内インヒビターの
合戒のためには、移動可能なＤＮＡ配列をα−アξラー
ゼリーダー配列のりボゾーム結合部位に翻訳可能なよう
にカップリングさせる。
これらの構築体のいずれかの転写は、α−ア旦ラーゼプ
ロモーターまたはその誘導体によって指示されるのが好
ましい。このｍＦＩＬ体は天然α−アミラーゼプロモー
ターのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有するが、同様
にｌａｃオペレーター領域も導入する．ベニシリナーゼ
遺伝子プロモーターおよびＩａｃオペレーターから構築
される類似のハイブリッドプロモーターは、Ｙａｎｓｕ
ｒａ．　Ｄ．　Ｇ．　＆　Ｈｅｎ−ｎｅｒ　：　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　　ｏｆ
　ＢａｃｉｌｉｉＧａｎｅｓａｎ，　Ａ．　Ｔ．　＆　
Ｈｏｃｈ．　Ｊ．　Ａ．　　＆Ｌ　ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ．　２４９〜２６３頁（１９８４）に記載され
ているように、バチルス宿主中、調節可能な様式で機能
することが明らかにされている．この記載は参考として
本明細書に導入する．大腸菌のＩａｃ　Ｉ遺伝子も１ｌ
ｉｆｆ用にブラスミド中に包含させることができる。
ロス　瞥ジウムベ　　ー クロストリジウム中での発現に好ましい構成は、Ｓｑｕ
ｉｒｅｓ＋　Ｃ．　Ｈ．ら：　　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏ１．．１５針４６５〜４７１　（１９８４）に記載さ
れているプラスミド中、Ｈｅｅｆ−ｎｅｒ，　Ｄ．　Ｌ
．ら：　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，垣：　４６０〜４
６４（１９８４）に記載の方法により、ウェルシュ菌に
トランスホームするものである。この両記載は参考とし
て本明細書に導入する。転写はテトラサイク１、ン抵抗
性遺伝子のプロモーターにより指示させ２翻訳は、他の
宿主での使用に適当なベクターにていて先に既述した操
作と全く同様に、この同じｔｅｔ’遺伝子のシャイン・
ダルガノ配列と対合させる． ｉｖ　　　　　べ　　　一 酵母に導入された異種ＤＮＡの維持は、Ｂｏｔｓｔｅｉ
＋Ｄ．　＆　Ｄａｖｉｓ，　Ｒ．　Ｗ．　：　Ｔｈｅ　
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｔｈｅ　Ｙｅ
ａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．　Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ．　Ｓ
ｔｒａｔｈｅｒｎ．　Ｊｏｎｅｓ，　＆　Ｂｒｏａｃｈ
ｍ．６０７〜６３６頁（１９６２）に記載のように数種
の方法で行うことができる。この記載は参考として本明
細書に導入する．サツ力ロミセス属の宿主生物に用いら
れる好ましい一つの発現系では、↑ＮＦインヒビター遺
伝子を２ξクロンプラスミドに係留させる。
２ミクロンサークルの利点は、比較的高ビー数なことと
ａｉｒ’株に導入した場合の安定性である。
これらのベクターには、大腸菌での復製と選択を可能に
するｐＢＲ３２２からの複製源と少なくとも１個の抗生
物質抵抗性マーカーを組込むことが好ましい．さらに、
このプラスミドは、２竃クロン配列と酵母のＬＥＩＩ２
欠損変異体におけるのと同じ目的で働く酵母ＬＥＵ２遺
伝子を有することが好ましい。
組換えＴＮＦインヒビターを最終的に酵母中で発現させ
ることを考慮する場合には、クローニングベクターをま
ず大腸菌に移入し、ここでベクターを複製させ、ベクタ
ーを増幅したのち、取得、精製する。ついでベクターを
、ＴＮＦインヒビターの最終的発現のために酵母に移入
する。
Ｃ ＴＮＦインヒビターのｃＯＮＡは、啼乳動物細胞でこの
インヒビターを発現させるための遺伝子として働く．そ
れは、Ｋｏｚａｋ　：　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ
．＋　ｌ５　：８ｌ２５〜８１３２　（１９８７）に記
載されているようにリボゾームの結合に有効な配列をも
たねばならず、また成熟蛋白質を細胞からプロセッシン
グを受けた形で分泌させるためにリーダー配列（３（ａ
）（ｖｉ）の項参照〕をコードする能力をもたねばなら
ない。
上述の記載は参考として本明細書に導入する。完全ｃＤ
ＮＡ配列をもつＤＮＡ制限フラグメントは、Ｇｕａ−ｒ
ｅｎｔｅ．　Ｌ．　：　Ｃｅｌｌ，　ｄ　：　３０３〜
３０５　（１９８Ｂ）およびＫａｄｏｎａｇａ．　Ｊ．
　Ｔら：　Ｃｅｌｌ．５Ｊ−　：　１０７９〜１０９０
（１９８７ｉの記載のように、転写プロモーターと転写
エンハンサーを有する発現ベクター中に挿入させること
ができる。上記両記載は参考として本明細書に導入する
。インヒビターの構造発現が細胞の増殖に有害な場合に
は、プロモーターはブラスミドｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ　Ｃａｔ　Ｎｏ．２７４５０６０１）のように調
節可能にすることができる．ベクターは、Ａｕｓｕｂｅ
ｌ，　Ｆ．河．ら：　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗ
ｉｌｅｙ　（１９８７）に記載されているように完全な
ボリアデニル化シグナルをもち、このベクターから転写
されたｓ＋ＲＮＡが適当に処理されなければならない。
この記載は参考として本明細書に導入する。最後に、ヘ
クターは、大腸菌中での？Ｊｊ製および選ｔＲ．カ可能
なように、ｐＢｌ？３２２からの複製源と少なくとも１
個の抗生物質抵抗性マーカーをもたねばならない ＴＮＦを産生ずる安定な細胞系を選択するためには、発
現ベクターは薬物抵抗性マーカーのような選択可能マー
カーをもつか、またはＡｕｓｕｂｅｌら（前出）に記載
されているように、欠損細胞に対して補足遺伝子、たと
えばｄｈｆｒ一細胞系の形質転換の場合には、ジヒドロ
葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子をもたねばならな
い。また、選択可能マーカーを有する別個のブラスミド
を発現ベクターと一緒にコトランスホームすることもで
きる。
上述のようにして得られたベクターを適当な宿主細胞に
移入する。これらの宿主細胞は微生物でもまた咄乳動物
細胞でもよい。
（ｃ）微生物 外因性ＤＮＡを取り込み、その遺伝子を発現する能力の
ある任意の微生物および付属の作動要素を選択すること
が可能である。宿主生物が選択されたならば、本技術分
野の通常の熟練者に一般的に知られている方法を用いて
、ベクターを宿主生物に移入する。このような方法の例
は、ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ．　
ＮｅｗＹｏｒｋ　（１９８０）に見出すことができる．
この記載は参考として本明細書に導入する。一態様にお
いては、上述の作動要素を用い、温度調節を遺伝子発現
を調節する手段として考慮するため、形質転換は低温で
行うのが好ましい。他の態様においては、滲透圧レギュ
レーターをベクターに挿入する。この場合には、形質転
換時の塩濃度の調節が、異種遺伝子の適当な制御を保証
するために要求される．宿主微生物は通性嫌気性菌か通
性好気性菌であることが好ましい。この方法への使用が
好ましい特定の宿主には酵母および細菌が包含される。
特定の酵母としては、サツカロξセス属の酵母、とくに
ビール酵母菌を挙げることができる。特定の細菌には、
バチルス、大腸菌およびシュードモナス属の細菌、とく
に枯草菌および大腸菌を挙げることができる。他の宿主
細胞は前出の第１表に掲げた。
（２）＠乳動物細胞 ベクターは、培養咄乳細胞中に、数種の技術たとえば、
リン酸カルシウム、ＤＮＡ共沈殿、エレクトロボレーシ
ョン、またはプロトプラスト融合によって導入できる。
好ましい方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ　ら（前出）によって
記載されたリン酸カルシウムを用いる共沈殿である。
形質転換が可能で、ｃＤＮＡ配列の転写および翻訳、↑
ＮＦインヒビター前駆体のプロセッシングならびに１′
ｆｃＰ蛋白質の分泌が可能な多くの安定な細胞種が存在
する。しかしながら、分泌蛋白質のグリコシル化および
翻訳後アミノ酸残基の修飾に関しては、細胞種によって
様々である。すなわち、理想的な細胞種は、天然分子と
同じ組換えＴＮＦインヒビターを産生ずる細胞である。
８　−　　　の滓 宿主細胞はＴＮＰインヒビターの発現に適当な条件下に
培養される。これらの条件は一般に宿主細胞について特
異的で、このような細胞の生育条件に関する文献の記載
および本明細書の教示を参照して、本技術分野の通常の
熟練者には容易に決定できる．たとえば、Ｂｅｒｇｅｙ
’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ＋　８版、Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｂａｌ
ｔｉｍｏｒｅ．Ｍａｒｙｌａｎｄには細菌の培養条件に
ついての情報が記載されている。この記載は参考として
、本明細書に導入する。酵母および啼乳動物細胞につい
ての同様の情報は，ＰｏｌｌａｃＬＲ．：　Ｍａｍｍａ
ｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ＋　Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ−ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ
　（１９７５）から得られる。この記載は参考として本
明細書に導入する。ベクター中に挿入されたまたは存在
する作動要素に応じた、ＤＮＡ配列の発現の調節に必要
な条件は、形質転換および培養段階で効力を発揮する。
一態様においては、細胞は、ＤＮＡ配列の発現を阻害す
る適当な調節条件の存在下に高密度に増殖される。至適
濃度に達したときに、環境条件をＤＮＡ配列の発現に適
当な条件に変える。すなわち、ＴＮＦインヒビターの産
生を、宿主細胞のほぼ至適密度までの増殖についで、あ
る時間間隔を置いて起こし、その発現に必要な調節条件
が誘導されてからある時間後に生成したＴＮＦインヒビ
ターの収穫を行うことを考慮している。
旦一益１ （ａ）　　微生物から産生されたＴＮＦインヒビター本
発明の好ましい態様においては、組換えＴＮＦインヒビ
ターは収穫後、そしてその活性構造を取らせる前に精製
される。この態様では、蛋白質をまず精製した方が、再
生蛋白質の高収率での回収が容易になり好ましいと発明
者らは考えている。
しかしながら、別の好ましい態様においては、ＴＮＦイ
ンヒビターは精製前にその活性構造を取らせるために再
生させる。さらに他の好ましい態様ではＴＮＦインヒビ
ターは、培養培地から回収した時点で、その再生された
活性状態で存在する。
ある種の環境においては、ＴＮＦインヒビターは、宿主
微生物で発現したときにその適正な、活性構造を取って
いて、この蛋白質は細胞壁もしくは細胞膜を通過してま
たはペリブラスム間隙に移送されるものと推測される。
これは一般的に、適当なリーダー配列をコードするＤＮ
Ａが組換え蛋白質をコードするＤＮＡに連結している場
合に起こる。
ＴＮＦインヒビターがその適性な活性構造を取らない場
合には、生威したジスルフィド結合および／または生成
した非共有結合的相互作用を変性剤および還元剤たとえ
ば塩化グアニジウムおよびβ−メルカプトエタノールで
破壊したのち、ＴＮＦインヒビターを希釈し、制御され
た条件下に酸化してその活性構造を取らせる。
再生前または再生後の精製には、以下の工程のある組合
せを用いることが好ましい。すなわち、陰イオン交換ク
ロマトグラフィ−（ｍｏｎｏＱまたはＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ）　、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕ
ｐｅｒｏｓｅ）　、等電点クロマトグラフ４　−　（Ｍ
ｏｎｏＰ）および疎水的相互作用クロマトグラフィー（
オクチルまたはフヱニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ）である。
とくに有用な方法はＴＮＦを用いるアフィニティークロ
マトグラフィーである（例１参照）。
（ｂ）　　噛乳動物細胞から産生じたＴＮＦインヒビタ
補乳動物細胞から産生したＴＮＦインヒビクーは調整培
地から、イオン交換クロマトグラフィーおよび例１に記
載したようなＴＮＦを用いるアフィニティーク口マトグ
ラフィーを含む工程によって精製される。本発明の方法
および生威物には様々な修飾および変更が可能なことは
、本技術分野の熟練者には自明のとおりである。すなわ
ち、本発明は、その修飾および変更が特許請求の範囲お
よび均等の範囲に含まれるものである限り、それらは本
発明に包含することを意図している。
前に指摘したように、本発明のＴＮＦインヒビターは治
療剤としての使用を考慮するものであり、したがって医
薬的に許容される担体中に処方されるものである。本発
明の一態様においては、その分子の薬動力学的性質を改
善するために化学的に修飾することができる。たとえば
、ＴＮＦインヒビターは高分子量重合物質たとえばポリ
エチレングリコールに付着させることができる。さらに
、インターロイキンー１インヒビターは、ＴＮＦインヒ
ビターとともに投与することができる。この併用療法は
、炎症性および退行性疾患の処置にとくに有用である． 以下の実施例は、本発明の現時点での好ましい様々な態
様を例示するものである。以下の実施例に引用されたす
べての文献および参照事項は参考として本明細書に導入
する。
ＴＮＦ　α（ＴＮＦａ）の遺伝子はＢｒｉｔｉｓｈ　Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉｍｉｔｅｄ，　Ｏｘｆ
ｏｒｄ＋　Ｅｎｇｌａｎｄから購入した．　　ＤＥＡＥ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６８樹脂およびＭｏｎｏ
４　｝ＩＲ５／５，　｝ＩＲＩＯ／１０　ＦＰＬＣカラ
ムはＰｈａｒ＋＋＋ａｃｉａ，　ｒｎｃ．＋　Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ．Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　　から購入した
。Ａｆｆｉｇｅｌ−１５樹脂およびＢｉｏＲａｄ蛋白質
アッセイキットはＢｉｏＲａｄ，　Ｒｉｃｈ−ｍｏｎｄ
，　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入した，　Ｔｗｅｅｎ
　２０％炭酸水素アンモニウム、リン酸ナトリウム、Ｐ
ＭＳＦ，炭酸水素ナトリウム、ジチオスレイトールクリ
スタルバイオレットおよびアクチノマイシンＤはＳｉｇ
ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ．，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉ
ｓ，　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ＋エンドプロテナーゼＬｙｓ−
Ｃ，エンドプロテアーゼＡｓｐ−ＮおよびＴＲＩＳはＢ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉ−ｃａｌｓ，　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ＋　Ｉｎ
ｄｉａｎａから購入した。ヘキサフルオロアセトンはＩ
ＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，　ＣｏｓｔａＭｅｓａ
，　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入した。シアノゲンブ
ロミド、トリフルオ口酢酸およびグアニジン塩酸塩はＰ
ｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ
，　Ｉｌｌｉｎｏｉｓから購入した。アセトニトリルお
よびＨＰＬＣ水はＪ．Ｔ．　Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ．，　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，　Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙから購入した。尿素はＢｅｔｈｅｓｄａ　
ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，　Ｍａｒｙｌａｎｄから購入した
。〔３Ｈ〕−ヨード酢酸はＮｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕ
ｃｌｅａｒ，　８ｏｓｔｏｎ＋　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ
ｔｔｓ　　から購入した。
（”’　Ｅ　］−ＴＮＦａはＡｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌ
ｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ．１１１ｉｎｏｉｓから
購入した。組換えヒトＴＮＦａは／ｌｍｇｅｎ．Ｔｈｏ
ｕｓａｎｄ　ＯａｋＳ＋　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購
入した。ｃ８一逆相カラム（２５ｃｍＸ４．６ａｎ）は
Ｓｙｎｃｈｒｏｍ，Ｉｎｃ．，　Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，
　Ｉｎｄｉａｎａから購入した。Ｃ８一ミクロボア逆相
カラム（７μ，２２ｃｍＸ２．１圓）はＡｐ９口ｅｄ　
８ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，Ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉａから購入した。Ｃｏｒｎｉｎｇ　９
６−ウェルマイクロタイタープレートはＶＷＲ　Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂａｔａｖｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓか
ら購入した。ＭｃＣｏｙｓ　５　Ａ培地およびウシ胎仔
血清はＧｉｂｃｏ．　Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋから購入した。ＲＰＭ−１　１６４０培
地およびＬ−グルタミンはＭｅ−ｄｉａｔｅｃｈ，　Ｈ
ｅｒｎｄｏｎ，　Ｖｅｒｇｉｎｉａから購入した。トリ
プシンはＫ．　Ｃ．　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．　Ｓｔ
．　Ｌｅｎｅｘ＋　Ｋａｎｓａｓから購入した，　ＭＥ
１８０，　Ｕ９３７およびＬ９２９細胞系はＡｍｅｒｉ
ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから人手
した。
Ｂ　　ＴＮＦインヒビ　ーの ＴＮＦインヒビターの確認には２種類の検定を使用した
。ひとつは細胞毒性検定である。他はゲルシフト検定で
ある。　　゛ 工−１圃Ｕ動４匪定 細胞毒性検定は、Ｏｓｔｒｏｒｅ　＆　Ｇｉｆｆｏｒｄ
　（　Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ　Ｅｘｐ．　Ｂｉｏｌ，　Ｍｅ
ｄ．．　１６０　：　３５４〜３５８．　１９７９）お
よびＡｇｇａｒｗａｌ　＆　Ｅｓｓａｌｕ　（Ｊ．　Ｂ
ｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６２：１００００〜１００
０７．　１９８７）の記載のようにアクチノマイシンー
Ｄ処理肝１８０細胞およびＬ９２９細胞を用いて実施し
た。Ｌ９２９細胞（ｃＣＬＩ：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ
ｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は１０
％ウシ胎仔血清含有Ｍｃ−Ｃｏｙ’ｓ　５Ａ培地中に維
持した。集密培養液を、５ｍＭ　ＥＤＴＡ含有生理溶液
中０．２５％トリプシンで短時間処理し、新鮮な培地に
再懸濁した。各ウェルあたりトリプシン処理細胞約２Ｘ
１０６個を９６ーウェルプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ）に
取り、３７゜Ｃで２４時間インキエベートした．ついで
アクチノマイシンＤを終濃度０．２５μｇ　／　ｍ　ｌ
になるように加えた。２時間後に、ＴＮＦおよびＴＮＰ
インヒビターを含むサンプルをウェルに加え、同（；温
度でインキュベーシッンを一夜続けた。顕微鏡で検査し
たのち、培地を傾写し、ウェルをＰＢＳですすいだ。
次にウェルを０．　１％クリスタルバイオレット、１０
％ホルムアミドおよび１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６
．０の溶液で５分間満たし、水で完全に洗浄し、乾燥し
た。染料を５０％エタノール中０．　１　Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ４．２で抽出した。生存細胞中の染料の
吸収を、Ｋｉｎｅｔｉｃマイクロプレートリーダー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐ．　ＣＡ
）を用いて５７０ｎｍで測定した。この検定の例は第１
図に示す。ＴＮＦインヒビターの存在下には、ＴＮＦの
細胞毒性作用は低下する。
゛ルシ ゲルシフト検定には未変性ポリアクリルアミドゲル電気
泳動系を使用する。この未変性４％ゲル電気泳動はＨｅ
ｄｒｉｃｋ　＆　Ｓｍｉｔｈの記載（八ｒｃｈ．　Ｂｉ
ｏ−ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．．１２６　：　１５
５〜１６４，　１９６８）に従って実施した。ヨード化
ＴＮＦ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を例ＩＣからのＴＮＦイ
ンヒビターと０８クロマトグラフィー後に混合し、３０
分〜２時間インキユーベートした。
この混合物をヨード化ＴＮＦ単独とともに４％未変性ゲ
ル上に負荷し、電気泳動を行った。ゲルをｌＯ％酢酸で
固定し、洗浄し、フィルムを置いてラジオオートグラフ
ィーを行った。第２図に示すように、ＴＮＦとＴＮＦイ
ンヒビターの複合体はＴＮＦ単独とは異なる移動性を示
す。このゲルシフト検定はＤＥＡＥ　ＣＬ６Ｂカラムク
ロマトグラフィーの溶出液中どの分画にＴＮＦインヒビ
ターが含まれるかを決定するために使用した． Ｃ　　３　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ　ーの腎機能不全
と診断された患者からの尿２ＯｆをＡｍｉｃｏｎ　ＹＭ
５膜で２００１ＩＩｉ！．に濃縮した。ついで濃縮液を
４゜Ｃで０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｆ　，　ｐＨ７．
　５に対して透析し、ついでＪＡ１４ローターを用い１
０．００Ｏ　ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を０
．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ１．５で平衡化した
４　０　Ｘ．４．　５　Ｃｆｎ　ＤＥＡＥ　Ｓｅ−ｐｈ
ａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂカラムに負荷し、平衡化緩衝液
で溶出液のＯＤｚｉｏがベースラインに復するまで完全
に洗浄した．クロマトグラフィーは０．０２５Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−（／！，　ｐＨ７．５中０　〜０．　０　５　Ｍ
　ＮａＣｌの直線勾配を用いて行い、ＯＤｚｓ。でモニ
タリングした。カラム分画を集め、未変性ゲル検定を用
いてＴＮＦインヒビター活性を検定した。ＴＮＦインヒ
ビターは、かなり鋭いピークとして８　０ｍＭ　ＮａＣ
ｌの溶出液中に溶出した。
第６Ａ図は２Ｏｆの尿のＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
　ＣＬ−６ＢクロマトグラフィーのＯＤｚｓ。像を示す
。第６Ｂ図は相当する未変性ゲル検定のオートラジオグ
ラフィーであり、ＴＮＦインヒビターのピークが分画５
７〜６３、約８　０ｍＭ　ＮａＣｆにあることを示して
いる。
ＴＮＦインヒビターはさらにＴＮＦアフィニティーカラ
ムを用いて精製した。組換えＴＮＦはＢＬ２１／ＤＥ３
中、総細胞蛋白質約１０〜２０％で発現した。細胞ペレ
ットをフレンチプレスで２０，０００　ｐｓｉに加圧し
、可溶性物質を４゜Ｃで０．０２５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃ
Ｉ，ｐＨ８．０に対して透析した。透析された溶解質を
０．２Ｇクロン濾過し、０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−（／
！　，　ｐＨ８．　０で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ　ＦＰ
ＬＣカラム上に負荷した。
０．０２５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−（／！，　ｐＨ８．０中０
　〜０．　５　Ｍ　ＮａＣｌの直線勾配を流し、００２
１１Ｇでモニタリングした。
１　ｍｌずつの分画を集め、純度をＳＯＳ−ＰＡＧＥで
分析した。後のＴＮＦａプールは、クーマッシー染色Ｓ
ＯＳ−ＰＡＧＥに基づく純度約９０％であり、リゾチー
ムを標準として用いたＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白質検定およ
びＡｍｇｅｎのＴＮＦａを標準として用いてＭＥ１８０
バイオアツセイ　（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，　Ｍ．：　Ａｎ
ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．＋　″７２　：２４８〜２５
４．　１９７６）において完全な活性を示した。
ＴＮＦａをＡｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０
で約２５ｍｇ／ｍｆに濃縮し、１　０　０　ｍＭ　Ｎａ
ＨＣＯ３．ｐＨ８．　５に対して透析し、２　５ｍｇ　
ＴＮＦ／ｍｆ樹脂でＡｆｆｉｇｅｌ−１５にカップリン
グした。カップリング効率８０％以上を示した高能力樹
脂を用いて、ＴＮＦインヒビターをさらに精製した。
終濃度１〜４ｍＭのＰＭＳＦをＤＥＡＥ　ＣＬ−６Ｂプ
ールに加え、０．０２５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−（ｉ！．ｐＨ
７．５により４゜Ｃで平衡化したＴＮＰアフィニティー
力ラム４　Ｘ　１　ｃｍに、流速０．１ｍｆ／分で適用
した。次にカラムを、流出液の００．，。がベースライ
ンに復するまで、０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃ　ｌ　ｐ
Ｈ　７．　５で洗浄した。カラムをついで０．　０　５
　Ｍリン酸ナトリウムｐＨ２．５で溶出し、００２８０
でモニタリングした。第７図はＴＮＦアフィニティーカ
ラムからの０．　０　５　Ｍリン酸ナトリウムｐｌ＋７
．５溶出液のＯＤ！．。像を示す。
ＴＮＦインヒビターは、Ｓｙｎｃｒｏｐａｋ　ＲＰ−８
　（ｃ８）カラム上逆相ＨＰＬＣによって均一に精製し
た。ＴＮＦアフィニティー力ラムからのＯＤ２８。ピー
クをプールし、０．　１％ＴＦ＾／ＨｔＯで平衡化した
ＲＰ−８カラムに直ちに負荷し、Ｏ．　ｌ％ＴＦＡ／ア
セトニトリルの１％／分直線勾配Ｏ〜５０％を流し、Ｏ
Ｄｚ＋ｓおよび００２８０でモニタリングした。分画を
集め、例ＩＢに記載したＬ９２９細胞を用いる生物活性
と未変性ゲル検定によって検定した。これらの両検定と
も、１８％アセト二トリルにおいて溶出する００２１５
とＯＤｚａ。のピークに相当する分画２８〜３２に生物
活性を示している。
第８Ａおよび８Ｃ図はＳｙｎｃｒｏｐａｋ　ＲＰ−８カ
ラム上でのＴＮＦアフィニティープールクロマトグラフ
ィー像を、Ｌ９２９細胞毒性検定からの相当する生物活
性とともに示す。第８Ｂ図は、ＲＰ−８プールの銀染色
１５％還元ＳＯＳ−ＰＡＧＥであり、３０ｋＤａに単一
のバンドを示している。
Ｄ　　３　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ　ーの　　　　　
の亘 ３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターは、蛋白質をニト
ロセルロース濾紙上に移したのちＣｏｎＡ−ベルオキダ
ーゼを用いて検出されたように垢蛋白質である。
この方法は、アクリルアξドゲル上で直接糖蛋白質を確
認したｗｏｏｄ　＆　Ｓａｒｉｎａｔａ　（Ａｎａｌ．
　Ｂｉｏｃｈｅｍ．＋６９　：　３２０〜３２２．　１
９７５）の方法の改良法である。
糖蛋白質のべルオキシダーゼ染色は、ベルオキシダーゼ
接合ＣｏｎＡまたは非接合（：ｏｎ　Ａを用いて実施し
た。非接合Ｃｏｎ　Ａを用いた場合は、ニトロセルロー
ス濾紙を、リン酸緩衝液ｐＨ７．　２　（ＰＢＳ）中Ｃ
ｏｎ　Ａ含有（　０．　５　ｍｇ／ｍ　ｌ　ｒ　Ｍｉｌ
ｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）溶液の中で１時間インキ
ユベートシ、ＰＢｓ中テついで３×５分洗浄した。洗浄
した濾紙を西洋ワサビペルオキシダーゼ中（　０．　１
　ｍｇ／　ｍ　Ｅ　，　ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ）
　　１時間インキユベートした。ＰＢＳ中３×１５分洗
浄したのち、濾紙を３ｍｇ／一の４一クロロー１−ナフ
トール（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および１２．
５μＩｌ　／　ｍ　ｌの過酸水素を含む溶液中に、発色
するまで浸漬した。糖蛋白質は紫色として観察される。
濾紙が発色したらば直ちに、第３図に示すように撮影し
た。
ＴＮＦの化学的脱グリコシル化はＥｄｇｅ，　ＦａｌＬ
ｙｎｅｋ＋１１ｏｆ，　Ｒｅｉｃｈｅｒｔ　＆　Ｈｅｂ
ｅｒ　（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．＋　１１８　：
１３１−１３７．　１９８１）（７）方法によッテ実施
した。０．２５ｍｌ！のアニソール（Ｅａｓｔｍａｎ　
Ｋｏｄａｋ）と０．５ｍｆｆｉのトリフルオロメタンス
ルホン酸（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ）の混合物を４
゜Ｃに冷却し、ついで乾燥ＴＮＦインヒビターをこの混
合物３μｌに溶解した。試験管に窒素をフラッシュし、
ついで室温で３０分間インキユベートした。この脱グリ
コシル化蛋白質をＳＯＳ−ＰＡＧＥで分析した（第５図
）。化学処理したＴＮＦインヒビターの分子量は約１８
．０００ダルトンである。１４．０００にバンドが認め
られたが、これは脱グリコシル化ＴＮＦインヒビターの
蛋白分解フラグメントである。
Ｎ−グリカナーゼを用いる酵素的脱グリコシル化は、Ｔ
ＮＰインヒビターをＮ−グリカナーゼと一夜ではなく５
〜６時間インキユベートしたほかは、製造業者（Ｇｅｎ
ｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ．）のプロトコールに従って実施し
た。変性ＴＮＦインヒビターの脱グリコシル型の分子量
は約２０．０００ダルトンを示す（第５図）。
脱グリコシル化に先立ってインヒビターを変性しないと
、脱グリコシル化蛋白質の分子量は約２６，０００ダル
トンである。
放射標識したＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）を炭水
化物の除去のためにＴＦＭＳＡ（　１−リフルオ口メタ
ンスルホン酸）で処理し、蛋白質からＴＦＭＳＡをＨＰ
ＬＣで分離した。蛋白分画をＴＮＦ−ａｆｆ　ｉｇｅｌ
と４゜Ｃで１時間混合し、非結合物質をすべて遠心分離
で除去した。ＴＮＦ−ａｆｆｉｇｅｌを５　０ｍＭ　Ｎ
ａＰＯ．　，ｐＨ２．　５で完全に洗浄した。各分画の
放射能をカウントし、またＳＯＳ−ＰＡＧＥで分析した
。ＴＮＦインヒビターの非特異的結合を、アンヒドロキ
モトリブシンａｆｆｉｇｅｔを用いて測定した。結果を
第２表に示す。これらの結果は、脱グリコシル化ＴＮＦ
インヒビクー（３０ｋＤａ）がＴＮＦに結合することを
示している。
他の実験においては、放射標識Ｔ　Ｎ　Ｆインヒビター
　（３　０ｋＤａ　）を還元し、ついでＮ−グリカナー
ゼで脱グリコシル化した。脱グリコシル化後、得られた
物質を１３ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）と室温
で１０分間インキユベートし、５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓで
５倍に希釈した．ついでシステインを終濃度５１になる
ように加えた．混合物を４゜Ｃで１６時間インキユベー
トし、ついでＴＮＦ−ａｆｆｉｇｅｌと４゜Ｃでｌ時間
混合した。非結合物質を除去し、ゲルを５　０　ｄ　Ｔ
ｒｉｓ−ＩＣ４　．　ｐＨ　７．　５で完全に洗浄した
。結合物質を５　０　ｍＭ　ＮａＰＯａ　，ｐＨ２．　
５で溶出した。各分画の放射能を分析し、また各分画に
ついてＳＯＳ−ＰＡＧＥを実施した。第３表および第１
８図にみられるように、脱グリコシル化および再酸化Ｔ
ＮＦインヒビターはいずれもＴＮＦに結合することを示
している。
３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ　ーのＮ末端配列はＡ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓプロテインシクエ
ンサ−４７０および４７７型を用いて決定した。配列決
定の前に、様々の蛋白分解酵素から発生させたペプチド
をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃ８−旦ク
ロボアＨＰＬＣカラム（２　２ｃｍＸ２．　１ｍｍ）上
で精製した。
Ａ　　ミ　　ｒ′１゛ 逆相（ＲＰ−８）精製ＴＮＦインヒビター約２５０ｐｍ
ｏｌｅを直接ボリブレンフィルターに適用し、自動Ｅｄ
ｍａｎ分解に付した。得られた配列情報はこの分子の最
初の３０個のアミノ酸を与えた。
Ｂ　　炊　　　のエン　　ロー　−ゼＬ　ｓ−Ｃ逆相精
製ＴＮＦインヒビター約２　５　０　ｐｍｏｌｅをエン
ドプロテナーゼｌｙｓ−Ｃ　　Ｉμｇで消化した。２５
゜Ｃでｌ２時間の消化をｌＭ尿素、０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０および１　５　０　ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ．ｐＨ８
．　０の存在下に実施した。ペブチド精製に先立って、
消化物に５０倍モル過乗のジチオスレイトールを加えた
のちｌ時間インキユベートして還元するか、またはジチ
オスレイトールに加えて２倍モル過乗の〔３Ｈ〕ヨード
酢酸を用い３７゜Ｃでさらに１時間インキユベートして
還元とアルキル化を行った。第９Ａ図にはこの消化の逆
相ＨＰＬＣパターンを示す。第９Ｂ図には、この消化に
続いてアルキル化を行った場合の逆相ＨＰＬＣパターン
を示している。
Ｃ　　炊　　　のエン゛プロー　−ゼＡｓ　−Ｎ逆相精
製ＴＮＦインヒビター約２　５　０ｐｍｏｌ　（５μｇ
）を２〜５μｇのエンドブロテナーゼＡｓｐ−Ｎで消化
した。１Ｍグアニジン塩酸塩、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２
０および１５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０の存在
下、３７゜Ｃで１２〜１８時間の消化を行った。
ベプチド精製に先立って、消化物を例２，　Ｂと同様に
して、還元し、アルキル化した。第１０図には２種のこ
のような消化物の逆相ＨＰＬＣパターンを示す。
Ｄ　　　　の　ーカルボキシメチル 逆相ＨＰＬＣ精製ＴＮＦインヒビターを、Ｇｌａｚｅｒ
ら：Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　
ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ＋　１０３〜１０４頁（１９７
５）の記載と、連続２ラウンドの還元の後にアルキル化
を行ったほかは同様にして〔３Ｈ〕ヨード酢酸で還元、
カルボキシメチル化した。蛋白質は蛋白分解的消化の前
に逆相ＨＰＬＣで再精製した。
還元カルボキシメチル化ＴＮＦインヒビター５５ｐｍｏ
ｌｅ　（約１μｇ）を１　５　０　ｍＭ　ＮａＨＣＯｚ
　ｐｌＨｌ．　Ｏに溶解し、それを０．　２μｇのｖ８
プロテアーゼにより２５℃で１８時間消化して、分析的
消化を実施した。逆相ＨＰＬＣ　（第１１Ａ図）により
３個の配列可能なペプチドが見出され、さらに大規模な
消化が必要になった。還元カルボキシメチル化ＴＮＦイ
ンヒビター約２　２　０　ｐｍｏｌｅ　（４．　５　ｐ
ｇ　）を１μｇのｖ８ブロテアーゼにより２５゜Ｃで５
時間消化し、ついでさらにｖ８プロテアーゼ０．　５μ
ｇを加えて消化を１６時間続けた．第１１Ｂ図に大規模
なｖ８消化の逆相｝ＩＰＬＣを示す。
Ｆ　ペプチド　　゜　　よびｃＤＮ＾　　゛　に　づ３
　　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ　ーの６　一　　″様々な
ペプチドフラグメントを例４で得られたｃＤＮＡ配列に
従って整列させた。これを第１９図に示す．蛋白質配列
決定で同定されない残基は残基数１４．４２，４３．４
４．９６．９７，１０５．１０７．１０８および１１０
〜１１９のものであった。Ｇｌｎ−　１１ｅ−Ｇｌｕ−
Ａｓｎの配列は明らかに３０ｋＤａＴＮＦインヒビター
のカルボキシル末端である。
単球様細胞系Ｕ９３７を１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰ
Ｍ　Ｉ培地中３７゜Ｃで、細胞密度ＩＸＩＯ”細胞／ｍ
ｌまで増殖させた。ついで細胞を遠心分離で取り出し、
５個の別々の１００ｃｍ”ペトリ皿に、血？青を含まず
ｌＯｎｇ／ｍｊ２のＰＭＡ　　（ホＪレボーノレ１２ー
ミリステー１−１３−アセテート）および５μｇ／ｍｌ
　ＰＨＡ−Ｐ　（フィトヘマグルチニンーＰ）を含有す
るＲＰＭＩ中２ＸＩＯ’細胞／　ｍ　ｌの濃度で再懸濁
した。ひとつのプレートから調整培地をわずかＩＯ分の
インキュベーション後に収穫し、０時間対照として使用
した。残りのプレートからの培地は、平板培養２４時間
、４８時間、７２時問および９６時間後に順次取出した
。これらのサンプル中に含まれるタンパク質をそれぞれ
Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０　（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒ
ｐ．）処理によって約４００ｕｌに濃縮した。次に各４
００μｌのサンプルを、本発明者らの実験室で製造した
精製ヒト組換えＴＮＦａ約１０ｍｇ／ｍＡを含むＡｆｆ
ｉｇｅｌ−１５　（ＢｉｏＲａｄ　Ｃｏｒｐ．）プレパ
レーションの等容と混合した。このＴＮＦａは、Ａｆｆ
ｉｇｅｌ−１５樹脂に結合させる前にマウスＬ９２９細
胞に対するその毒性により生物活性が明らかにされてい
た． 調整培地は、ＴＮＦａアフィニティー樹脂とバッチ方式
により室温で２時間インキユベートした。樹脂を遠心分
離したのち、非結合分画を除去し、ついで樹脂を０．１
％ゼラチンを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝食塩溶液、ｐ
Ｈ７．５）１　ｍｌ　（５００μｌ５２回）で洗浄した
。結合した物質を一塩基性リン酸ナトリウムの２５ｍＭ
溶液ｐＨ２．５（４００μｌ、２回）で溶出した。非結
合、洗浄および溶出分画それぞれ４０ｕｉ！を乾燥し、
ｌｏａｆ．の２　５ｍＭ　ＴｒｉｓｐＨ７．５に再懸濁
し、２μｌ　（　１　０　０ｐｃｉ）の１２Ｓｌ−ＴＮ
Ｆａ　（　４　０　０　〜８　０　０　ｃｉ／ｍｍｏｌ
ｅ，　Ａｍｅｒｓｈａｍ）と混合し、室温で３０分間イ
ンキユベートした。これらの混合物を次に５μｌの４０
％スクロースおよび１　ｍｌの０．　１％プロモフェノ
ールブルーと混合し、例１．Ｂに記載したように４％未
変性アクリルアミドゲルに適用した．ゼロ対照を除くす
べてのサンプルからの調整培地が、第１５図に示すよう
に、この検定でＴＮＦａ結合活性を含んでいた。
各サンプルからの残りの３００μｌ（最初の低ｐＨ溶出
液）をＣＢ　ＨＰＬＣ力ラムに適用し、アセトニトリル
の直線勾配により６０分を要して溶出を行った（１％／
分、流速１ｎｆ！／分、１　ｍｌずつの分画を収集）。
各分画を乾燥し、５０μｌのＰＢＳ十０．１％ゼラチン
に再懸濁した。これらのサンプル各ＬＯｕｉ．を”’Ｉ
−ＴＮＦａと上述のように混合し、未変性ポリアクリル
アミドゲルによって分析した。
ＴＮＦａ結合活性は、第１６図に示すように、３３％お
よび３６％アセトニトリルに相当する分画に検出される
。
Ｕ９３７細胞を例３に記載したようにＩＸＩＯ’細胞／
ｍｌの濃度まで増殖し、血清を含まない培地中に、ＰＭ
Ａ（１　０ｎｇ／ｍＡ！）およびＰＨＡ（５　ｕ　ｇ／
ｍ　ｌ　）をとともにまたはそれらを加えないで、２　
Ｘ　１　０ｂ細胞／　ｍ　ｌ．に再懸濁した。サンプル
を１時間後に＋／　−　ＰＭＡ／ＰＨＡについて、１７
時間後には＋ＰＭＡ／Ｐ｝ＩＡのみについて採取した。
総ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　＆　Ｓａｃｃｉ
のグアニジニウムチオシアネートーフェノールークロロ
ホルム法により、細胞から調製した（＾ｎａｌ．　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．．　１６２　：　１５６〜１５９．１９８
７）。ポリＡ”ＲＮＡは総ＲＮＡからオリゴｄＴセルロ
ース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ
）へのア二一リングによって製造した。各ポリＡ”ＲＮ
Ａ各８μｇをついで６．６ホルムアルデヒド、１．２％
アガロースゲルに適用した。ゲル内のＲＮＡを次にツェ
ータブローブ膜（ＢｉｏＲａ２）にプロットした。膜を
例５に記載するように処理して、オリゴヌクレオチドブ
ロープでヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グした。標識一本鎖ＤＮＡブローブ（ポリヌクレオチド
キナーゼ）を添加した。このプローブの配列は ５’　　ＴＴＧＴＧＩＩ；ＣＡＣＴＴＧＧＴＡＣＡ（；
ＣＡＡＡＴ３’であり、第１３図に示す配列の塩基４１
０〜４３０に相当する。６５゜Ｃで一夜ハイブリダイゼ
ーションしたのち、膜を６　ＸＳＳＣ　０．　１％ＳＯ
Ｓ中室温で１回、同じ溶液中６５゜Ｃで１回洗浄し、つ
いでＸ線フィルムに７２時間露出した。第１７図に示し
たオートラジオダラムは、血清を含まない培地中でのυ
９３７細胞のＰＭＡ／ＰＩＩＡによる１時間の処理が、
３　０　ｋＤａ　ＴＮＦａインヒビターメッセンジャー
ＲＮＡの発現を明らかに刺激し、処理■７時間までにこ
のメッセージは実質的に消失することを指示している。
３　０　ｋＤａ　ＴＮＦａインヒビターメッセンジャー
ＲＮＡのこの実験に基づく分子サイズは約２．４キロ塩
基である。
５　　３　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ　ーのヒ　　゛ノ
ムＤＮＡ　−イブ−１−の１゛告 ヒトゲノムＤＮＡをＳａｕ　３　Ａｌで部分消化し、サ
イズ選択を行った。平均サイズ１５ＫＢのＤＮＡをバク
テリオファージラムダＣｈａｒｏｎ　３０の石旧部位に
リゲートした（Ｒｉｍｍ，　Ｄ．　Ｌ．．　Ｈｏｒｎｅ
ｓｓ，　　Ｄ．＋Ｋｕｃｅｒａ，　Ｊ．　＆　Ｂｌａｔ
ｔｎｅｒ．　Ｆ．　Ｒ．　：　Ｇｅｎｅ，１２　：　３
０１〜３０９．　１９８０）。ファージは大腸菌ＣＢＳ
　２００上で増殖させ、増幅させた。
Ａ　ブローブ 第４表に掲げた４種の縮退オリゴヌクレオチドハイプリ
ダイゼーションプローブを、ＡＩ）ｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡシンセサイザーで合威した。各プ
ローブ混合物は、与えられたペプチド配列をコードする
すべての可能なＤＮＡ配列から構成される。
オリゴヌクレオチドは、（　Ｔ−”ｐ）　ＡＴＰ　（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｃ．＋　Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈ
ｅｉｇｈｔ，　ＩＬ）およびＴ４ボリヌクレオチドキナ
ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，　ＩＮ）により、製造業者の指
示に従って比活性６　〜９　Ｘ　１　０　ｈｃ．ｐ．ｍ
．　／ｐｉｃｏｍｏｌｅに標識した。
旦一友虚 ヒトゲノムＤＮＡを含有するラムダファージ８．４×１
０５個を平板培養し、ニトロセルロース゜濾祇に二重に
移送した。これらの濾紙を１．　Ｏ　Ｍ　ＮａＣ　Ｉ！
．、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、２×デンハルト’Ｒ
ｆ＆（Ｄｅｎｈａｒｄｔ，　Ｄ．　Ｔ．：　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏ−ｍｍｕｎ
．，　２３　：　６４１〜６４６．　１９６６）、Ｏ．
　ｌ％ＳＯＳ’，　０．５％ピロリン酸ナトリウムおよ
び１　５　０　ｐｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡを含有する溶液
中、１　ｐＭｏｊ２／ｍｆのプローブＴＮＦＢＰ−２’
と、温度５２℃でハイブリダイズさせた。この温度は、
オリゴヌクレオチドプールの大部分のＡＴに富んだメン
バーについて計算されたＴｍより２゜Ｃ低い（Ｓｕｇｇ
ｓ，　ｓ．Ｖ．：ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌ
ｏｇｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ＋
　Ｂｒｏｗｎ＋　Ｄ．Ｄ．　＆Ｆｏｘ，　　Ｃ．　　Ｆ
．ｆ４，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ＋　　６８３〜６９３頁、１９８１）。ハイ
ブリダイゼーション後、濾紙を、Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ．．
０．　１　Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．５％ＳＯＳ
を３回交換して、室温で４５分間洗浄した。プールへの
大部分のＡＴに冨んだメンバーについて、計算されたＴ
ｍ　（すなわちハイプリダイゼーション温度より２゜Ｃ
高い温度）で８分間、緊縮洗浄を行った．ついで濾紙を
乾燥し、増感スクリーン１枚を用い、−７０″Ｃで４０
時間、オートラジオグラフィーに付した。
ハイブリダイズした１１個の陽性プラークを検出し、こ
れらを単離、増幅した。これらのクローンがＴＮＦＢＰ
−２０，　ＴＮＦＢＰ−Ｐ３’およびＴＮＦＢＰ−Ｐ４
にハイブリダイズする能力を同じ方法を用いて試験した
。１個のクローン（ＴＮＦＢＰ−８）が４種のすべての
オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。このクロー
ンをブラーク精製し、増幅した。ＤＮＡはこのクローン
から、Ｌａｍｂｄａ−Ｓｏｒｂ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏ
ｒｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）を用い、製造業者によ
って記述された方法で製造した。
このＤＮＡ　　１μｇをついでＳａｕ　３ＡＩで消化し
、フラグメントをＢａｍ旧で消化したＭ１３配列決定ベ
クターｍｐｌ８　（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，　Ｃ
．＋　Ｖｉｅｒａ，　Ｊ．　＆Ｍｅｓｓｉｎｇ，　Ｊ　
：　Ｇｅｎｅ．　３３　：　１０３〜１１９＋　１９８
５）中にサブクローニングした。Ｍ１３クローンを次に
ニトロセルロース濾紙に二重に移送し、前述の条件を用
いて第４表のオリゴヌクレオチドプロープにノ＼イプリ
ダイズした。陽性サブクローンを精製し、改良Ｔ４　０
ＮＡポリメラーゼ（シクエナーゼ、ＵＳＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．，　Ｃｌｏｖｅｌａｎｄ　ＯＨ）
を製造業者によって記述されたようにして使用して配列
を決定し、またそれらのプローブを用いて得られたクロ
ーンまたは配列の同定には縮退プロープのいずれかをブ
ライマーとして使用した。得られた配列には、サブクロ
ーンＴＮＦＢＰ−Ｍ１３−Ｓａｕ３Ａ−Ｐ２’−２およ
びＴＮＦＢＰ−Ｍ１３−Ｓａｕ３Ａ−Ｐ４プライマーＰ
３，Ｐ３’Ｐ２’　　Ｐ２およびＰ４がある。配列デー
タは第１３図に示す。この配列はプローブによって特定
されるもの以外に、３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビク
ーペブチドの少なくとも４８個のアミノ酸を含有し、し
たがってクローンＴＮＦＢＰ８はＴＮＦインヒビターを
コードすることが確認される。この配列はまた、ＴＮＦ
インヒビターの遺伝子が少なくとも１個のイントロン（
ＧＴＡＧＧＧＧＣＡＡ・・・ＣＣＣＣＡＴＴＣＡＣＡＧ
）を包含することを示している。最後に、この配列は、
３０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターが前駆体蛋白質として
合成され、或熟、活性蛋白質を発生するためにはＡｒｇ
Ａｓｐ配列における蛋白分解的切断が必要なことを示し
ている。
例４に記載した実験では、ＰＭＡ／ＰＨＡで１時間処理
したＵ９３７細胞はＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）
に冨んだメッセンジャーＲＮ＾のプールを含有すること
が明らかにされている。したがって、例４に記載したよ
うにしてＰＭＡ／ＰＩＩＡで処理したｕ９３７細胞から
得られたポリＡ”ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを製
造した。約５μｇのポリＡ″ＲＮＡから、ほぼＧｕｂｌ
ｅｒ．　Ｕ　＆　Ｈｏｆｆｍａｎ＋　Ｂ．　Ｊ．　（Ｇ
ｅｎｅ．　２５　：　２６３．１９８３）の記載に従い
、ロット試験試薬（Ａｍｈｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇ
ｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，　ＩＬ）を製造業者によって
推薦された操作によって使用し、二本鎖、プラント末端
ｃＤＮＡを得た。得られた二本ｉＪｃＤＮＡ約ｌμｇを
酵素ＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、配列ｄ　（ｐＣＣ
ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ）を有するＥｃｏＲＩ　　リンカ
ー（Ｎｅｉｖ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ．　Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ，　ＭＡ）をＴ４　ＤＮＡリガーゼによって
結合し、ついでエンドヌクレアーゼＥｃｏＲ　Ｉで消化
した。このＤＮＡをついで、予めＥｃｏＲ　Ｉで消化し
たラムダーバクテリオファージクローニングベクターｇ
ｔｌｏ　（Ｙｏｕｎｇ，　Ｒ．　Ａ．　＆　Ｄａｖｉｓ
，　Ｒ．　Ｗ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ，　
Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８０　：　１１９４　〜１１９８
．　１９８３）にリゲートし、感染ラムダーパクテリオ
ファージ粒子中に、ＳＬｒａｔａｇｅｎｅ　（Ｌａ　Ｊ
ｏｌｌａ＋　ＣＡ）からそのプロトコールに従って得ら
れたラムグーＤＮＡパッケージングエキストラクト（Ｇ
ｉｇａｐａｋ　Ｕ　Ｇｏｌ２）を用いて生成物をパッケ
ージした。このラムダ分解物（ｃＤＮＡライブラリー）
を次に大腸菌株Ｃ６００ＭＩａのインフェクトに使用し
、このライブラリーが約２．５Ｘ１０６組換えメンバー
を含有することを明らかにした。
このライブラリーの約４Ｘ１０’個のメンバーを大腸菌
株Ｃ６００ｈｆｌａ上にプレートした（５ＸｌＯ’ｐ．
ｆ．ｕ．／プレート）。ニトロセルロースへの二重の移
送を行い、濾紙を例５に記載したと同様に処理して、ヒ
トゲノムライブラリーのスクリーニングを行った。濾紙
上のＤＮＡをついで例４に記載したのと同じ３ｔｐ標識
ラベルに、インキュベーション温度を４２゜Ｃとした以
外は同様にしてハイブリダイズさせた。プレートされた
４Ｘ１０’個の組換えファージから、三重にプラークを
このプロープにハイブリダイズした。これらはさらに再
単離し、上述のようにしてさらに配列 ５’　ＣＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＴＴＧ
Ｔ＾３′を有する付加的合或プローブを用いて検査した
。
このプロープは、第１３図に示されるヒトゲノムＴＮＦ
インヒビタークローンの塩基６７１〜６９４に相当する
。両プローブは第一のプロープで同定された３個のブラ
ークのすべてとハイプリダイズした。
プラーク精製後、これらの３個のクローンからＤＮＡを
製造し、例５に記載したようにＭ１３ベクターＭＰ１８
およびＭＰ１９のＥｃｏＲ１部位にサブクローニングし
た．これらのｃＤＮＡはそれぞれ２個のＥｃｏＲＩ　フ
ラグメントから構威され、ひとつは３個のすべてのクロ
ーンに共通の約８００ｂｐであり、他はクローンによっ
て１３００ｂｐ．　ｌ１００ｂｐまたは１０００ｂｐで
ある。各クローンにおける唯一のＥｃｏＲＩフラグメン
トの起源は多分、ｃＤＮＡの第一鎖合成時の逆転写酵素
による不完全伸長であろう。したがって、これらのＥｃ
ｏＲＩ　フラグメントは、ＴＮＦインヒビターｍＲＮＡ
の５′末端と３′末端の８００ｂｐフラグメントを表す
ものと思われる。これは、以下に述べるように、これら
のフラグメントについて得られたＤＮ＾配列によって確
認される。
上述のｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ　サブクローンから２１０
０ｂｐｃＤＮＡの全配列が得られた。ジオキシヌクレオ
チド連鎖停止法による配列決定が使用された（Ｓａｎｇ
ｅｒＦ．　＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ，　Ａ．　Ｒ．　：　Ｊ
．　Ｂｉｏｌ，　Ｃｈｅｍ．＋　９４　：４４１〜４４
８．　１９７５）。改良↑７　ＤＮＡポリメラーゼ、シ
クエナーゼ（Ｕ．Ｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，　Ｃ
Ｉｅｖｅｌａｎｄ＋ＯＨ）は供給者による記載のように
伸長酵素として使用した。配列決定プライマーは、第１
３図に示すようにＴＮＦインヒビターのヒトゲノム配列
から製造されたオリゴヌクレオチドまたはそれらのプラ
イマーを用いて得られた配列である。第２０図には、ｃ
ＤＮＡクローンのひとつから誘導された翻訳配列を示す
。この配列は第１９図に示すような蛋白質配列データに
よって得られた配列に相当する．クローン、ラムダーｇ
ｔｌｏ−７ｃｔｎｆｂｐからのヒト３　０　ｋＤａ　Ｔ
ＮＦインヒビターの全配列を第２１図に示す。
可溶性ＴＮＦａインヒビター活性をコードするＴＮＦイ
ンヒビター（３　０ｋＤａ）　ｃＤＮＡ遺伝子の部分を
大腸菌での発現のために、以下のように調製した。
尿誘導ＴＮＦインヒビターのＣ末端部分を決定する蛋白
質コード配列（配列旧ＥＮ，塩基７７１，第２０図）は
ｃＤＮ＾配列中停止コドンに続いていないので、ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を指図するオリゴヌクレオチド
によって添加した（ＢｉｏＲａｄ，　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ
，　ＣＡ）。
クローン、ラムグーｇｔｌＯｃｔｎｆｂｌ）からの１３
００ｂｐＥｃｏＲＩ　フラグメントのＭｌ３ＭＰ１９ク
ローンを合威オリゴヌクレオチド ５’　　ＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＴＴＧＡＧＡＡＴＴＡＡ
ＧＣＴＴＡＡＧＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＡＣ　　３’とハ
イブリダイズした。
二本鎖合戒および適当な宿主へのトランスフェクション
後に、上述の突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドへの
ハイブリダイゼーションにより変異クローンを同定した
。このようにして同定されたクローンの分子同一性は例
５に記載したＤＮＡ配列決定によって確認された．次に
、Ｓｔｙ４（位置３０３）および旧ｎｄＩ［Ｉによって
決定される４６８ｂｐを有する蛋白質のＣ一末端を変異
したクローンとしてＲｆ型から除去し、ｔａｃ　Ｉプロ
モーター（ＤｅＢｏｅｒ，Ｈ．　Ａ．ら：　Ｐｒｏｃ．
　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　８０　
：２ｌ〜２５．　１９８３）を含む大腸菌プラスミド中
に挿入した。この構築は、合成二本鎖アダプター配列：
５’　　ＧＡＴＣＣＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴ
ＴＡＡＡＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＴＴＧＣＣＣＣ　　３゜
ＧＣＴＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＡＴＴＴＡＣＣＴ
ＧＴＣＧＣＡＡＡＣＧＧＧＧＧＴＴＣの使用により達成
された。このアダプターはＴＮＦインヒビター遺伝子（
上述の切りつめた型）を、バクテリオファージＴ７遺伝
子１０の最初の１２個のコドンに翻訳的にカップリング
する。遺伝子１０の翻訳開始点からアダプター配列まで
のこの構築体のＤＮＡ配列は第２２図に示す。大腸菌内
での発現のためにはＴＮＦインヒビター遺伝子配列にメ
チオニンコドン（＾ＴＧ）の付加が必要である。このブ
ラスミドはｐＴＮＦｉＸ−１と呼ばれる。
この蛋白質の推定分子量は約１７．６００ｋＤａで、脱
グリコシル化天然ＴＮＦインヒビター（３０ｋロａ）の
分子量にきわめて近似している。
誘導条件で２時間増殖させた大腸菌培養液（ｐＴＮＦＩ
ＸＩＪＭ１０７１ｏｎ−）　１　１からの細胞を１０ｍ
ｊ２の２ｍＭ　ＥＤＴＡ含有５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔ
ｌ（／！．．ｐｔｌ７．　５　（ＴＥ緩衝液）１０ｍｌ
に再懸濁し、フレンチプレスにより４゜Ｃ、２０，００
０ｐｓｉで圧縮した。生成物を２０，０００ｇで１０分
間遠心分離した。得られたベレ・ントをＴＥＩＩ街液で
１回洗浄した。洗浄したペレットを２ｍｆの６Ｍグアニ
ジン塩酸塩に再懸濁し、室温で１０分間インキユベート
した．インキュベーション後、５００ｍＭＤＴＴ８０μ
ｎを加え、混合物を室温でさらに３０分間インキエベー
トした。この処理後に不溶のまま残った物質を２０，　
０００　ｇで１５分間遠心分離して除去した。上清に５
００ｍＭ酸化型グルタチオン１２０ｕｌを加え、混合物
を室温で１０分間インキユベートした。次にこの混合物
を０．　６％Ｔｒｉｓ塩基溶液２０ｍｊ２中に希釈し、
５００一システイン２００μｌを加えた。インキュベー
ションを４゜Ｃでさらに１６時間続けた。１６時間のイ
ンキュベーシゴン後、わずかな不溶性残留物が認められ
た。この不溶性物質を２０，　０００　ｇで２０分間遠
心分離して除去した。得られた上清を５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−｝１ｃ４２　ｐＨ　７．　５に対し、４゜Ｃで１６
時間透析し、ついで２０，ＱＯＯｇで１０分間遠心分離
した。
この上清に終濃度４ｍＭでＰＭＳＦを加え、この混合物
をＴＮＦ−アフィニティーカラム（０．７Ｘ２ｃｍ）に
流速０．１ｍｌ／分で負荷した。このカラムを５０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　ｐＨ　７．　５で完全に洗浄し、
結合蛋白質は５　０ｍＭ　ＮａＰＯ４−ＨＣｉ！．ｐＨ
　２．　５で溶出した。ｐＨ２．５の溶出液を、予め０
．　１％ＴＥＡ／Ｈ２０で平衡化したＲＰＢカラム上に
負荷した。ＴＮＦインヒビターは０．１％ＴＦＡ／アセ
トニトリルの１％／分での直線勾配により溶出した（第
２５図）。分画をｓＤｓＰＡＧＥで分析し（第２６図）
　、ＴＮＦインヒビターを局在化するために細胞毒性検
定を実施した（第２５図）．大腸菌産生ＴＮＦインヒビ
ター（３０ｋＤａ　）は、グリコシル化されていないの
で約２０ｋＤａに移動した．分画番号３０から３５まで
がＴＮＦインヒビターを含んでいる。この物質のアミノ
末端配列は、大腸菌産生ＴＮＦインヒビターが以下の配
列： Ｍｅｔ−＾ｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−（　）−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−を有することを
示している。
この操作を用い、１ｌの培養液からＴＮＦインヒビター
（３０ｋＤａ）約４０ｕｇが得られた。収率は約２〜３
％であった。再び再生させる前にＴＮＦインヒビターを
精製することにより、収率は５０％以上に上昇させるこ
とができた。
ＴＮＦインヒビターの動物細胞発現には以下の工程が必
要である。
ａ．発現ベクターの構築 ｂ．宿主細胞系の選択 Ｃ．宿主細胞中への発現ベクターの導入ｄ．　ＴＮＰ−
ＢＰの発現レベルを上昇させるための組換え宿主細胞の
操作 ｌ．動物細胞中での使用のために設計されたＴＮＦイン
ヒビタ一発現ベクターは、強力な構戒発現構築体、誘導
可能遺伝子構築体、ならびに特定の細胞型中での発現の
ために設計された構築体を含めて数種の型がある。いず
れの場合も、プロモーターおよび他の遺伝子調節領域た
とえばエンハンサー（誘導可能または不能）およびボリ
アデニル化シグナルが、プラスミドベースのベクター中
ｃＤＮＡ配列に関連して適当な位置に配置される。この
ような構築の２つの例を以下に示す。
強力な構成プロモーター領域を用いる構築体はサイトメ
ガロウイルス（ｃＭＶ）直前遺伝子制御シグナルを用い
て作成することができる。このプラスミドは標準的な分
子生物学的手法（Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｍａｎｕａ１ｌＣｏ１ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８２）を用いて構築され
、生成したプラスくドは第２３図に示すとおりである（
ｐＣＭＶＸＶβＴＮＦ８ＰｓｔｏｐＡ）　．複製のＳν
４０オリジンがこのプラスミドには包含されていて、一
時的発現検定のためのＣＯＳ細胞中でのその使用を容易
にする。この特定の構築体は、Ｂｏｓｈａｒｔら（ｃｅ
ｌｌ，　４１　：　５２１〜５３０．　１９８５）に記
載されているようにＣＭＶ直前プロモータおよびエンハ
ンサーを含有し、これはＲａｍ　ＩｌｌおよびＥｃｏＲ
Ｉ制限部位に隣接するウサギＢ−グロビン第２イントロ
ン（ｖａｎＯｏｙｅｎら：　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２０６
　：　３３７〜３４Ｃ　１９７９）に続いている。この
イントロンは、一部の発現ベクターの転写領域にイント
ロンを包含させると発現レベルの上昇がみられたので（
Ｂｕｃｋｍａｎ　＆　Ｂｅｒｇ　：Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ
．　Ｒｉｏｔ．，　８　：４３９５〜４４０５．　１９
８８）　、含有させる。ボリアデニル化シグナルはシご
アンウィＪＬス４　０　（ＳＶ４０）配列（地図座標２
５８９　〜２４５２　．ＲｅｄｄＶら：　Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ．　２００　：　４９４　〜５０２．　１９７８参照
）によって与えられる。３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒ
ビターＤＮＡ配列は次のように修飾された。すなわち、
ヒト尿からの精製ＴＮＦインヒビターのＣ末端３′に存
在する伸張領域を欠失させ、停止コドンをＣ末端アスパ
ラギンの直後の位置に導入した。類似のベクター中で非
翻訳３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターｃＤＮＡ配列
をＣＯＳ細胞を導入し、このような細胞にＴＮＦ結合活
性の増大が認められる。
第２の構築体（第２４図参照）　（ｐＳＶＸＶＴＮＦ−
ＢＰｓ　ｔｏｐＡ）は、ＳＶ４０初期遺伝子からの強力
な構成プロモーター領域を、ブラスミドｐＳＶ２−ＣＡ
Ｔ　（Ｇｏｒｍａｎら：　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉ
ｏｌ．，　２　：　１０４４〜１０５１．　１９８２）
に見出される配列で使用している。このプラス嵩ドは、
標準的な分子生物学的手法を用い、クロラムフエニコー
ルアセチルトランスフエラーゼのコード配列をＴＮＦイ
ンヒビターｃＤＮ＾で置換するように操作される。この
場合も、ＴＮＦインヒビターｃＤＮ＾はＣＭＶプロモー
ター構築体について上述のように修飾された。ＳＶ４０
初期プロモーター領域はＨｉｎｄＩ［［部位からＢａｍ
旧部位までを（地図座標５０９０〜１８Ｂ，　Ｒｅｄｄ
ｙら：　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２００　：　４９４〜５０
２．１９７８）を包含し、ＳＶ４０ポリアデニル化シグ
ナルはＣＭＶ構築体について上述のとおりである． ２．上述のようにベクターを用いてＴＮＦインヒビター
を発現させるためには、２種の動物細胞系を用い、活性
蛋白質を製造した。この異種遺伝子の発現を促進する能
力が明らかにされた細胞系には、サル腎細胞ＣＯＳ−７
、およびチャイニーズ・ハムスター卵巣（ｃＩＯ）ジヒ
ドロ葉酸レダクターゼ欠損（ｄｈｒｆ−）細胞が包含さ
れる。
３．　　３　０ｋＤａ　ＴＮＰインヒビターを細胞培養
培地中に分泌する連続ＣＨＯ−誘導細胞系を樹立するた
めには、ＴＮＦインヒビター発現プラスミドをこれらの
ｄｈｆｒ一細胞に、ジヒドロ幕酸レダクターゼの合戒を
指令するプラスミドとともに、Ｇｒａｈａｍ　＆ｖａｎ
　ｄｅｒ　Ｅｂ　（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．　５２　：　４
５６〜４６７．　１９７３　）によって報告されたリン
酸力ルシウムーＤＮＡ沈降法を用いて導入した。ＤＮＡ
を取り込み、ＤＨＦＲを発現する細胞を、Ｒｉｎｇｏｌ
ｄら（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．，１
　二１６５〜１７５．　１９８１）の記載のように選択
した。
４．ＴＮＦインヒビター遺伝子構築体を発現できる細胞
はＴＮＦインヒビターの産生レベルが増大するように操
，作できる。ＴＮＦインヒビター発現ベクターをｄｈｆ
ｒ発現ベクターとともに含有する細胞は、メトトレキセ
ート、ｄｈｆｒの競合的アンタゴニストを用い、Ｒｉｎ
ｇｏｌｄら（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ
．，　　１：１６５〜１７５．　１９８１）によって報
告されている遺伝子増幅プロトコールによって採取され
なければならない。遺伝子増幅は細胞中に存在するｄｈ
ｆｒおよびＴＮＦインヒビクー遺伝子のコピー数の増加
を招き、同時にＴＮＦインヒビターｍＲＮ＾のレベルを
上昇させ、結局、細胞によって製造されるＴＮＦインヒ
ビター蛋白質を増加させる。
濫３ｌと二逗■［在 ヒトＵ９３７細胞を１５０ｃｍ２のフラスコ中、２００
単位／　ｍ　ｌのペニシリン、２００単位／　ｍ　ｌの
ストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲ
ＰＭＩ　１６４０培地を用い、ＩＸＩＯ’細胞／　ｍ　
ｌの濃度で増殖させた。３７゜Ｃで３日間インキユベー
トしたのち、細胞を１５００　ｇで７分間遠心分離して
収穫した。細胞を、血清を含まないＲＭＰＩｌ６４０培
地中、濃度２Ｘ１０”／ｍｌで再悲濁した。細胞を５μ
ｇ／ｍ４２　ＰＨＡ−Ｐ　（フォトへマグルチニン）お
よび１　０　ｎｇ／ｍｌ　ＰＭＡ　（フオノレボーノレ
１２−ミリステートｌ３−アセテート）中２４時間増殖
した。
２４時間培地（４４２５　ｍｌ　）を遠心分離で集め、
Ａｍｉｃｏｎ　ＹＭ５フィルターにより約１００ｍｊ！
に濃縮した。この混合物をＴＮＦ−アフィニテイーゲル
（０．７Ｘ２ｃｍ）に流速０．１ｍｊ２／分で通過させ
、ゲルを５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　ｐＨ　７．　
５で完全に洗浄した。結合した蛋白質を５　０ｍＭ　Ｎ
ａＰＯ４−ＨＣｊ２　ｐｌ１２．　５で？容出し、ＴＮ
ＦインヒビターをＨＰＬＣ−ＲＰＣ８によって他の夾雑
蛋白質から分離した。第２７図から明らかなように、２
個のＴＮＦインヒビターピークが観察される。ＲＰＣ８
分画のＳＯＳ−ＰＡＧＥ分析により、２個のピークの分
子量はほぼ３０ｋＤａおよび４０ｋＤａ蛋白質に相当す
る（第２８図）。３ＱｋＤａ蛋白質（ＴＮＦ−　ＩＮＨ
Ｉ）をアξノ末端配列分析に付し、上述の３　０　ｋＤ
ａ　ＴＮＦインヒビターの場合と同じ配列であることが
見出された。しかしながら、４０ｋＤａ蛋白質の蛋白配
列は３０ｋＤａ蛋白質と同一ではないことを明らかにし
た（例１１参照）。第８図の分画の周辺にみられるヒト
尿中の第２のＴＮＦインヒビターピークをさらに精製し
たところ、それも４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター
蛋白質であることが認められる（第２９図および第３０
図）。
４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターはまた糖蛋白質で
ある。これは、蛋白質を例１Ｄに記載したようにニトロ
セルロース濾紙上に移送したのち、ＣｏｎＡ　−ベルオ
キシダーゼを用いて検出された。Ｎ−グリカナーゼ処理
４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの分子量はＳＯＳ
−ＰＡＧＥでは約３６ｋＤａであった（例ＩＤに記載の
操作参照）。
例ＩＥに概述した操作に従い、グリコシル化４　０　ｋ
Ｄａ　ＴＮＦインヒビターもＴＮＦαに結合することが
決定できる。さらに、グリコシル化４０ｋＤａ蛋白質は
またＴＮＦ　β（リンホトキシン）に結合することも示
される。
蛋白質のアごノ末端配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ
ｙｓ−Ｌｅｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎシクエンサ−４７０型を
用いて決定した。天然および還元力ルボキシメチル化蛋
白質の両者について配列を決定した。逆相（ＲＰ−８）
精製ＴＮＦインヒビター約２　０　０　ｐｍｏｌｅをポ
リブレンフィルターに適用し、自動Ｅｄｍａｎ分解に付
した。
得られた配列を第３１図に示す。Ｕ９３７誘導３０ｋＤ
ａ蛋白質は、尿中に生成し同定される蛋白質と同一であ
ることが明らかである。４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒ
ビター蛋白質は３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター蛋
白質と同じではない。尿中４　０　ｋＤａ　ＴＮＦイン
ヒビター蛋白質は２個のアミノ末端残基を含まず、ｕ９
３７誘導４０ｋＤａ蛋白質の場合と同じである。
１　２　　４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ　ーの一還元
カルボキシメチル化ＴＮＦインヒビター（４０ｋＤａ　
）約４０μｇを上述のようにエンドプロテアーゼｖ８で
消化し、生成したペプチドをＲＰＣ１８カラムで分離し
た（第３２図）。精製されたペプチドを、Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ蛋白質シクエンサ−４７０型に
より配列決定した。
還元力ルボキシルメチル化ＴＮＦインヒビター約９０μ
ｇを、０．２Ｍ炭酸水素アンモニウム中、３７゜Ｃでエ
ンドペプチダーゼ＾ｒｇ−Ｃで処理した。
２４時間消化したのち、Ａｒｇ−Ｃ消化物質をＨＰＬＣ
−ＲＰＢカラム上に負荷してペプチドを分離した（第３
３図）。精製ペプチドを前述したと同様にして配列決定
した。一部のペプチドをさらにＴＰＣＸ−トリプシンま
たはキモトリプシンで消化した。ａｒｇＣ１６ペプチド
約５　０　０　１）ｍｏｌｅを０．　２　Ｍ炭酸水素ナ
トリウム中３ｕｇのＴＰＣＫ−　１−リプシン（ｌｌ０
６ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により、３７゜
Ｃで７時間処理し、ペプチドをＲＰ８を用いて分離した
（第３４図）。
ペプチドａｒｇ−１０約２　０　０　ｐｍｏｌｅを１μ
ｇのキモトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）により、３７゜Ｃで３．５時間消化し、生威
したペプチドをＲ　Ｐ　Ｃ　１’８上で分離した（第３
５図）。
ＴＮＦインヒビター（４０ｋＤａ）の部分構造は様様の
重複ペプチドを整列させて決定した（第３６図）。４　
０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの完全一次構造を第３８
図に示す。蛋白質配列決定で確認されない残基は４　０
　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターをコードするｃＤＮＡク
ローンの配列の再検討により推定した。これは例１４Ａ
に論じ、第３９図に示したとおりである。
例９で得られた情報は、ＰＭＡおよびＰＨＡで処理した
Ｕ９３７細胞が分子量約４０ｋＤａのＴＮＦａインヒビ
ターを生戒することを示している。この蛋白質を精製し
、そのアミノ酸配列は例１２に記載したようにほぼ決定
された。第５表には、この蛋白質から誘導された数種の
ペプチド配列を示し、ここに記載した４　０　ｋＤａ　
ＴＮＦインヒビターをコードする遺伝子の単離に用いた
混合配列オリゴヌクレオチドプローグの配列を与える。
４０ｋＤａインヒビターからなる配列をコードする遺伝
子は例５に記載のヒトゲノムライブラリーまたはＰＭＩ
｛およびＰＨＡで９時間処理したＵ９３７細胞から得ら
れたｍＲＮＡから構築されるｃＤＮ＾ライブラリーから
単離できる（例１４参照）。各ライブラリーは約１．Ｏ
Ｘ１０’個の組換え体を含まねばならない。
第 表 ＧＣＣＣＧＧ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ　　Ｇ　　Ｇ　　Ｇ　　ＣＡＣ Ｔ Ｃ Ｃ　　ＧＣＴＧ Ｔ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ ＧＧ ＴＴ ＴＮＦ インヒビ −ｃＤＮＡ の ＩＪ９３７ｍＪ？ＮＡはＰＭＡ／ＰＨＡで９時間誘導し
た細胞から単離した。ついでそれをオリゴｄＴカラム上
で選択し、このようにして単離されたポリアデニル化ｍ
ＲＮＡを用い、逆転写酵素ついでＥｃｏＲＩポリメラー
ゼＩ／ＲＮナーゼＨにより、ｄｓｃＤＮＡを作成した。
ｄｓｃＤＮＡを、プライマーとして第５表に示す縮退プ
ローブ（４　０　ＫＤ−Ｐｌ’および４　０　ＫＤ−Ｐ
７）を使用するポリメラーゼ連鎖反応に付した。この反
応からのＤＮＡ生戒物をサザンプロット上プロープ４０
　ＫＤ−Ｐ６′（第５表参照）で試験し、この配列を含
んだ単一バンドを同定した。このバンドをアガロースゲ
ル上で単離し、Ｍ１３ファージＤＮＡ　（株ｍｐｌ８）
にクローン化した．大腸菌ＪＭｌ０９株にトランスホー
ムし、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含む培地上で平板培
養し、正しいｃＤＮＡ挿入体を含有する澄明なブラーク
が同定された．このクローン中のＤＮＡの配列を、この
配列から推定される翻訳生成物とともに第３７図に示す
。このアもノ酸配列は第３６図（残基ｌ２〜１０４）お
よび第３８図に示すペプチド配列と一致する。
１４Ａ　　　ＰＭＡ　　ＰＨＡ　　沫　０９３７　　　
　　−　４　０ｍＲＮＡは、ＰＨＡおよびＰＭＡに９時
間暴露したヒトＵ９３７細胞から単離された（ｃｈｉｒ
ｇｗｉｎ，　Ｊ．　Ｍ．ら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，　１８　：　５２９４〜５２９９）。ｍＲＮＡはオリ
ゴ−ｄＴセルロースを用い、このＲＮＡから精製した（
Ａｖｉｖ，　Ｈ．　＆　Ｌｅｄｅｒ，　Ｐ．　：　Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｈ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ．　６
９　：　１４０８〜１４１２．　１９７２）　，　コ（
７）ｍＲＮＡ５　μｇを用い、プラント末端、二本ｔＪ
ｊｃＤＮＡ３μｇを合威した（Ｇｕｂｌｅｒ．　Ｕ．　
＆　Ｈｏｆｆｍａｎ，　Ｂ．　Ｊ．：　Ｇｅｎｅ．　２
５　：２６３〜２６９．　１９８３）。影遼Ｒｌ　リン
カーを加えたのち、ｃＤＮＡをＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ
−４００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）回転カラムクロマト
グラフィーで精製し、エタノールで沈殿させた。このｃ
ＤＮＡ　　１　０　０ｎｇを、影冴Ｒｌ消化し、アルカ
リホスファターゼ処理したラムダｇｔ−１０　　（　１
ｐｇ　）にリゲートし、ｇｉｇａｐａｋ　ｇｏｌｄ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏでパッ
ケージした。パッケージｃＤＮＡを大腸菌ｃ６００　ｈ
ｆｌ上にプレートすると組換え体２．５Ｘ１０”を生成
した。このライブラリー１．２Ｘ１０’メンバーを、Ｂ
ｅｎｔｏｎ．　Ｗ．Ｄ．　＆　Ｄａｖｉｓ，Ｒ．　Ｗ，
　：　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　１９６　：　１８０−１８２
＋　１９７７の記載のように、３２Ｐ標識プローブ４　
０　ＫＤ−Ｐ６＋７　（５’ＧＧＧ　ＣＧＴ　ＡＴＧ　
ＴＧＣ　ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＣＡＣ　ＡＧＧ　３’　）で
二重にスクリーニングした。１２個の陽性ハイプリダイ
ズクローンを単離し、ブローブ４　０　ＫＯ−Ｐ６’お
よび４　０　ＫＯ−Ｐ７　（例１３，第５表参照）で再
スクリーニングした。これらのクローン中の４個が３つ
のブローブすべてにハイブリダイズした。これらのクロ
ーンのひとつ、Ｃ４０　ＤＫｌ５をＥｃｏＲＩで消化し
、２．２ｋｂ挿入体を単離し、両方向でバクテリオファ
ージＭ１３ベクター、ｍｐｌ９　（Ｙａｒｒｉｓｈ−Ｐ
ｅｒｒｏｎ＋Ｃ．ら：　Ｇｅｎｅ．　３３　：　１０３
〜１１９．　１９８５）にサブクローニングした。配列
は両鎖から、読み終わり法（Ｓａｎ−ｇｅｒ．　Ｆ．　
＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ，　Ａ．　Ｒ．：　Ｊ．　Ｍｏｌ、
Ｂｔｏｌ．＋　９４：４４１〜４４８．　１９７５）に
より、Ｔａｑ　ＤＮ＾ボリメラーゼ（υ．Ｓ．　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて決定した。この配列を、そ
れから推定される翻訳生戒物とともに第３９図に示す。
この配列は、塩基９３のＡＴＧ　　トリプレットから４
０ｋＤａ蛋白質のＣ末端配列を越えて塩基８６３のＧＡ
Ｃ　　ｌ−リプレットに及ぶ単一の読み取り枠を含有す
る。
３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターおよび４　０　ｋ
Ｄａ　ＴＮＦインヒビターの両者について、ＴＮＦβ（
リンホトキシン）の活性も阻害できるかを決定するため
に試験を行った。様々な濃度のＴＮＦβ（　Ｅｎｄｏｇ
ｅｎから購入）を各インヒビターと室温で１時間インキ
ユベートした。生或した混合物を、ＴＮＦαについて例
１．Ｂ．１．に記載したと同じＬ９２９１１１胞アッセ
イ系により分析した。これらの実験から、３０ｋＤａＴ
ＮＦインヒビターはＴＮＦβに対してほとんど阻害作用
をもたないことが明らかにされた。しかしながら、４　
０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターは有意なＴＮＦβ阻害を
示した．これらの実験の結果を第４０図に示す。
４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの適当なヒトゲノ
ムＤＮＡライブラリーは、３　０　ｋＤａ　ＴＮＦイン
ヒビターについて例５に記載したと同様にして作威した
。
可溶性ＴＮＦ結合活性をコードするＴＮＦインヒビター
（　４　０　ｋＤａ　）　ｃＤＮＡ遺伝子の部分（第３
９図）を、以下に記載するように、大腸菌での発現のた
めに調製した． 尿またはｕ９３７細胞から誘導される戒Ｐ４０ｋＤａＴ
ＮＦインヒビターのＣ末端配列を明確に決定するのは困
難であったので、発明者らは、ｃＤＮ＾クローンの配列
分析に基づきそのｃＤＮＡコード配列の３種の誘導体を
構築した。第１の配列は、この蛋白質塩基対８６３（第
３９図）の推定トランスメンプラン配列に及び、ペプチ
ド配列・・・Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＡｓｐに
終わる．次の２つの配列は、このクローンより５１（Δ
５１）および５３（Δ５３）アξノ酸短く、それぞれ塩
基対７１０・・・Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒおよび塩基対
７０４・・・Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒで終わる。
これらの３つのＣ末端それぞれは、４０ｋＤａＴＮＦａ
インヒビターのｃＤＮＡのＭ１３クローンのｉｎｖｉｔ
ｒｏ突然変異誘発（　”Ｍｕｔａｇｅｎｅ　，　Ｂｉｏ
Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，　ＣＡ）により作戊した。
最長のクローンはまず、以下の合成オリゴメクレオチド
オリゴヌクレオチド１はアミノ酸２３５のＡｓｐＯ後に
翻訳停止コドンを挿入し、またこの点にＨｉｎｄｌＩ［
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を創或する。オリゴヌ
クレオチド２は或熟蛋白質のＮ末端配列、Ｌｅｕ　Ｐｒ
ｏ　Ａｌａ−ｂｐ　１５９　　（第３９図）を、大腸菌
での発現のために、１）ア逅ノ酸位置ｌにＭｅｔ，　Ａ
ＴＧコドンを挿入する、２）翻訳カプラー配列および５
’　ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を挿入
することにより改変する。変異体Ｍ１３クローンのＲｆ
　ＤＮＡのＢａｍ旧／ＨｉｎｄＩＩＩ消化により変異誘
発フラグメントを除去し、例７に記載したように大腸菌
発現プラスミド中に挿入した。この遺伝子構或をもつク
ローンをＴＮＦ．４０と呼ぶ。
２つの短縮されたクローンは、上に単離した４　０　ｋ
Ｄａ　ＴＮＦａインヒビタークローンの突然変異誘発Ｍ
１３誘導体と以下のオリゴヌクレオチド５１　ＧＴＣＣ
ＣＣＣＡＣＣＴＡＡＧＣＴＴＣＧＧＡＧＴＡＴＧＧ　３
　１　　Δ５１５１　ＧＴＣＣＡＣＧＴＣＣＴＡＡＧＣ
ＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＧＡ　３−　Δ５３を用いて上述
のように構築された。
これらの２つのオリゴヌクレオチドは、翻訳停止コドン
をそれぞれｂｐ７１０および７０４に導入する（第３９
図）。これらの遺伝子構戊をもつクローンはそれぞれＴ
ＮＦ　：　４０　５１およびＴＮＦ４０　５３と呼ばれ
る。
４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターのクローンの動物
細胞中での発現は、例９に述べたと同様に実施できる。
４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターのＣ末端の３′に
存在する伸長領域を欠失させ、Ｃ末端アスパラギン酸の
直後の位置に停止コドンを組込むこともできる。
１　９　　３　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ　ー　コード
る＝　　ｃＤＮＡの　　　　　での　　はＴＮＦ　　六
位【」駈加ｌｍ五 第２ｌ図に示す全３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター
ｃＤＮＡ　（　２．　１　ｋｂ）が導入された発現ベク
ター　ｐ３０ＫＸＶＡを作成した。これは他の点ではす
べて、第２３図に示すベクターと同じであった。すなわ
ち、その図に示したＴＮＦ−ＢＰ配列がプラスξド中の
唯一のＥｃｏＲＩ部位を用いて２．　１　ｋｂ　ｃＤＮ
Ａに置換された。
この発現ベクターのより完全な記述は例９にある．この
プラス旦ドは、Ｆｅｉｇｎｅｒら：Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ
ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８４：７４１３，
　１９８７に記載されているリポフエクション操作を用
い、ＣＯＳ７細胞中に導入された。トランスフェクトさ
れた細胞はその（１２５１）ＴＮＦａ結合能を分析した
。第４１図には、発現ベクターｐ３０ＫＸＶＡで模擬ト
ランスフェクトまたはトランスフエクトされた細胞の結
合アッセイの結果を示す。プラスミドでトランスフェク
トされた細胞上の結合部位数は、対照細胞上の数よりも
劇的に大である。完全ｃＤＮＡクローン（すなわち、尿
由来３０ｋＤａインヒビターよりもはるかに大きい蛋白
質をコードする読み取り枠）は実際、ＴＮＦ受容体のｃ
ＤＮＡクローンである。
発現ベクターは、例１４Ａに記載のラムダファージペー
ジ＃６から単離された２．　４　ｋｂ　ｃＤＮＡフラグ
メトンを用いて作威した。このプラスミドは、３　０　
ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターｃＤＮ＾の配列が４０ｋＤ
ａ　ＴＮＦインヒビターｃＤＮＡに置換されたほかは、
例９に記載のプラスミド（第２３図）と同しである。プ
ラスξドは２．　４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　ｃＤＮ＾フラ
グメントの両方向で単離され、ｐ４０ＫＸＶＡ　（セン
ス方向）およびｐ４０ＫＸＶＢ　（アンチセンス方向）
とした。これらのプラスミドは、Ｓｖ起源の複製、サイ
トメガロウィル直前プロモーターおよびエンハンサー、
ウサギＢ−グロビン第２イントロン、４　０　ｋＤａ　
ＴＮＦインヒビターｃＤＮＡ、およびＳＶ５０初期ポリ
アデニル化シグナル（このベクターについてのより完全
な説明は例９参照）をｐＢＲ　３２２ベースのプラスミ
ドに含有する。これらのプラスミドをＣＯＳ？細胞中に
トランスフエクトし、ついでＴＮＦ結合について検定し
た（第４２図）。ｐ４０ＫＸＶＡでトランスフェクトし
た細胞は、ＣＯＳ？細胞自体またはｐ４０ＫＸＶＢでト
ランスフエクトした細胞よりも細胞表面上に多数のＴＮ
Ｆ結合部位を示し、このｃＤＮＡがＴＮＦ受容体をコー
ドしていることが示唆゛される。この受容体と過剰産生
できるまたは４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターを組
織培養培地中に分泌する他の啼乳動物細胞、たとえばＣ
ＨＯ細胞は、例９に記載のように開発できる。
２１　ヒト　　　　　　　　れるインヒビ　ーヒト単球
は血液５００ｍｊ！からＨａｎｎｕｍ，　Ｃ．　Ｈ．ら
：　Ｎａｔｕｒｅ，　３４３　：　３３６〜３４０．　
１９９０の記載のようにして調製した。新鮮な単球（２
Ｘ１０’細胞）を血清を含まないＲＰＭＩ　６４０培地
５００ｎ／！中に播き、Ｌｏｎｇ／ｍｆのＰＭＡおよび
５ｕｇ／ｔｅｌ．のＰＨＡＰにより、２４．４８および
７２時間処理した。
インキュベーシゴン後、培地を遠心分離によって集め、
５０ｎ／！に濃縮した。濃縮培地をサンプル毎にＴＮＦ
アフィニティー力ラム（床容量２ｅ／！）上に負荷し、
酸で例１のように溶出した。溶出された物質を、例ｌの
場合と同じ条件でＨＰＬＣＲＰＣ−８カラムを用いてさ
らに精製し、各分画についてＬ９２９細胞毒性アッセイ
を行った。第４３図はＴＮＦ阻害活性の２つのピークを
示している。これらの２つのピークは３ＱｋＤａおよび
４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターに相当し、これら
はＰＭＡおよびＰＨＡで処理したＵ９３７細胞の培養培
地中にも見出され、また尿中゛に確認された。
大腸菌培養液の細胞各３　０　０　ｍｌ（４　０ｋＤａ
　ＴＮＦインヒビターΔ５１および４　０　ｋＤａ　Ｔ
ＮＦインヒビターΔ５３）を別個に誘導条件で２時間増
殖させ、２ｍＭＥＤＴＡ含有５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
（／！，　ｐＨ７．　５　（ＴＥ緩衝液）１０ｎ／！中
に再懸濁し、フレンチプレスにより２０．０００Ｇで１
０分間圧縮した。得られたペレットをＴＥ緩衝液で１回
洗浄した。洗浄ペレットを２ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸
塩／　１　０　０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！　，　
ｐＨ８．　５　／　４　ｍＭ　ＰＭＳＦ中に再懸濁し、
室温でｌ時間インキユベートした。インキュベーション
後、５　０　０ｍＭ　ＤＴＴを終濃度４ｍＭになるよう
に加え、混合物を室温でさらに１時間インキヱベートし
た。
不溶性物質を２０，　ＯＯＯＧで１５分間遠心分離して
除去した。上清に５００ｍＭの酸化型グルタチオンを終
濃度が２０ｍＭになるように加え、混合物を室温で１０
分間インキユベートした。この物質をついで、５ｍＭシ
スティンを含む０．６％Ｔｒｉｓ塩基溶液２０ＩＩＩ１
中に希釈した。ＰＭＳＦを終濃度２ｍＭになるように加
えた。４゜Ｃで１６時間インキユベートしたのち、この
混合物を５　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（／！，　ｐＨ７．
　５の３００容に対して透析し、ついで２０，　ＯＯＯ
Ｇで１５分間遠心分離した。上清をＴＮＦアフィニティ
ー力ラム（０．　７　Ｘ　２　ｃｍ，　　１　３ｍｇ　
ｒｈＴＮＦ／ｍｊ！　Ａｆｆｉ−ｇｅｌ−１０）に、流
速０．０９ｍｌ／分で負荷した。このカラムを５　０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（，ｌ．　ｐＨ７．　５で完全に洗浄
した。結合蛋白質は５　０　ｍＭ　ＮａＨｚＰＯａ−４
ＨＣｌ　，　ｐＨ２．５で溶出した。酸性溶出液をＲＰ
Ｂカラム（２×２　０　０　ｍｍ，　Ｓｐｅｌｃｏ）に
負荷し、ＴＮＦインヒビターは０．　１％ＴＦＡ中アセ
トニトリルの直線勾配により、流速Ｌｍｌ／勾配／分で
溶出した（第４４Ａ図および第４５Ａ図）。分画につい
て、Ｌ９２９細胞毒性アッセイを行い、ＴＮＦインヒビ
ターを局在化した。
各ＲＰＢ像の主ピークはＴＮＦ阻害活性を含んでいる（
第４４Ｂ図および第４５Ｂ図）。大腸菌産生ＴＮＦイン
ヒビター（　４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターΔ５
３および４　０　ｋＤａ　ＴＮＰインヒビター△５３）
は、ＳＯＳ−ＰＡＧＥにおいて期待される位置に移動す
る（第４４Ｂ図および第４５Ｂ図）。これらの物質のア
ミノ末端配列決定では、大腸菌産生ＴＮＦインヒビター
は以下の配列を示す。
Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−νａｌ−Ａ
ｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−ＰｒｏＴｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｕ この操作を用いて各４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビタ
ー（Δ５１およびΔ５３）約１５０μｇが、培養液３０
ｍｆから得られた。収率は数％であったが、この精製の
各工程を改良することにより３０％以上に上昇させるこ
とができる。
これらの４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの両者（Δ
５ｌおよびΔ５３）はＴＮＦ−αのみでな＜　ＴＮＦ−
βも阻害する。
２３　　４　　ｋＤａＴＮＦインヒビ　ー　　の戒熟４
　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター（例１２の場合のよ
うな）の全長の遺伝子を有するプラスミドをもつ大腸菌
株から、活性４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターを精製
した．活性インヒビターの単離に用いた方法は、例２２
の場合と同じである。この活性インヒビターは、ＴＮＦ
−αおよびＴＮＦ一βの両者を阻害し、７５ノ末端配列
は例２２に示したものと同しである。
２　４　　４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビ　−のアミノ
延威 Ｕ９３７一産生或熟４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター
を、ＰＴＣ−ア累ノ酸分析システムによって総アミノ酸
について分析した。成熟４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒ
ビターの全長についての実際のおよび推定される組戒デ
ータは、第３８図および第６表に示すとおりである。
２５　　　　に　　　　たＴＮＦインヒビ　ー企星遣 血漿中のＴＮＦの半減期を延長するために、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）で化学的に修飾したＴＮＦイン
ヒビターを作戒することができる。修飾は、ＴＮＦイン
ヒビター分子のシステイン残基へのＰＥＧの架橋によっ
てもよい。ＴＮＦインヒビター中のシステイン残基はす
べてジスルフイド結合を形威しているので、各インヒビ
ターのアごノ末端、グリコシル化部位、およびカルボキ
シル末端に余分のシステイン残基を含む変異体ＴＮＦイ
ンヒビクーを構築する。突然変異誘発は、所望の突然変
異を含有するオリゴヌクレオチドを用いＰＣＲによって
行うこともできる。３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビタ
ーについては、余分のシステイン残基は残基番号１，１
４または１０５に添加した。これらの変異体蛋白質は、
例７．２２および２３に記載したのと同じシステムを用
いて大腸菌中で発現させ、活性ＴＮＦインヒビターに再
生させた。変異体蛋白質は非突然変異蛋白質と同様に活
性である．これらの蛋白質のべギレーションを行い、活
性が評価されることになる。４０ｋＤａ突然変異体も上
述したのと同様に構築され、活性蛋白質を得るためにペ
ギレーションが行われ、ＴＮＦインヒビターの安定性を
増大させることができる。
Ａｓｘ ＧＩＸ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ 工ｌｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｃｙｓ １３．０ ２２．６ ２３．２ １７．８ ４．５ ２３．９ ｌ７ １５．１ ２２．３ ８．７ ３．４ ８．６ ４．６ ５．４ ５．Ｏ ＮＤ ＮＤ ＮＤ 本発明の教示の特定の発現系の応用は、本明細書の記載
を参考に、本技術分野の通常の熟練者には可能な範囲に
あると考えられる。すなわち、本技術分野の熟練者には
、本発明の方法および生成物に様々な修飾および改変が
可能なことは自明のとおりである。本発明は、これらの
修飾および改変は、それが特許請求の範囲およびその均
等範囲内にある限り本発明に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
第１図はＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ−）の存在下
または不存在下におけるＴＮＦの細胞毒性検定の結果を
示すグラフである。 第２図は、ＴＮＦ単独およびＴＮＦのＴＮＦインヒビタ
ー（３０ｋＤａ）存在下における天然ゲルシフト検定の
結果である。 第３図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のＣｏｎ
Ａ−ベルオキシダーゼ染色を示す。 第４図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）の化学的
脱グリコシル化の結果を示す。 第５図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のＮ一グ
リカナーゼ処理の結果を示す。 第６Ａ図は、尿のＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ
−６８クロマトグラフィーの００２１１０像を、第６Ｂ
図はＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）の天然ゲルシフ
ト検定におけるピークのオートラジオグラフイーである
。 第７図は、ＴＮＦアフィニテイーカラムからの溶出液の
ＯＤ２８。像である。 第８Ａ図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のＲＰ
８精製クロマトグラフイー像、第８Ｂ図は、ＲＰ８プー
ルのＳＯＳ−ＰＡＧＥである。 第９Ａ図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のＬｙ
ｓ消化物のペプチド精製、第９Ｂ図は、アルキル化Ｌｙ
ｓ−Ｃ消化物のペプチド精製を示す。 第１０図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）の２種
のアルキル化Ａｓｐ−Ｎ消化物のべブチド精製を示す。 第１１Ａ図および第１１Ｂ図は、還元カルボキシメチル
化ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のエンドペブチダ
ーゼｖ８消化物のペプチド精製を示す。 第１２図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）のアミ
ノ酸配列を示す。 第１３図は、ＴＮＦインヒビター（３０ｋＤａ）の少な
くとも一部をコードするゲノムクローンのＯＮ八配列を
示す。 第１４図は、好ましいＴＮＦインヒビターの成熟アごノ
酸配列の少なくとも７０％を示す。 第１５図はｕ９３７上清のゲルシフト検定によるＴＮＦ
インヒビターの検出結果を示す。 第１６図はＵ９３７上清のＨＰＬＣによるＴＮＦインヒ
ビターの検出結果を、第ｌ７図はそのノーザンプロット
を示す。 第１８図は、ＴＮＦに対する脱グリコシル化ＴＮＦイン
ヒビクー（３０ｋＤａ）の結合を示す。 第１９図は３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの完全
アξノ酸配列を、第２０図はそれをコードするｃＤＮＡ
配列を、第２１図はその前駆体の全ｃＤＮＡ配列を示す
． 第２２図は、プラスξドｐＴＮＦＩＸ−１中ノＴＮＦイ
ンヒビター遺伝子の開始部付近のＤＮＡ配列を、第２３
図は、プラスもドｐＣＭＸＶβＴＮＦＢＰｓ　ｔｏｐＡ
，第２４図はブラスミドｐＳＶＸＶＴＮＦＢＴｓ　ｔｏ
ｐＡを示す。 第２５図は大腸菌からの３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒ
ビターのＲＰＢカラムクロマトグラフイー像を、第２６
図はその分画のＳＯＳ−ＰＡＧＥを示す。 第２７図はυ９３７細胞からのＴＮＦインヒビターのＲ
ＰＢカラムクロマトグラフイー像およびＬ９２９生物検
定の結果を、第２８図はＲＰ８分画のＳＯＳ−ＰＡＧＥ
を示す。 第２９図は尿４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの精
製クロマトグラフィーとＴＮＦ阻害活性を、また第３０
図はそのＲＰＢ分画のＳＯＳ−ＰＡＧＥを示す。 第３１図は０９３７由来インヒビター（３０ｋＤａおよ
び４０ｋＤａ）ならびに尿由来４　０　ｋＤａ　ＴＮＦ
インヒビターのアミノ末端配列を示す。 第３２図および第３３図は、４　０　ｋＤａ　ＴＮＰイ
ンヒビターのそれぞれエンドペプチダーゼｖ８およびＡ
ｒｇ消化ペプチドの精製を示す。 第３４図および第３５図はそれぞれ、トリプシン消化Ａ
ｒｇ−Ｃ１６およびキモトリプシン消化＾ｒｇ−Ｃ１６
ペプチドのペプチド精製を示す。 第３６図は４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの一次
構造を示す。 第３７図は４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターのｃＤ
ＮＡ配列の一部とその予想される翻訳生戒物を示す。 第３８図は４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターの全ア
ミノ酸配列を示す。 第３９図は４　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビター前駆体
の全ｃＤＮＡ配列とその予想される翻訳生戒物を示す。 第４０図は、３０ｋＤａもしくは４　０　ｋＤａ　ＴＮ
Ｆインヒビターの存在下または不存在下におけるＴＮＦ
−βの細胞毒性アッセイの結果である。 第４１図は、３　０　ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターのｃ
ＤＮＡ配列のＣＯＳ７！Ｈ胞中での発現を示す。 第４２図は、４　０ｋＤａ　ＴＮＦインヒビターｃＤＮ
Ａ配列のＣＯＳ７細胞中での発現を示す。 第４３図はＰＭＡおよびＰＨＡ処理ヒト単球のＩＩＰＬ
ｃＲＰＣ−８分画の細胞毒性アッセイの結果である。 第４４図および第４５図は、それぞれ４０ｋＤａＴＮＦ
インヒビターΔ５ｌおよびΔ５３のＲＰＣクロマトグラ
フィー像、そのＳＯＳ−ＰＡＧＥ，およびＬ９２９細胞
での細胞毒性アッセイの結果を示す。 代 理 人 浅 村 皓 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 ｂ Ｏ ■ 第２図 ｂ Ｃ ｄ 第３図 ｂ Ｃ ｄ 第４図 ａ ｂ 一転 ４１　一 ↓１−● 帽一　　拳゜ Ｖ＋− 第５図 ム９ ５７　５９　６１日５５ 第６Ｂ図 第７図 第８Ａ図 第８Ｂ図 生存率（％） Ａ． ★　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　自ＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰ
ＱＮＮＳ　工（Ｓ Ｇ ＳＦ ＴＡＳＥ１１ＨＩ，ＲＥ Ｂ． （Ｅ） ★　　　　★ ＫＱＮＴＶＣＴＣＨＡＧＦＦＬＲＥ Ｃ． ★ （Ｋ）ＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＤ． （Ｋ）　　（Ｓ）Ｌ　Ｅ　Ｃ　Ｔ　Ｋ　Ｌ　Ｃ　Ｌ　Ｐ
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　　　　　　★ ＣＬＳＣＳ Ｋ ★　　　　　　　★　　　　　　　　　★　　　　　　
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）★　　　　　★ ＶＣ　Ｇ　Ｃ　ＲＫ　Ｎ　　（ｃ）　　（Ｙ）　　（Ｒ
）　　（｝Ｉ）　　（Ｙ）２１２図 ＶＣＧＣＲＫＮ κ［］ＮｒＶＣＴＣ｝ＩＡＧＦＦＬＲＥＮＥｃＶｓｃＬ
ＥＣＴＫＬＣＬＰ［ｌＩＥＮ 第１ ５０　　　　　　印　　　　　７０８０ＣＥＳＧＳＦＴ
ＡＳＥＮ｝ＩＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧ（ＩＭＥ
　ＩＳＳＣＴＶ［ｌＲＯＴ４図 ｒ４＠゜ 第１６図 Ｎｏ ＰＭΔ／Ｐ｝ｌΔ 第１７図 第１８図 Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　工
１ｅＬｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ
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Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＰｈｅ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅ
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Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　ＡｌａＡｓｎ　Ｃｙｓ　Ｌｙ
ｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ第１５ Ｈｉｓ　　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ Ａｌａ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ Ｇ工ｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ Ａｓｎ　ＡＳｎ　　Ｓｅｒ　　工１ｅ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ 工１ｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ ６ＡＴＣ＾ζ％ ２０Ｓｏ４０Ｓｏ６０７０ ４ｕ＾（．Ｇｍｆ　ＧＡＩＣｔσａＴ４　ｔｔｃｍｒｃ
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ＴＴ＾＾＾ＧＣＴＣ＾＾＾＾＾＾＾ＴＮＦインヒビター
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ＣＴＣＴ　　ＡＧＡ　　ＭＴ　　ＡＡＴ　　Ｔワ開始道
伝子１０蛋白配列 ＡＴＧ　ＧＣ’Ｉ’　ＡＧＣ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＧＧＴ
　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＣＭ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　ＡＣＭｅｔ
　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　ＴｈＡＴＧ　ＧＡＣ
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ター配列開始 第２２図 １’Ｔ　ＧＴＴ　ＴＭ　ＣＴＴ　ＴＭ　ＧＭ　ＧＧＡ　
ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＣＡＴ：Ｇ　ＧＡ’ｆ’　ＣＣＧ　Ａ
ＴＣ ＴＴＧ　　ＧＡＧ ＧＡＴ　ＧＡＴ ？Ｍ ｉｒ　Ａｓｐ Ｐｒｏ　工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ翻訳
力方一 ｓ　ｔｏｐ Ｆ−Ｎ ２９　　３０　３１　　３２　　３３　３ｔ　　３５　
　３５第２６図 ＯＤ５７０ｆＬ９２９アッセイ） ３ロ　ー　●一中 １８　一　一 ト１ 第２８図 第２９図 Ｉ 第３０図 Δｒｇ，　Ｃ　２４時間 Δ２１５ 第３３図 吸光度 第３５図 第３９図（その２） Ｌａｕ　　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　入１ａ　
　ＰｈａＴｈｒ　Ｃｙｓ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　Ａｒｑ
　　Ｇｌｕ　ＴｙｒＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙａ　Ｓａｒ　
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コＭｌｉＡＴｃＡｃ１３ｃｃＡＣＴＩＩＩＣ＾Ｃ丁Ｃｅ
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ｅτＣＴｅ＾＾＾＾Ｇ＾＾＾＾＾一第３９図（その．３
） 結合 ＣＰＭ 結合 Ｃｐｍ （ＸＩＣｒ３１ 第４３図 Δフ１Ｌ ”７ｍ，：”？；丁ｒ−　　−．７Ｍ−第４４Ｂ図 Δ２１４ 第４５Ｂ図 対照 細胞毒性のｌｉｆｌ害

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対して活性な、実質的
    に精製された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）インヒビター。 （２）ＴＮＦインヒビターは分子量約３０ｋＤａを有す
    る糖蛋白である請求項（１）記載のＴＮＦインヒビター
    。 （３）ＴＮＦインヒビターは脱グリコシル化されていて
    、分子量約１８ｋＤａを有する請求項（２）記載のＴＮ
    Ｆインヒビター。 （４）ＴＮＦインヒビターは組換えＤＮＡ法によって製
    造される請求項（３）記載のＴＮＦインヒビター。 （５）ＴＮＦインヒビターは分子量約４０ｋＤａを有す
    る糖蛋白である請求項（１）記載のＴＮＦインヒビター
    。 （６）ＴＮＦインヒビターはＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−
    β両者に対して活性である請求項（５）記載のＴＮＦイ
    ンヒビター。 （７）ＴＮＦインヒビターは脱グリコシル化されている
    請求項（６）記載のＴＮＦインヒビター。 （８）ＴＮＦインヒビターは第１９図に示すアミノ酸配
    列を有する請求項（２）記載のＴＮＦインヒビター。 （９）ＴＮＦインヒビターは第３８図に示すアミノ酸配
    列を有する請求項（５）記載のＴＮＦインヒビター。 （１０）ＴＮＦインヒビターは４０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターΔ５１である請求項（５）記載のＴＮＦインヒビ
    ター。 （１１）ＴＮＦインヒビターは４０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターΔ５３である請求項（５）記載のＴＮＦインヒビ
    ター。 （１２）（ａ）宿主細胞にＴＮＦインヒビター活性を有
    する蛋白質の産生を指図できるＤＮＡ配列の製造、 （ｂ）このＤＮＡの、全細胞中にトランスフェクトさせ
    複製させることが可能でそのＤＮＡの発現に必要な作動
    要素を含有するベクターへのクローニング、 （ｃ）合成ＤＮＡと作動要素を含有するベクターのＴＮ
    Ｆインヒビター暗号ＤＮＡを発現できる宿主への移入、 （２）ベクターの増幅およびインヒビターの発現に適当
    な条件下での宿主細胞の培養、 （ｅ）インヒビターの収穫、および （ｆ）インヒビターに、ＴＮＦ阻害活性を有する活性三
    次構造を取らせること、 からなるＴＮＦインヒビターの組換えＤＮＡ法による製
    造方法。 （１３）ＴＮＦインヒビターは３０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターである請求項（１２）記載の方法。 （１４）ＴＮＦインヒビターは４０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターである請求項（１２）記載の方法。 （１５）ＴＮＦインヒビターは４０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターΔ５１である請求項（１２）記載の方法。 （１６）ＴＮＦインヒビターは４０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターΔ５３である請求項（１２）記載の方法。 （１７）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）インヒビターをコード
    する遺伝子。 （１８）ＴＮＦインヒビターは３０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターである請求項（１７）記載の遺伝子。 （１９）ＴＮＦインヒビターは４０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターである請求項（１７）記載の遺伝子。 （２０）ＴＮＦインヒビターは４０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターΔ５１である請求項（１７）記載の遺伝子。 （２１）ＴＮＦインヒビターは４０ｋＤａＴＮＦインヒ
    ビターΔ５３である請求項（１７）記載の遺伝子。
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SG (1) SG55131A1 (ja)
TW (1) TW206234B (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04164099A (ja) * 1989-09-12 1992-06-09 F Hoffmann La Roche Ag Ｔｎｆ結合タンパク質
US7144987B1 (en) 2000-03-02 2006-12-05 Xencor Protein based tumor necrosis factor-receptor variants for the treatment of TNF related disorders

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5811261A (en) * 1988-09-12 1998-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
DE59010941D1 (de) 1989-04-21 2005-03-24 Amgen Inc TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
US6221675B1 (en) 1989-04-21 2001-04-24 Amgen, Inc. TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them
US7264944B1 (en) 1989-04-21 2007-09-04 Amgen Inc. TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them
US6232446B1 (en) 1989-05-18 2001-05-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. TNF ligands
US6262239B1 (en) 1989-05-18 2001-07-17 Yeda Research And Development Co., Ltd. TNF receptor-specific antibodies
IL95031A (en) 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
US5395760A (en) * 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
US5945397A (en) * 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
US5605690A (en) * 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US6541610B1 (en) 1989-09-05 2003-04-01 Immunex Corporation Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
EP0480389A1 (de) * 1990-10-12 1992-04-15 Hoechst Aktiengesellschaft Inhibitoren für die Bildung von Tumor Nekrose Faktor, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
GB9027917D0 (en) 1990-12-21 1991-02-13 Ici Plc Expression systems
ATE190629T1 (de) * 1991-01-18 2000-04-15 Amgen Inc Methoden zur behandlung von durch den tumor nekrose faktor ausgelösten krankheiten
ATE242322T1 (de) * 1992-03-30 2003-06-15 Immunex Corp Fusionsprotein , das zwei rezeptoren des tumornekrose-faktors enthält
CA2118119C (en) * 1992-04-30 2001-07-31 Robert C. Thompson Methods for treating interleukin-1 and tumor necrosis factor mediated diseases
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
JP4344404B2 (ja) 1996-02-09 2009-10-14 アムジェン インコーポレイテッド インターロイキン―１インヒビターおよび制御放出ポリマーを含む組成物
US5747639A (en) * 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
TW555765B (en) 1996-07-09 2003-10-01 Amgen Inc Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins
EP2002846B1 (en) 1996-12-06 2017-01-25 Amgen Inc. Combination therapy using an IL-1 inhibitor for treating IL-1 mediated diseases
CA2273850A1 (en) 1996-12-06 1998-06-11 Amgen Inc. Combination therapy using a tnf binding protein for treating tnf-mediated diseases
DE69816651T2 (de) * 1997-09-05 2004-04-01 Glaxo Group Ltd., Greenford 2,3-diaryl-pyrazolo[1,5-b]pyridazin derivate, deren herstellung und deren verwendung als cyclooxygenase 2 (cox-2) inhibitoren
US20040220103A1 (en) 1999-04-19 2004-11-04 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
TWI322154B (en) 2000-03-16 2010-03-21 Amgen Inc Il-17 receptor like molecules and uses thereof
US7879448B2 (en) * 2000-07-11 2011-02-01 Guardian Industires Corp. Coated article with low-E coating including IR reflecting layer(s) and corresponding method
WO2002020762A2 (en) 2000-09-05 2002-03-14 Amgen Inc. Tnf receptor-like molecules and uses thereof
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
NZ530765A (en) 2001-06-26 2006-11-30 Amgen Fremont Inc Antibodies that bind OPGL and compositions and methods for the treatment of bone diseases
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
JP2006517191A (ja) 2002-12-30 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド 共刺激因子を用いた併用療法
AU2004287431B2 (en) 2003-10-27 2010-03-11 Amgen Inc. Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent
AU2006315758A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Ercole Biotech, Inc. Splice switching oligomers for TNF superfamily receptors and their use in treatment of disease
US7785834B2 (en) * 2005-11-10 2010-08-31 Ercole Biotech, Inc. Soluble TNF receptors and their use in treatment of disease
PE20070684A1 (es) 2005-11-14 2007-08-06 Amgen Inc MOLECULAS QUIMERICAS DE ANTICUERPO RANKL-PTH/PTHrP
US8795668B2 (en) * 2005-12-23 2014-08-05 The Regents Of The University Of Michigan Methods for treating pulmonary fibrosis
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
US20090264353A1 (en) * 2007-10-19 2009-10-22 Santaris Pharma A/S Splice Switching Oligomers for TNF Superfamily Receptors and their Use in Treatment of Disease
GB0708376D0 (en) 2007-05-01 2007-06-06 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides and uses thereof
US8277650B2 (en) 2009-03-13 2012-10-02 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography
TW201117824A (en) 2009-10-12 2011-06-01 Amgen Inc Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins
EA201891433A3 (ru) 2010-01-15 2019-02-28 Кирин-Эмджен, Инк. Состав антитела и терапевтические режимы
US20140234330A1 (en) 2011-07-22 2014-08-21 Amgen Inc. Il-17 receptor a is required for il-17c biology
KR102530900B1 (ko) 2014-03-31 2023-05-12 암젠 케이-에이, 인크. 손발톱 및 두피 건선의 치료 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02117700A (ja) * 1988-03-31 1990-05-02 Glaxo Group Ltd 生物学的に活性な蛋白質
JPH03133382A (ja) * 1989-09-05 1991-06-06 Immunex Corp 腫瘍壊死因子―αおよび―βレセプター
JPH03164179A (ja) * 1989-04-21 1991-07-16 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh Ｔｎｆレセプター、ｔｎｆ結合たん白質およびこれらをコードするｄｎａ
JPH03197499A (ja) * 1989-05-18 1991-08-28 Yeda Res & Dev Co Ltd 腫瘍壊死因子結合蛋白
JPH04164099A (ja) * 1989-09-12 1992-06-09 F Hoffmann La Roche Ag Ｔｎｆ結合タンパク質
JPH04505014A (ja) * 1989-05-09 1992-09-03 ビーエーエスエフ　アクチェンゲゼルシャフト 新規の蛋白質及びその製法

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
IN150740B (ja) 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4560649A (en) 1981-10-15 1985-12-24 Cornell Research Foundation Assaying for hLH or hCG with immobilized hormone receptors
JPH0751511B2 (ja) 1982-03-15 1995-06-05 味の素株式会社 インターロイキン２を含有してなる癌治療剤
US4587046A (en) 1982-05-18 1986-05-06 The Regents Of The University Of California Drug-carrier conjugates
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4966888A (en) 1985-07-08 1990-10-30 Cornell Research Foundation, Inc. hCG-hLH receptor and hCG-hLH receptor-hCG complex as antigens, antibodies thereto and contraceptive vaccine
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
CA1339269C (en) 1984-05-21 1997-08-12 Douglas P. Cerretti Purification of and cloning of the gene for interleukin-2 receptor
US4578335A (en) 1984-05-21 1986-03-25 Immunex Corporation Interleukin 2 receptor
US4675285A (en) 1984-09-19 1987-06-23 Genetics Institute, Inc. Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
CA1283046C (en) 1986-05-29 1991-04-16 Nandini Katre Tumor necrosis factor formulation
IN165717B (ja) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US4931544A (en) 1986-09-04 1990-06-05 Cetus Corporation Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions
IL80005A (en) 1986-09-10 1992-11-15 Yeda Res & Dev Compositions for modulating the effect of tnf and il-1
IL98078A0 (en) 1991-05-07 1992-06-21 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising an anticytokyne
US5512544A (en) 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
IL83878A (en) * 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5153265A (en) 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8806339D0 (en) 1988-03-17 1988-04-13 Hoffmann La Roche Monoclonal antibodies
US5214131A (en) 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
US5359037A (en) 1988-09-12 1994-10-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to TNF binding protein I
US5811261A (en) 1988-09-12 1998-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
US5162430A (en) 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
DE59010941D1 (de) * 1989-04-21 2005-03-24 Amgen Inc TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
DE3913101A1 (de) 1989-04-21 1990-10-31 Boehringer Ingelheim Int Tnf-(alpha) bindende proteine und dafuer kodierende dnas
DE3920282A1 (de) 1989-06-21 1991-01-03 Boehringer Ingelheim Int Tnf-rezeptor, tnf bindende proteine und dafuer kodierende dnas
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
IL95031A (en) 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
CA2485553A1 (en) 1989-09-05 1991-03-21 Immunex Corporation Tumor necrosis factor - .alpha. and - .beta. receptors
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
DE69022559T2 (de) 1989-12-13 1996-05-02 Yeda Res & Dev Expression des rekombinanten Tumor-Nekrosisfaktor-Bindungsproteins I (TBP-I).
US5136021A (en) 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
GB2246569A (en) 1990-06-15 1992-02-05 Charing Cross Sunley Research Tumour necrosis factor - alpha binding protein
CA2087163A1 (en) 1990-07-20 1992-01-21 Hubert Agback Heterobifunctional reagents and conjugates with oxaalkylene units for amphiphilic bridge structures
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
ATE190629T1 (de) 1991-01-18 2000-04-15 Amgen Inc Methoden zur behandlung von durch den tumor nekrose faktor ausgelösten krankheiten
ATE241011T1 (de) 1991-02-27 2003-06-15 Micromet Ag Serin-reiche peptidlinker
WO1992016221A1 (en) * 1991-03-15 1992-10-01 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
CA2123593C (en) 1992-09-15 2000-03-14 Craig A. Smith Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02117700A (ja) * 1988-03-31 1990-05-02 Glaxo Group Ltd 生物学的に活性な蛋白質
JPH03164179A (ja) * 1989-04-21 1991-07-16 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh Ｔｎｆレセプター、ｔｎｆ結合たん白質およびこれらをコードするｄｎａ
JPH04505014A (ja) * 1989-05-09 1992-09-03 ビーエーエスエフ　アクチェンゲゼルシャフト 新規の蛋白質及びその製法
JPH03197499A (ja) * 1989-05-18 1991-08-28 Yeda Res & Dev Co Ltd 腫瘍壊死因子結合蛋白
JPH03133382A (ja) * 1989-09-05 1991-06-06 Immunex Corp 腫瘍壊死因子―αおよび―βレセプター
JPH04164099A (ja) * 1989-09-12 1992-06-09 F Hoffmann La Roche Ag Ｔｎｆ結合タンパク質

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04164099A (ja) * 1989-09-12 1992-06-09 F Hoffmann La Roche Ag Ｔｎｆ結合タンパク質
US7144987B1 (en) 2000-03-02 2006-12-05 Xencor Protein based tumor necrosis factor-receptor variants for the treatment of TNF related disorders

Also Published As

Publication number Publication date
DK0422339T3 (da) 1998-09-23
KR100230156B1 (ko) 1999-11-15
HK1014539A1 (en) 1999-09-30
DE69031997D1 (de) 1998-03-05
PL286089A1 (en) 1991-07-29
TW206234B (ja) 1993-05-21
ES2116970T3 (es) 1998-08-01
NO903192L (no) 1991-01-21
IL131281A0 (en) 2001-01-28
IL95031A0 (en) 1991-06-10
NO306728B3 (ja) 2003-02-17
EP0422339B1 (en) 1998-01-28
KR910015309A (ko) 1991-09-30
EP0790306A3 (en) 1998-07-01
AU5897690A (en) 1991-01-24
EP0422339A1 (en) 1991-04-17
FI114398B (fi) 2004-10-15
US6541620B1 (en) 2003-04-01
AU647397B2 (en) 1994-03-24
EP0790306A2 (en) 1997-08-20
NO306728B1 (no) 1999-12-13
GR3026416T3 (en) 1998-06-30
FI903591A0 (fi) 1990-07-16
PT94754B (pt) 1997-04-30
PL168844B1 (pl) 1996-04-30
SG55131A1 (en) 1998-12-21
ATE162801T1 (de) 1998-02-15
PT94754A (pt) 1991-03-20
IL95031A (en) 2007-03-08
NZ234499A (en) 1992-08-26
IE990595A1 (en) 2000-11-15
DE69031997T2 (de) 1998-05-14
NO903192D0 (no) 1990-07-17
IE902608A1 (en) 1991-02-27
CA2021369A1 (en) 1991-01-19

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