JPH0272877A - Ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 及且上段■几分ル 本発明は血管平滑筋収縮作用を有するペプチド（エンド
セリン）をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、エンド
セリン前駆体蛋白質、エンドセリン前駆体蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡ、上記ＤＮＡを保持する
形質転換体および成熟エンドセリンもしくはエンドセリ
ン前駆体蛋白質の製造、使用方法および該ペプチドを含
有する薬剤組成物に関する。

上記エンドセリンとしてはブタ・エンドセリンおよびヒ
ト・エンドセリンが包含される。また本明細書において
、前駆体蛋白質とは成熟ペプチド（エンドセリン）のア
ミノ酸配列を持ち、かつそのＮ末端側もしくはＣ末端側
、またはその両方にエンドセリンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａによっ
てコードされるアミノ酸配列の一部又は全部を持つよう
な蛋白質をさす。

１朋 内皮依存性の血管拡張反応とならんで１種々の刺激に対
する内皮依存性の血管拡張反応が報告されている。血管
の伸張や内圧の７！ｃ進といった機械的負荷による収縮
、さらには二二一口ペプチドＹ〔竹本、プロシーデイン
グズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイ
エンス・オン・ザ・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、ｌＪ、ｓ、Ａ、）、　７９．
５４８５（１９８２）；シー、ミンス等、同、　８１．
４５７７（１９８４））によるノルアドレナリン収縮の
増強などがその例である。

アメリカン・ジャーナル・オン・フイジオロジー（＾ｍ
ｅｒ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、　２４８．　Ｃ５
５０（１９８５）（ニーりリスチン等）およびジャーナ
ル・オン・セルラー・フイジオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ
　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、　１３２．２６３（１９８７）
　Ｃアールエフオブライエン等）には内皮細胞由来の冠
血管収縮因子（分子量はそれぞれ８゜５００および３，
０００　）が記載されているが構造は不明である。また
、ジャーナル・オン・ファーマコロジー・アンド・エク
スペリメンタル・セラビューティクス（Ｊ、　Ｐｈａｒ
ｍａｃｌ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、）、　２３６．３３
９　（１９８５）　（エムエヌ　ギレスピー等）にも内
皮細胞由来のペプチド様物質が記載されているが、これ
も構造は不明である。

一方、血管収縮作用を有するペプチドとしてバンプレツ
シン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）やブラジキニン（Ｂｒ
ａｄｙｋｉｎｉｎ）などのペプチドが知られていて、そ
れらのアミノ酸配列も明確にされているが、これらのペ
プチドが哺乳類または鳥類の血管内皮細胞をオリジンと
して得られたという報告はない。また、血管収縮作用を
有するアンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）が
ウシ大動脈の内皮細胞から得られるという報告〔アイカ
イフォーおよびヴイ　ジエ　ドザブ、サーキュレーショ
ン・リサーチ（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃ
ｈ）、　６０．４２２　（１９８７））があるが、アン
ジオテンシンは分子ｔ　１，０００のペプチドである。

本発明者らは補乳類または鳥類の血管内皮細胞から得ら
れる、人間を含めた動物に対し、血管平滑筋収縮作用を
有する分子４ｉ　２，５００±３００の新規なペプチド
を見出し、先に出願している（特願昭６２−２５５３８
１号）、本発明者等は、このペプチドをエンドセリンと
命名した。

このエンドセリンは２１個のアミノ酸残基を有し、その
中には上記アミノ酸配列のＮ末端から数えて第１番目、
第；３番目、第１１番目、第１５番目に位置する４個の
システィン基が含まれ、それらは２組のジスルフィド結
合を形成している。このジスルフィド結合の組合せとし
ては、　　ｌ　−１５，３−１１の組合せ、および１−
１１．３−１５の組合せがあるが、前者の組合せのもの
の方が活性が高い。

ブタ大動脈内皮細胞から単離・精製されたエンドセリン
のうちの一つは、アミノ酸分析にンヒドリン法）１分子
量　８＋！Ｉ定およびその他のデータから、次のアミノ
酸２１個からなるペプチド（以後、エンドセリンＡと表
す）であることが分かつている。エンドセリンＡのアミ
ノ酸配列は Ｃｙｓ　　Ｓａｒ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　
Ｌａｕ　　ＭｅｔＡｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙ
ｓ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＣｙｓ　　Ｈｉｓ　
　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ｔｒｐで
あり、ＣｙｓとＣｙｓの間でＳ−８結合が２組存在する
。分子量は２，４９２である。

また１本発明者らは上記ブタからのエンドセリンＡの前
駆体としてアミノ酸２０３個からなるペプチド（以後、
ブタ・エンドセリン前駆体と表す）も得た。この前駆体
蛋白質のアミノ酸配列については、第２図のアミノ酸配
列Ｎ０．　１〜２０３を参照されたい。第２図中、四角
で囲んだ部分が成熟ブタ・エンドセリンに相当する。

発明が解決しようとする問題占 従来、上記ペプチドは哺乳類または鳥類の血管内皮細胞
の培養、それに続く培養物からの単離、精製といった方
法でのみ得られていたが、該方法は複雑でまた目的とす
るペプチドも少量しか得られないという問題があった。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、上記血管収縮作用を有する新規ペプチド
（エンドセリン）を大量に製造する方法を提供すべく研
究を重ねた結果、ブタ大動脈内皮細胞エンドセリンの相
補ＤＮＡのクローニングに成功し、その全塩基配列を同
定し、エンドセリンを遺伝子組み換え技術によって大量
に生産する道を拓くことに成功したものである。

また本発明者らは上記ブタ・エンドセリンのペプチドの
一部をコードするＤＮＡを化学合成し。

プローブとして使用して、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライ
ブラリーから、はじめてヒトのエンドセリンをコードす
るｃＤＮＡをクローニングすることにも成功し、さらに
ｃＤＮＡの全塩基を同定し、ヒトのエンドセリンやその
前駆体蛋白質のアミノ酸配列（第４図）を明らかにし、
これらを遺伝子組み換え技術によって大量に生産する道
を拓くことに成功したものである。

なおヒト成熟エンドセリンは上記のブタからのエンドセ
リンＡと同一で、第４図におけるＮｏ　、　５３〜７３
のアミノ酸に相当する Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　
Ｌｅｕ　　ＭｅｔＡｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙ
ｓ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＣｙｓ　　Ｈｉｓ　
　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ｔｒｐで
あり、分子量は２，４９２と計算された。

しかし、ヒト・エンドセリンの前駆体蛋白質は２１２個
のアミノ酸からなり、ブタ・エンドセリンの前駆体蛋白
質よりも９個アミノ酸が多く、アミノ酸配列においても
変化が認められた。これらの違いについては、第６図を
参照されたい。第６図において、Ｈがヒト・エンドセリ
ンを、Ｐがブタ・エンドセリンを表わし、四角で囲った
部分が成熟エンドセリンである。

すなわち、本発明は（１）ブタまたはヒト・エンドセリ
ンをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２）ブタま
たはヒト・エンドセリンの前駆体蛋白質、（３）ブタま
たはヒト・エンドセリンをコードするＤＮＡを含有する
ＤＮＡを保持する形質転換体および（４）ブタまたはヒ
ト・エンドセリンをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ
を保持する形質転換体を培養し、培養物中にエンドセリ
ンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
ブタまたはヒト・エンドセリンの製造方法に関するもの
である。

本発明のブタ・エンドセリンをコードするＤＮＡとして
は、ブタ・エンドセリンのアミノ酸配列をコードする塩
基配列を含有するものであればいかなるものであっても
よいが、たとえば第２図の塩基配列を含有するＤＮＡあ
るいはその一部のＤＮＡであることが好ましい。

またヒト・エンドセリンをコードするＤＮＡとしては、
ヒト・エンドセリンのアミノ酸配列をコードする塩基配
列を含有するものであればいかなるものであってもよい
が、たとえば第４図の塩基配列を含有するＤＮＡあるい
はその一部のＤＮＡであることが好ましい。

本発明方法におけるエンドセリンをコードする塩基配列
を有するＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば。

（イ）エンドセリンをコードするＲＮＡを分離し、（ロ
）該ＲＮＡから単鎖の相補Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａ　）を、次いで二重１ｊｔＩＤＮＡを合成し。

（ハ）該相補ＤＮＡをファージあるいはプラスミドなど
のクローニングベクターに組み込み、（ニ）得られた組
み換えＤＮＡで宿主を形質転換し。

（ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばエンドセリンの一部をコードするＤＮ
Ａプローブとのハイブリダイゼーションにより、あるい
は抗エンドセリン抗体を用いたイムノアッセイ法により
目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミ
ドを単離し、 （へ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化Ｄ
ＮＡを切り出し。

（ト）該クローン化ＤＮＡを発現ベクター中のプロモー
ターの下流に連結する。ことにより製造することができ
る。

エンドセリンをコードするＲＮＡは１種々のエンドセリ
ン産生細胞１例えばブタ大動脈内皮細胞、ヒト大動脈内
皮細胞、ヒト胎盤などから得ることができる。

エンドセリン産生細胞からＲＮＡを調製する方法として
は、グアニジンチオシアネート法〔（ジェー・エム・チ
ルブライン（Ｊ、Ｍ、　、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら、バイ
オケミストリー（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、　
１８．５２９４　（１９７９）〕などが挙げられる。

このようにして得られたＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素
を用いて、例えば岡山（Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ）らの方法
〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）　２１６１　（１９８２）および同誌３　２
８０（１９８３））に従いｃＤＮＡを合成し、得られた
ｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。

ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌由来のｐＢ　Ｒ３２２（ジーン（ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　）
　ｒ　２Ｌ９５（１９７７））、ｐＢ　Ｒ３２５（ジー
ン、％、１２１（１９７８））、ｐＵｃ１２〔ジーン、
月１，２５９（１９８２））、ｐＵ　Ｃ１３（ジーン、
耳片２５９（１９８２））、枯草菌由来のｐＵＢｌｌｏ
（バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーヨン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｏ＋ｓｍｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎ）、旦２６７８（１９８３））などが挙
げられるが、その他のものであっても、宿主内で複製増
殖されるものであれば、いずれをも用いることができる
。またｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、
たとえばλｇｔｔｔ（ヤング及びデーヴイス（Ｙｏｕｎ
ｇ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，、）プロシー
ジングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・
サイエンス・オン・ザ・ニー・ニス・ニー（ｐｒｏｅ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）
、８０．１１９４（１９８３））などが挙げられるが、
その他のものであっても宿主内で増殖できるものであれ
ば用いることができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば。

ティー・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モ
レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−（Ｃｏ　ｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
−ｂｏｒａｔｏｒｙ）、第２３９頁（１９８２）に記載
の方法などが挙げられる。またファージベクターにｃＤ
ＮＡを組み込む方法としては、たとえばヒューン（Ｈｙ
ｕｎｈ、Ｔ、Ｖ、）らの方法〔デイ−・エヌ・ニークロ
ーニングアプラクティカルアプローチ（ＤＮＡ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ）　１　、４９（１９８５））などが挙げられる。

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主たと
えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌。

バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導入する。

上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１
（プロシージング・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−
・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、）６ｇＬ１６０（１９６８））、Ｍ２Ｏ３（ヌクレ
イツク°アシツズ。

リサーチ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ）、９，３０９（１９８１）Ｌ　Ｊ　Ａ　２２１
（ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ）Ｌ１２虹５１７（１９７８））、　ＨＢＩＯＩ（
ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー月ユ４
５９（１９６９））、Ｃ６００（ジェネティックス（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）、３９，４４０（１９５４））などが
挙げられる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス。

サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ
　Ｉ　１１４（ジーン。

人２５５（１９８３））、２０７−２１（ジャーナル・
オン・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ％８７（１９８４））などが挙
げられる。

プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たとえ
ばティー・マニアテイス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら
。

モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、第２４９頁（１９８２）に記
載のカルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロラ
イド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる。

またファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば増
殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて
導入することができる。

このようにして得られた形質転換体中から自体公知の方
法、例えばコロニー・ハイブリダイゼーション法〔ジー
ン、遅扉６３（１９８０））およびＤＮＡ塩基配列決定
法〔プロシージング・オン・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）７４，５６０（１９
７７）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９３０９（１
９８１））を用い、求めるクローンを選出する。

このようにして、クローン化されたエンドセリンをコー
ドする塩基配列を含有するＤＮＡを有するベクターを保
持する微生物が得られる。

次に、該微生物からプラスミドやファージ・ベクターを
単離する。

該単離法としては、アルカリ法〔エッチ・シー・バレン
ボイム（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｍｂｏｉｍ）ら、ヌクレイツク
・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、ｌ＋１５１３（１９７９））など
が挙げられる。

上記クローン化されたエンドセリンをコードする塩基配
列を含有するＤＮＡを有するプラスミドまたはファージ
・ベクターは目的によりそのまま。

または所望により制限酵素で切り出す。

クローン化された遺伝子は１発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。

ヒト・エンドセリンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含有するヒト・ｃ
ＤＮＡライブラリーは上記の方法などで得ることが出来
るが、市販品として購入することも可能であり５例えば
ヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリーはクローンチックラボ
ラトリーズ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、米国）から入手するこ
とができる。

ヒト・ｃＤＮＡライブラリーからヒト・エンドセリンｃ
ＤＮＡをクローニングする方法としては、例えばファー
ジベクターλｇｔｌｌと抗ブタ・エンドセリン抗体を用
いたＨｕｙｎｈらの方法〔ディーエヌニークローニング
、ア　プラクティカルアプローチ（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）
、ｐ４９（１９８５））あるいはブタ・エンドセリンの
アミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチ
ドをプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーシ
ョンまたはプラークハイブリダイゼーション法〔ティー
・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ−ｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、（１９８２）３などが挙げられる。

このようにしてクローン化されたヒト・エンドセリンｃ
ＤＮＡは必要があればプラスミド、例えばｐＢＲ３２２
，ｐＵｃ１２．　ｐＵｃ１３．　ｐＵｃｌｇ、　ｐＵｃ
１９．　ｐＵｃ１１８゜ＰＵＣ１１９などにサブクロー
ニングしてヒト・エンドセリンｃＤＮＡを得ることがで
きる。

このようにして得られたＤＮＡの塩基配列を、たとえば
マキサム・ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒ
ｔ、　ｗ、、プロシージングズ・オン・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・オン・ザ・ニー・ニ
ス・ニー（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７４，５６０（１９７７））あ
るいはジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、ら、ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９，３０９（１９８１））
によって決定し、既知のアミノ酸配列との比較からヒト
・エンドセリンＱＤＮＡの存在を確認する。

以上のようにして、ヒト・エンドセリンの前駆体たんば
くをコードするＤＮＡ　（ヒト・エンドセリンｃＤＮＡ
）（第４図）が得られる。

後述の実施例５で得られたヒト・エンドセリンの眞駆体
たんばくをコートするＤＮＡの制限酵素断片地図を第３
図に示す。またジデオキシ法で決定したｃＤＮＡの塩基
配列と、その塩基配列から判明したアミノ酸配列を第４
図に示す。

上記のようにしてクローン化されたヒト・エンドセリン
の前駆体たんばくをコードするＤＮＡは目的によりその
まま、または所望により制限酵素で消化して使用するこ
とが出来る。

クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる
。

該ＤＮＡはその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳開始コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成りＮ
Ａアダプターを用いて付加することもできる。さらに該
ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを接続
する。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２、ｐＵｃ１
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐ　Ｕ　Ｂ　１１０
　、　ｐ　Ｔ　Ｐ　５　、　ｐ　Ｃ１９４）　、酵母由
来プラスミド（例、ｐｓＨ１９，ｐｓＨ１５）。

あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレ
トロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス
などが挙げられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。

形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合は
、ｔｒｐプロモーター、Ｑａｃプロモーター、ｒｅｃＡ
プロモーター　λＰＬプロモータＱＰＰプロモーターな
どが、宿主がバチルス属菌である場合は、５ＰＯＬプロ
モーター、ＳＰ○２プロモーター、ｐｅｎＰプロモータ
ーなど。

宿主が酵母である場合は、ＰＨ０５プロモーターＰＧＫ
プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモータ
ーなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌で
プロモーターがｔｒｐプロモーターまたはλＰＬプロモ
ーターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターメタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。

なお、発現にエンハンサ−の利用も効果的である。

このようにして構築されたヒト・エンドセリンの前駆体
たんばくや成熟ペプチド（エンドセリン）をコードする
ＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造
する。

宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例としては
、前記したものと同様のものが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサツカロマイセスセレビシ
ェ（ＳａｃｃａｒｏｌＩｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ａ）　Ａ　Ｈ２２。

ＡＨ２２Ｒ″″、ＮＡ３７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄなど
が挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７、Ｖｅ
ｒ０．チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ。

マウスＬ細胞、ヒトＰＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージング・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、６９．２１１０（１９７２）やジー
ン、　１７．１０７（１９８２）などに記載の方法に従
って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
　、１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従
って行なわれる・酵母を形質転換するには、たとえばプ
ロシージング・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ）、７５．１９２９（１９７８）に記載の方
法に従って行なわれる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジー（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

このようにして、エンドセリンの前駆体蛋白質や成熟ペ
プチド（エンドセリン）をコードするＤＮＡを含有する
発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。

宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。

炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカーペ
プトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出
液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば
塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネ
シウムなどが挙げられる。

また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。

培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ）　、ジャーナル・オン・エクスペリメンツ・
イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊ。

ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。

４３１−４３３．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮｅＩＩＹｏｒｋ　１９
７２）が好ましい、ここに必要によりプロモーターを効
率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアク
リル酸のような薬剤を加えることができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を
加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダ−（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ、に、し、ら、［プロシー
ジング・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ）７７．４５０５（１９８０）　］が挙げられる。

培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい、培養は
通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に
応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際。

培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含
むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１２２
゜５０１（１９５２））、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地〔ヴイ
ロロジ−（Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ）、８，３９６＜１９５
９））、　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地〔ジャーナル・
オン・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーシ目ン
（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＭｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）　１９
９，５１９（１９６７））、　１９９培地〔プロシージ
ング・オン・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロ
ジカル・メディスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　
ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）７３．１　（１９５０）
）などが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好まし
い。培養は通常約３０℃〜４０”Ｃで約１５〜６０時間
行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

上記培養物からエンドセリンの前駆体蛋白質や成熟エン
ドセリンを分離精製するには、例えば下記の方法により
行なうことができる。

エンドセリンの前駆体たんばくや成熟エンドセリンを培
養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、
公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩
衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結
融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠
心分離やろ過によりエンドセリンの前駆体蛋白質や成熟
ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩
衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんばく変性剤
や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれてい
てもよい。

培養液中にエンドセリン前駆体蛋白質や成熟ペプチドが
分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法
で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。

このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に
含まれるエンドセリン前駆体蛋白質や成熟ペプチドの精
製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行
なうことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ適法、ゲルろ適法、および５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法
。

等重点電気泳動法などの等重点の差を利用する方法など
が挙げられる。

かくして生成するエンドセリン前駆体蛋白質や成熟ペプ
チドの活性は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセ
イ、蛋白質リン酸化などにより８＋１１定することがで
きる。また生成物に血管収縮活性がある場合は、該活性
を指標にして測定することもできる。

作用・効果 本発明のＤＮＡでＤＮＡ感染または形質転換した菌体や
細胞では、大量のヒト・エンドセリン前駆体たんばくや
成熟ペプチドを産生せしめることができ、ヒト・エンド
セリン前駆体たんばくや成熟ペプチド生産を有利に導く
ことができる。

ここに製造されるエンドセリン、特に成熟エンドセリン
は低血圧治療剤や局所血管収縮剤としても利用すること
ができるのみならず、生体の血管収縮反応のメカニズム
の解析や血管収縮因子のアンタゴニストの解明の手掛か
りを与えるものである。

例えば、エンドセリンは血管収縮剤として種々の出血、
例えば胃や食道の出血を防止するような効果を有する。

またこのものは種々のショック症状を回復させる効果を
も有する。このペプチドは経口的、局所的、静注もしく
は非経口的に投与することができるが、局所もしくは静
注投与が好ましい。投与量は０．００１μｇ−１００μ
ｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１μｇ〜１０μｇ／ｋｇで
あり、体重に応じた投与量を１〜１０＋ａＱの生理的食
塩水中に溶解して用いる。

エンドセリンは副成分を含む乳剤、水和剤、錠剤、水溶
剤、粉剤１粒剤、カプセル剤、丸剤などの種々の形態に
製剤化したものとして使用できる。

副成分としては、薬理的に許容され得る賦形剤、崩壊剤
、滑沢剤、結合剤、分散剤、可塑剤、充填剤、担体など
が用いられる。これらの副成分の例としては、賦形剤と
しては乳糖、ぶどう糖、白糖などが、崩壊剤としては滅
粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、カルボキシメチル
セルローズカルシウムなどが、滑沢剤としてはステアリ
ン酸マグネシウム、タルク、流動パラフィンなどが、結
合剤としては単シロップ、ゼラチン溶液、エタノール、
ポリビニルアルコールなどが、分散剤としてはメチルセ
ルロース、エチルセルロース、セラックなどが、可塑剤
としてはグリセリン、澱粉などが挙げられる。

以上、エンドセリンをコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのクロ
ーニング、エンドセリン前駆体および成熟ペプチドの発
現ベクターの作製と、それらによる形質転換体の製造、
該形質転換体を用いたエンドセリン前駆体たんばくおよ
び成熟ペプチドの製造及びその有用性等について詳細に
述べた。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ　Ｂ　　Ｃｏ
＋＊ｍ１ｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ａＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メツセンジャーリポ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄｃＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム ＧｌｙまたはＧ　ニゲリシン Ａ　ｌ　ａまたはＡ　：アラニン Ｖａｌまたは■　：バリン ＬｅｕまたはＬ　：ロイシン １１ｅまたは工　：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ　：セリン Ｔ　ｈ　ｒまたはＴ　：スレオニン ＣｙｓまたはＣニジスティン ＭｅｔまたはＭ　：メチオニン ＧｌｕまたはＥ　：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ　＝アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ　：リジン ＡｒｇまたはＲ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ　：フェニールアラニンＴｙｒまたはＹ
　：チロシン Ｔ　ｒ　ｐまたはＷ　ニトリブトファンＰｒｏまたはＰ
　ニブロリン ＡｓｎまたはＮ　：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ　：グルタミン なお、本発明のヒト・エンドセリン前駆体や成熟ペプチ
ドにおいては、そのアミノ酸配列の一部が修飾（付加、
除去、その他のアミノ酸への置換など）されていてもよ
い。

失庭孤 以下の参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

後述の実施例３で得られた形質転換体エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＸＬ−１／ｐ
ｐＥ　Ｔ４゜４は昭和６２年１０月３０日に通商産業省
工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号
ＦＥＲＭＰ−９６８３として寄託され、また該微生物は
昭和６２年１１月２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ
）に受託番号Ｉ　Ｆ　Ｏ１４６７０として寄託されてい
る。

後述の実施例６で得られた形質転換体エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ１０
３／ｐＨＥ　Ｔ　４−３は昭和６２年１２月１０日に通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に
受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−９７５５として寄託され、また
該微生物は昭和６２年１２月４日から財団法人発酵研究
所（ＩＦＯ）に受託番号Ｉ　Ｆ　Ｏ１４６７５として寄
託されている。

また同じく形質転換体５ａｃｃｈａｒｏ＋ｍｙｃｅｓ　
ｃａｒｅｖｉｓｉａｅＡＨ２２Ｒ″″／　ｐ　Ｇ　Ｌ　
Ｄ９０６−２０は昭和６３年６月１６日から財団法人発
酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ１０４３５として
寄託されており、また該微生物は昭和６３年６月２４日
からＦＲＩにブダペスト条約に基きＦＥＲＭ　ＢＰ−１
９２５として寄託されている。

後述の実施例９で得られた形質転換体サツカロミセス６
セレビシｘ　（Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）Ａ　Ｈ２２Ｒ”７　ｐ　Ｇ　Ｌ　Ｄ９０
６−２１、実施例１０で得られたエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｎ４８３０／　
ｐ　Ｔ　Ｓ　４００７およびエシェリヒア・コリ（１：
５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ１／　ｐ　
Ｔ　Ｓ　６００３は昭和６３年１０月２８日に通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にブダペ
スト条約に基き受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−２１３２、Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−２１３０、ＦＥＲＭＢ　Ｐ−２１３１と
して各々寄託された。

見工健 （１）血管平滑筋収縮作用のアッセイ法内皮を綿棒によ
る擦過にて除去したブタ右冠状動脈スパイラル標本（２
Ｘ２０ｍｓ）を炭酸ガスと酸素の混合ガス（５：　９５
．Ｖ／Ｖ）で飽和した３７℃のクレブス−リンゲル液（
３ｍＱ）中に懸垂する。刺激前張力（ｂａｓａｌ　ｔｅ
ｎｓｉｏｎ）を１ｇに設定したのち、張カドランスデュ
ーサーで等尺性張力を４１１定する。

（２）強心作用のアッセイ法 前記（］）のアッセイ法で用いたブタ右冠状動脈スパイ
ラル標本のかわりにモルモットの右心房の懸垂標本を使
用し、　（１）と同じ操作を行って張力および毎分の心
脈数を測定する。

（３）ＥＤ、。

平均効果投与是のことで、５０％の被験体に有効な投与
量をいう。

失庭貫上　ブタ大動脈内皮細胞ｃＤＮＡライブラリーの
作製 ブタ大動脈内皮細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むイーグ
ル最少培地中にて単層培養し、１０８個の細胞よりＲＮ
Ａをグアニジン・熱フェノール法〔マニアティステイー
（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　）ら、モレキュラークロー
ニングアラポラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎ
ｕａｌ）　。

ｐｐ、１９４−１９５．１９８２　）を用いて抽出し、
このＲＮＡをポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセルロース
カラムクロマトグラフィーにより精製した（同上ｅ　Ｐ
Ｐ１９７−１．９８　＞　　。このポリ　（Ａ）ＲＮＡ
を鋳型とするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをワトソンシージｚ　−（
Ｗａｔｓｏｎ、Ｃ，Ｊ、）とジャクソンジェーエフ（Ｊ
ａｃｓｏｎ、Ｊ、Ｆ、）の方法〔グローバーデイ−エム
（Ｇｌｏｖｅｒ、Ｄ、Ｍ、）ｐディーエヌエークローニ
ング（Ｄ　Ｎ　Ａ　ｃｌｏｎｉｎｇ）　。

ｖｏｌ、　Ｉ　、ｐｐ、７９−８８．１９８５）で合成
し１次にヒューンティーブイ（Ｈｕｙｎｈ、Ｔ、Ｖ、　
）　らの方法（同上ｒ　ＰＰ４９−７８）に従って、こ
のｃＤＮＡをファージベクタλｇｔｌｏのＥｃｏＲ１部
位にクローニングし、２×１０６独立クローンよりなる
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

％−ブタ・エンドセリンの一部をコードするＤＮＡプロ
ーブの作製 ブタ・エンドセリンの７〜２０残基目のアミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ　−Ｖａ　１
−Ｔｙ　ｒ−Ｐｈ　ｅ−Ｃｙ　５−Ｈｌｓ　−Ｌｅｕ−
Ａｓｐ−１１ｅ−１１ｅ をコードするＤＮＡ配列のうち、最も使用頻度の高いコ
ドンをラーゼ（Ｌａｔｈｅ、Ｒ，）の報告〔ジャーナル
オンモレキュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、）　１８３．１−１２　（１９８５）　）に従って選
出し、次のような配列を持つ、ＤＮＡプローブを合成し
た。

”　ＡＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＴＣＴＡＣＴＴ
ＣＴＧＣＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣ”このＤＮＡ
プローブの５′端をポリヌクレオチドキナーゼを用いて
３２ｐ−りん酸化し、ｃ　ＤＮＡライブラリのスクリー
ニングに用いた。

実施例３　ブタ・エンドセリンｃＤＮＡの単離とその塩
基配列の決定 大腸菌Ｃ６００ｈ　ｆｌに前述のλｇｔｌｏｃＤＮＡラ
イブラリーを感染させてブレーティングし、ファージプ
ラークを出現せしめた。プラークＤＮＡの一部をナイロ
ン膜にうつしとり、３２Ｐで標識した前項のＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダ
イゼーションは、２０％ホルムアミド存在下、４２℃で
行なった。ハイブリダイゼーション陽性の３８個のクロ
ーンをそれぞれ単離し、そのうちのひとつであるλｐＥ
Ｔ４のｃＤＮＡ部分をＥｃｏＲｌで切り出してプラスミ
ドｐＵＣ１１８のＥｃｏＲ１部位にリクローニングし、
プラスミドｐＰ　ＥＴ４．４を作製した。このプラスミ
ドで大腸菌ＸＬ−１を形質転換し、形質転換体エシェリ
キア・コリＸＬ−１／ｐｐ　ＥＴ４．４を得た。このプ
ラスミドに含まれるｃＤＮＡ部分は１．８Ｋｂｐであり
、その簡単な制限酵素地図を第１図に示した。

図中の区域は以下のものを示す。

ニコ：ブタ・エンドセリン前駆体コード域、■：ブタ・
エンドセリン、ロ：シグナルベブチド（推定）ム：塩基
性残基ペア、ＭＡＭ　：ポリ（Ａ）。

：シーケンシングの方向と長さ このｃＤＮＡ部分の塩基配列をサンガー（Ｓａｎｇｅｒ
）の方法〔プロシージングオンザナショナルアカデミー
オブサイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
。

ＵＳＡ）　７４．５４６３−５４６７　（１９７７）　
）によって決定した。

この塩基配列、およびそれより推定されるブタ・エンド
セリン前駆体蛋白質のアミノ酸配列を第２図に示した。

二二で囲った領域が、成熟エンドセリンである。

実施例４ （１）エンドセリンＡの合成 市販の保護トリプトファン樹脂（ＢｏＣ−ＴｒＰ　（Ｃ
ＨＯ）−ＰＡＭ樹脂、アプライド・バイオシステムズ社
製）　０．７ｇ　（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、ペプ
チド合成機（アプライド・バイオシステムズ社製・モデ
ル４３ＯＡ）を使用し、通常の方法により合成した。

縮合方法は、樹脂上のＢｏＣ基を塩化メチレン中５０％
トリフルオロ酢酸で処理し、末端アミノ基を遊離させ、
この遊離のアミノ基にＢｏｃ−１１ｅ。

ＢｏＣ−Ａｓｐ　（ＯＢｚ　１）ｔ　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ。

ＢｏＣ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　　（Ａ
ｃｍ）、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ　（Ｂｒ−ｚ）＋　Ｂｏａ−Ｖ
ａ　］、、］ＢｏＣ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯＢ
ｚ　ｌ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　　（ＣＱ−Ｚ）、Ｂｏｃ−
Ｍｓｔ、　Ｂｏｅ−３ｅｒ　（Ｂｚｌ）をＣ末端側より
エンドセリンのアミノ酸配列通りに、ジシクロへキシル
カルボジイミド（ＤＣＣ：）の存在下に縮合させる反応
をくり返した。

この様にして得られた保護エンドセリン樹脂１゜８ｇの
うち８００　＋ｎｇをアニソール１ｍＱ、１．２−二タ
ンジオチール１ｒｒ＋Ｑで膨潤させ、０℃でフッ化水素
ＬＱｍＱと６０分間処理した後、過剰のフッ化水素を減
圧留去した。残査を酢酸エチル５ｍＱで洗った後、５０
％−酢酸水に抽出し、デキストランゲル（セファデック
スＬＨ−２８）カラム（２Ｘ９０ｃｍ）に付し、同溶媒
で溶出した主分画を集め凍結乾燥し、１２０■の白色粉
末を得た。これの２０■を８０％−酢酸水２０ｍＱに溶
解し、トリフルオロ酢酸第二水銀１５■を加え、室温で
６０分間撹拌したのち、同溶媒３０ｍＱで希釈し、硫化
水素ガスを通じ、析出物をろ去し、凍結乾燥したにれを
希酢酸４００　ｍＱに溶解し５重炭酸アンモニウムでｐ
Ｈ８に調節したのち６時間空気酸化に付し、酢酸を加え
ｐＨ３としたのち、凍結乾燥した。これを３０％−酢酸
で充填したセファデックスＬＨ−２０のカラム（２Ｘ９
０ｍ）に付し、主要分画を集め、さらにＨＰＬＣ（カラ
ム：　ＭＭＣ，溶媒：０．１％−トリフルオロ酢酸水と
０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリルの直線
型濃度勾配溶出）で分取し目的物２．７■を得た。

合成されたエンドセリンＡは、ＨＰＬＣで天然抽出物と
一致する位置に溶出された。

測定条件■ カラム：ケムコ社製ヌクレオシル５０ＤＳ−Ｈ（４，６
ｍφＸ２５０ｃｍ） 溶離液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（
０，１％−トリフルオロ酢酸含有−５０％含水アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配 溶出（２０分） 流　速：　１．ｏｍ　Ｑ　／分 測定条件■ カラム：東洋ソーダ製　ＤＥＡＥ−２ＳＷ（４，６ｍＩ
ＩφＸ２５０ｍ） 溶離液：Ａ液（１０ｍＭ　　トリス・塩酸ｐ　Ｈ７，５
）Ｂ液（ＩＭＮａＣＱ含有Ａ液） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配 溶出（４０分） 流　速：　１．Ｏｍ　ｎ　／分 溶出位置　２１．５分（ａｌｌ定条件■）２１．３分（
測定条件■） （２）アッセイ 上記（１）で得られたエンドセリンＡの活性が参考例（
１）および（２）の方法で測定された。

アッセイ法（１）（ブタ冠状動脈によるアッセイ）によ
ルＥＤ、、は４〜５ＸＩＯ−１ａモ／ｌ／／Ｑテアった
・ アッセイ法（２）（モルモット左心房による強心作用）
によるＥＤｌはｌＸｌ０−’モル／Ｑであった。

（３）注射剤の製造 （１）で得られたエンドセリンＡ　１２μｇを生理的食
塩水に溶解し、ミリポアフィルタ−でろ過、次いで凍結
乾燥した。使用時に静注剤を製造するに当り、上記凍結
乾燥物を生理的食塩水に溶解し、全量を５１１Ｑとして
注射剤とした。

実施例５　ブタ・エンドセリンの一部をコードするＤＮ
Ａプローブの作製 ブタ・エンドセリンの７〜１６残基目のアミノ酸配列 Ｍ　ｅ　ｔ　−Ａ　ｓ　ｐ　−Ｌ　ｙ　ｓ　−Ｇ　ｌ　
ｕ　−Ｃｙ　ｓ　−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−
Ｈｉｓから予想されるメツセンジャーＲＮＡの配列を推
定し、次のような配列を持つ、ＤＮＡプローブを化学合
成した。

”ＴＧ　　ＧＣＡ　　ＧＡＡ　　ＧＴＡ　　ＧＡＣＧＣ
Ａ　　ＣＴＣＣＴＴ　　ＧＴＣＣＡＴ”このＤＮＡプロ
ーブの５′端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
３２Ｐ−りん酸化し、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニ
ングに用いた。

叉産孤旦　　ヒト・エンドセリン前駆体ｃＤＮＡの単離
とその塩基配列の決定 大腸菌Ｙ　１０９０に前述のヒト胎盤ｃＤＮＡライブラ
リー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　Ｉｎｃ、製）を感染させてブレーティングし、ファー
ジプラ―りを出現せしめた。ベントンとデイビス（Ｂａ
ｎｔｏｎ、　Ｗ、、　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，）の報告〔サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１９６．１８０−１８２
（１９７７））に従ってプラークＤＮＡの一部をニトロ
セルロース膜にうつしとり、３Ｚｐで標識した前項のＤ
ＮＡプローブとプラークハイブリダイゼーションを行な
った。ハイブリダイゼーションは、ホルムアミド非存在
下、５５℃で行なった。ハイブリダイゼーション陽性の
５個のクローンをそれぞれ単離し、そのうちのひとつで
あるλＨＥＴ４−３のｃＤＮＡ部分をＥｃｏＲＩで切り
出してプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲ１部位にリクロ
ーニングし、プラスミドｐＨＥＴ４−３を作製した。こ
のプラスミドで大腸菌ＪＭ１０３を形質転換し、形質転
換体エシェリヒア・コリＪＭ１０３／ｐＨＥＴ４−３を
得た。このプラスミドに含まれるｃＤＮＡ部分は１．２
Ｋｂｐであり、その簡単な制限酵素地図を第３図に示し
た。図中の区域は以下のものを示す。

ロコ：ヒト・エンドセリン前駆体コード域。

ｍ：ヒト・エンドセリン成熟体コード域このｃＤＮＡ部
分の塩基配列をサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の方法［プロ
シージングオンザナショナルアカデミーオブサイエンス
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）　７４．５４６３−５４６７　（１９７７）　
］によって決定した。

この塩基配列、およびそれより推定されるヒト・エンド
セリン前駆体のアミノ酸配列を第４図に示した。ニコで
囲った領域が、ヒト・エンドセリン成熟ペプチド部であ
る。

末産孤ユ　酵母を宿主とするヒト・エンドセリン発現ベ
クターの構築（第５図）と酵母 への導入 実施例６に記載のプラスミドｐＨＥＴ４−３（１０μｇ
）を制限酵素ＢｇＱＩＩとＥｃｏＲＩ　　［ともに全酒
造（株）］で消化した後、アガロースゲル電気泳動を用
いて、ヒト・エンドセリンのコード領域を含む１．ｏＩ
Ｋｂ　ＤＮＡ断片を分離した０本ＤＮＡ断片（２μｇ）
に１ユニツトのＤＮＡポリメラーゼ■・に１ｅｎｏｖフ
ラグメント〔全酒造（株）〕を加え１反応液（７ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　、　ｐ　Ｈ７，５／２０ｍＭ　Ｎａ
ＣＱ／７ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０．１ｍＭ　ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）中で３７℃、１時間反
応させ、ＤＮＡ末端の平滑化を行った０次にＸｈｏＩリ
ンカ−、ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）（全酒造（株）〕を０
０．１５ｇえ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ〔全酒造（株）　）
１００ユニツトを用いて反応液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＱ　、　ｐ　Ｈ７，６／６．６ｍＭ　ＭｇＣＱ　２
　／　１０　ｒｎ　Ｍジチオスレイトール／　０　、１
　ｍ　Ｍ　ＡＴＰ）中で１４℃、１６時間反応させ、Ｘ
ｈｏｌリンカ−を付加した。さらに２０ユニツトの制限
酵素ＸｈｏＩ（（株）ニラポンジーン〕を加え、３７℃
、３時間反応を行い、ＤＮＡ断片のトリミングを行った
０本ＤＮＡ断片０．５μｇと、酵母用発現ベクターｐＧ
　Ｌ　Ｄ９０６−１　（特開昭６１−４３９９１号）を
制限酵素５ａｌＩで切断して得られた９、４Ｋｂ　ＤＮ
Ａ断片０゜１μｇを２０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて上記の反応液中で連結し、Ｅ　、　ｃｏｌｉ　
ＤＨ１（モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）の形
質転換を行った。得られたアンピシリン耐性の形質転換
体からプラスミドｐＧ　Ｌ　０９０６−２０を分離した
（第５図）。

プラスミドｐＧ　Ｌ　０９０６−２０３μｇを用いて、
プロトプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ　ら、プロシーディン
グオンザナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、　７５．
１９２７（１９７８））によりサツカロミセスセレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）　Ａ　Ｈ２２Ｒ−（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ　ら、プ
ロシーディングオンザナショナルアカデミーオブサイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
）、　８０゜１　（１９８３））の形質転換を行った。

その結果、ロイシンを含まない培地で生育する形質転換
体ＡＨ２２Ｒ−／ρＧＬＤ９０６−２０を多数分離した
。

ｍ８　　酵母を宿主とするヒトエンドセリンの発現 ヒトエンドセリンの生産 実施例７で得られた多くの形質転換体Ｓ　、　ｃａｒｅ
ｖｉｃｉａｅ　Ａ　Ｈ２２ＲＶｐＧ　Ｌ　Ｄ９０６−２
０から５株を選び以下の方法によりこれらのヒトエンド
セリン生産能を調べた。

Ｋｉｔａｎｏ（バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣ
ＮＯＬＯＧＹ）　。

５　、２８１（１９８７））らの培地５ｍ１２を試験管
に分注し、これに形質転換体を接種した後、３０’Ｃで
３日間振盪培養した。その１ｍｆｌを同一培地■ｏｍＱ
を分注した試験管に移し、３０℃で１日振盪培養した０
次にその３ｍＱを前と同一の培地３０ｍＱを含む２００
ｍＱフラスコに移し、３０℃で２日間培養した。

得られた培養液を３　、０００回転で１０分間遠心分画
し、上清と菌体に分離した。菌体はＲｏｓｅらの方法〔
プロシーディングオンザナショナルアカデミーオブサイ
エンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ）、　７８．２４６０（１９８１）３ニより破砕し、
抽出液を得た。すなわち、１０ｍ　Ｑの培養液より集菌
した菌体を一度ＳＭバッファ　　（８５ｍＭ　ＮａＣｎ
、１ｍＭＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ，、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｑ　、　ｐ　Ｈ７，４）で洗浄した後、−８０℃で菌体
を凍結した。凍結菌体に１ｍＱの破砕用バッファ　　（
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　、　ｐＨ８，０，２０
％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、　１　ｍ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　
、　Ｉｎ　ＭＤＴＴ）と２ｇのグラスビーズを加え、ポ
ルテックスミキサーによる強い撹拌で破砕した。これを
遠心分離し、上清を菌体抽出液とした。

エンドセリンの定量は、競合法に基づ＜ＥＩＡによって
行った。標識体はパーオキシダーゼ標識（Ｐ　ＯＤ）−
エンドセリンを、抗体は抗エンドセリンーウサギポリク
ローナル抗体を用いて行った。

その結果、５株の形質転換体は、いずれも菌体内と菌体
外にヒト・エンドセリンを生産していることがわかった
。

酵母におけるＣ００Ｈ−成熟エンドセリンの発現プラス
ミドｐ　Ｇ　Ｌ　Ｄ９０６−２０　（実施例８）をＢａ
ｍＨＩおよびＨｉｎｄｎｌで消化し、この断片をＭ１３
ｍｐ１８のＢａｎ　ＨｌおよびＨｉｎｄ　　ｍ部位に挿
入した１次いで、特定部位指向性変異を行い。

エンドセリンの第２２番目のアミノ酸であるバリンを停
止コドンＴＡＡに変換させた。このＤＮＡ断片をｐ　Ｇ
　Ｌ　０９０６−２０のＢａｎ　ＨＩおよびＨｉ　ｎｄ
ｍ部位に挿入した。このようにして得られたプラスミド
をｐ　Ｇ　Ｌ　Ｄ９０６−２１　（第７図）と命名した
が、このものはサツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてＣ
００Ｈ−成熟エンドセリンを発現した。このプラスミド
ＰＧＬ　Ｄ９０６−２１を保持する形質転換体をサツカ
ロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ａ　Ｈ２２Ｒ−／ｐ　Ｇ　Ｌ　
Ｄ９０６−２１ト命名シタ、　コ０）形質転換体はＣ０
０Ｈ−成熟エンドセリンを培養液中に６ｎｇ／ｍ１．菌
体中に２５ｎｇ／ｍｌ生産した。

失１匹則 旦８匹旦におけるプレプロ−エンドセリンの発現ｉ）形
質転換体の構築 プラスミドｐＨＥＴ４０−３を精製し、制限酵素Ｂｇｌ
■およびＥｃｏ　　Ｒ１で消化した。このようにして得
られたｌｋｂのＤＮＡ断片をＭ１３　ｍｐ　１８のＥｃ
ｏ　　Ｒ１，Ｂａｍ　Ｈ１部位に挿入した。エンドセリ
ンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａにおけるヌクレオチド配列５’ＴＴＴ
ＣＡＧＡＡＴＧＧＡＴ　　が、特定部位指向性変異法に
より５’ＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴに変換され制限酵
素部位Ｎｅｏ　　１がつくられた〔クンケル等、プロシ
ージング・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８２，４８８−４９２．１
９８５）　−このようにして得られたプラスミドｐＴＳ
４００１をＮｃｏ　　Ｉで切断し、次いでＤＮＡポリメ
ラーゼ、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片と処理して平滑
末端を得た。Ｅｃｏ　　Ｒ１リンカ−５’ｄＧＧＡＡＴ
ＴＣＣをこのＤＮＡ断片に連結し、次いでＥｃｏ　　Ｒ
１で消化した。こうして両端にＥｃｏ　　Ｒ１部位を有
するヒト・プレプロ−エンドセリンｃＤＮＡが得られた
。このＤＮＡ断片をλＰＬプロモーターを有するＰ　Ｔ
　Ｂ　２８１のＥｃｏ　　ＲＩ部位に挿入した。このよ
うにして得られた発現プラスミドをＰＴＳ４００７と命
名した（第８図）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｎ４８３０をｐ　Ｔ　Ｓ　４０
０７で形質転換した。

ｉｉ）プレプロ−エンドセリンの発現 上記ｉ）で得られたＥ、ｃｏｌｉＮ４８３０／　ｐ　Ｔ
　Ｓ　４００７を１０■１の培養管中の１％バクト　ト
リプトン（Ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎｓ）［デイフコ
　ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）、　ＵＳＡ］、０．５％バクトイ−ストエクスト
ラクト（デイフコ　ラボラトリーズ、ＵＳＡ）、０．５
％塩化ナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリンを
含有する２ａ＋１の液体培地（ｐＨ７，０）中に播種し
た。

振とう回転機上３０℃で１晩培養後、培養培地を０゜５
％カザミノ酸、０．５％グルコースおよび５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを含有するｌＯ耐のＭ９培地を含有す
る２５０＋＋＋１のフラスコに移した。更に３０℃で４
時間、次いで４２℃で２時間、振どう培養を行った。

この培養液から菌体を遠心分離にて採取し、０．１Ｍ　
Ｔｒｉｓ−塩酸中、ｐＨ８，０，０℃で１時間、７Ｍグ
アニジン−塩酸で処理した。この溶解物を１５．０００
ｒｐｍ＋において１０分間遠心分離しＥＩＡ緩衝緩衝液
冷釈した。Ｅ　、　ｃｏｌｉ中で生成したプレプロ−エ
ンドセリンの計測値は１Ｍｇ／ｍｌ培養液であった。

この培養Ｅ　、　ｃｏｌｉのウェスタン・プロッティン
グ分析によれば、約２５　、０００〜２８，０００の分
子量の発現生成物が抗エンドセリン抗体で見出された（
第９図）。

大室■旦 動物細胞ＣＯ８７におけるエンドセリンの発現プラスミ
ドｐＨＥＴ４−３が制限酵素ＥｃｏＲ■で切断されて全
ヒト・エンドセリンｅＤＮＡを含有するＤＮＡ断片が得
られた。このようにして得られた１、１７　ｋｂ　ＤＮ
Ａ断片２．５μｇをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して
平滑末端とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＢｇｌ　　
ＩＩリンカ−ｄ　ＣＡＧＡＴＣＴＣと結合させた。この
ようにして得られりＤ　Ｎ　ＡをＢｇｌ　　Ｉｆで消化
してＤＮＡの各々の端部にＢｇｌ　　１１部位を設けた
。このＤＮＡ断片を、ＳＶ４０プロモーターおよびポリ
アデニル化シグナル部位を有するＰＴＢ５５１のＢｇｌ
　　１１部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。

この結合されたＤＮＡ生成物を、ＬＢ培養液を含有する
１゜５％アガロース板上でアンピシリンの存在下（５０
ｆｉ　ｇ／ｍｌ）でＥ、ｃｏｌｉＤＨｌを形質転換する
のに用いた。ＳＶ４０プロモーターの下、正常な読取り
枠でヒト・ブレブローエンドセリンｃＤＮＡを有するプ
ラスミドをもったクローンをｐ　Ｔ　Ｓ　６００３と命
名した（第１０図）。

このようにして得られたプラスミドｐ’ｒ　Ｓ　６００
３の５μｇを用いて、予めプラスチックデイツシュ上に
播かれたＣＯ３７細胞を、１０％胎児牛血清を含有する
ダルベツコ最小必須培地（Ｄ−ＭＥＭ）中３７℃で５％
ＣＯ□中〔ボルマン等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
　２２１．５５１−５５３．１９８３）で、形質転換し
た。ＤＮＡ形質転換後２４．４８および７２時間の各々
で得らた菌体培養培地を取り、ヒト・エンドセリン特有
のＥＩＡでアッセイを行なった。ｐＴｓ６００３で形質
転換されたＣＯ８７細胞は第１１図に示すようにヒト・
エンドセリンを合成した。

【図面の簡単な説明】

第１図はブタ・エンドセリンｃＤＮＡの簡単な制限酵素
地図である。 第２図はブタ・エンドセリンｃＤＮＡの塩基配列および
それより推定されるブタ・エンドセリンのアミノ酸配列
を示す。 第３図はヒト・エンドセリン前駆体や成熟ペプチドｃＤ
ＮＡの簡単な制限酵素地図である。 第４図はヒト・エンドセリン前駆体や成熟ペプチドｃ　
Ｄ　Ｎ　Ａの塩基配列およびそれより推定されるヒト・
エンドセリン前駆体や成熟ペプチドのアミノ酸配列を示
す。 第５図は酵母を宿主とするヒト・エンドセリン発現ベク
ターの構築図である。 第６図はブタおよびヒト・エンドセリンの塩基配列およ
びそれから推測されるアミノ酸配列を比較した図である
。 第７図はＣ００Ｈ−成熟エンドセリンの発現のためのプ
ラスミドの横築図、第８図はプラスミドｐ　Ｔ　５４０
０７の横築図である。 第９図はＥ　、　ｃｏｌｉ　Ｎ４８３０／ｐＴ　５４０
０７の発現生成物のウェスタンブロッティング解析図で
ある。 第１Ｏ図はプラスミドｐＴｓ６００３の構築図である。 第１１図はｐＴｓ６００３で形質転換されたＣＯ８７の
ヒト・エンドセリン製造を示すグラフである。

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）エンドセリンをコードするＤＮＡを含有するＤＮ
   Ａ。
2. （２）エンドセリンがブタ・エンドセリンである請求項
   １記載のＤＮＡ。
3. （３）第２図のＤＮＡもしくはその一部である請求項２
   記載のＤＮＡ。
4. （４）エンドセリンがヒト・エンドセリンである請求項
   １記載のＤＮＡ。
5. （５）第４図のＤＮＡもしくはその一部である請求項４
   記載のＤＮＡ。
6. （６）第４図のＤＮＡの少なくともＮｏ．２６１〜８９
   ６で表わされるものである請求項５記載のＤＮＡ。
7. （７）第４図のＤＮＡのＮ０．４１７〜４７９で表わさ
   れるものである請求項５記載のＤＮＡ。
8. （８）エンドセリン前駆体蛋白質。
9. （９）エンドセリンがブタ・エンドセリンである請求項
   ８記載の前駆体蛋白質。
10. （１０）第２図のアミノ酸配列である請求項９記載の前
    駆体蛋白質。
11. （１１）エンドセリンがヒト・エンドセリンである請求
    項８記載の前駆体蛋白質。
12. （１２）第４図のアミノ酸配列である請求項１１記載の
    前駆体蛋白質。
13. （１３）エンドセリンをコードするＤＮＡを含有するＤ
    ＮＡを保持する形質転換体。
14. （１４）エンドセリンがブタ・エンドセリンである請求
    項１３記載の形質転換体。
15. （１５）ブタ・エンドセリンのＤＮＡが第２図のＤＮＡ
    もしくはその一部である請求項１４記載の形質転換体。
16. （１６）エンドセリンがヒト・エンドセリンである請求
    項１３記載の形質転換体。
17. （１７）ヒト・エンドセリンのＤＮＡが第４図のＤＮＡ
    もしくはその一部である請求項１６記載の形質転換体。
18. （１８）ＤＮＡが第４図のＤＮＡの少なくともＮｏ．２
    ６１〜８９６で表わされるものである請求項１７記載の
    形質転換体。
19. （１９）請求項１３記載の形質転換体を培養し、培養物
    中に成熟エンドセリンまたはエンドセリンの前駆体を生
    成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする成熟エ
    ンドセリンまたはエンドセリンの前駆体の製造方法。
20. （２０）請求項１４または１５記載の形質転換体を用い
    る、請求項１９記載のブタ・成熟エンドセリンまたはブ
    タ・エンドセリンの前駆体の製造方法。
21. （２１）請求項１６または１７記載の形質転換体を用い
    る、請求項１９記載のヒト・成熟エンドセリンまたはヒ
    ト・エンドセリンの前駆体の製造方法。
22. （２２）エンドセリンの有効量および薬剤的に許容し得
    る添加剤を有する薬剤組成物。
23. （２３）有効量が０．００１μｇ〜１００μｇ／ｋｇで
    ある請求項２２記載の薬剤組成物。
24. （２４）薬剤的に許容し得る添加剤が担体、崩壊剤、潤
    滑剤、結合剤、分散剤、充填剤を包含する請求項２２ま
    たは２３記載の薬剤組成物。