JPH01503679A - カリクレインの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 浄書（内容に変更なし） 本発明は、組換えで誘導された新規な原性（組織）カリクレインポリペプチドお よびそのようなポリペプチドの製造方法に係る。さらに本発明は、そのようなポ リペプチドを含有する薬剤組成物ならびにそのようなポリペプチドおよび組成物 の血管拡張剤としてのおよび高血圧症および男性不妊症の治療における用途に係 る。

発明のバックグラウンド カリクレイン類は、セリシブ０テアーゼに密接に関連する亜群の一員である。カ リクレインはキニノーゲンからキニンという血管に作用するペプチドを遊離する 活性によって特徴付けられるが、これらの酵素のタンパク質分解作用の生理学的 な意味は、少なくともいくつかの場合には、キニンの遊離とは無関係のようにみ え、またある種のカリクレインは生理活性ペプチドおよび因子をその前駆体から 生成する特定のプロセッシング過程に関与すると考えられている［ツクシマ（Ｆ ｕｋｕｓｈｉｍａ）ら、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、第２４巻、第 ８０３７〜８０４３頁（１９８５年）］。

マウスおよびラットのカリクレインのｃＤＮＡ配列が、顎下腺および膵臓ｃＤＮ Ａバンクから単離された［ナカニシ（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　）ら、生物工学（Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　、第３巻、第１０８９〜１０９８頁（１９８５年 ）］。ヒトカリクレインのｃＤＮＡクローンはヒトの膵１１ｃＤＮＡバンクから 単離されたしペイカー（Ｂａｋｅｒ）ら、ディー・エヌ・ニー（ＤＮＡ）　、第 ４巻、第６号、第４４５〜４５０頁（１９８５年）］。活性な酵素形態は２３８ 個のアミノ酸から成り、その前にアミノ酸２４個のシグナルペプチドおよびプロ フラグメントがついていると報告された。また、セリンプロテアーゼ活性に必要 な鍵となるアミノ酸残基（Ｈｉｓ−４１，Ａｓｐ−９６，５ｅｒ−１９０）およ びカリクレインタイプの開裂特異性に必要な鍵のアミノ酸残基（Ａｓｐ−１８４ ）が、ヒトのカリクレインでもマウスおよびラットのカリクレインと同様に保持 されていることも注目さ本発明によって、新規な種類の原性カリクレインポリペ プチドが提供される。これらの生物学的に活性なカリクレインポリペプチドは次 式（Ｉ＞に示すＮ末端から延びるアミノ酸配列をもっている。

ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　 Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ａｌａ@Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ｔｙｒ　Ｈｉｓ Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　 Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ@Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　 Ａｌａ　Ａｌａ ５０６゜ Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　 Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ@Ｐｈｅ　Ａｓｐ　 Ａｓｐ　Ｇｌｕ Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｖａｔ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ@Ｐｈｅ　Ａｓｎ　 Ｈｅｔ　５ｅｒ （Ｉ＞ Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｔ@Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　 Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ@Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　 Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ@Ｐｒｏ　Ａｓｎ　 Ａｓｐ　Ｇｌｕ Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｔ@Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ@Ａｓｐ　Ｇｌｙ　 Ｖａｌ　Ｌｅｕ Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　 Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ@Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 Ｖａｌ　Ａｌａ ２こで、ｎはＯか１である。

これらのカリクレインポリペプチドは、ゲノム、ｃＤＮＡからまたは遺伝子合成 によって得られた外因性ＤＮＡの原核または真核宿主による発現（たとえば、細 菌、酵母、バチラス（桿菌）および哺乳類の培養細胞による）の産物として特徴 付けられる。

本発明のＤＮＡは、上記式（Ｉ）で表わされるアミノ酸配列および天然のカリク レインの生物学的な性質の１種以上を有するカリクレインポリペプチドの一次構 造コンホメーション（立体配置）をもつポリペプチド産物の、適当な宿主細胞中 での発現を確実にするのに有用なりＮＡを含んでいる。本発明のＤＮＡは、特に 、式（Ｉ）の配列をコードしているＤＮＡまたはそれらと相補的なストランドを 含むと考えられる。とりわけ、製造されたＤＮＡとしてカリクレインをコードし ているものが包含され、そのようなりＮＡは微生物宿主中でのメツセンジャーＲ ＮＡの翻訳を容易にするコドンをもっていてもよい。このような製造されたＤＮ Ａは、アルドン（Ａ　ｌ　ｔｏｎ　）らのＰＣＴ出願Ｗ０８３１０４０５３号の 方法に従って容易に構築できる。

また、本発明には、適切な希釈剤、賦形剤および／または担体と共に本発明のカ リクレインポリペプチド産物を治療上有効な量で含み、血管の拡張および男性不 妊症用などに有用な薬剤組成物も包含される。

さらに本発明は、各種のクローン化された遺伝子、複製可能なりローニングビヒ クル、発現ビヒクルおよび形質転換された培養物も包含する。これらはすべて、 組換えで誘導された本発明のカリクレインポリペプチドの生産に作用するのに必 要な遺伝情報をもっている。

図面の簡単な説明 第１図は、ＤＤＳＨＫｌの構築を示す。

第２図は、組換えヒト成熟カリクレインと天然の尿カリクレインとを比較して示 す５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真である。分子量マーカーは右側に示さ れており、第１列と第２列は、それぞれ、非還元条件下での尿カリクレインと組 換え成熟カリクレインを示し、第３列と第４列は、還元条件下での尿カリクレイ ンと組換え成熟カリクレインを示す。

第３図は、ｐＤＧＨＫ−ＬＩＡの構築を示す。

発明の詳細な説明 本発明により、本発明のヒト種放線カリクレインのポリペプチド配列をコードす るＤＮＡ配列を単離し、特徴付けた。更に、ヒトＤＮＡは、天然に存在するカリ クレインの生物学的及び免疫学的特性並びに天然に存在するカリクレインのｉｎ 　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ＶｉｔｒＯの生物学的活性、特に治療活性を有するポリペ プチドを単離可能な邑与える真核及び原核発現において利用され得る。

ヒト種族起源のＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離した。カリクレ インコードＤＮＡを含有するクローンの単離は、混合オリゴヌクレオチドプロー ブのプールを使用するＤＮＡ／ＤＮＡプラークハイブリダイゼーションにより実 施した。

本発明のヒトカリクレイン遺伝子は２６２個のアミノ酸カリクレインポリペプチ ド、即ち発生予定の（ｐｒｅｓｕｍｐｔｉＶｅ）の１７個のアミノ酸シグナルペ プチド、７個のアミノ酸プロ酵素断片及び２３８個のアミノ酸成熟タンパクをコ ードする。

ゲノム若しくはｃＤＮＡクローニング又は遺伝子合成により得られる本発明の外 因性ＤＮＡを真核又は原核宿主（例えば細菌、酵母及び哺乳動物の培養細胞）に より発現させると、本発明の組換えヒトカリクレインポリペプチドが得られる。

を推動物（例えば哺乳動物及び鳥類）細胞における微生物発現によるカリクレイ ンポリペプチド産物は、天然の哺乳動物細胞環境中又は血漿又は尿のような細胞 外流体中ではカリクレインと結合し得るヒトタンパク又は他の汚染物質を結合し ていない特徴を有スル。典型的な酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は原核生物（例えば大腸菌）宿主細胞による産物は哺乳 動物タンパクを結合していない。使用した宿主に応じて、本発明のポリペプチド を哺乳動物又は他の真核炭水化物とグリコジル化してもよく、非グリコジル化し てもよい。本発明のポリペプチドは（−１位に）最初のメチオニンアミノ酸残基 を含有し得る。

本発明の実施態様はサル及びヒト種族起源のクローン化ＤＮＡ配列及びそれから 適当に推察されるポリペプチドであり、これらはそれぞれ表■に示すアミノ酸配 列を有するサル及びヒト種族起源のカリクレインの一次ｍ造コンホメーションを 表わす。

本発明の微生物学的に発現されたカリクレインポリペプチドは、例えばモノクロ ーン及び／又はポリクローン抗体作製を含む、又はアフイニテイクロマトグラフ イー用セリンプロテアーゼの阻害物質若しくは基質を用いる免疫学的分離或いは りＤマドグラフィーによる分離を包含する通常の手段により単離、精製され得る 。本発明のポリペプチド産物を検出可能なマーカー物質（例えばＩ　のような放 射性標識又はビオチンのような非アイソトープ標識）を用いて共有結合して“標 識パシて、固体組織及び流体サンプル例えば血液又は尿中のカリクレインを検出 ・定量化するための有用な試薬を提供することもできる。

本発明のＤＮＡ産物を、検出可能なマーカー（例えば【１２５Ｐ３２のような放 射性標識又はビオチンのような非アイソトープ標識）を用いて標識し、カリクレ イン遺伝子位置及び／又はヒト、サル及び他の哺乳類の染色体マツプにおける関 連する遺伝子の位置を決定するためにＤＮＡハイブリダイゼーション法に使用し てもよい。標識化ＤＮＡはＤＮＡレベルでのカリクレイン遺伝子異常を特定する ためにも使用され、近隣の遺伝子及びそれらの異常を特定するための遺伝子マー カーとしても使用される。

本発明により提供されるカリクレインポリペプチド産物は、１つ以上の生物学的 性質を保有させるべく天然に存在するカリクレインの一次構造コンホメーション を有し且つ天然に存在するカリクレインとは異なる平均的炭水化物組成を有する 産物である。

本発明のカリクレインポリペプチド産物の投与方法には、経口投与及び非経口（ 例えばＩＶ、　ＩＮ、　ＳＣ又はＩＰ）投与が包含され、こうして投与される本 発明の薬剤組成物は通常治療上有効な岱の産物と許容され得る希釈剤、賦形剤又 は担体とを含む。治療上有効な用量は治療する症状に応じて変化し得るが、活性 物質０．１〜１００＃／体重に９である。本発明のカリクレインペプチド及び組 成物を凍結乾燥させてもよく、また錠剤にしてもよい。

本発明の薬剤組成物に通常の希釈剤例えばヒト血清アルブミン、又は通常の担体 例えば食塩液を使用してもよい。

本発明のカリクレイン産物は単独又は他の成分若しくは薬物と組合せて血管拡張 及び男性不妊症の用途に有用である。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、特にカリクレインをコー ドするサルｃＤＮＡクローン及びヒトゲノムクローンを同定する前に実施される 方法、前記同定方法、並びに配列決定、発現系の開発及び前記系におけるカリク レイン発現の免疫学的確認に関する。

本発明の各種局面及び利点は、本発明の現在好ましい具体例を示す以下の詳細な 記載から当業者には自明のことであろう。

以下の実施例中、特記しない限り、組換えカリクレインという用語は式（■）　 （式中ｎ＝ｏ）を有するアミノ酸配列で表わされる組換え成熟カリクレインを指 す。

文献記載の方法に従って、ヒト尿カリクレインを約３０人の正常白人男性の貯尿 より精製した［Ｊ、Ｃｈｉｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　＆Ｈｅｔ ａｂｏｌｉｓｍ　５１　：　８４０〜８４８　（１９８０）］　。このようにし て得た純粋なヒト尿カリクレインをＮ−末端シーケンス分析にかけ、最初の４０ 個のアミノ酸を同定した。精製尿カリクレインタンパク質を過ギ酸で酸化し、ジ チオトレイトールとヨードアセテートで還元アルキル化して誘導体化した。この タンパク質誘導体を次に、トリプシン、スタフィロコッカス　オウレウス　ｓｖ −ｇプロテアーゼ及びエンドリシン−Ｃペプチダーゼを用いて消化した。この消 化物から２９個の別個のペプチドフラグメントを単離した。

還元しアルキル化したヒト尿カリクレイン由来のこのペプチドフラグメントは、 任意に、使用したプロテアーゼに従って番号付けした（すなわち、■はトリプシ ン消化によるペプチドフラグメント、Ｓは５Ｖ−８プロテアーゼにより得られる ペプチドフラグメント、またＬＣはエンドリシン−Ｃペプチダーゼにより得られ るペプチドフラグメントを表わす）。気相シーケンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて微量シーケンス分析により、フラグメントの分析を 行い、ヒト尿カリクレインのアミノ酸配列を決定し、第１表に示した。さらに、 上記の消化物から得たペプチドフラグメントも同じく第工表に示す。第工表にお いては、尿カリクレインの推定翻訳ポリペプチド配列を一文字表示によって表わ す。アステリスク（＊）は未同定アミノ酸を示し、”　Ｎ　Ｔ　”は完全タンパ ク質のＮ−末端シーケンシングを示し、パ＃”は決定されたＡｓｎ−グリコジル 化部位を示し、さらに“＋”は未決定のＡｓｎ−グリコジル化部位を示す。

第工表記載の５−１８及びＬ　Ｃ−１７の二つの重複するペプチドの単離及び配 列分析から、ヒト尿カリクレインタンパク質の配列の１６２位のアミノ酸はりシ ンと同定した。

３１１４夏表 ＱＥＰＥＶＧＳＴＣＬＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＮＦＳＦＰＤＤＬＱＣＶＤＬＫＩＬ ＰＮＤＥＣＫＫＡＩ（ＶＱＫＶＴＤＦＭＬＣＶＧＨＬＥこの結果は、第Ｖ表に示 したヒトゲノムカリクレインＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列と一致する 。しかしながら、この結果は、ヒト膵臓ｃＤ　Ｎ　Ａ及び腎ＷａｃＤＮＡ由来の 報告された配列と異なる。その配列においては、報告された成熟したカリクレイ ンの１６２位にグルタミン酸が存在する［　Ｂａｋｅｒら、ＤＮＡ　４．　４４ ５〜４５０　（１９８５）及びツクシマら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４゜ ８０３７〜８０４３　（１９８５）］。

Ｂ、グリコジル化部位 上部位ル５１酸ナトリウム（ＳＯ３）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により めた分子量に基づき、ヒト尿カリクレインは約３０％の炭水化物分を含有してい ることが判明した。ヒト尿カリクレインのアミノ酸配列は、三つの有力な（ｐｏ ｔｅｎｔ）　Ａｓｎ−結合グリコシル化部位を有することを示している。実施例 ＩＡで得られたペプチドフラグメントの配列分析から、三つのＡＳｎ−結合グリ コシル化部位の存在が明らかである（第■表）。

しかしながら、Ａｓｎ１４１は部分的にのみグリコジル化されている（６０％） ことが見出された。これは、同一の配列（Ｔ　−５８とＬＣ−５１対Ｔ−６２と ＬＣ−５４Ａ）を含む二個のペプチドをシーケンシングした結果に基づいている 。Ａｓｎ１４１は、フラグメングリコペプチドの配列分析によって同定できない 。

第　■　表 グリコペプチドの単離及び同定 フラグメント番号　位装置Ａｓｎ−結合　グリコジル化部位Ｌ　Ｃ−６４１−１ １４あ　リ　Ａｓｎ　７８　；　Ａｓｎ　８４Ｌ　Ｃ−５１１１５−１５４あ　 リ　ＡＳｎ　１４１Ｌ　Ｃ−５４ａ　１１５−１５４　な　し　な　しＣＤ　Ｎ 　Ａ及び／又はゲノムＤＮＡライブラリー上でのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼ ーションに混合プローブが適用し得るか否か確かめる目的で、第工表に記載のア ミノ酸配列を遺伝子コドンの縮重に関して精査した。

トリプシン処理ペプチドフラグメントＯＸ　−Ｔ　−４３からのＰｈｅ−Ａｓｐ −Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌフラグメ ント及び１〜１０と１２〜２９のＮ−末端アミノ酸残基（第１表参照）をデオキ シオリゴヌクレオチドプローブ混合物の合成用に選択し、第■表記載のプローブ 混合物を設計した。

ｅｉ　ｈロ　ω　Ｑ＋ロ　ロ　ロ　ロ　乙口←−■　ロ　−ロ　ω　ω　ロ　の く ロロ　ロ　Ｉ−＋＜　＜　＜　＜　＜　Ｃ５〜−〇　ロ　ロー　−−−親。← 閃←ｌ−ｅｔ８（ｊ　１３　Ｃ５１Ｊ　Ｍ＜〉ロ　ロ　工０　ロ　ロ　ロ　くロ ーロ←　←　へ≧←ＣＪ　ｆ−（Ｊ　ｌ＋○　←Ｑ　−υ←−←　←　−一←　 ←　ト　ト　工← ＋＜（ロＣ５１ｊ　Ｃ５（ｊ　Ｑ−１−プローブ混合物である＠　Ｋ　−１ａ及 び１ｂは、長さが２９ヌクレオチドの６４プローブの混合物であり、ＨＫ　−６ ａ、　６ｂ、　７ａ及び７ｂは長さが５３ヌクレオチドの３２１０−ブの混合物 であり、またプローブＫＦ−２ｂは長さが２９ヌクレオチドの３２プローブの混 合物である。

これらのオリゴヌクレオチドプローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥ Ｎ）を用いて、５′末端をγ−３２Ｐ−ＡＴＰ、７５００〜８０００キユ一リー ／ミリモル（ＩＣＮ）でラベルした。

実施例　３ ハイブリダイゼーション プローブＨＫ　−１ａ、ｌｂ、６ａ、６ｂ、７ａ及び７ｂを用いてヒトＤＮＡサ ザンブＯットまたはサル腎臓ポリ（Ａ）”　ｍＲＮＡプロットのハイブリダイゼ ーションを行い、特異的ハイブリダイゼーションを調べ、ハイブリダイゼーショ ン条件を決定した。プローブ混合物ＨＫ−１ｂ及びＨＫ　−７ｂは、０．９ＨＮ ａＣｊ！　１５ｍＨＥＤＴＡ１５０ｍＨリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５１０，５ ％サルコシル／１００埒／ｄの醇母ｔＲＮＡ中に０．０２５１）ｍｏｌ／ｌ１１ １！の各プローブ配列を含むハイブリダイゼーションバッフ７−において、それ ぞれ４５℃及び４６℃で特異的ハイブリダイゼーションを生起した。これにより 、これ等のプローブ混合物の２つのセットを、実施例４Ｃに記載するサル腎ｒｉ ＆ｃＤＮＡライブラリースクリーニングに使用した。

ＰＣＴ特許出願Ｎｏ、ＷＯ３５１０２６１０及びＬｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、　［Ｇ ｅｎｅ　４４：２０１−２０９．　（１９８６）］に記載のようにして、貧血カ ニクイザル腎臓から単離したポリ（Ａ＞”　ｍＲＮＡからサル腎臓ｃＤＮＡライ ブラリーを構築した。

Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ　［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８　：　５２ ９４−５２９９　（１９７９）］のグアニジニウムチオシアネート法により貧血 サル腎臓からメッセンジｔ−ＲＮＡを単離し、Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、 　［”ＨｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｈａｎ ｕａド　、ｐ、１９７−１９ｇ　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｒ＋ｏＳＨａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒｏｔｏｒｙ、　Ｇｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　 （１９８２）］が記載したようにしてオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムクロマ トグラフィーを２回行い、ポリ　（Ａ）＋ＩＩＩＲＮ　Ａを精製した。ｃＤＮＡ ７−１’７７！Ｊ−ハｏｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、［Ｈｏ１．ａｎｄ　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、２．１６１−１７０　（１９８２）］の一般般的類を改変した手 順により構築した。手順を要約すると以下の通りである。

（１）　ｐＵｃ８を唯一のベクターとして使用し、ＰＳｔＩで切断し、その後６ ０〜８０１！ｉ基長のオリゴｄＴでティリングする：　（２）　Ｈｉｎｃ■で消 化してベクターの１つからオリゴｄＴテイルを除去する：（３）第１の鎖の合成 及びオリゴｄＧティリングをＯｋａｙａｍａの方法により行う：　（４）　Ｂ　 ａｍＨＩにより消化してベクターの１つの末端からオリゴｄＧテイルを除去する ；（５）オリゴｄＧティリングされたベクターに対して３倍モル過剰の２つのリ ンカ−（ＧＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣ及びＡＣＧＧＴＣＴ ＴＴＡ　）の存在下にＲＮＡ鎖をＤＮＡにより置き換える。

を行い、１％（ｗ／ｖ）　Ｂａｃｔｏ　トリプトン１０．５％（Ｗ／Ｖ）酵母エ キス＝１０ｍＨＮａＣ４１−１０ｍＨＨｔ＋Ｓ０４．５０ｘアンピシリン１１ｄ 、を含む１，５％（ｗ／ｖ）　Ｂａｃｔｏアガーを含むＬＨ−Ａｐアガー上でト ランスフォーマントを選択した［Ｈａｎａｈａｎ、　Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、ユ ６６：５５７−５８０　（１９８３）］。

］処５Ｘ１０５／ポリ（Ａ＞＋ＲＮＡ埒のレベルでトランスフォーマントが（ワ られた。

サルＣＤ　Ｎ　Ａライブラリースクリーニングのためのコロニーハイブリダイゼ ーション方法はＰＣＴ出願Ｎｏ、　ＷＯ３５１０２６１０及びＬｉｎ　ｅｔ　ａ ｔ　［Ｇｅｎｅ　４４：　２０１−２０９．（１９８６）］に記載のものと実質 的に同じ方法であった。

・トランスフオームされたＥ、Ｃ０１ｉを、１ｄ当り５０．Ｂのアンピシリンを 含む栄養プレート上にプレート１’０Ｘ１０ａｏ当り９０００コロニーの密度で スプレッドした。Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎフイルター（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　 Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ、ＮＥＦ−９７２）をＢＨＩ　−ＣＡＩ （プレート（５００鱈／ａｅのクロラムフェニコールを含有する、Ｂａｃｔｏ脳 心混合物３７ｇ／ｆｌ、カサミノ酸（ｃａｓａｍＦｎｏ　ａｃｉｄ）　２ｇ／（ ！及びアガー１５’Ｊ／１　）上で予備湿潤し、コロニーをプレートから釣り上 げるのに使用した。コロニーを上記培地上で１２時間またはそれ以上成育させ、 プラスミドコピー数を増加させた。増殖したコロニーを、下記溶液のそれぞれで 飽和したｗｈａｔｍａｎ　３８Ｍペーパーの２片上にフィルターを順次移して（ コロニー側を上にして）処理した。

（１）　５０ｍＭグルコース−２５ｍＨ１−リス−ＨＣｊ　（ｐＨ８，０）−１ ０ｍＨＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）−５分間 （２）　０．５ＨＮａＯＨ−１０分間 （３）　１．０Ｈｔ−リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）−３分間フィルターを真空オ ーブン中８０℃で２時間風乾し、その後０．１Ｈトリス−ＨＣｊ　（＋）８８． ０）、　０１１８　Ｍａｃｌ、　１０ｍＨＥＤＴＡ（ｐＨ８，２）及び０．２％ サルコシルを含むバッファーに中１ｄ当り５０埒のブロティナーゼＫを含む溶液 で処理した。特に、５ｄのプロテイナーゼに溶液を核フィルターに加え、５５℃ で３０分間消化させ、その後溶液を除去した。

フィルターを４−のブレハイブリダイゼーションバッファー［５ｘ　５ＳＰＥ　 （０，１８ＮａＣ（１１５ｍＨＥＤＴＡ１５０ｍＨリン酸ナトリウム、　ｐＨ６ ，５）−０，５％サルコシル−１００ＩＪ！ｌ／　ｌ１ｔｆ！一本領Ｅ、ｃｏｌ ｉ　ＤＮＡ−５×Ｂ　Ｆ　Ｐ　（１ｘ　ＢＦＰ＝０．０２Ｘ　ｗｔ／ｖｏ１．の ＢＳＡ、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｈ，Ｗ、４００，０００）及びポリビニルピロリドン） ］で処理した。プレハイブリダイゼーションは５５℃で、一般に４時間あるいは それ以上行い、その時間の後ブレハイブリダイゼーションバッファーを除去した 。

ハイブリダイゼーション過程は以下のように行った。各フィルターに、表３の６ ４プロ一ブ配列（全混合物がＨＫ　−１ｂと指称される）のそれぞれを０．０７ ５　ｐｉｃｏｍｏｌｅ含むハイブリダイゼーションバッファー（５ｘ　５ＳＰＥ −０，５％サルコシル−１００埒／ｄの酵母ｔＲＮ　Ａ　）の３ｄを加え、フィ ルターを２０時間４５℃に維持した。

ハイブリダイゼーションの後、フィルターを６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ−０，１５ ＨＨａ（Ｊ、　１５ｍＨクエン酸ナトリウム、　ｐＨ７）−０，５％サルコシル により空温において１０分間シェーカーで３回洗浄し、ハイブリダイゼーション 温度（４５℃）で６ｘ　５ＳＣ−１χサルコシルで２〜３回洗浄し、その後オー トラジオグラフィーにかけた。フィルターを１ｘ　ＳＳＣ，ｐＨ７，０／　０． １％す）Ｌｔ　：］　シ）Ｌｔ中１００℃で２分間インキュベートし、ハイブリ ダイズしたプローブを除去した。フィルターを上述のようにして再度プレハイブ リダイズし、その後ＨＫ　−７ｂ混合プローブと４６℃でハイブリダイズさせ、 上述のように洗浄した。

ＨＫ　−７ｂ及びＨＫ−１ｂプロ一ブ混合物の両方とハイブリダイズした４つの 陽性クローンをスクリーニングした２００．０００コロニーから得、もう一つの プローブ混合物ＫＦ−，２ｂのセットとの４８℃におけるハイブリダイゼーショ ンによりさらに確認した。

Ｍ　Ｋ　Ｋ　８０ａと指称する陽性クローンの１つをさらに分析し、Ｓａｎｇｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、Ａｃａｄ、、ＵＳＡ　７ ４　：　５４６３−５４６７（１９７７）　］のジデオキシ法により配列決定し た。Ｍ　Ｋ　Ｋ　８０ａクローンインサートのヌクレオチド配列を表４に示す（ 矢印゛↓”はサルカリクレイン配列の開始点を示す）。これは表５に示したヒト ゲノムカリクレインクローンλＨＫ　６５ａのヌクレオチド配列から推論される アミノ酸配列は、表８に示したヒトカリクレインのもと９３％の相同性を示して いる。

第　■　べ （ｉＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣ　ＣＯＧ　ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＡＡＡ　ＣＡＣ　ＣＧＴ　 ＣＣＣ　ＣＣＣ　ＣＣＣ　ＣＣＣ　ＡＧＣ　ＴＣＣ　ＴＣＣ@ＡＣＣ　ＴＧＣ　 ＣＯＧ　ＣＣＣ　ＣＴ（ｉ７１１　１１！１　９１１　１０８　１１８　１２８ Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｃｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ１３ｇ　！４１１　１５１１ 　１［ｉ１１　１７ｇ　１１１８零零本本本本 ＧＣ；ＴＣＧＴＣＣＧＣＣＣＣＣＧＡＴＴＣＡＧＴＣＣＣＧ（ｉＡＴＴＣＴＣＧ ＧＡＧＧＣＴＯＯＧＡＧＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＯＯＧｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌ ａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ｌｌｅ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　人ｒｇ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌ ｙ　（ｉｌｙ　Ｔｒｐ　Ｃｉｌｕ　Ｃ凾刀@Ｓｅｒ　Ｓｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ Ｃｌｎ＾ＩａＡｌａＬｅｕＴｙｒＨｉｓＰｈｅＳｅｒＴｈｒＰｈｉＧｉｌｎＣｙ ｓ（ｉｌｙ（ｉｌｙＩＩｓＬｅｕＶａｌＨｌｓＰｒｏＧｉｎ２５１１２８８２７ １１２８８２９１１３０ｇＡｓｎＬｅｕＰｈｅＡｓｐＡｓｐＧｌｕＡｓｐＴｈｒ ＡｌａＧｌｎＰｈｅＭａｌｌ｛ＩｓＶａｌＳｅｒ（ｉｌｕＳｅｒＰｈｅＰｒｏＨ ｉｓ３７１１３１１８３９８４０８４１８４２ＢＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓ ｎ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ．Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｒ ｇ　Ｃｌｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ@Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ ４３８４４８４５８４Ｂ！ｌ４７８４８８ＡｓｐＬｅｕＭｅｔＬｅｕＬｅｕＡｒ ｇＬｅｕＴｈｒＣｌｎＰｒｏＡｌａＧｌｕＩｌｅＴｈｒＡｓｐＡｌａＶａｔＧｌ ｎＶａｌＶａｔＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　（ ｉｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅ秩@ Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ 第　■　ム（ｖｃ　き） ８１１　６２８　８３８　８４８　６５１１　６８ｇ零零本零零零 ＣＣＣＡＡＴＣＡＴＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧ ＧＴＧＡＣＡＧＡＧｎｃＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＰｒｏＡｓｎＡｓｐＣｌｕＣ ｙｓＡｌａＬｙｓＡｌａＨｉｓＴｈｒＧｌｎＬｙｓＶａｔＴｈｒＧｌｕＰｈｅＭ ｅｔＬｅｕＣｙｓＡｌａＧｌｙ｝ＩｔｓＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｙＬｙｓＡｓｐ ＴｈｒＣｙｓＶａｔＧｌｙＡｓｐＳｅｒＧｌｙＧｌｙＰｒｏＬｅｕＴｈｒＣｙｓ ＡｓｐＧｌｙＶａｔＬｅｕＧｉｎＣｌｙＶａｔＴｈｒＳｅｒＴｒｐＧｌｙＴｙｒ ＩｌａＰｒｏＣｙｓＧｌｙＳｅｒＰｒｏＡｓｎＬｙｓ７９１１８０８８１８８２ ８８３１１［１４１１本本本本零本 ＣＣＴＣｉＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＣ＾＾ＡＧＴＧＣＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＧＡＡ ＧＴｆ，ＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣＡｃｅＡＴＡＧＣＧＧＡＧＰｒｏ　Ａｌａ　Ｖａ ｌ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙ ｓ　Ｔｒｐ　ＩＩｓ　（ｉｌｕ　Ａｓ吹@Ｔｈｒ　ＩＩｓ　＾ｌａ　Ｇｌｕ ８５８８８８８７１１８８ｌｌ８９８９０１１実施例　５ ヒトゲノムライブラリーからカリクレインｔ伝子を　するファージブラークハイ ブリダイゼーション法Ｌａｗｎら記載の方法（Ｃｅｌｌ　１３　：　５３３　〜 ５４３　（＋９７９））により［したｃｈ４Ａファージ産生ヒト退治肝臓ゲノム ライブラリーが得られ、ブラークハイプリダイゼーションアッセイに使用した。

利用したファージブラークハイブリダイゼーション法はＰＣＴ　Ｎｏ，Ｗ０　８ ５／０２６１０及びＬｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ａｃａｄ．，ＬＩ ＳＡ　８２：　７５８０〜７５８４　（１９８５））に記載ざれていた。ファー ジブラークは、遺伝子スクリーンプラスフィルター（Ｇｅｎｅ　Ｓｃｒｅｅｎ　 Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒｓ）とＮＺＹＡＨプレート（ＮａＣＲ　，　５９　；Ｈ ａｄ！　−６８２０　．　２ｇ：Ｎ２−アミンＡ，１０ｇ：酵母抽出物，５ｇ； カザミノＢ．２ｇ：マルトース，２ｇ；寒天，１５ｇ（１リットルにつき））を 使用することを除き、誓００の方法（Ｈｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８， ３８９　〜３９５　（１９７９））に従い増幅した。ファージ粒子をアルカリ処 理により崩壊させ、ＤＮＡをフィルター上に固定した（８．４ｘ８．４　ａｎフ ィルターにつきｓｏ，ｏｏｏ個のファージブラーク》。自然乾燥したフィルター を８０℃で１時間焼き、実施例４に記載のようにしてブロティナーゼＫ加水分解 処理をした。Ｈ｛−　ＮａＧ！／　１％　ｓａｒｋｏｓｙｌ　’１ｇ液を用いブ レハイブリダイゼーションを５５℃で４時間もしくはそれ以上の時間行なった。

サノレカリクレインＭ　Ｍ　Ｋ　８０ａのクローンＤＮＡを３２Ｐ標ｍαｄＣＴ Ｐでニツクトランスレーションをし、ＣＤ　Ｎ　Ａインサート（〜１００ｂｐ） をＥＣＯＲＩとＨ　ｉｎｄ　ＩＩＩで二重消化することにより切り出し、ヒト胎 児肝臓ライブラリーのスクリーニングのブローブとして使用した。ハイブリダイ ゼーション綴衝液は、０．９Ｈ−　ＮａＣｉ！／ＳｍＨ−ＥＤＴＡ／５０＋ｎＨ リン酸ナトリウム（１）Ｈ　６．５）　／０．５Ｘｓａｒｋｏｓｙｌ／ｉ＆！に つき１００埒の酵母中にニツクトランスレーションしたサル力リクレインｃＤ　 Ｎ　Ａを２Ｘ　１０５Ｃｌ）１Ｇ／ａｆ含有した。

ハイブリダイゼーション５５℃で２０時間行なった。ハイブリダイゼーションの 完了時に、フィルターを室温で６ｘＳＳＣ（ｐＨ　７．０）／０．５％　ｓａｒ ｋｏｓｙｌを用いて３回、ハイブリダイゼーション温度で２回洗浄．（１回の洗 浄につき１０分）した。

λＨＫ６５ａおよびλＨＫ７６ａとして表わされる２つの極めてポジティブなク ローンを、スクリーニングした総数が１．８７ｘ　１０６個のファージブラーク から得た。

ヒトゲノム力リクレインλクローンをｐＵｃ１１８またはｐＵｃ１１９にサブク ローニングし、二本ＩＩＤＮＡをＳａｎｇｅｒらのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：　５４６３−５４６７　（ｔ９７７ ））を使用するＣｈｅｎらの方法（ＤＮＡ　４　，　１６５　〜１７０　（１９ ８５））により配列決定した。λＨ　Ｋ　６５ａクローンの領域を含むカリクレ イン遺伝子のヌクレオチド配列を第５表に示す。

実施例　６ 第■表は、本発明の成熟カリクレインポリペプチド組換え体をコードする生成り ＮＡのヌクレオチド配列を示す。生成りＮＡＬｔＡｌｔｏｎらが記載の方法（Ｐ ＣＴ出願Ｗ０１１１３１０４０５３）ｉ、：　ヨリ構築した。この生成（合成） 遺伝子はＥ、ｃｏｌｉ発現優先のコドンを有する。ＥＣ０ＲＩおよびＮｄｅ■部 位を、５′から開始コドンＡＴＧまでに加え、ＰＳｔＩおよびＢａｍＨ１部位を 、３′がら収支コドンＴＡＡまでに加えた。得られた配列は第Ｖｌ−Ａ表に表わ す。無傷の合成遺伝子をＥＣ０ＲＩで切ったＩ）Ｕ　Ｃ１１９にクローンし、１ ｑられたプラスミドを配列決定した。遺伝子をＮｄｅ■とＢａｍ１−ＩＩで加水 分解除去し、米国特許出願筒００４．３７９号明ｍのくこの米国特許は本願明細 書の参考文献に含める）に記載［：、ｃｏｌｉ発現ベクターＤＣＦ　Ｍ　１１５ ６に挿入した。得られた発現プラスミドをＢＵｒｎｅｔｔｅら、ＢＩＯ／ＴεＣ ＨＮＯＬＯＧＹ、　Ｖｏｌ、６．６９９（１９８８）に記載のようにしてＥ、ｃ ｏｌｉホストＦＭ５をトランスフェクションするのに使用した。形質転換したＥ 、ｃｏｌｉを、２０埒／ｌｌ１１２カナマイシンを含む脳／心臓注入剤（ＢＨＩ ）培地中、２８℃で０Ｄ６ｏｏ−０，１になるまで培養し、４２℃に移動し４〜 ６時間最大発現させた。カリクレイン発現レベルは、全細胞溶解物（Ｉｙｓａｔ ｅｓ＞の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で評価したように、全細胞タ ンパク質の約２５％であった。

ＥＩＣｏｌｉ発現カリクレインは、８Ｍ尿素にｐＨ３，５，２時間可溶化するこ とによりバクテリア細胞ペーストから分離した封入体から抽出した。溶解物を遠 心分離（ｓｏｏｏｘｙ、３分）により清澄化した。透明な溶解物を１０倍希釈し 、水酸化ナトリウムでｐＨ９〜１１に調整した。溶液を攪拌しながら一晩、４℃ で報知した後、２−メルカプトエタノールを最終濃度０，５０または１００ｍＨ になるまで加えた。、酸化終了時、溶液を酢酸でｐ１１８に調整し、前述のよう にして清澄化した。

免疫学的に検出可能な分子への再生の効率を、実施例７に記載のよう、にしてＲ ＩＡで決定したところ、封入体中に存在するタンパク質の約０．４２％であった 。

第　■　表 Ｃ１ｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｙａｌ　ＩＩｓ　Ｖａｔ　 Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ@Ｃｌｙ　Ｐｈｅ　 Ａｓｎ　Ｍｅｔ Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｌｕ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ＾ｒｇ　Ｃｌｎ＾Ｉ ａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　Ａ唐吹@Ｌｅｕ　Ｍｅ ｔ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　人ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　人ｓｐ　Ｔｈｒ　 ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｆｔ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ@Ｖａｌ　Ｇｌｕ　 Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　Ｃｌｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　 Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｃｌｙ@Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　 Ｇｌｕ　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ@Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　 Ａｓｎ　Ａｓｐ Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　 Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｃｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ@Ｃｙｓ　Ａｓｐ　 Ｃｌｙ　Ｖａｔ Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｃ１ｙ　Ｔｙｒ　 Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ@Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　 Ｓｅｒ　Ｖａ１ ＧＣＧ：（ＴｒＣＧＴ（ｉＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣ（ＴＴＡＡＡＴＯＯＡＴＣＣＡ ＡＣＡＴＡＣＣＡＴＴＣＣＧＧＡ（ｉＡＡＣＡＧＣＴＡＡ＾Ｉａ　Ｍａｌ　Ａｒ ｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌ ｕ　Ａｓｐ　７ｈｒ　ＩＩｓ　Ａｌｅ@Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｅｎｄ 第Ｖｌ−Ａ表 実施例　７ カリクレインの定りに実施したラジオイムノアッセイは、５ｈｉｌｌｌａｌｎＯ ｔＯらの方法を修正したものであった（　Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌ　＆　Ｎｅｔ、　５１：　８４０〜８４ｇ　（１９８０））。

使用したアッセイ緩衝液は、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ 　：　０．０１Ｍ−Ｈａｌ１２ｐｏ４中０．１４８−ＮａＣｊ）　、　ｐＨ７， ０）であった。アッセイは以下の試薬およびサンプルを使用した：アッセイ緩衝 液中適当な希釈度の精製ヒト尿カリクレイン（２４ｐｃ＋〜６２５０１）ｇ＞標 準を含有する２００ＩＪｉアリコート；精製ヒト尿カリクレイン、に対して生じ るウサギ抗血清、希釈度ｉ　：　２５０，０００の１００ρ：　ニーヒト尿カリ クレイン（比活性〜１．５Ｘ１０８ｃｐｍ　）　ｓｏ、ｏｏｏ　ｃｐｍの１００ ｇｅ。全てのサンプルおよび標準は、２度アッセイした。試験管を３１℃で２時 間、次いで４℃で一晩インキユベートした。ホルマリン固定した５ｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕＳ　（Ｃｏｗａｎ　５ｔｒａｉｎ）ｌ胞懸濁液ｒ　 Ｑ　Ｇｓｏｒｂ　（εｎｚ、ｙｍｅ　ｃｅｎｔｅｒ、　Ｉｎｃ）の添加により、 遊離カリクレインから抗体が結合したカリクレインを分離した。各試験管に１０ ％ｌ　ｇ　Ｇｓｏｒｂの５０〜を加え、反応混合物を室温で３０分間放買した。

試験雀を遠心分離にかけ、得られたベレットを洗浄緩衝液（０，０５ＭのＴｒｉ ｓ−ＨＣＩ！　（ｐＨ８，９）。

２Ｘ　ＢＳＡ、　０．１Ｘ　ＳＯＳ、　０．ＩＸ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００か らなる）で２回洗浄し、γカウンターで計数した。アッセイは約２４ｐｌ；ｌ〜 約６２５０ｐりの範囲のカリクレインを検出した。未知のサンプルのカリクレイ ン含有役が、既知量のｆｒｉ製ヒト尿カリクレインを含む標準と比較することに より決定された。

λＨＫ　６５ａおよびλＨＫ　７６ａとして表わされる２個の独立の正のヒトゲ ノムカリフレインク０−ンのヌクレオチド配列分析を行ない、λＨＫ６５ａクロ ーン領域を含むカリクレイン遺伝子に対して、得られた結果を第７表に示す。第 ■表に、両クローンが有する同一のカリクレインタンパク質コード配列および同 一のイントロン配列（該配列は完全なものである）Ｆ３よびλＨＫ６５ａ由来の ヒトカリクレイン遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。

遺伝子のタンパク質コード領域は、４つの介在配列すなわちイントロンによって 分けられている。ヒｌ゛組１１１１ＲＮＡを欠くためカリクレインに対するｍＲ ＮＡの転写開始部位が決定されなかったので、エキソンエの５′側における境界 が不明である。

第１表に示すヒト尿カリクレインのアミノ酸配列に対するヌクレオチド配列の比 較により、および公表されたｃＤＮＡ配列（Ｂａｋｅｒら（上記）およびＦｒｋ ｕｓｈｉｍａら（上記））との比較によりエキソンを同定した。カリクレイン遺 伝子のエキソンーイントロン境界は共通スプライス則（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　５ ｐｌｉｃｅ　ｒｕｌｅｓ）（Ｍｏｕｎｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、１０　：　４５９〜４７２　（１９８２））に従う。

第■表において開始配列は、遺伝子の５′末端非翻訳領域（８０２ｂｐ）を含む ことが明らかであり、これはエンハンサ−／プロモータ一様のぼ能を含んでもよ く、最初の１５個のアミノ酸（−２４から−１０までおよび残基の−９の一部） をコードする、翻訳されたＤＮＡ領域、第１のエキソンに導く。次いで１８２９ 塩基対の介在配列（ＩＶＳ）が続く。第２のエキソンは直ちに引き続きアミノ酸 残塁、グリシン−９からアスパラギン酸４５までをコードする。続く第２のＩｖ Ｓは１２６８塩基対からなる。第３のエキソンはアミノ酸残基、アスパラギン酸 ４５からフェニルアラニン１４２までをコードし、１１８塩基対の第３のＩＶＳ が続く。第４のエキソンは、アミノ酸残基、フェニルアラニン−１４２からバリ ン１８７までをコードし、５４８塩基対の第４のｒＶＳが続く。

最後のエキソンは、アミノ酸残基、グリシン１８８からセリン２３８および停止 コドン（ＴＧＡ）をコードする。

最後のエキソンの３′末端に４６ｂｐの非翻訳領域がある。この部位から１５ｂ ｐ上流のヌクレオチド配列は、共通ポリアデニル化シグナル配列ＡＡＴへＡＡに 似ているＡＧＴＡＡＡ配列を含み、該配列は通常この位置で見られる（　Ｎｅｖ ｉｎｓ、　Ａｎｒ＋ｌＪ、　Ｒｅｖ、　８ｉｏｃｈｅｍ、５２．４４１〜４４６ 　（１９８３））。

カリクレイン遺伝子は、２６２＠のアミノ酸のタンパク質をコードする。精製ヒ ］−尿カリクレインのＮＨ２−末端アミノ酸配列に基づく、最後の２３８＠の残 基は、非グリコジル化形態において口出したＭｒが２６４０３の成熟活性タンパ ク質に対応する。

疎水性残基が優位の最初の１７個のアミノ酸配列は、シグナルペ性化ペプチドす なわちプロペプチドである（　Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　９９．　９８９〜９９２　（１９Ｈ））。

−７位から一１位までのアミノ酸配列は組換え体ブＯカリクレインにおけるプロ ペプチドに対応し、＋１位で開始するアミノ酸配列はＣＨＯ細胞における本発明 の成熟カリクレイン生成物発現組換え体のアミノ末端の配列に対応する。第７表 に示シタように、成熟タンパク質はＡ　ｓｎ−Ｘ　ａａ　−Ｓ　ｅｒ／　Ｔ　ｈ ｒ則（Ｈａｒｓｈａｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｓｙｍｐ、４０．１７〜２ ６　（１９７４））に従うＡＳｎ−グリコシル化のための３個のポテンシャル部 位（遺伝子の第３のエキソン中アミノ酸残基７８．８４．１４１）を有し、１０ 個のシスティン残基を有する。

実施例　９ 以下の第■表は、本発明ヒトおよびサルカリクレイン間のポリペプチド配列相同 性の程度を示す。表の上側連続ラインにおけるアミノ酸３文字表記は、−２４の 残基で始まる本発明のヒトカリクレインの推定翻訳ポリペプチド配列を表すのに 使用し、下側連続ラインにおけるアミノ酸残基も特定された−２４の残基で始ま るサルカリクレインの推定ポリペプチド配列を示す。ダラシ１２１号は、本発明 のヒトカリクレインに存在するサルカリクレイン配列中ハイライト欠失アミノ酸 配列を表す。

第　■　表 ヒトおよびサルのカリワレインアミノ酸配列の比較にａｔ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌ ｅｕ 寒１」ｕ互 １　・４　にお（るヒト　リフレイン　の　のためのプラスミドＤＳＨＫＩの　 築 ヒトカリクレイン遺伝子を発現させるために、まず最初に完全なカリクレイン遺 伝子を含むλクローンλＨＫ６５ａから７ｋｂのＢｇｌ　Ｉｆ　−Ｘｂａ　ｌフ ラグメントを単離し、次に、ＢａｍＨｌ　／Ｘｂａ　■で二重に消化したプラス ミドベクターｐＵｃ１１８に挿入した。こうしてｐｔｌｃ１１８に担持したカリ クレインクローンをＨｅｎ１ｋｏｆｆ欠失手順［Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ、　Ｇｅｎｅ 　２８：　３５１−３５９　（１９８４）コに従って処理し、３゛−フランキン グ配列が種々の程度まで欠失しているヒトカリクレイン遺伝子を含むクローンを 生成した。特に、制限酵素ｓｐｈ　ｌ及び５ａｌｌで消化することによりプラス ミドを切り開いた。　Ｅｘｏｌｌヌクレアーゼ及びＳＩヌクレアーゼを組み合わ せて使用し、種々の時間間隔の間、３゛末端（Ｘｂａ　１部位）から挿入部を消 化した。その後、プラスミドＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼの大きいフラグメント （フレノウ酵素）で処理し、その後のプラント末端結合のために末端を７４ＤＮ Ａリガーゼで充填した。再び環状になったプラスミドＤＮＡを使用して叶５ａ　 Ｅ、ｃｏｌｉ宿主（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　８２６３Ｓ八）を形質転換した。得られた形質転換 細胞を挿入部の寸法決定及びＤＮＡ配列決定により分析した。欠失クローンの１ つであるｐＨＫ１０２は、タンパク質開始コドンの上流に８０１ｂｐ及び終止コ ドンの下流に２３２ｂｐを有する完全なヒトカリクレイン遺伝子挿入部を含んで いた。　ｐＨＫ１０２はカリクレイン遺伝子のタンパク質開始ｐｕｃ１１８の２ ３７ｂｐから移されたＨｉｎｄｌ１１部位を含んでいた。　ｐＨＫ１０２　ＤＮ ＡをＤｒａ　ｌ及び旧ｎｄｌで消化し、約４．８５ＫｂのＤｒａ　Ｉ　−Ｈ１ｎ ｄｌｌフラグメントを単離し、Ｂａ１３１−スローヌクレアーゼで一時的に消化 した。得られたＤＮＡフラグメントを、Ｂ　ａ　ｍ　Ｈｌ　テａ　Ｂ　Ｌ　タ発 現へ９９−ｐＤｓＶＬ（ｐＤｓＶｌｊ、ｔ　ＰＣＴ出１１１Ｗｏ　８５１０２６ １０に記載されているようにマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及びＳＶ４ ０後期プロモーターを含んでいる）に連結し、該発現ベクターは、ＤＮＡポリメ ラーゼの大きいフラグメント（フレノウ酵素）で末端を充填しておいた。こうし て得られたカリクレイン発現プラスミドは開始コドンの上流の５゛末端に６４ｂ ｐ及び終止コドンの下流の３°末端に２３２ｂｐを有する完全なヒトカリクレイ ン遺伝子を含んでおり、このプラスミドをｐｌ）Ｓｌ（に１と命名した。　ｐＤ ｓＨＫｌの構築物の詳細を第１図に示す、　ｐＤｓＨＫ１プラスミドは、ｐＭＧ ｌがらのＥｃｏＲｌ　−Ｐｓｔ　ｌフラグメントとしてマウスＤＨＦＲミニ遺伝 子、Ｈｉｎｄｍ　−ＢａｍＨｌフラグメント中のＳＶ４０複製起源及び初期／後 期プロモーター、ＢａｍＨＩ　−Ｂｃｌ　ｌフラグメント中のＳＶ４０　ｎｔ２ ５３８−２７７０、ＨｉｎｄＩ［［−ＥｃｏＲｌフラグメント中のｐＨＫ３２２ 　ｎｔ２４４８−４３６２、及びヒトカリクレイン遺伝子の４．８５ｋｂのＤｒ ａ　１−ＨｉｎｄＩ［［フラグメントを含んでいる。５Ｖ４０ｆ＆期プロモータ ーを使用してヒトカリクレイン遺伝子の発現を推進した。

このｐＤｓＨＫ１プラスミドを使用し、一時的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎ）のためにアフリカミドリザル腎細胞ＣＯ５−１、又をトランス フェクトした。

及り鮭比 共有結合環状ＤＮＡであるｐＤｓＨＫｌのリン酸カルシウム微細沈降物を細胞４ Ｘ１０ｓ個につき１．ｈｙのＤＮＡの割合で担体としての１０．、のマウス肝臓 ＤＮＡと共に使用し、ＣＯ５−１細胞をトランスフェクトした。１０％のウシ胎 児血清＋ペニシリン、ストレプトマイシン及びグルタミンを補充した高グルコー スＤＭＥＭ培地で細胞を増殖した。笑施例７のラジオイムノアッセイ手順による と、３日熟成した培地は５．１Ｂ／ｚ＆の免疫反応性カリクレインを含有してい た。

Ｂ、プラスミドＤＳ）ＩＫＩによる　ヤイニーズハムスター　巣（ＣＩＯのヒト 　リフレイン遺伝　の チャイニーズハムスター卵巣ＤＨＦＲ−細胞（ＣＩＯＤＨＦＲ−ａ胞）［Ｕｒｌ ａｕｂ他、（１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｌ　八Ｃａｄ、　ＳＣ１，（Ｕ、Ｓ、 ＾−＞＋　７７゜４４６１］は椙遺遺伝子中の突然変異により酵素ジヒドロ葉酸 レダクターゼ（ＤＩ（ＦＲ）を欠失しているので、増殖用培地中にグリシン、ヒ ボキサンチン及びチミジンの存在を必要とする。５％のウシ胎児血清、１％の非 必須アミノ酸、１％のヒボキサンチン及びチミジン、及びペニシリン、ストレプ トマイシン、及びグルタミンを補充したダルベ・ンコの変形イーグル培地（ＤＭ ＥＭ）を含むＣ培地で細胞を単層として増殖した。トランスフェクションの１日 前に、細胞を培養皿１０ｃ＋ｎ当たり約３Ｘ　１ｏ’個の密度で培食した。　Ｃ ｒａｈａｎ他［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：　４５６−４６７　（１９７３）］及び 旧Ｈｌｅｒ他［Ｃｅ１ｌ　１１：　２２３−２３２（１９７７）］の方法の変形 によるリン酸カルシウム微細沈降物手順を使用し、最終濃度が細胞１０６個当た り６〜７＋ｕｇのプラスミドＤＮ＾となるようにｐＤｓｌ（ＫＩ　ＤＮＡを導入 した。　ＤＨＦＲ遺伝子（従ってカリクレイン遺伝子）により形質転換されてお り、該遺伝子を発現していた細胞は、１０％の透析ウシ胎児血清、１％の非必須 アミノ酸、グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシンを補充し且つヒボ キサンチン及びチミジンを含まないＤＭＥＭから成る選択培地中で生存し、増殖 した。

選択培地中で増殖した細胞を安定な形質転換細胞であるとみなした。安定な形質 転換細胞の熟成培地を採取し、実施例７に記載したラジオイムノアッセイ手順に より免疫反応性ヒトカリクレインを定量した。定量の結果によると、免疫学的に 反応性の組換体ヒトカリクレイン生成物は３日熟成培地から６ｎｇ／ｘｉのレベ ル濃度で分泌された。

プラスミドｐＤｓｔｌＫ１　（９，８５ｋｇ）を制限酵素ＥｃｏＲ”１及びＨｉ ｎｄｌｌＪにより消化した。得られた消化物を０．７％アガロースゲル電気泳動 にかけ、ｐＢＲプラスミドに由来する原核ＤＮ＾フラグメントからのフラグメン トを含むカリクレイン挿入部を分離した。　ＤＨＦＲ遺伝子、ＳＶ４０ｍ節配列 、及びカリクレイン遺伝子を含む７．９ｋｂのＤＮ＾フラグメントをアガロース ゲルから単離した。この直線状ＤＮＡフラグメントによるＣ）ＩＯＥ＋胞のトラ ンスフェクションは、閉環状ＤＮＡ４二ついて上記実施例１１８（１）に記載し たように６０１の培養皿で冥施し、培養皿当たり１１０１Ｉの７．９ｋｂ　ＤＮ 八へラグメントを加え、培養皿当たり１×１０′の細胞密度となるように行った 。細胞にＤＮＡを加えてから１７時間後、培地を吸引し、新鮮な培地に交換した 。３日後、２つの６０ｎｕａの培養皿の細胞をトリプシン処理し、２つの７５ｃ ｍ”の培養フラスコに移した。翌日、培地を選択培地に交換した。この時点から 細胞を選択培地中に約４週間維持し、継代培養し、この細胞な安定な形質転換細 胞と命名しＰ−１２７Ｄ１４Ｅの１二１混合物の無血清条件で１４日間培養して 得られる熟成培地をＯ，’１７ＩＩｇｈｌの分泌レベルで分泌する。

１クレイン遠−ＨＫの　幅 安定な形質転換細胞により産生される組換体カリクレインの量は、より高い産生 率を有する新規細胞株を得るためにメトトレキセート処理による遺伝子増幅によ り増加することができる。クローン化カリクレイン遺伝子を増幅するために、メ トトレキセートの濃度を漸増する一連のメトトレキセート処理を安定な形質転換 細胞に施した。まず最初に細胞を選択培地からメトトレキセート培地に移した。

メトトレキセート培地は５％のウシ胎児血清、１％の非必須アミノ酸、グルタミ ン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充し、これに所望の濃度のメトトレ キセートを加えたＤＭＥＭから構成される。

メトトレキセートの濃度な漸増（ＯｎＭ、２０ｎＭ、６０ｎＭ、３００ｎＭ、及 びｂ＋Ｍ）　Ｌながら細胞株Ｃｌｌ０−ＤＳＨＫＩ−ＣＩ　（環状ＤＮＡでトラ ンスフェクトした細胞に由来する安定な形質転換細胞）を処理し、より産生度の 高い細胞株を選別した。所与のメトトレキセート含有培地中で約４週間培養後、 はぼ集密的な細胞にメトトレキセートを含まない無血清培地を供給した。

各増幅段階から無血清培養の代表的な７日熟成培地サンプル（ＨａＩＩｄ’ｓ　 Ｆ−１２／ＤＭＥＭの１：１混合物）を取り出し、実施例７に記載したラジオイ ムノアッセイ手順により定量した処、ｄ当たり夫々１０．４２．１１０．６９３ 及び７０８ｎｙのヒトカリクレインを含有していた。他方、細胞株ＣＨＯ−ＤＳ ＨＫＩ−ＬＬ（直線状ＤＮ＾でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に由来する安定 な形質転換細胞）も同様にメトトレキセートの濃度を漸増（ＯｎＭ、３０ｎＭ、 ６０ｎＭ、３００ｎＭ、１１ＩＭ及び５．Ｍ）することにより増幅した。

熟成培地中のカリクレイン含有量を実施例７に記載したラジオイムノアッセイ（ ＲＩ＾）手順により決定した。７日熟成サンプルに基づく結果を表ＩＸに示す。

省仄 カリクレイン濃度 ＯＳＦ＋　１４　０．２７ ３００ｎＭ　ＳＦ＋ＰＣ−１７２，３４ＳＦ＋ＰＣ−１＋Ｇ１ｎ３７　３．５７ ＳＦ＋ＰＣ−１’　７　４．０６ ５％血清　７　１．７４ ５１１Ｍ　５％血清　７　０．８２ １、ＳＦ−無血清培地、即ちＨａｍ’ｓ　Ｆ１２／ＤＭＥＭの１：１混合物。

２、　ＰＣ−１＝無結成培地の補充成分としてＶｅｎｔｒｅｘ（ＰｏｒＬｌａｎ ｄ、　Ｍａｉｎｅ）から入手。

３、グルタミン濃度は通常の２ｍＭでな（８ｍＭとした。

４、この実験で使用した細胞はＰＣ−１を補充した無血清培地中に予め７日間維 持した後、メトトレキセート培地中に３日間維持しておいた。

最高の発現レベルが観察されたのは、直線化カリクレインＤＮＡでトランスフェ クトし、３００ｎＨのメトトレキセートで処理した細胞を７日熟成培地であり、 ４．０６μｇ／ｘｉのヒトカリクレインが得られた。

Ｄ、ブースミドＤＧＩ（Ｋ−Ｌｌ＾によるＣＨＯ２のヒトカリクレイン遺−の （１）ＤＣＨｋ−Ｌ１＾　ベクターの　築第３図に示すｐＤｃ：）ｌｋ−Ｌｌ＾ は次の要素から構成される。（ｉ）ＨｉｎｄＩｆｆ　−ＥｃｏＲＩフラグメント としてｐＢＲ３２２ｎｔ　２４４８−４３６２；（ｉｉ　）５５６ｂｐのＢｇｌ 　Ｕ　−［ｆｌ　Ｕフラグメントを除去した後、末端をフレノウ酵素で充填する ことにより３゛未翻訳領域に欠失を有するｐＭ、１からのＥｃｏＲｌ　−Ｐｓｔ 　ＩフラグメントとしてのＤＨＦＲミニ道伝子遺伝ｉｉｉ）最初はＢａｍＨＩ　 −Ｂｃｌ　Ｉフラグメント（ＳＶ４０　ｎＬ　２７７０−２５５３）であり、Ｂ ｃｌＩに合成リンカー−１を加え（Ｂｅ１１部位を破壊し、Ｐｓｔ　ｒ部位を生 成）、フラグメントのＢａｍＨｌ末端に合成リンカー−２を加えて５ｉ１１部位 をした２３７ｂｐの二方向ＳＶ４０終止配列；（ｉｖ）Ｄｒａ１１部位のｎＬ　 ８０１に合成リンカー−３を加え、５ａ１１部位を有するカリクレイン遺伝子（ 表■のｎｔ　８０１−　ｎＬ　５３７０）は、部位特異的突然変異誘発を使用し て終止コドンＴＧ＾の後のｎＬ　１５及びｎｔ　１６の間にＣ＾を挿入し、配列 ■人＾ＣＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴΔ（Ｇ＾）Ｃ３生成することにより形成した ；　（ｖ　）Ｓｍａ　Ｉ　−Ｂｓｓｈ　ＩＩフラグメント（ＣＲＰ７８ｎｔ−７ ２２〜ｎｔ−３７）を含むグルコースで調節したラットタンパク質（ＧＲＰ７８ ）遺伝子プロモーター［５ｈｉｎ　Ｃ，Ｃｈａｎｇ他。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４：６８０−６８４　（１９ ８７）］：及び（ｖｉ）ｍＲＮＡキャップ部位を含む配列を復元し、ＢａｍＨＩ クローニング部位を形成するための合成リンカー−４，（：ＲＰブロモ−クー− カリクレイン遺伝子の融合は、リンカー−４のＢａｍ８１部位をリンカー−４の ＢｇＩｎ部位に連結し、更にリンカー−３のＢｇｌ　１１部位に連結することに より行った。　［：ＲＰプロモーター配列の５Ｔａａ　ｌ末端にリンカー−５を 加え、ＨｌｎｄｌｌでｐＢＲ３２２から誘導される配列に結合した。

リンカ−１： ＧＣ八へＴＧ（：ＣＡＡＣ八八ＣへへＴＧＣＣＣＣΔＣＧＴＣ［、ＴＴＡＣＣＧ ＴＴＧＴＴＧＣΔΔＣ［；［；［：ＣＣＴ八Ｇへｓｔ　Ｉ　（Ｂｃｌ　Ｉ　） ［１，ＡＣＣＴＡ（： リンカ−３： Ｂｇｌ　Ｔｌ　（Ｄｒａｎｌ） （：ＡＴＣＴＣ八＾＾ＣへにＡＣ＾＾ＣＡＴ＾［；ＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴ リンカ：１： ＣＧＣＧＣＴＣＣＡＴＡＣＴＧＧ　ＣＴにＴＣＡＣＴＡＣＡＣＴｆ；ＡＣＴＴＧ ＧＡＣＡＣＴＴ、ＧＧＣＣＴＴＴＴにＣＧ　Ｇ　ｌｌ：ＴＴsｃＡＧ ＣＡＣＣＴＡＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＴＧＴＧ八ＣＴＧ＾八ＣＣＴ（、ＴＯ ＾八ｃへｃｃ＾＾Δ＾ＣＧＣＣＣへ＾＾ＣＴへＣＴＡＧＢｓｓｈ　ＩＩ　Ｂａｍ ［Ｉ　Ｉ グンオニｊ： Ｈｉｎｄｍ　ＥｃｏＲＩ　Ｓｍａ　ｒ ＾ＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴｆｌ：へへＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣ（、ＴＡＣＣＣ＾Ｃ ＴＣＡｆ、（：へＣＴＴ＾＾ＧＣＴＣＣへＧＣＣへＴＣ；（：Ｇ１３．６μｇ／ ｘ／Ｖのヒボキサンチン、７．６１Ｊｇ７ｘｉのチミジン、及び２１のグルタミ ンを補充した高グルコース、高グルタミンＤＭＥＭ（（，１ｂｃｏ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃａｔ、　＃３２０−１９６５）中でＣＨＯＤ−細３．３ 胞を増殖した。５１１の培地を含む培養皿につき約ムロＸ１０Ｓ個の細胞密度で ６０℃菌のプレートに接種し、３７℃、５％Ｃ０２で約２０時間増殖した。各プ レートから培地を吸引し、新鮮な培地を加え、３７°Ｃ５５％ＣＯ２で更に５時 間細胞を増殖させた。

培地を再び吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗い、次にトランスフェクション緩衝液 で１回洗った後、細胞を直線状プラスミドＤＮＡ、ｐＤｃＨＫ−Ｌｌ＾でトラン スフェクトした。トランスフェクション手順はＢｏｎｄ及びＨｏ１ｄ（Ｂｏｎｄ 、　Ｖ、Ｃ，及びＭｏ１ｄ、　Ｂ、、　Ｍｏｌ。

＆　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：２２８６−２２９３．１９８７）により記載 されているとほぼ同一の手順で行った。トランスフェクションＭＷＪ液は５ｍＭ 　ＮａＣｌ、１２０ｍＭ　ＫＣＩ、１．５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４及び２５ｍＭＴ ｒｉｓ。

ｐＨ７，５から構成し、１．４ｍＭまでのＣａＣＬ及び０．５１１ＩＭまでのＭ ｇＣｌ２を加えた。混合後、０．２２ｐｍのＣｏ５Ｌａｒ旧ｃｒｏｓＬａｒフイ ルターで沢過することによりＭ街液を滅菌した。制限酵素Ｐｖｕ　ｌで直線化し たプラスミドｐＤＧ）ＩＫ−ＣＩＡを、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ。

した１：１のフェノール−クロロホルムで１回抽出し、更にクロロホルム単独で １回抽出した。抽出したプラスミド消化物を１７２容旦の７，５邑酢酸アンモニ ウム及びｚｔｉ容量の絶対エタノールで一２０℃で一晩沈降させた。沈降したプ ラスミドＤＮ＾を、最終濃度が約２．５１Ｉｙ／ｚＮ及び５μｇ／ｘ１となるよ うに無苗トランスフェクション緩＠液に再溶解させた。　０．２ＺＩＩｍのＣｏ ５ｔａｒ　ＨｉｃｒｏｓＬａｒフィルターを通して滅菌した０、ＯＩＭ　Ｔｒｉ ｓｐＨ７，５中の’ｌｏｏｘｇ／ｘｌのポリ−し一オルニチン（Ｓｉｇｍａ、　 Ｃａｔ。

１１Ｐ４６３８）を、２．５μｇ／ｒ１の１ラスミド濃度のトランスフェクショ ン混合物には１７ＩＩｆＩ／１まで、５μｇａｚｅのプラスミドＤＮＡ濃度のプ ラスミドＤＮＡトランスフェクション混合物には２５１ｇ／ｌまで加えた１Ｍ３ 胞を収容する培養皿上にトランスフェクション混合物（０，５ｔｊ！／６０ｍｍ の培養皿）を注急深く積層し、層流フード下で室温で１時間インキュベートした 。トランスフェクション処理の終わりに５１□１の培地を各培養皿に加え、次に 培養皿を３７℃、５％ＣＯ２に戻した。翌日、即ち約１６時間後に培地を吸引し 、新鮮な培地を加え、培養皿を４８時間の間に３７℃、５％ＣＯ□に戻した０Ｍ Ｊ胞をトリプシン処理し、各６０＋ｕｅの培養皿を４個の１００ｍｍの培養皿（ 夫々１０１の培地）に交換した。１日後、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗 った。

次に選択培地（１０％の透析ＰＢＳ、２ｍＭのグルタミン、０．１ｍＭの非必須 アミノ酸を補充した高グルコース、高グルタミン濃度のＤＭＥＭを含む）を加え た０選択培地は個々のコロニーが現れるトランスフェクションから１５日後まで 約３日毎に交換した。コロニーをまとめ、トリプシン処理し、フラスコ化たりプ ールしたコロニーが約５０個の密度となとるように２５ｃｍ”の培養フラスコに 移した。トランスフェクトしたＤＮＡｔｕｙから約４０〜５０個のコロニーが得 られた。

（３）　Ｊ＾を　むＣＩＯＤＨＦＲ−細　にお（るクローン１１に遺伝子の増幅 直線状ｐＤＧＨＫ−ＬＩＡを含むＣＨＯＤＨＦＲ−細胞の増幅手順は実施例１１ Ｃに記載したとほぼ同一であり、次のように変形した。

細胞株ＣＨＯ−ＤＧＨＫ−Ｌ已−８（ｐＤＧＨＫ−ＬＬ八でトランスフェクトし た細胞に由来する安定な形質転換細胞）に異なる２系列のメトトレキセート（Ｍ ＴＸ）処理を行った。一方のＭＴＸ濃度系列は、０−２０ｎＭ−６０ｎＭ−２０ ０ｎｌ（−６００ｎＨＨＴＸとし、他方は、 ０−”　３０ｎＭ−１００１００ｎ　３００ｎＭ−９００ｎＭとした。細胞によ り培地中に分泌されるカリクレインの量を実施例７に記載したようなＲ１八を使 用して決定した。６０ｎＭのＨＴＸ及び１１００ｎのＭＴＸで増幅した細胞は最 高レベルのカリクレインを分泌し、夫々１３５０ｎｙ／＊１／日及び１７２５Ｂ ／ｚ１７日であった。結果を下記の表Ｘに示す。

轟う辷 メトトレキセートによる各増幅　階におけるＣｌ０−ＤＣＨＫＬＩ＾−８４によ るカリクレインの　レベルｒ■ヱ快　ｒＨＫの　・・ｎ／１１／日の細胞を収容 する１７５ｃｍ’の培養フラスコから得た。使用した培地は、ＰＣ−Ｈ培地５０ Ｏ１１ニツき１０ｚｉり、６１ｆｆｉＭノクルタミン及び０．１＋ａＭの非必須 アミノ酸を含む１：１のＤＭＥＭ／Ｆ１２とした。

及１１段 ４　ヒト　■　レインの゛ ＣＨＯＭＪ胞により産生された組換体ヒトカリクレインを含む無細胞培地をプー ルし、１００００ダルトンの分子量を分画するメンブランフィルタ−を有する透 析ｒ過器を使用して濃縮した。濃縮したサンプルを１０容量のＩＯＱＩＭ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣＩ緩街液（ｐＨ７，８）で緩衝液交換した。　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩｈｉ街液（ｐＨ７，８）で平衡化したＱ八−セファロース充填カラムに未 調整の組換体カリクレインを加えた。カラムを平衡！ｉ液で洗い、組換体カリク レインを同一緩衝液中の０〜０．５Ｍの直線勾配ＮａＣＩで溶離させた。活性な カリクレイン及び酵素的に不活性なプロカリクレインはいずれも０．３〜０．４ ＭのＮａＣＩを含むフラクションで溶出した０組換体カリクレイン及びプロカリ クレインフラクションをプールし、１０＋ｏＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，８ ＞緩ｆｆｒ液で透析し、過剰の塩化ナトリウムを除去した。

透析は４℃で２〜３日間行い、こうしてプロカリクレインをカリクレインにより 完全に活性化させ、成熟カリクレインを生成した。透析した活性化カリクレイン プールを、１０ｍＭＴｒｉｓ−１（ＣＩ　（ｐＨ７，８＞で予め平衡化したペン ズアミジンーセファロースアフィニティ力ラムに加えた。カラムを平衡ＭＦｆｆ 液で洗い、２ＨのグアニジンＨＣＩを含む同一の緩衝液でカリクレインを溶離さ せた。カリクレインフラクションをプールした後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，８＞中の７０％飽和硫酸アンモニウムで沈降させた。硫酸アンモニウ ムで沈降させたカリクレインフラクションを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（＋） Ｈ７，８）に溶解させ、溶解したサンプルを同−ｍｍ液で平衡化したセファクリ ルＳ−３００ゲル濾過カラムに加えた。カリクレインフラクションを３００００ 〜４５０００の分子量で溶離させた。プールしたカリクレインフラクションは高 純度の活性な組換体ヒト成熟カリクレインを含んでいた。　Ｃ，ＩＩＰＬｃカラ ム（Ｖｙｄａｃ　Ｃ４力ラム２５ｃｍＸ　４．６ｍｍ）クロマトグラフィを使用 して最終生成物の純度をチェックした。使用した緩衝液勾配条件を以下にＬ（分 ）　％＾　％Ｂ 八＝０．１％ＴＦ＾（トリフルオロ酢酸）Ｂ冨９０％ＣＨ，ＣＮ１０．１％ＴＦ ＾（ＣＨ，ＣＮ＝Ｎニアセトニトリル量＝　１ｚｌ／分 結果を下記の表Ｘ＾に示す。

基質として合成ペプチド＾ｅ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ−ＯＥｔ−ニトロアニリドを使用 し、（：ｅｉｇｅｒ他［Ａｄｖ、　Ｂｉｏｓｃｉ、　１７．１２７　（１９７９ ）］により記載の手順に従ってエステラーゼアッセイを行った処、得られた精製 カリクレインは酵素的に活性であることが判明した。

同様の精製手順を使用して培地の各バッチからカリクレイン（成熟活性形）及び プロカリクレイン（不活性形）の両方を精製した。精製したプロ酵素は酵素的に 活性でなかった。

自己賦活後、又はトリプシンと共にインキュベーションすることによりプロカリ クレインから活性化ペプチドを除去した後、活性なカリクレインを羊離した。

大ＪＬｆＬｕ カリクレイン　びプロカリクレインの　１ゝ精製した組換体カリクレインを配列 決定した処、精製タンパク質は相同であり、単一のアミン末端３含んでいること が判明した０部分的Ｎ−末端配列は次のように決定される。

、　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１Ｈ −Ｉｌｅ−Ｖａｌ−ＧＩｙ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｕ−ＸＸＸ−Ｇｌｕ−にＩｎ −Ｈｌｓ−Ｓｅｒ７ＣＩｎ−Ｐｒ。

尚、ＸＸＸは明確に指定することができない残基を表す、この結果から明らかな ように、ｆｆｌ換体刀体カリクレイン−末端配列は従来決定されているヒトの尿 のカリクレインのＮ−末端配列と同一である。

組換体プロカリクレインのト末端配列分析の結果、前駆形態はへブタペプチドリ ーダーとそれに続く成熟カリクレインのアミノ酸配列を有することが判明した。

＾１−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Δｒｇ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇ ｌｙ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｃｌｕ−ＸＸＸ− ｆ、ＬＵ−Ｃ：Ｉｎ−Ｈｌｓ−Ｓｅｒ−ｆ；Ｉｎ−Ｐｒｏ−−−−−−−−。

尚、ＸＸＸは明確に指定することができない残基を表す、この前駆形Ｎ−末端配 列は同様に、Ｔａｋａｈａｓｈｉ他の前出の文献に報告されているＮ−末端配列 と同一である。

天上」シロ− 力１クレインの　ノゲナーゼアツセイ 本発明の組換体カリクレインポリペプチドのキニン産生活性を測定するために使 用した手順は、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ他、　Ｊａｐ。

Ｃ１ｒｃ、　Ｊ、　４３：　１４７−１５２．　（１９７９）により記載されて いる手順とほぼ同一である。

精製したヒトの尿のカリクレイン標準又は組換体カリクレインサンプルを、０． ５ｚｊ！の総容量中に３目の精製ウシ低分子量キニノーゲンを含有する０、１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ８，５）７３０ｍＭ　Ｎａ、ＥＤＴＡ／３ｍＭフェナン トロリンで希釈しく２０．Ｆ又は４０ハ）、３７℃で３０分間インキュベートし た。１０分間沸騰させて反応を終了し、５０ν！のアリコートを２つ収り分け、 抗キニンウサギ抗血清を使用してキニン放出量によりキニン放出量を測定した０ 組換体カリクレインのキニンゲナーゼ活性を、３０分間にカリクレインｕ当たり 産生されたキニンの旦（ｐｙ）で表した。

夾澹［ リフレインの血　久　、のｉｎ　ｖｉｖｏアッセイ＾、ラット 体重的２５０ｇの自発的高血圧症のラットの雄種を使用して試験した。ラットに ベントパルピトールナトリウム（５０ｚｙ／体重Ｋｇ）を腹腔内に投与して麻酔 をかけた。比類動脈にカニユーレを挿入し、Ｓｔａｔｈａｍ圧力変換器に連結し た。右頚静脈にカニユーレを挿入してカリクレインを投与し、ポリグラフで血圧 の変化を測定した０本発明の組換体成熟カリクレインを投与した処、高血圧症の ラットの血圧レベルの低下が観察された。

Ｂ、ブタ 薬剤試験の有意識動物実験を実施するために、次のプロトコールを使用した１体 重約５０ｋｇの正常な飼育用ブタにＫｇ当たり２５ｚｙのケタミンＨＣＩを筋肉 内投与して鎮静作用を与え、Ｋｇ当たりＺＯｘｇのチアミロ−ルナトリウムで麻 酔を誘導し、１〜２％のへロタンで維持した。左胸壁の第４又は第５肋骨間隙含 切開した。大動脈及び左心房カテーテルを植え込み、背中から体外に出した。

実験を実施する１週間前に動物を回復させた０回復期間中に各動物を薬剤試験手 順に羽化させた。全動物が健康になるのを毎日監視した。

動物を実験カートに入れ、各動物の２本のカテーテルを流通させた。大動脈系を 使用して血圧を連続的に監視した。

各実験の間、動物に１００ＯＯＵ／時の割合でヘパリン与え、土塊の形成を阻止 した。一旦安定な血圧に達したら、即ち平均動脈圧が±５ｍｍＨＨに５分間維持 されたら、試験を開始した。

次に継続的に血圧を監視しながら左心房カテーテルを通して薬剤を投与した。薬 剤試験の時間間隔は、動物及び先に与えた用量に従って変化した。純粋な組換体 カリクレイン（ｒＨＫ）の２種類の調製物をに−０１１及びに−０１２と命名し 、試験に使用した。１１ｇのｒＨＫ＝’１．５＾２１Ｇと仮定すると、　Ｋ−０ １１では試験で使用される０、２５ｚｆの溶液が体重ｋｉ当たり２．５■のｒ） ＩＫの投与量に相当し、調製物に−０１２では、０．２５ｚｉ’の溶液が体重ｋ ｇ当たり１．２５．ｇのｒ）ＩＫに相当する。

結果を表ＸＩ〜ＸＩｖに示す０体重ｋｇ当たり１．２５．ｇ程度の低濃度でも有 意識ブタの平均心房圧は著しく降下し得る（表ｘＩｖ）。

用量＝０．２５１１　用量＝０．５０ｚ１時間　）ＩＲＢＰＭ八Ｐ　へ時間　Ｈ ＲＢＰＨＡＰｃｏｎｔ、１１５　１７０／１１５　１３７　ｃｏｎｔ、１０５　 １６５／１１５　１３２３０秒　２１０　１７５／１００　１２５　３０秒　１ ６５　１４０／７０　９３１分　１７５　１７５／１００　１２５　１分　１４ ７　１５５／７０　９８２分　１６０　１７５／１１５　１３７　２分　１２５ 　１６０／１１０　１２７３分　１４５　１７５／１１５　１３７　３分　１２ ０　１６０／１１０　１２７４分　１３０　１７５／１１５　１３７　４分　１ ２０　１６０／１１０　１２７５分　１１５　１７５／１１５　１３７　５分　 １２０　１６０／１１０　１２７６分　１０５　１７５／１１５　１３７　６分 　１２０　１６０／１１０　１２７用量−１，Ｏｘｌ　用量＝　２．ＯｘＮ時間 　ＨＲＢＰＭ静　時間　ＨＲＢＰＨＡＰｃｏｎｔ、１２０　１９０／１４５　１ ６３　ｃｏｎｔ、１６５　１６５／１１５　１３２３０秒　１６５　１１５／７ ５　８８　３０秒　１８０　１１５／７５　８８１分　１６５　１５５／７０　 １２７　１分　１６５　１６０／１０５　１２３２分　１６０　１６０／１１０ 　１１７　２分　１６５　１６０／１０５　１２３３分　１６５　１６５／１１ ５　１３２　３分　１６５　１６０／１１５　１３０４分　１６５　１６５／１ １５　１３２　４分　１６５　１６０／１１５　１３０５分　１６５　１６５／ １１５　１３２　５分　１６５　１６０／１１５　１３０６分　１６５　１６５ ／１１５　１３２　６分　１６５　１６０／１１５　１３０８＾Ｐ＝平均心房圧 青μ↓ 置方に立」 Ｌ久旦 用量二〇。２５１１　用量＝０．５０ｚ１時間　ＨＲＢＰＭ八Ｐ　へ時間　ＨＲ ＢＰＨＡＰｃｏｎｔ、　９６　１１５／６５　８２　ｃｏｎｔ、　８１　１００ ／６０　７３３０秒　１６７　１００／３０　５３　３０秒　１２０’ｌＯＯ／ ３０　５３１分　１２０　１００／３０　５３　１分　１３８　１１５／４０　 ６５２分　９６　１００／３５　５５　２分　１０８　９０／３０　５０３分　 ９０　１００／４５　６３　３分　８４　８５／４０　５５４分　９０　１１０ ／６０　７７　４分　７８　９５７５０　６５５分　７８　１００／６５　７７ 　５分　７２　９５／６０　７２６分　８０　１０５／７５　８５　６分　７２ 　９５／６０　７２用量＝　１　、（ｈｌ　用量＝２．０Ｒ１時間　ＨＲＢＰＭ 八Ｐ　へ時間　ＨＲＢＰＭ＾Ｐ３０秒　１３８　９５／３５　８８　３０秒　１ ３８　８０／２５　４３１分　１２０　１００／４０　１２７　１分　１２０　 １００／４５　６３２分　９６　１００１５０　１１７　２分　９６　９５１５ ５　６８３分　９０　１００／６０　１３２　３分　９６　１００／６０　７３ ４分　９０　９０１５５　１３２　４分　８４　１００／７０　８０５分　７８ 　９５／６０　１３２　５分　９０　１ｆｌＯ／７０　８０６分　７８　９５／ ６０　１３２　６分　７２　１０５／７０　８２ｃｏｎｔ　、　＝対照 ＨＲ＝心拍数 ＢＰ＝血圧 Ｍ胛−平均心房圧 表Ｘｌｌ１ １創に立Ｒ ブタ１４ 用量＝０．２５肩ｐ　用量＝　０．５０ｇ１時間　ＨＲＢＰＭ八Ｐ　へ時間　Ｈ ＲＢＰＨＡＰｃｏｎｔ、　９６　１１５／７５　８８　ｃｏｎｔ、１１４　１３ ５／９５　１０８３０秒　１３２　１００／４０　６０　３０秒　２０４　１１ ０１５５　７３１分　１１５　１０５／６５　７８　１分　１３２　１１０／６ ０　７７２分　１０４　１１０／７５　８６　２分　１１４　１０５／７０　８ １３分　１０４　１１０／７５　８６　３分　１０２　１１０／７５　８６４分 　１０４　１１０／７５　８６　４分　１０２　１１０／７５　８６５分　１０ ４　１１０／７５　８６　５分　１０２　１１０／７５　８６６分　１０４　１ １０／７５　８６　６分　１０２　１１０／７５　８６時間　ＨＲＢＰＭ＾Ｐ ｃｏｎｔ、　９６　１１０／７５　８６３０秒　１６８　１００／４０　６０ １分　１３６　１００／４２．５　６１．５２分　１０２　１００１５０　６７ ３分　９６　１００１５５　７０ ４分　９０　１００／６５　７７ ５分　８４　１００／７０　８０ ６分　８４　１００／７０　８０ ＨＲ＝心拍数 ＢＰ＝血圧 ＭＡＰ　＝平均心房圧 轟μヱ 匡正に刀ヱ ブタ４３ ）ＩＲ−心拍数 ＢＰ−血圧 ＨへＰ−平均心房圧 得られた最長応答は６分間であった。

Ｋ毘鰻咀 −ｆｆＩ′ｊ４　ヒト　リフレインの”ニノゲナーゼ活　び工区ｊ２Σ：」５１ 五− 組換体ヒトカリクレインは基質キニノーゲンに作用してキニンを放出させ、即ち 天然に産生ずるカリクレインに関連する活性であるキニンゲナーゼ活性を示した ０表ＸＶに示すように、本発明の精製組換体ヒト成熟カリクレインの活性は、精 製したヒトの尿のカリクレインがら得られる活性と同様であった。

組換体カリクレイン　２９．０　４５．１ヒト尿カリクレイン　２８．９　５７ ．５緩衝液隼独　０　０ （１）キニンゲナーゼ比活性は３０分間にカリクレインＩｆｆ当たりに産生され るキリンｌＩｇで表し、実施例１２の手順に従って決定した。

（２）エステラーゼ単位は基質として３Ｔｏ　Ｔｏｓ−Ａｒｇ−ＯＭｅを使用し て測定し、Ｅ、Ｕ、／■９カリクレインとして表し、Ｂｅａｖｅｎ他［Ｃｌ１ｎ 、　Ｃｈｉｎ、＾ｃｔａ、　３２．６７　（１９７１）］の手順に従って決定し た。

実施例７のラジオイムノアッセイ手順により測定した処、組換体ヒトカリクレイ ンはヒトの尿のＲＨカリクレインと同様の用量応答曲線を示した。このことから 明らかなように、組換体細胞により産生されるカリクレインは天然の細胞により 産生される天然に産生ずるカリクレインと同一の免疫特性と有する。

精製組換体ヒト成熟カリクレインを８〜２５％の勾配ドデシルＫＭ−ポリアクリ ルアミドゲル中で分析した処、組換体ヒト成熟カリクレイン及び天然に産生ずる 尿のカリクレインは類似の分子量を有しており、寸法の相異を示した（第２図） １寸法の相異は糖鎖長の相異により糖タンパクに共通である。

去１」１■− ζΣ址五五１尤に　ζ′−ヒト　１　レインのｔ受精能のある正常な供与体から 精子を得た。精製ヒトカリクレイン（０，６８＾２．。）を、１：１０及び１： ２０の最終希釈度で最終月旦１００ハ中の１〜２ｘ　１０’個の精子に加えた。

参考文献として本願の開示内容に加えるＭａｔｈｕｒ他。

Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ、　Ｖｏｌ、　４６．　Ｎｏ 、　３．４８４（１９８６）及びＭａｔｈｕｒ他、＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｒ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏ−１ｎｇｙ　ａｎｄ　 Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　１２：８７−８９（１９８６）に記載の手原を使 用して精子の運動能を測定した。４８時間観察後の結果を以下に示す。

運１Ｕｌχ一 対照培地　２９．１３ ｒ−ＨｕＫ（１：１０の希釈度）　４２．７６ｒ−ｔ（ｕＫ（１：２０の希釈度 ＞　４１．２１３組換体カリクレインは精子運動能が著しく増加した０組換体カ リクレインのこの生物活性は男子の不妊症の治療剤として重要である。

以上の具体例に鑑みて本発明の種々の変形が当業者に予想されよう、従って、本 発明は請求の範囲のみに限定されるものと見なされるべきである。

ＦＩＧ、３ 平成元年５月２日 特許庁長官　古　１）文　毅　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０２２１４２、発明の名称　カリクレイ ンの生産 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　アムジエン・インコーホレーテッド５、補正命令の日付　自　発 ６、補正の対象　明細書の翻訳文及び請求の範囲の翻訳文７、補正の内容 （１）鮮明な明細書の翻訳文を別紙の通り補充する。

（内容に変更なし。） 国際調査報告 ＩＡ瞳ＩＭ１１ＨＯＡａｌ＾””””””０１７ｈ−ＣＱＱ／Ｌ１つつ１ＡＰＣ Ｔ／ＵＳ８８１０２２１４ Ｇｒｏｕｐ　ＩＩＩ　ｘｎｃＬｕｄｅｓ　ｃ上ａｉｍｓ　９−１５　ａｎｄ　１ ９−２２　ｄｒａｗｎ　セｏ　ＤＮＡ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｎ末端から始まる以下のアミノ酸配列：【配列があります】 （ｎは０又は１） を含み、外来性ＤＮＡ配列の原核又は真核細胞による発現生成物であることを特 徴とする、精製及び単離された組換えカリクレインポリペプチド。
2. ２．ｎが０である請求の範囲第１項記載の精製及び単離された組換えカリクレイ ンポリペプチド。
3. ３．ｎが１である請求の範囲第１項記載の精製及び単離された組換えカリクレイ ンポリペプチド。
4. ４．如何なる哺乳動物タンパクとも混在していない請求の範囲第２項記載の精製 及び単離された組換えカリクレインポリペプチド。
5. ５．外来性ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である請求の範囲第２項記載の精製及び単 離された組換えカリクレインポリペプチド。
6. ６．外来性ＤＮＡ配列が合成ＤＮＡ配列である請求の範囲第２項記載の精製及び 単離された組換えカリクレインポリペプチド。
7. ７．外来性ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ配列である請求の範囲第２項記載の精製及 び単離された組換えカリクレインポリペプチド。
8. ８．検出可能標識を有する請求の範囲第１項記載の精製及び単離された組換えカ リクレインポリペプチド。
9. ９．請求の範囲第１項記載のカリクレインポリペプチドの原核及び真核宿主によ る発現をコードする精製及び単離されたＤＮＡ。
10. １０．表Ｖに示したヌクレオチド配列を有する請求の範囲第９項記載の精製及び 単離されたＤＮＡ。
11. １１．ＤＮＡがｃＤＮＡである請求の範囲第９項記載の精製及び単離されたＤＮ Ａ。
12. １２．ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求の範囲第９項記載の精製及び単離された ＤＮＡ。
13. １３．ＤＮＡが合成ＤＮＡである請求の範囲第９項記載の精製及び単離されたＤ ＮＡ。
14. １４．大腸菌細胞における発現に好適な一つ以上のコドンを有する請求の範囲第 １３項記載の精製及び単離されたＤＮＡ。
15. １５．表ＶＩに示したヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１４項記載の精製 及び単離されたＤＮＡ。
16. １６．治療上有効量の請求の範囲第１項記載のカリクレインポリペプチド及び医 薬上許容し得るアジュバントを含む医薬組成物。
17. １７．請求の範囲第１項記載のカリクレインポリペプチドの治療上有効量を投与 することから成る血管拡張療法。
18. １８．請求の範囲第１項記載のカリクレインポリペプチドの治療上有効量を投与 することから成る男性不妊症治療法。
19. １９．請求の範囲第１項に記載のカリクレインポリペプチド生成物を発現し得る ように請求の範囲第９項記載のＤＮＡで形質転換又はトランスフェクションされ た原核又は真核宿主細胞。
20. ２０．ｐＤＨＳＫＩ１及びｐＤＧＨＫ−Ｌ１Ａから成る群より選択されるプラス ミド。
21. ２１．請求の範囲第２０項記載のプラスミドで形質転換又はトランスフェクショ ンされた真核宿主細胞。
22. ２２．請求の範囲第９項記載のＤＮＡで宿主細胞を形質転換又はトランスフェク ションし、 形質転換又はトランスフェクションした宿主細胞を培養してカリクレインポリペ プチドを発現させ、そして、カリクレインを単離する操作を含む、精製及び単離 されたカリクレインポリペプチドの製造方法。
23. ２３．組換えヒトカリクレインを含む培養培地をジアフィルトレーションによっ て濃縮し、 この培養培地をアフィニティクロマトグラフィにかける操作を含む、 組換えヒトカリクレインの精製法。
24. ２４．濃縮操作の次に培養培地をアニオン交換クロマトグラフィ操作にかけ、そ してアフィニティクロマトグラフィ操作の次に培養培地をゲルフィルトレーショ ン操作にかける、請求の範囲第２３項に記載の精製法。
25. ２５．アニオン交換クロマトグラフィ操作の次に自己活性化によってプロカリク レインをカリクレインに変換する操作にかける、請求の範囲第２４項に記載の精 製法。