PL214284B1 - Sposób wytwarzania wirusa oraz sposób wytwarzania immunogennej kompozycji zawierajacej wirusa albo antygen wirusa - Google Patents

Sposób wytwarzania wirusa oraz sposób wytwarzania immunogennej kompozycji zawierajacej wirusa albo antygen wirusa

Info

Publication number
PL214284B1
PL214284B1 PL374782A PL37478203A PL214284B1 PL 214284 B1 PL214284 B1 PL 214284B1 PL 374782 A PL374782 A PL 374782A PL 37478203 A PL37478203 A PL 37478203A PL 214284 B1 PL214284 B1 PL 214284B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
virus
cells
hydrolyzate
yeast
medium
Prior art date
Application number
PL374782A
Other languages
English (en)
Other versions
PL374782A1 (pl
Inventor
Manfred Reiter
Wolfgang Mundt
Leopold Grillberger
Barbara Kraus
Original Assignee
Baxter Healthcare Sa
Baxter International
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Healthcare Sa, Baxter International filed Critical Baxter Healthcare Sa
Publication of PL374782A1 publication Critical patent/PL374782A1/pl
Publication of PL214284B1 publication Critical patent/PL214284B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/005—Protein-free medium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/74—Undefined extracts from fungi, e.g. yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 374782 (22) Data zgłoszenia: 08.07.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
08.07.2003, PCT/EP03/007341 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
15.01.2004, WO04/005493 (11) 214284 (13) B1 (51) Int.Cl.
C12N 7/00 (2006.01) A61K 39/12 (2006.01) C12N 5/07 (2010.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 5/00 (2006.01)
Sposób wytwarzania wirusa oraz sposób wytwarzania immunogennej kompozycji zawierającej wirusa albo antygen wirusa (73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:
BAXTER INTERNATIONAL, INC., Deerfield, US BAXTER HEALTHCARE S.A., Wallisellen, CH
09.07.2002, US, 60/394,243 (43) Zgłoszenie ogłoszono:
31.10.2005 BUP 22/05 (72) Twórca(y) wynalazku:
MANFRED REITER, Wiedeń, AT WOLFGANG MUNDT, Wiedeń, AT LEOPOLD GRILLBERGER, Wiedeń, AT BARBARA KRAUS, Wiedeń, AT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.07.2013 WUP 07/13 (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Agnieszka Żebrowska-Kucharzyk
PL 214 284 B1
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania wirusa oraz sposobu wytwarzania immunogennej kompozycji zawierającej wirusa albo antygen wirusa z wykorzystaniem pożywki wolnej od białka zwierzęcego obejmującej kombinację hydrolizatu soi i hydrolizatu drożdży. Sposoby te umożliwiają prowadzenie hodowli bez obecności białka zwierzęcego. Te sposoby są użyteczne w hodowli komórek, takich jak komórki rekombinowane lub komórki zakażone wirusem i do wytwarzania produktów biologicznych w trakcie hodowli komórkowych.
Tło wynalazku f
Dla prowadzenia hodowli komórek, w szczególności komórek eukariotyczych, a bardziej konkretnie komórek ssaków, istnieje potrzeba stosowania specjalnych pożywek hodowlanych, które zapewniają substancje odżywcze i odżywcze substancje wzrostowe niezbędne dla wydajnego wzrostu komórek oraz do wytwarzania pożądanych białek lub wirusów. Pożywki do hodowli komórek uzupełnia się rozmaitymi dodatkami, włączając w to składniki niezdefiniowane, takie jak płodowa surowica cielęca (FCS), szereg białek pochodzenia zwierzęcego i/lub hydrolizaty pochodzenia bydlęcego.
Zasadniczo, surowica i substancje pochodzące z surowicy, takie jak albumina, transferyna lub insulina, mogą zawierać niepożądane czynniki, które mogą zanieczyszczać hodowle oraz otrzymywane z tych hodowli produkty biologiczne. Ponadto, dodatki ludzkiej surowicy muszą być każdorazowo poddawane badaniu pod kątem wszystkich znanych wirusów, włączając w to wirus zapalenia wątroby i HIV, które mogą być przenoszone przez surowicę. Surowica bydlęca i substancje z niej pochodzące, na przykład trypsyna, niosą ryzyko wystąpienia zanieczyszczenia BSE. Dodatkowo, wszystkie produkty pochodzące z surowicy mogą być zanieczyszczone nieznanymi czynnikami. W przypadku surowicy albo dodatków białkowych, które pochodzą od człowieka albo z innych źródeł zwierzęcych w hodowli komórkowej, istnieją liczne problemy (np. zróżnicowana jakość i skład różnych partii i ryzyko zanieczyszczenia mykoplazmą, wirusami lub BSE), szczególnie, jeżeli komórki są stosowane do wytwarzania czynników medycznych albo szczepionek do podawania ludziom.
Mając powyższe na uwadze dokładano licznych starań, aby dostarczyć wydajny system gospodarza i warunki hodowania, które nie wymagają obecności surowicy lub innych składników pochodzących z białek zwierzęcych. Prosta, wolna od surowicy pożywka zawiera zazwyczaj pożywkę podstawową, witaminy, aminokwasy, sole organiczne i nieorganiczne, lecz może zawierać również dodatkowe składniki do wytwarzania złożonej pożywki odżywczej. Takie pożywki są jednak niejednokrotnie odżywczo niewystarczające i muszą być uzupełniane różnymi dodatkami białkowymi pochodzenia zwierzęcego albo zrekombinowaną wersją białek stosowanych w hodowli komórkowej, takimi jak insulina, insulino-podobny czynnik wzrostu i inne czynniki wzrostu.
Dla uniknięcia stosowania zwierzęcych dodatków białkowych w pożywce hodowlanej wolnej od surowicy, podjęto kilka prób opracowania pożywek użytecznych do hodowli komórek, które są całkowicie wolne od białek.
Cinatl i wsp., Cell Biology International 17:885-895 (1993) ujawnili opracowanie pożywki (PFK-1) specyficznej dla ciągłego namnażania komórek VERO w hodowli powierzchniowej na poliwinyloformalu (PVF, od ang. polyvinyl formal).
W opisie WO 96/15231 ujawniono wolną od surowicy pożywkę składającą się z syntetycznej minimalnej niezbędnej pożywki i ekstraktu drożdży do hodowli komórek kręgowców i procesu wytwarzania wirusów.
Wytwarzanie pożywki składającej się z podstawowej pożywki do hodowli komórek zawierającej peptyd z ryżu i ekstrakt z drożdży albo produkt jego trawienia enzymatycznego i/lub lipid roślinny do hodowli komórek zwierzęcych opisano w publikacji WO 98/15614.
Pożywka zawierająca oczyszczony hydrolizat soi do hodowli komórek zrekombinowanych jest ujawniona w opisie WO 01/23527.
Publikacja WO 00/03000 opisuje pożywkę, która zawiera hydrolizat soi i ekstrakt drożdżowy, lecz wymaga dodatkowo obecności zrekombinowanych postaci białek zwierzęcych, takich jak czynniki wzrostu.
Dla zapewnienia wydajnego wytwarzania produktów biologicznych, takich jak wirusy lub zrekombinowane białka, ważne jest, żeby osiągnięta została optymalna gęstość hodowli w celu uzyskania maksymalnej wydajności produktu.
A zatem, wciąż istnieje w dziedzinie zapotrzebowanie na opracowanie sposobów hodowli zapewniających zwiększenie wzrostu, aktywności metabolicznej i gęstości komórek oraz na dostarczenia
PL 214 284 B1 optymalnej pożywki hodowlanej, wolnej od białek zwierzęcych, użytecznej do wytwarzania produktów biologicznych, takich jak te wykorzystywane w produkcji leków lub szczepionek do stosowania u ludzi. Ponadto, późniejsza obróbka, np. oczyszczanie pożądanego produktu z pożywki hodowlanej może być bardziej wydajne pod względem kosztów i czasu, jeżeli białka zwierzęce nie są obecne w pożywce. Dodatkowo, niepożądane immunogenne białka zwierzęce mogą wywoływać szkodliwe reakcje immunologiczne, których unika się przy wykonywaniu niniejszego wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wirusa, obejmujący:
dostarczanie hodowli komórek VERO, które były hodowane w wolnej od białka zwierzęcego pożywce obejmującej hydrolizat soi w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 0,3% (wag./obj.), zakażanie komórek wirusem, i inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa.
Korzystnie wirus jest wybrany z grupy obejmującej wirus grypy, wirus krowianki i ospy krowiej, wirus ospy drobiu, wirus ospy krów, wirus kleszczowego zapalenia mózgu (TBE, od ang. tick-borne encephalitis), wirus polio, wirus zapalenia wątroby A, wirus Ross River, wirus żółtej gorączki i pochodzące od niego wirusy chimerowe, wirus zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirus japońskiego zapalenia mózgu, wirus różyczki, wirus zapalenia wątroby C (HCV), wirus świnki, wirus odry, wirus oddechowy (RSV od ang. respiratory syncytial virus), wirus opryszczki pospolitej (HSV, od ang. herpes simplex virus), cytomegalowirus (CMV), wirus Epsteina-Barra (EBV), rotawirus, wirus pryszczycy (FMDV, od ang. foot and mouth disease virus).
Korzystnie, komórkami są komórki VERO, a wirus jest wybrany z grupy wirusa grypy, wirusa TBE, wirusa krowianki, wirusa polio, wirusa zapalenia wątroby A, wirusa Ross River, wirusa żółtej gorączki i pochodzących od niego wirusów chimerowych, wirusa zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa różyczki, HCV, wirusa świnki, wirusa odry, wirusa oddechowego, HSV, CMV, EBV, rotawirusa.
W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest poddawany oczyszczaniu, szczególnie korzystnie na drodze ultrafiltracji.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania kompozycji immunogennej zawierającej wirusa albo antygen wirusa obejmującego:
dostarczanie hodowli komórek VERO, które były hodowane w wolnej od białka zwierzęcego pożywce zawierającej hydrolizat soi i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 0,3% (wag./obj.), zakażanie komórek wirusem, inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa, zebranie wytworzonego wirusa albo antygenu wirusa, wytworzenie kompozycji immunogennej z zebranego wirusa albo antygenu wirusa.
Korzystnie, zebrany wirus albo antygen wirusa jest poddawany oczyszczaniu.
W korzystnej postaci sposób według wynalazku obejmuje: zakażanie komórek wirusem wybranym z grupy ortomiksowirusów, paramiksowirusów, reowirusów, pikornawirusów, flawiwirusów, arenawirusów, wirusów opryszczki, wirusów ospy, koronawirusów i adenowirusów, inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa, zebranie wytworzonego w ten sposób wirusa albo antygenu wirusa, i wytworzenie kompozycji immunogennej z zebranego wirusa albo antygenu wirusa.
W korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest poddawany oczyszczaniu, szczególnie korzystnie na drodze ultrafiltracji.
Te i inne aspekty niniejszego wynalazku będą oczywiste dla specjalisty w dziedzinie w świetle zamieszczonego poniżej opisu.
Termin „pożywka wolna od białka zwierzęcego” w jego różnych formach gramatycznych, dotyczy pożywki, która nie jest uzupełniona białkami i składnikami białkowymi z wyższych wielokomórkowych Eukaryota innych niż rośliny (tj. kręgowców), które posiadają struktury drugorzędowe, trzeciorzędowe i czwartorzędowe charakterystyczne dla białek występujących w naturze. Typowe białka, których obecności w pożywce unika się, to te znajdujące się w surowicy i substancjach pochodzących z surowicy, takich jak albumina, transferyna, insulina i inne czynniki wzrostu. Według wynalazku unika się również wersji białek zwierzęcych wytwarzanych przez rekombinowanie DNA, które mogą zawierać immunogenne składniki bakteryjne i nie są one obecne w pożywce wolnej od białka zwierzęcego według wynalazku. Zwierzęce białka i składniki białkowe odróżnia się od białek niezwierzęcych, małych
PL 214 284 B1 polipeptydów i oligopeptydów, które można otrzymać z roślin (zwykle o długości około 10-30 aminokwasów), takich jak soja, oraz niższych Eucaryota, takich jak drożdże. Oczywiście po doprowadzeniu do kontaktu albo zaszczepieniu pożywki komórkami, które mają być namnażane, pożywka będzie zawierała białka zwierzęce wydalane albo wydzielane przez te komórki, włączając w to dowolne zrekombinowane białka wyrażane przez zmodyfikowane genetycznie komórki, jeżeli takie komórki są hodowane. A zatem nie traktuje się terminu pożywka wolna od białka zwierzęcego oraz wytwarzanych przy jej użyciu materiałów i preparatów jako wymaganie nieobecności białek wydalanych albo wydzielanych przez komórki namnażanie w pożywce, a dotyczy on natomiast braku bezpośredniego uzupełnienia pożywki zwierzęcymi białkami i składnikami białkowymi otrzymanymi ze źródeł zwierzęcych lub temu podobnych wytwarzanych przez rekombinowanie DNA.
Termin „pożywka podstawowa”, w jego różnych formach gramatycznych, to pożywka syntetyczna, taka jak DMEM, HAM's F12, Medium 199 lub RPMI albo ich kombinacje oraz inne, które są znane z piśmiennictwa albo są dostępne handlowo. Według wynalazku, każda pożywka syntetyczna, która nie zawiera białek zwierzęcych może być zastosowana w połączeniu z hydrolizatem soi i w połączeniu z hydrolizatem drożdży. Pożywka podstawowa może zawierać wiele składników, włączając w to aminokwasy, witaminy, sole organiczne i nieorganiczne, źródła węglowodanu, gdzie każdy składnik jest obecny w ilości, która podtrzymuje hodowlę komórek in vitro. Przykładowo, jako pożywkę podstawową można użyć pożywki DMEM/HAM's F12 (1:1). Pożywka może zawierać dodatkowe substancje, takie jak substancje buforowe, jak biwęglan sodowy, stabilizatory utleniania, stabilizatory przeciwdziałające stresowi mechanicznemu albo inhibitory proteaz. Jeżeli trzeba, do pożywki można dodawać niejonowe środki powierzchniowo czynne (surfaktanty), takie jak glikol polipropylenowy, (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 lub PLURONIC F-108) jako czynniki przeciw pienieniu. Czynniki te stosuje się zwykle w celu ochrony komórek przed negatywnymi efektami napowietrzania, ponieważ bez dodawania środka powierzchniowo czynnego wznoszące się i rozrywające pęcherzyki powietrza mogą prowadzić do uszkodzenia tych komórek, które znajdują się na powierzchni tych pęcherzyków powietrza (ang. „sparging”). Korzystne jest, jeżeli ilość niejonowego środka powierzchniowo czynnego wynosi około 0,05 i około 10 g/l, typowo pomiędzy około 0,1 i około 5 g/l. Dodatkowo, pożywka może również zawierać cyklodekstrynę lub jej pochodne, typowo pomiędzy około 0,001 g/l i około 1 g/l.
Zgodnie z wynalazkiem pożywka zawiera hydrolizat soi i hydrolizat drożdży, które mogą być dodane do pożywki podstawowej. Termin „hydrolizat” obejmuje produkt trawienia enzymatycznego peptonu sojowego albo ekstraktu drożdżowego. Hydrolizat można otrzymać z rozmaitych preparatów, odpowiednio, peptonu sojowego albo ekstraktu drożdżowego, które mogą być dalej trawione enzymatycznie (na przykład przez papainę) i/lub wytwarzane przez autolizę, termolizę i/lub plazmolizę. Hydrolizaty można również nabyć na przykład jako Hy-Soy, Hy-Yeast 412 i Hi-Yeast 444, ze źródeł takich jak Quest International, Norwich, New York, OrganoTechnic, S.A. France, lub Deutsche Hefewerke GmbH, Germany. Źródła ekstraktów drożdżowych zostały ujawnione również w opisie WO 98/15614. Źródła ekstraktów drożdży i hydrolizatów soi są opisane także w publikacji WO 00/03000.
Korzystne jest, jeżeli hydrolizaty stosowane w pożywce według wynalazku są oczyszczone z surowej frakcji, ponieważ korzystne jest wyeliminowanie w trakcie oczyszczania zanieczyszczeń, które mogłyby przeszkadzać w wydajnej hodowli, co poprawia jakość hydrolizatu. Oczyszczania można dokonywać przez ultrafiltrację albo chromatografię na złożu Sephadex na przykład Sephadex G25 lub Sephadex G10 albo równoważnych materiałach, chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, sączenie molekularne albo chromatografię z „odwróconymi fazami”. Te procesy są znane w tej dziedzinie. Przy zastosowaniu tych sposobów można wybrać frakcje, które zawierają hydrolizat soi lub drożdży, o określonej masie cząsteczkowej, korzystnie <1000 Daltonów, korzystniej <500 Daltonów, jeszcze korzystniej <350 Daltonów. Korzystne jest, jeżeli co najmniej 90% hydrolizatu ma masę cząsteczkową <1000 Daltonów. Korzystne jest, jeżeli średnie masy cząsteczkowe hydrolizatów soi i drożdży wynoszą między około 220 i 375 Daltonów. Wartość pH hydrolizatu soi i hydrolizatu drożdży powinna być między około 6,5 i 7,5. Zawartość azotu powinna wynosić, odpowiednio, między około 8 i 11%, korzystnie między 9,0 i 10,0% a zawartość popiołu <18%. Korzystny hydrolizat charakteryzuje się taką właściwością, że ma zawartość wolnych aminokwasów pomiędzy 5 i 30%. Zawartość endotoksyny, jeśli w ogóle taka jest, powinna być <500 jedn./g.
Jedna z pożywek użytecznych w praktycznej realizacji wynalazku ma następujący skład: syntetyczna pożywka minimalna (pożywka DMEM/HAM's F12 (1:1) (1-25 g/l), hydrolizat soi (0,5-10 g/l)
PL 214 284 B1 i hydrolizat drożdży (0,5-3 g/l), L-glutamina (0,05-1 g/l), NaHCO3 (0,1-10 g/l). pH pożywki wynosi pH 6,8 i 7,6, korzystnie między pH 7,0 i 7,3.
Dla specjalisty w dziedzinie będzie oczywistym, że termin „około” w kontekście wartości liczbowych i zakresów dotyczy wartości lub zakresów, które dążą lub są zbliżone do przytoczonych wartości lub zakresów, tak, że wynalazek można wykonywać zgodnie z zamierzeniem, na przykład aby uzyskać pożądany stopień wzrostu, co jest oczywiste z zawartych tu wskazówek i ma zastosowanie do wszystkich wartości. A zatem termin ten obejmuje wartości poza nimi, będące wynikiem systematycznego błędu.
Twórcy niniejszego wynalazku niespodziewanie stwierdzili, że pożywka podstawowa wolna od białka zwierzęcego uzupełniona hydrolizatem drożdży i hydrolizatem soi jest bardziej korzystna dla tempa wzrostu komórek, komórkowej aktywności metabolicznej i ostatecznej gęstości komórek w porównaniu z pożywkami opisanymi uprzednio. Było to tym bardziej zadziwiające w świetle ujawnienia z WO 98/15614 pokazującego, że wyższe stężenia peptydu roślinnego są mniej optymalne. W pożywce wolnej od białka zwierzęcego według wynalazku zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi jak tu opisano, komórki wykazywały wyższe tempo wzrostu, większą ostateczną gęstość komórek w biomasie i zwiększoną aktywność metaboliczną (wyrażaną jako zużycie tlenu w % na min.) w porównaniu z pożywką zawierającą bądź sam hydrolizat soi bądź hydrolizat drożdży, nawet jeżeli końcowe stężenie hydrolizatu drożdży lub hydrolizat soi dodawanego osobno do pożywki było równoważne sumie stężenia łącznego hydrolizatu. Przykładowo, stężenie końcowe około 0,4% (wag./obj.) samego hydrolizatu drożdży w pożywce miało efekt hamujący na wzrost komórek i gęstość komórek. Pożywka zawierająca 0,4% (wag./obj.) lub wyższe hydrolizatu soi nie osiągała wyższej gęstości niż pożywka zawierająca 0,3% (wag./obj.). Jednakże pożywka zawierającą połączenie hydrolizatu soi i hydrolizatu drożdży w końcowym całkowitym stężeniu hydrolizatu 0,4% (wag./obj.) wykazywała znaczący wzrost w aktywności metabolicznej komórek, wzroście komórek i ostatecznej gęstości komórek.
Suma ilości hydrolizatu soi i hydrolizatu drożdży w pożywce powinna wynosić zgodnie z wynalazkiem pomiędzy około 0,2% (wag./obj.) i około 0,6% (wag./obj.) z wyższym stosunkiem hydrolizatu soi w pożywce w porównaniu z hydrolizatem drożdży. Optymalny stosunek pomiędzy hydrolizatem soi i hydrolizatem drożdży wynosi około 3:1 (soja/drożdże), odpowiednio.
Pożywka stosowana w sposobie według wynalazku, jak opisano niniejszym, może być przydatna do hodowania komórek. Termin „komórki” oznacza ogólne pojęcie i obejmuje hodowanie pojedynczych komórek, tkanek, narządów, komórek owadów, komórek ptaków, komórek ssaków, komórek naczelnych, ciągłych linii komórkowych, komórek macierzystych i/lub komórek zmodyfikowanych genetycznie, takich jak komórki zrekombinowane wyrażające heterologiczny polipeptyd albo białko. Zrekombinowane komórki obejmują na przykład komórki CHO lub komórki BHK wyrażające heterologiczne polipeptydy albo białka, takie jak czynnik wzrostu albo czynnik krwi. Komórki stosowane niejednokrotnie do hodowania wirusa obejmują komórki VERO i komórki CV-1.
Komórki ssaków przydatne do hodowania w pożywce do hodowli komórek określonej w niniejszym opisie obejmują te pochodzenia ludzkiego, które mogą być komórkami pierwotnymi pochodzącymi z próbki tkanki, szczepami komórek diploidalnych, komórkami stransformowanymi albo wyprowadzonymi liniami komórkowymi. Komórki ssaków mogą obejmować komórki ludzkie, a także inne niż ludzkie. Komórkami ssaków pochodzenia innego niż ludzkie mogą być komórki nerki małpy, komórki nerki wołu, komórki nerki psa, komórki nerki świni, komórki nerki myszy, komórki nerki szczura, komórki nerki owcy, komórki nerki chomika, komórki nerki chomika chińskiego i lub komórki zwierzęce pochodzące z dowolnej tkanki. Konkretnie, komórkami ssaków, które można hodować w takiej pożywce hodowlanej mogą być komórki BSC-1, komórki LLC-MK, komórki CV-1, komórki COS, komórki COS-1, komórki COS-3, komórki COS-7, komórki VERO, komórki MDBK, komórki MDCK, komórki CRFK, komórki RAF, komórki RK, komórki TCMK-1, komórki LLC-PK, komórki PK15, komórki LLC-RK, komórki MDOK, komórki BHK-21, komórki CHO, komórki 293, komórki NS-1 komórki MRC-5, komórki WI-38, komórki BHK, komórki 293 i komórki RK. Przykłady komórek zrekombinowanych obejmują komórki CHO wyrażające na przykład czynnik VIII, FII, FIX, FX, vWF, wszystkie dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie.
Terminy „komórki ciągłe” lub „ciągłe linie komórkowe” (CCL, od ang. continuous cell line), w ich różnych formach gramatycznych, oznaczają hodowane komórki, które mogą replikować się w nieskończoność i są zdolne do wzrostu w hodowli zawiesinowej lub hodowli na dużą skalę w bioreaktorze. Nieograniczony wzrost CCL umożliwia długotrwałą hodowlę z wystandaryzowanego substratu komórkowego i niższe koszty. Linie komórek ssaków można wybrać z grupy składającej się z komórek
PL 214 284 B1
CHO, komórek COS, komórek VERO, komórek LLC-MK2, komórek NS-1, komórek MDBK, komórek MDCK, komórek MRC-5, komórek WI-38, komórek BHK, komórek CV-1, komórek nerki szczura (RK) i innych linii komórkowych ujawnionych w Butler i wsp. BIOS Scientific Publisher str. 1-24 (1992), co jest tu włączone jako odniesienie. Korzystne jest, jeżeli CCL są przetestowane pod kątem nieobecności szkodliwych czynników, takich jak bakterie, grzyby, mykoplazma, pierwotniaki i wirusy.
Termin „hodowla komórek”, w jego różnych formach gramatycznych, dotyczy komórek hodowanych w zawiesinie, obrotowych butelkach, kolbach i temu podobnych. Terminem tym są również objęte podejścia realizowane na dużą skalę, takie jak bioreaktory, włączając w to hodowle komórek przylegających rosnących w postaci przyczepionej do mikronośników w fermentorach z mieszaniem. Ponadto, możliwe jest również nie tylko hodowanie komórek zależnych od powierzchni, ale również zastosowanie technik hodowli zawiesinowych z wykorzystaniem pożywki jak zdefiniowana w sposobie według wynalazku. Jeżeli komórki hoduje się na mikronośnikach, mikronośnik można wybrać z grupy mikronośników w oparciu o dekstran, kolagen, plastik, żelatynę i celulozę oraz inne, jak odpisano w Butler, Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3:283-303 (1988). Odpowiednie są nośniki porowate, takie jak np. Cytoline® lub Cytopore©, jak również nośniki w oparciu o dekstran, takie jak DEAE-dekstran (Cytodex 1®), dekstran powleczony czwartorzędową aminą (Cytodex 2®) lub nośniki w oparciu o żelatynę, takie jak dekstran powleczony żelatyną (Cytodex 3®). Nośniki te można otrzymać z Pharmacia.
Pożądane jest, jeżeli hodowla komórek od ampułki do biomasy przebiega w pożywce wolnej od białka zwierzęcego i utrzymuje się w warunkach pożywki do hodowli w czasie wzrostu komórek i procesie wytwarzania produktu. Zalecane jest użycie komórek, które już zostały przystosowane do pożywki. Stwierdzono, że przy użyciu takich wstępnie przystosowanych komórek można uzyskać nie tylko zwiększoną wydajność, ale ich stabilność w hodowli jest również wyraźnie zwiększona przez zastosowanie pożywki określonej w sposobie według wynalazku.
Termin „hodowanie”, w jego różnych formach gramatycznych, dotyczy utrzymywania komórek in vitro w warunkach umożliwiających wzrost i stałą żywotność. Komórki ssaków hoduje się typowo w inkubatorze do komórek w temperaturze około 37°C, przy czym pożywka hodowlana ma optymalne pH w zakresie około 6,8 do 7,6, korzystnie między 7,0 a 7,3. Komórki w hodowli stałej mogłyby mieć całkowitą wymianę pożywki, co około 2 do 3 dni albo mniej lub bardziej często, jeśli trzeba. Komórki w hodowli z przepływem (np. w bioreaktorach lub fermentorach) mogą mieć wymianę na świeżą pożywkę ma bazie ciągłego obiegu. Podejścia hodowlane mogą obejmować, w zależności od kontekstu i potrzeby, rozhodowywanie, pasażowanie i namnażanie komórek.
Wynalazek dostarcza, zatem sposobów hodowania komórek obejmujących etapy hodowania komórek w pożywce podstawowej zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Zgodnie z przedmiotem niniejszego wynalazku, komórki hoduje się zarówno małej skali jak i dużej skali biomasy w pożywce wolnej od białka zwierzęcego. Korzystne jest przeprowadzanie pasażowania i rozhodowywania komórek z wytworzeniem biomasy hodowlanej z wykorzystaniem proteazy pochodzenia niezwierzęcego, takiej jak Pronaza albo jej oczyszczona frakcja. Jedną z proteaz jest oczyszczona, trypsyno-podobna frakcja ze Streptomyces griseus (SGT), jak opisano w zgłoszeniu patentowym USA nr 10/006, 223, włączonym w całości do niniejszego opisu jako odnośnik literaturowy. W celu uniknięcia materiału pochodzenia zwierzęcego w czasie hodowli komórek, a w szczególności w czasie hodowania komórek przylegających, które rosną jako związane z nośnikiem, korzystne jest, jeżeli nośnikiem jest nośnik syntetyczny albo mikronośnik powleczony materiałem pochodzenia niezwierzęcego. Na przykład mikronośnik DEAE-dekstran lub dekstran powleczony czwartorzędową aminą.
Wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania pożywki do hodowli komórek wolnej od białka zwierzęcego, gdzie komórki hoduje się, rozhodowywuje i pasażuje w warunkach pozbawionych białek zwierzęcych. Sposób obejmuje etapy dostarczenia wolnej od białka zwierzęcego pożywki zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, hodowania komórek w takiej pożywce, pasażowania i rozhodowywania takich komórek rosnących w tej pożywce stosując proteazę pochodzenia niezwierzęcego dla uzyskania konfluentnej gęstości komórek i powtarzania etapów rozhodowywania i wzrostu komórek aż osiągnięta zostanie pożądana ostateczna biomasa hodowli komórek. Sposób obejmuje hodowlę komórek w pożywce wolnej od białka zwierzęcego, rozhodowywania i pasażowania komórek stosując proteazę pochodzenia niezwierzęcego, korzystnie oczyszczoną trypsyno-podobną frakcję ze
PL 214 284 B1
Streptomyces griseus (SGT). W trakcie hodowania komórek przylegających, które rosną jako związane z nośnikiem, korzystne jest, jeżeli nośnikiem jest nośnik syntetyczny albo mikronośnik powlekany materiałem pochodzenia niezwierzęcego. Przez połączenie tych etapów można uniknąć stosowania białek zwierzęcych.
Komórki odpowiednie do hodowli w pożywce wolnej od białka zwierzęcego użytecznej w sposobie wynalazku obejmują między innymi komórki BSC-1, komórki LLC-MK, komórki CV-1, komórki VERO, komórki MDBK, komórki MDCK, komórki CRFK, komórki RAF, komórki TCMK-1, komórki LLC-PK, komórki PK15, komórki LLC-RK, komórki MDOK, komórki RK, komórki BHK-21, komórki WI- 38, komórki 293 i komórki MRC-5, lecz nie są do nich ograniczone. Te komórki mogą być zakażone wirusami, takimi jak ortomiksowirus, paramiksowirus, reowirus, pikornawirus, flawiwirus, arenawirus, wirus opryszczki, wirus ospy, koronawirus, adenowirus i innymi wirusami znanymi specjaliście w dziedzinie. Konkretnie, wirusem stosowanym do zakażania hodowli komórek może być wirus grypy, wirus krowianki i ospy krowiej, wirus ospy drobiu, wirus ospy krów, wirus kleszczowego zapalenia mózgu (TBE, od ang. tick-borne encephalitis), wirus polio, wirus zapalenia wątroby A, wirus Ross River, wirus żółtej gorączki i pochodzące od niego wirusy chimerowe, wirus zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirus japońskiego zapalenia mózgu, wirus różyczki, wirus zapalenia wątroby C (HCV), wirus świnki, wirus odry, wirus oddechowy (RSV od ang. respiratory syncytial virus), wirus opryszczki pospolitej (HSV, od ang. herpes simplex virus), cytomegalowirus (CMV), wirus Epsteina-Barra (EBV), rotawirus, wirus pryszczycy (FMDV, od ang. foot and mouth disease virus). Jest w zakresie wiedzy specjalisty dziedzinie wybór wirusa i komórek, na których wirusa można namnażać. Komórki można hodować w pożywce i prowadzić hodowlę do osiągnięcia optymalnej gęstości przed zakażeniem odpowiednim wirusem. Ku zaskoczeniu, hodowla komórek prowadzona i namnażana w pożywce do hodowli komórek wolnej od białka zwierzęcego według wynalazku wykazuje znaczący wzrost wydajności wytwarzania wirusa. Przykłady różnych wirusów namnażanych na komórkach hodowanych i utrzymywanych na pożywce pokazały 2 do 5-krotny wzrost uzysku wirusa w porównaniu z pożywką zawierającą jedynie ekstrakt drożdżowy. Sprawia to, że taki system hodowli jest bardziej korzystny dla sposobów hodowli komórek i wytwarzania wirusa niż sposoby znane i opisane uprzednio w stanie techniki.
W korzystnym wykonania wynalazku, komórkami są komórki VERO, a wirus jest wybrany z grupy wybranej spośród wirusa grypy, wirusa TBE, wirusa krowianki, wirusa polio, wirusa zapalenia wątroby A, wirusa Ross River, wirusa żółtej gorączki i pochodzących od niego wirusów chimerowych, wirusa zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa różyczki, HCV, wirusa świnki, wirusa odry, wirusa oddechowego, HSV, CMV, EBV, rotawirusa. Można również stosować inne wirusy, o których wiadomo, że rosną na komórkach VERO.
Wynalazek dostarcza również sposobu użytecznego do wytwarzania wirusa krowianki poprzez dostarczenie hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek wirusem krowianki i inkubowanie hodowli komórek w celu namnożenia wirusa krowianki. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Według tego aspektu wynalazku komórkami mogą być komórki VERO, komórki CV-1, komórki RK, komórki BHK-21, komórki MRC-5 lub dowolna komórka, na której wirus krowianki może rosnąć. Wirusem krowianki może być naturalnie występujący wirus krowianki, szczepionkowy wirus ospy, wirulentne wirusy krowianki, atenuowane wirusy krowianki i zrekombinowane wirusy krowianki.
Dzięki sposobowi według wynalazku można otrzymywać ortomiksowirus dzięki dostarczeniu hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek ortomiksowirusem i inkubowanie hodowli komórek w celu namnożenia ortomiksowirusa. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Komórkami mogą być komórki BSC-1, komórki CV-1, komórki VERO, komórki MDBK, komórki MDCK komórki MDOK, komórki BHK-21, komórki WI-38, komórki MRC-5 lub dowolna komórka, na której ortomiksowirus może być namnażany. Ortomiksowirusem może być wirus grypy, takiej jak grypa typu A, B i C.
Sposobem według wynalazku można także otrzymać wirusa Ross River poprzez dostarczenie hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek wirusem Ross River i inkubowanie hodowli komórek w celu namnożenia wirusa Ross River. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce
PL 214 284 B1 zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Komórkami mogą być komórki BSC-1, komórki CV-1, komórki VERO, komórki MDBK, komórki MDCK, komórki CRFK, komórki BHK-21, komórki WI-38, komórki MRC-5 lub dowolna komórka, na której wirus Ross River może być namnażany.
Podobnie, sposobem według wynalazku można również wytwarzać flawiwirusa poprzez dostarczenie hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek flawiwirusem i inkubowanie hodowli komórek w celu namnożenia flawiwirusa. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Flawiwirusem może być wirus żółtej gorączki albo rekombinanty jego chimerowych pochodnych, wirus japońskiego zapalenia mózgu, wirus kleszczowego zapalenia mózgu, wirus zapalenia mózgu zachodniego Nilu i wirus zapalenia wątroby C. Zidentyfikowane tu typy komórek można zastosować do namnażania flawiwirusa.
Sposób według wynalazku jest również użyteczny do wytwarzania pikornawirusa przez dostarczenie hodowli komórek hodowanych i utrzymywanych w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej hydrolizat drożdży i hydrolizat soi, zakażanie takich komórek pikornawirusem i inkubowanie hodowli komórek w celu namnożenia pikornawirusa. Korzystne jest hodowanie komórek w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od około 0,05% (wag./obj.) do około 0,3% (wag./obj.). Pikornawirusem może być wirus polio i wirus zapalenia wątroby A. Zidentyfikowane niniejszym typy komórek można zastosować do namnażania pikornawirusa.
Wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania kompozycji immunogennych zawierających wirusa albo antygen wirusa obejmujących etapy dostarczenia hodowli komórek zwierzęcych, gdzie komórki są wybrane z grupy składającej się z komórek nerki małpy, komórek nerki wołu, komórek nerki psa, komórek nerki świni, komórek nerki myszy, komórek nerki szczura, komórek nerki owcy, komórek nerki królika, komórek nerki chomika i komórek ludzkich, które były hodowane w pożywce według wynalazku, zakażania komórek wirusem wybranym z grupy składającej się z ortomiksowirusów, paramiksowirusów, reowirusów, pikornawirusów, flawiwirusów, arenawirusów, wirusów herpes, wirusów ospy, koronawirusów i adenowirusów, inkubowania hodowli komórek w celu namnożenia wirusa, zebrania wytworzonego wirusa i wytworzenia kompozycji immunogennej z zebranego wirusa. Wytworzony i zebrany wirus może być oczyszczany przy zastosowaniu metody znanej w tej dziedzinie, takiej jak wymiana jonowa albo sączenie molekularne.
Opisany niniejszym wynalazek będzie lepiej zrozumiały dzięki odniesieniu do następujących, nieograniczających jego zakresu przykładów, które zamieszczono w niniejszym opisie jedynie w celach ilustracji wynalazku.
Przykłady
P r z y k ł a d 1
Wytwarzanie pożywki hodowlanej
Pożywkę wolną od białka zwierzęcego wytwarza się z pożywki podstawowej DMEM/HAM's F12 (1:1), która jest uzupełniona solami nieorganicznymi, aminokwasami, witaminami i innymi składnikami. Dodawane są również biwęglan sodowy (1-3 g/l), L-glutamina (0,1 do 1 g/l) i różne stężenia hydrolizatu sol (Quest Technologies, New York) lub hydrolizatu drożdży (Deutsche Hefewerke, Germany) albo ich kombinacja.
P r z y k ł a d 2
Wytwarzanie komórek w pożywce wolnej od białka zwierzęcego
Komórki VERO w pożywce wolnej od białka zwierzęcego
Jako linię komórkową zastosowano komórki VERO (Zielona małpa afrykańska, Cercopthecus aethiops, nerka). Komórki otrzymano z kolekcji American Type Cell Culture Collection, Rockville, Maryland jako pasaż numer 124 oznaczony jako ATCC CCL 81. Komórki hodowano w różnych pożywkach jak tu opisano.
Komórki z roboczego banku komórek namnażano w kolbach T oraz obrotowych butelkach i systemem mikronośnika przy stosunku rozsiewania 1:6-1:8. Komórki hodowano w 37°C przez 6-8 dni. Utrzymywano stałe warunki hodowli: nasycenie tlenu 20% +/- 10% i pH 7,1 +/- 0,35. Na zakończenie wytwarzania biomasy, kiedy komórki osiągnęły wzrost konfluentny, ustalano gęstość komórek i zużycie tlenu.
PL 214 284 B1
Liczbę komórek w biomasie hodowli komórkowej na zakończenie wytwarzania biomasy ustalono bądź przez trypsynizację komórek i liczenie przy zastosowaniu licznika komórek CASY® (metoda A), jak opisano w Scharfe i wsp. Biotechnologie in LaborPraxis 10:1096-1103 1988) albo przez traktowanie kwasem cytrynowym i fioletem krystalicznym, a następnie liczenie w hemocytometrze (metoda B), jak opisano w Sanford i wsp., J. Nat'I Cancer Inst. 11:773-795 (1951).
Komórki VERO namnażano i hodowano w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej hydrolizat drożdży w stężeniu 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3% lub 0,4%, 0,5% (wag./obj.) albo hydrolizat soi w stężeniu 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3% albo 0,4%, 0,5% (wag./obj.) albo hydrolizat soi i hydrolizat drożdży w stężeniu drożdże do soi (drożdże/soja) 0,05%/0,05% (wag./obj.), 0,1%/0,2% (wag./obj.), 0,1%/0,3% (wag./obj.), 0,2%/0,2% (wag./obj.), 0,3%/0,2% (wag./obj.) lub 0,2%/1,0% (wag./obj.). Gęstość komórek w hodowli komórkowej na zakończenie wytwarzania biomasy w pożywce wolnej od białka zwierzęcego zawierającej różne stężenia hydrolizatu soi, hydrolizatu drożdży lub ich kombinacji obliczano przy zastosowaniu metod A i B.
Wyniki pokazują, że sam hydrolizat drożdży i soi podtrzymywał wzrost komórek. W stężeniu 5
0,1% hydrolizatu drożdży osiągano gęstość komórek około 11,8 x 105 komórek/ml, jednakże wzrastające stężenie hydrolizatu drożdży do wyższego niż 0,3% (wag./obj.) miało negatywny wpływ na wzrost komórek i w konsekwencji na gęstość komórek. Stężenia samego hydrolizatu soi między 0,1% (wag./obj.) a 0,2% (wag./obj.) wykazywały mniejszy wzrost komórek i gęstość komórek, niż stężenia soi 0,3% (wag./obj.) i 0,4% (wag./obj.). Jednakże gęstość komórek i zużycie tlenu komórek hodowanych w pożywce zawierającej 0,3% (wag./obj.) lub 0,4% (wag./obj.) hydrolizatu soi nie różniły się znacząco i wyższe stężenia do około 1% wag./obj. hydrolizatu soi nie miały dodatniego wpływu na wzrost komórek. Optymalne stężenie samego hydrolizatu soi ustalono jako pomiędzy 0,2% wag./obj. do 1,0% wag./obj. Przez uzupełnienie pożywki podstawowej kombinacją hydrolizatu soi i hydrolizatu drożdży osiągnięta końcowa gęstość komórek była znacząco zwiększona w porównaniu z pożywką zawierającą sam hydrolizat soi lub hydrolizat drożdży. Osiągnięta gęstość komórek przy stężeniu 0,05% 5 (wag./obj.) soi i 0,05% (wag./obj.) drożdży wynosiła około 12,1 x 105 komórek/ml i miała wyższą gęstość komórek w hodowli komórkowej w porównaniu do komórek hodowanych w pożywce zawierają5 cej jedynie bądź 0,1% (wag./obj.) hydrolizatu soi (10 x 105 komórek/ml), bądź 0,1% (wag./obj.) hydroli5 zatu drożdży (11,8 x 105 komórek/ml). Gęstość komórek w hodowli komórkowej w porównaniu do komórek hodowanych w pożywce zawierającej drożdże w stężeniu 0,2% (wag./obj.) i soję w stężeniu 1,0% (wag./obj.) była podobna do gęstości otrzymanej w pożywce zawierającej 0,05% (wag./obj.) soi
0,05% drożdży (wag./obj.).
Najbardziej znaczący wpływ na wzrost komórek miała pożywka, w której stężenie hydrolizatu soi w porównaniu z hydrolizatem drożdży było około 2-3 razy wyższe. Komórki hodowane w pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu około 0,3% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu około 5
0,1% (wag./obj.) osiągały gęstość komórek około 21,0 x 105 komórek/ml i wykazywały zatem około razy wyższą gęstość komórek w porównaniu do komórek hodowanych w jedynie na hydrolizacie soi w stężeniu około 0,4% (wag./obj.) i około 2,5 razy wyższą gęstość komórek w porównaniu do komórek hodowanych w jedynie na hydrolizacie drożdży w stężeniu około 0,4% (wag./obj.). Aktywność metaboliczna komórek hodowanych w pożywce zawierającej hydrolizat drożdży i soi była również wyższa w porównaniu do komórek hodowanych w pożywce zawierającej jedynie hydrolizat drożdży lub soi. Tempo zużycia tlenu wynosiło 1,5 (% na min.) w pożywce zawierającej 0,1% (wag./obj.) hydrolizatu drożdży i mniej niż 1,0 (% na min.) w pożywce zawierającej 0,4% (wag./obj.) samego hydrolizatu drożdży lub hydrolizatu soi. W pożywce zawierającej 0,1% (wag./obj.) hydrolizatu drożdży i 0,3% (wag./obj.) hydrolizatu soi zużycie tlenu wynosiło około 2,9 (% na min.), czyli było około 2 razy wyższe niż komórek hodowanych w pożywce zawierającej jedynie hydrolizat soi lub drożdży.
Dodatkowo cykl komórkowy, który wynosi 7 dni w pożywce wolnej od białka zwierzęcego uzupełnionej samym hydrolizatem drożdży lub soi, jest zmniejszony do 6 dni w pożywce z kombinacją hydrolizatów (soi i drożdży).
P r z y k ł a d 3
Namnażanie komórek zrekombinowanych
Hodowlę komórkową zrekombinowanych komórek ssaków, takich jak komórki rFVIII-CHO, hoduje się w 10 I tanku z mieszaniem i przepływem. Pożywkę zgodną z przykładem 1 stosuje się jako pożywkę do hodowli i wzrostu. Komórki są unieruchamiane na porowatym mikronośniku (Cytopore®, Pharmacia) i hodowane, przez co najmniej 6 tygodni. Tempo przepływu wynosi 4 zmiany objętości na
PL 214 284 B1 dzień, pH wynosi 6,9 do 7,2, stężenie O2 wynosi około 20-50%, a temperatura to 37°C. Określa się gęstość komórek.
P r z y k ł a d 4
Porównanie wytwarzania antygenu wirusa na komórkach VERO hodowanych w pożywce uzupełnionej hydrolizatem drożdży i hydrolizatem soi.
a. Wytwarzanie biomasy hodowli komórkowej
Komórki VERO o określonej liczbie pasaży rozmrożono z ciekłego azotu i pasażowano w kolbie Roux i butelkach obrotowych w celu wytworzenia dostatecznej liczby komórek do zaszczepienia 1,5 litrowego bioreaktora. Komórki hodowano bądź w pożywce podstawowej uzupełnionej albo hydrolizatem drożdży albo kombinacją hydrolizatu drożdży i soi, jak opisano w Przykładach 1 i 2. Po osiągnięciu konfluencji z końcową gęstością komórek 1,5 x 106 komórek/ml, komórki uwalniano z mikronośnika przy użyciu oczyszczonej frakcji Pronazy, trypsyny S. griseus (SGT), jak opisano w zgłoszeniu patentowym USA nr 10/006223 i przenoszono do 10-litrowego bioreaktora. To z kolei zastosowano jako inokulum 100-litrowego bioreaktora mającego stężenie mikronośnika 3,0 g/l. Rozpoczynając od ampułki z roboczego banku zawierającej 107 komórek, potrzeba około 30 generacji dla osiągnięcia ostatecznej konfluentnej biomasy komórek VERO w ostatnim fermentorze. Komórki hodowano w 37°C. W czasie namnażania wirusa utrzymywano stałe warunki hodowli: nasycenie tlenu 20% +/- 10% i pH 7,1 +/- 0,35.
Komórki z roboczego komórkowego banku komórek VERO namnażano w kolbach T i butelkach obrotowych przy stosunku rozsiewania 1:6. Dalsze namnażanie komórek przeprowadzano w 1,5, 10 i 50 I fermentorze z mieszaniem jako bioreaktor, stosując mikronośnik Cytodex1® jako substrat do przylegania. Komórki hodowano w 37°C. W czasie namnażania wirusa utrzymywano stałe warunki hodowli: nasycenie tlenu 20% +/- 10% i pH 7,1 +/- 0,35.
b. Namnażanie wirusa grypy
Komórki VERO zakażano dwoma różnymi szczepami grypy, Nowa Kaledonia A/H1N1 i Panama A/H3N2 i namnażano w odpowiedniej pożywce. Na zakończenie procesu namnażania wirusa, sklarowany supernatant zawierający wirusa oczyszczano przez ultrawirowanie. Uzysk z hodowli komórek VERO jedynie z hydrolizatem drożdży albo z hydrolizatem drożdży i hydrolizatem soi porównywano na podstawie objętościowej produktywności antygenu (całkowity SRD, pojedyncza promieniowa immunodyfuzja), a zawartością antygenu w supernatancie na zakończenie procesu (antygen oczyszczony w gradiencie gęstości). Wydajności dla obydwu składów pożywek porównywano i zebrano w Tabeli 1.
T a b e l a 1.
Porównanie wydajności produktu przy wytwarzaniu wirusa grypy z VERO dla różnego składu pożywki
SRD (pg/mi) Białko (pg/mi) SRD/Białko Dawka/Litr (na szczep)
Szczep Nowa Kaledonia A/H1N1
1 g/l hydrolizatu drożdży + 3 g/l hydrolizatu soi 130 341 0,38 146
1 g/l hydrolizatu drożdży 51 147 0,35 57
Szczep Panama A/H3N2
1 g/l hydrolizatu drożdży + 3 g/l hydrolizatu soi 130 233 0,56 103
1 g/l hydrolizatu drożdży 44 117 0,38 35
Połączenie hydrolizatu drożdży i hydrolizatu soi wykazuje znaczące polepszenie w stosunku do samego hydrolizatu drożdży.
c. Wytwarzanie wirusa ospy
Komórki VERO zakażano szczepem do wytwarzania szczepionki przeciw ospie (Dryvax, Wyeth Vaccines, otrzymany z Acam-bis, Inc., szczepionkowy szczep z limfy cielęcej zaadaptowany do wzrostu w ciągłej linii komórkowej) przystosowany do komórek VERO wolnych od białka zwierzęcego przez serię pasaży przy wielokrotności namnażania (m.o.i., od ang. multiplicity of infection) 0,1-0,3. Po czasie inkubacji 2-4 dni w 37°C komórki zbierano i z komórek odzyskiwano wirusa.
Tabela 2 pokazuje wyniki uzysku wirusa otrzymanego z komórek hodowanych w pożywce podstawowej uzupełnionej samym hydrolizatem drożdży albo hydrolizatem drożdży i soi.
PL 214 284 B1
T a b e l a 2:
Określenie miana wirusa krowianki na zakończenie cyklu wytwarzania w systemie bioreaktora.
Uzupełnienie pożywki m.o.i Końcowe miano (pfu) Pfu/komórkę
1 g/l hydrolizatu drożdży 0,1 - 0,3 1,42 x 107/ml 14
1 g/l hydrolizatu drożdży + 3 g/l hydrolizatu soi 0,1 - 0,3 16,00 x 107/ml 69
Połączenie hydrolizatu drożdży i hydrolizatu soi wykazuje znaczące polepszenie w stosunku do samego hydrolizatu drożdży.
d. Wytwarzanie wirusa Ross River
Hodowlę komórek VERO, otrzymaną jak opisano, zakażano wirusem Ross River przy wielokrotności namnażania (m.o.i) 0,1-0,3. Po czasie inkubacji 2-4 dni w 37°C komórki zbierano i z komórek odzyskiwano wirusa. Tabela 3 pokazuje wyniki uzysku wirusa otrzymanego z komórek hodowanych w pożywce podstawowej uzupełnionej samym hydrolizatem drożdży albo hydrolizatem drożdży i soi.
T a b e l a 3:
Określenie miana wirusa Ross River na zakończenie cyklu wytwarzania w systemie bioreaktora.
Uzupełnienie pożywki Końcowe miano (pfu/ml) Względna wydajność (%)
1 g/l hydrolizatu drożdży 1,5 x 107 100
1 g/l hydrolizatu drożdży + 3 g/l hydrolizatu soi 2,5 x 107 167
Połączenie hydrolizatu drożdży i hydrolizatu soi wykazuje znaczące polepszenie w stosunku do samego hydrolizatu.
Jest zrozumiałe, że opis, konkretne przykłady i dane, jakkolwiek wskazują na przykładowe wykonania, są podane w celu ilustracji i nie jest ich zamiarem ograniczanie wynalazku. Rozmaite zmiany i modyfikacje w obrębie niniejszego wynalazku staną się oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie z dyskusji, ujawnienia i zawartych tu danych, a zatem są uważane za część wynalazku.

Claims (10)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania wirusa, znamienny tym, że obejmuje:
    dostarczanie hodowli komórek VERO, które były hodowane w wolnej od białka zwierzęcego pożywce obejmującej hydrolizat soi w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 0,3% (wag./obj.), zakażanie komórek wirusem, i inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa.
  2. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że wirus jest wybrany z grupy wirus grypy, wirus krowianki i ospy krowiej, wirus ospy drobiu, wirus ospy krów, wirus kleszczowego zapalenia mózgu (TBE, od ang. tick-borne encephalitis), wirus polio, wirus zapalenia wątroby A, wirus Ross River, wirus żółtej gorączki i pochodzące od niego wirusy chimerowe, wirus zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirus japońskiego zapalenia mózgu, wirus różyczki, wirus zapalenia wątroby C (HCV), wirus świnki, wirus odry, wirus oddechowy (RSV od ang. respiratory syncytial virus), wirus opryszczki pospolite] (HSV, od ang. herpes simplex virus), cytomegalowirus (CMV), wirus Epsteina-Barra (EBV), rotawirus, wirus pryszczycy (FMDV, od ang. foot and mouth disease virus).
  3. 3. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że komórkami są komórki VERO, a wirus jest wybrany z grupy wirusa grypy, wirusa TBE, wirusa krowianki, wirusa polio, wirusa zapalenia wątroby A, wirusa Ross River, wirusa żółtej gorączki i pochodzących od niego wirusów chimerowych, wirusa zapalenia mózgu zachodniego Nilu, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa różyczki, HCV, wirusa świnki, wirusa odry, wirusa oddechowego, HSV, CMV, EBV, rotawirusa.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest poddawany oczyszczaniu.
  5. 5. Sposób według zastrzeżenia 4, znamienny tym, że hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest poddawany ultrafiltracji.
    PL 214 284 B1
  6. 6. Sposób wytwarzania kompozycji immunogennej zawierającej wirusa albo antygen wirusa, znamienny tym, że obejmuje:
    dostarczanie hodowli komórek VERO, które były hodowane w wolnej od białka zwierzęcego pożywce zawierającej hydrolizat soi w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 1% (wag./obj.) i hydrolizat drożdży w stężeniu od 0,05% (wag./obj.) do 0,3% (wag./obj.), zakażanie komórek wirusem, inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa, zebranie wytworzonego wirusa albo antygenu wirusa, wytworzenie kompozycji immunogennej z zebranego wirusa albo antygenu wirusa.
  7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że zebrany wirus albo antygen wirusa jest poddawany oczyszczaniu.
  8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że obejmuje: zakażanie komórek wirusem wybranym z grupy ortomiksowirusów, paramiksowirusów, reowirusów, pikornawirusów, flawiwirusów, arenawirusów, wirusów opryszczki, wirusów ospy, koronawirusów i adenowirusów, inkubowanie zakażonych komórek w celu namnożenia wirusa, zebranie wytworzonego w ten sposób wirusa albo antygenu wirusa, i wytworzenie kompozycji immunogennej z zebranego wirusa albo antygenu wirusa.
  9. 9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest poddawany oczyszczaniu.
  10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że hydrolizat soi i hydrolizat drożdży jest poddawany ultrafiltracji.
PL374782A 2002-07-09 2003-07-08 Sposób wytwarzania wirusa oraz sposób wytwarzania immunogennej kompozycji zawierajacej wirusa albo antygen wirusa PL214284B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39424302P 2002-07-09 2002-07-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL374782A1 PL374782A1 (pl) 2005-10-31
PL214284B1 true PL214284B1 (pl) 2013-07-31

Family

ID=30115698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL374782A PL214284B1 (pl) 2002-07-09 2003-07-08 Sposób wytwarzania wirusa oraz sposób wytwarzania immunogennej kompozycji zawierajacej wirusa albo antygen wirusa

Country Status (14)

Country Link
US (3) US7955833B2 (pl)
EP (2) EP1520008B1 (pl)
JP (5) JP2005532057A (pl)
CN (2) CN100591759C (pl)
AU (1) AU2003249990B2 (pl)
CA (1) CA2491992A1 (pl)
DK (2) DK1520008T3 (pl)
ES (2) ES2394085T3 (pl)
MX (1) MXPA05000418A (pl)
NZ (1) NZ538094A (pl)
PL (1) PL214284B1 (pl)
PT (2) PT1520008E (pl)
SI (1) SI1520008T1 (pl)
WO (1) WO2004005493A1 (pl)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
US7425437B2 (en) * 1999-11-26 2008-09-16 Crucell Holland B.V. Vaccines against West Nile Virus
FR2836924B1 (fr) * 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
JP2005532057A (ja) 2002-07-09 2005-10-27 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 細胞を培養するための動物性タンパク質非含有培地
PL1720979T3 (pl) * 2004-03-01 2008-03-31 Ares Trading Sa Zastosowanie podłoża pozbawionego surowicy do hodowli komórkowej do wytwarzania IL-18BP w komórkach ssaków
EP1739167B1 (en) * 2004-04-19 2015-08-12 DENKA SEIKEN Co., Ltd. Method of producing virus
PL2236155T3 (pl) * 2004-09-09 2012-10-31 Novartis Ag Zmniejszenie potencjalnego zagrożenia jatrogennego związanego ze szczepionkami przeciwko grypie
AU2011221414B2 (en) * 2004-10-29 2012-09-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Animal Protein-Free Media for Cultivation of Cells
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
KR100679112B1 (ko) 2004-11-17 2007-02-07 삼성정밀화학 주식회사 동물세포 배양방법
CN103555670B (zh) * 2004-12-23 2015-08-12 米迪缪尼有限公司 用于病毒增殖的非致瘤性mdck细胞系
CA2601006C (en) * 2005-03-10 2012-10-23 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell strain capable of being cultured without ingredients derived from animals, method of producing the same, method of producing virus using the same, and method of producing vaccine
FR2884255B1 (fr) 2005-04-11 2010-11-05 Vivalis Utilisation de lignees de cellules souches aviaires ebx pour la production de vaccin contre la grippe
BRPI0607540B1 (pt) * 2005-04-13 2017-05-09 Merial Ltd ensaio para a produção de circovírus porcino
US8052974B2 (en) 2005-05-12 2011-11-08 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
JP2007000077A (ja) * 2005-06-23 2007-01-11 Hitachi Medical Corp 付着性動物細胞の無血清培養方法及び付着性動物細胞の無血清培養用培地
CA2633306A1 (en) 2006-01-04 2007-07-12 Baxter International Inc. Oligopeptide-free cell culture media
JP2009532352A (ja) 2006-03-31 2009-09-10 ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション ワクチンのための高力価組み換えインフルエンザ・ウィルス
EP2017333B1 (en) * 2006-04-28 2011-10-12 Kyoritsu Seiyaku Corporation Feline cell capable of being cultured without animal protein, and method for production of virus and method for production of vaccine using the feline cell
EA018030B1 (ru) * 2006-06-06 2013-05-30 Круселл Холланд Б.В. Связывающие молекулы человека, имеющие убивающую активность против стафилококков, и их применения
MX2009001477A (es) * 2006-08-09 2009-02-18 Vivalis Metodo de produccion de un aviar transgenico utilizando celulas progenitoras embrionicas.
EP2069480B1 (en) * 2006-09-15 2014-03-19 MedImmune, LLC Mdck cell lines supporting viral growth to high titers and bioreactor process using the same
TW200902708A (en) 2007-04-23 2009-01-16 Wyeth Corp Methods of protein production using anti-senescence compounds
EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2008-10-29 Vivalis Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines
EP1995309A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
US9474798B2 (en) 2007-06-18 2016-10-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines
ES2657055T3 (es) * 2007-08-09 2018-03-01 Wyeth Llc Uso de perfusión para mejorar la producción de un cultivo de células alimentado por lotes en biorreactores
AU2008345231B2 (en) * 2007-12-27 2014-09-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cell culture processes
US20090181423A1 (en) * 2007-12-31 2009-07-16 Baxter International Inc. Substantially animal protein-free recombinant furin and methods for producing same
KR101220239B1 (ko) * 2008-04-01 2013-01-09 바이오스펙트럼 주식회사 식물성 펩톤을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물
TW201012930A (en) 2008-06-16 2010-04-01 Intervet Int Bv Method of replicating viruses in suspension
BRPI0919252A2 (pt) * 2008-09-24 2015-08-11 Medimmune Llc Métodos para cultivar células, propagação e purificação de vírus
CA2769003C (en) * 2009-07-23 2018-10-16 Xcellerex, Inc. Drain down and re-feed of microcarrier bioreactor
ES2813347T3 (es) 2009-10-26 2021-03-23 Wisconsin Alumni Res Found Virus recombinantes de la influenza de alto título con replicación mejorada en células Vero
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
CN101988047B (zh) * 2010-05-13 2013-07-03 维亚生物科技(上海)有限公司 一种低成本的昆虫细胞无血清培养基
ES2655051T3 (es) 2011-08-26 2018-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Virus de la gripe con segmento génico PB2 mutante como vacunas vivas atenuadas
CN102533634A (zh) * 2012-02-22 2012-07-04 江阴剑桥生物技术有限公司 Cho细胞无血清无蛋白化学培养基
AU2014290203B2 (en) 2013-07-15 2020-12-24 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in MDCK or vero cells or eggs
GB201321679D0 (en) * 2013-12-09 2014-01-22 Vibralogics Gmbh Method of culturing vero cells
WO2015101510A1 (en) 2013-12-30 2015-07-09 Baxter Healthcare Sa A method of predicting a performance characteristic of a plant or yeast hydrolysate and its use
CN106687575B (zh) 2014-06-04 2021-04-30 美国安进公司 用于收获哺乳动物细胞培养物的方法
US10053671B2 (en) 2014-06-20 2018-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
CN105385661B (zh) * 2014-09-03 2019-02-05 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法及其应用
US10633422B2 (en) 2015-06-01 2020-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA
WO2017007839A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Improved influenza virus replication for vaccine development
CN105154389A (zh) * 2015-10-15 2015-12-16 南京三生生物技术有限公司 一种适于pk-15细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法
AU2017221444B2 (en) 2016-02-19 2021-07-29 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Improved influenza B virus replication for vaccine development
EP3372671B1 (en) * 2017-03-09 2021-11-03 Evonik Operations GmbH Culture medium comprising olgopeptides
CN107043740A (zh) * 2017-05-10 2017-08-15 浙江美保龙生物技术有限公司 一种mdbk细胞培养液及其制备方法、使用方法
US11197926B2 (en) 2017-10-25 2021-12-14 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
US12343390B2 (en) 2018-08-07 2025-07-01 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant biologically contained filovirus vaccine
US11389523B2 (en) 2018-08-20 2022-07-19 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vectors for eliciting immune responses to non-dominant epitopes in the hemagglutinin (HA) protein
IL282899B2 (en) 2018-11-15 2025-12-01 Aleph Farms Ltd High quality cultured meat, compounds and methods for producing same
CN113330111A (zh) * 2018-11-21 2021-08-31 西方溶瘤细胞有限公司 病毒的制造
BR112021014116A2 (pt) * 2019-01-17 2021-09-21 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Meio sem soro para produção de vacinas aviárias e seus usos
EP3914295A2 (en) 2019-01-23 2021-12-01 Yoshihiro Kawaoka Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
WO2020153619A1 (ko) * 2019-01-25 2020-07-30 바이로큐어 주식회사 Bhk-21 세포를 이용한 바이러스 생산방법
CN113874496A (zh) 2019-02-08 2021-12-31 威斯康星校友研究基金会(Warf) 人源化细胞系
WO2020223699A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Improved influenza virus replication for vaccine development
JP7627911B2 (ja) 2019-08-27 2025-02-07 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション 卵内複製のための安定化されたｈａを持つ組換えインフルエンザウイルス
KR102817858B1 (ko) 2019-12-24 2025-06-10 주식회사 엘지화학 베로 세포 배양용 저혈청 배지 조성물 및 이의 이용
EP4084629A4 (en) 2019-12-31 2023-12-27 Air Protein, Inc. HIGH PROTEIN FOOD COMPOSITIONS
MX2022009132A (es) * 2020-01-24 2022-08-22 Air Protein Inc Hidrolizados de proteina derivados de microorganismos, y metodos de preparacion y uso de los mismos.
WO2021150874A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized na
WO2021195410A1 (en) 2020-03-25 2021-09-30 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant multivalent influenza viruses
WO2022103252A1 (en) * 2020-11-12 2022-05-19 Imu Education Sdn Bhd Culture medium for bacteria
KR102581772B1 (ko) * 2021-03-30 2023-09-22 강원대학교 산학협력단 식물 및 곤충 단백질 가수 분해물을 이용한 배양육 제조를 위한 최적 배양 방법 및 그 응용
WO2023235132A1 (en) * 2022-06-03 2023-12-07 Bluerock Therapeutics Lp Cell delivery vehicle and methods of using the same
CN120359291A (zh) * 2024-05-27 2025-07-22 安琪酵母股份有限公司 一种以蛋白水解物为核心原料的干细胞培养基制备及其应用方法
CN119162122B (zh) * 2024-09-14 2025-10-03 江苏华诺泰生物医药科技有限公司 一种流感病毒维持液配方及其制备方法和应用
CN120738314A (zh) * 2025-09-08 2025-10-03 安琪酵母股份有限公司 一种无动物源复合蛋白水解物及其制备方法

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT165999B (de) 1947-06-26 1950-05-25 Delle Atel Const Electr Einirchtung zum Schutz von Drehstrommotoren gegen Überstrom
FR2196386A1 (en) 1972-08-17 1974-03-15 Cudennec Alain Culture media selection - for identification of unknown bacteria
US4500513A (en) * 1979-05-15 1985-02-19 Miles Laboratories, Inc. Influenza vaccine production in liquid cell culture
US4282315A (en) * 1979-09-13 1981-08-04 Corning Glass Works Preparation of enriched whole virus radioligand
US4443540A (en) * 1980-05-09 1984-04-17 University Of Illinois Foundation Protein hydrolysis
DK207980A (da) * 1980-05-13 1981-11-14 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et skumnings- eller emulgeringsmiddel paa sojaproteinbasis
DE3122669A1 (de) * 1980-06-12 1982-02-11 Asta-Werke Ag, Chemische Fabrik, 4800 Bielefeld "verfahren zur herstellung von neuen mutanten von herpes simplex-viren typ 1 und typ 2"
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
CH652378A5 (de) 1983-12-21 1985-11-15 Heinrich Nagel Ag Wislikofen Einrichtung zum absaugen und zerkleinern von in einem gasfoermigen medium foerderbarem material.
FI86885C (fi) 1984-04-20 1992-10-26 Genentech Inc Foerfarande foer framstaellning av human rekombinantfaktor viii och nukleinsyrasekvenser och vektorer anvaend daertill
ATE89314T1 (de) 1985-02-13 1993-05-15 Scios Nova Inc Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.
US4978616A (en) * 1985-02-28 1990-12-18 Verax Corporation Fluidized cell cultivation process
JP2520681B2 (ja) 1986-08-04 1996-07-31 ザ ユニバーシティ オブ ニュー サウス ウェールズ 生合成のヒトの成長ホルモン製品
US4710282A (en) 1986-08-08 1987-12-01 Maryan Chak Device for siliverizing running water
JPH03500529A (ja) * 1987-06-18 1991-02-07 モナシュ ユニバーシティ 増殖因子
FI890889A7 (fi) 1987-06-30 1989-02-24 Amgen Inc Kallikreinin tuottaminen
JP2507882B2 (ja) 1988-02-17 1996-06-19 工業技術院長 外部増殖因子非依存性増殖良好細胞株の製造法
JPH01211878A (ja) 1988-02-19 1989-08-25 Fujitsu Ltd Ｉ／ｏピンの修復方法
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5573937A (en) * 1989-12-07 1996-11-12 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Serum free culture medium
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
CA2074363C (en) 1990-01-22 2004-11-09 David Thomas Vistica Co2-independent growth medium for maintenance and propagation of cells
JP2844484B2 (ja) 1990-02-22 1999-01-06 味の素株式会社 組換え蛋白質の生産方法
JP2859679B2 (ja) 1990-03-01 1999-02-17 協和醗酵工業株式会社 新規細胞株
US5378612A (en) * 1990-05-11 1995-01-03 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Culture medium for production of recombinant protein
JP2696001B2 (ja) 1991-04-15 1998-01-14 財団法人化学及血清療法研究所 組換え蛋白質産生用培地
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
JPH04228066A (ja) 1990-10-23 1992-08-18 Rikagaku Kenkyusho 外来遺伝子発現用培養細胞
US5213795A (en) * 1990-10-24 1993-05-25 Oxford Encephalomyocarditis virus vaccine
EP0531562A1 (de) * 1991-09-11 1993-03-17 Doerr, Hans-Wilhelm, Prof. Dr. med. Kultivierung von Säugetierzellen
JPH05123178A (ja) 1991-11-01 1993-05-21 Ajinomoto Co Inc Ｌ−フエニルアラニンの製造法
JP3511399B2 (ja) * 1993-03-31 2004-03-29 株式会社三菱化学ヤトロン 細胞培養基材及び細胞培養方法
AU7895898A (en) 1993-04-26 1998-10-08 Hans Wolf Mammal cell lines and method of obtaining glycoproteins
DE4313620A1 (de) 1993-04-26 1994-10-27 Biotechnolog Forschung Gmbh Hamsterzellinien und Verfahren zur Glykoproteingewinnung
US5405637A (en) 1993-06-30 1995-04-11 Bristol-Myers Squibb Company Milk protein partial hydrolysate and infant formula containing same
JP4098372B2 (ja) 1993-07-28 2008-06-11 三菱化学株式会社 ヘパリン結合性増殖因子の生産方法
JP2766165B2 (ja) 1993-08-02 1998-06-18 株式会社バイオポリマー・リサーチ バクテリアセルロースの製造方法
US5833162A (en) * 1993-12-22 1998-11-10 Daewoo Electronics Co., Ltd. Reel table driving device for a video cassette recorder
US5719050A (en) * 1993-12-24 1998-02-17 Eiken Chemical Co., Ltd. Animal cell culturing media containing N-acetyl-L-glutamic acid
EP0666312A1 (en) 1994-02-08 1995-08-09 Wolfgang A. Renner Process for the improvement of mammalian cell growth
US5789247A (en) * 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
WO1996007730A2 (de) 1994-09-09 1996-03-14 Renner Wolfgang A Chemisches verfahren zur förderung der proliferation von tierischen zellen
EP0791055B1 (en) * 1994-11-10 2012-01-25 Baxter Healthcare S.A. Method for producing biologicals in protein-free culture
US5753489A (en) * 1994-11-10 1998-05-19 Immuno Ag Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
JP3244391B2 (ja) 1994-12-08 2002-01-07 財団法人国際超電導産業技術研究センター 複合基板及びそれを用いた単結晶基板の製造方法
AU4302796A (en) 1994-12-16 1996-07-03 Novartis Ag Production of recombinant secretory component
AU703484B2 (en) 1995-02-23 1999-03-25 Quest International Services B.V. Peptides for tissue and cell culture media
US5741705A (en) * 1995-02-23 1998-04-21 Quest International Flavors & Food Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. Method for in vitro cell growth of eucaryotic cells using low molecular weight peptides
WO1996040866A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novartis Ag Serum-free media for primitive hematopoietic cells and methods of use thereof
WO1996040886A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Thomas Jefferson University Anti-fungal agents and methods of identifying and using the same
AUPN442295A0 (en) 1995-07-26 1995-08-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulated autocrine growth of mammalian cells
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
WO1998008934A1 (en) * 1996-08-30 1998-03-05 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
EP1983044B1 (en) 1996-10-10 2016-08-10 Life Technologies Corporation Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
PT1849860E (pt) 1997-05-28 2011-02-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Processo de preparação de um factor imunogénico de corynebacterium diphtheriae utilizando um meio de cultura com extracto de levedura como fonte de aminoácidos e sem complexos proteicos de origem animal
US6475725B1 (en) * 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
TR200000175T2 (tr) 1997-07-23 2001-01-22 Roche Diagnostics Gmbh Endogenik gen aktivasyonu ile eritropoietinin hazırlanması.
JPH11211488A (ja) 1998-01-21 1999-08-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 携帯情報端末を用いたデータ転送システム
FR2775983B1 (fr) * 1998-03-13 2000-11-10 Pasteur Merieux Serums Vacc Milieu et procede de propagation et de multiplication virales
WO1999057246A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising non-animal or plant-derived nutrients
US6406909B1 (en) * 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
AT409379B (de) * 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
AU780810B2 (en) 1999-08-05 2005-04-21 Baxalta GmbH Recombinant stable cell clone, its production and use thereof
ATE342962T1 (de) 1999-08-25 2006-11-15 Immunex Corp Zusammensetzungen und verfahren für verbesserte zellkultur
US7425437B2 (en) * 1999-11-26 2008-09-16 Crucell Holland B.V. Vaccines against West Nile Virus
JP2001211878A (ja) * 2000-02-04 2001-08-07 National Federation Of Dairy Cooperative Associations ヨーグルトスターター乳酸菌の高濃度培養方法、及び得られた高濃度培養液を用いたヨーグルトの製造方法
KR20030061810A (ko) 2000-09-25 2003-07-22 폴리문 사이언티픽 임무노이비오로기쉐 포르슝 게엠베하 생균 백신과 제조 방법
EP1208966A1 (en) 2000-11-27 2002-05-29 Cheng-Kun Liao Manufacturing process of patio tabletop glass with broken protection
JP2005532057A (ja) 2002-07-09 2005-10-27 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 細胞を培養するための動物性タンパク質非含有培地
JP4316484B2 (ja) 2004-12-10 2009-08-19 シャープ株式会社 画像形成装置、トナー濃度制御方法、トナー濃度制御プログラムおよびその記録媒体

Also Published As

Publication number Publication date
NZ538094A (en) 2007-01-26
AU2003249990A1 (en) 2004-01-23
US20040077086A1 (en) 2004-04-22
EP1520008B1 (en) 2012-09-05
EP2287288B1 (en) 2012-11-07
EP1520008A1 (en) 2005-04-06
JP6084359B2 (ja) 2017-02-22
WO2004005493A1 (en) 2004-01-15
JP2013172741A (ja) 2013-09-05
PT2287288E (pt) 2012-12-10
US20130316434A1 (en) 2013-11-28
CA2491992A1 (en) 2004-01-15
US9163211B2 (en) 2015-10-20
EP2287288A1 (en) 2011-02-23
CN101058800A (zh) 2007-10-24
ES2398706T3 (es) 2013-03-21
MXPA05000418A (es) 2005-03-23
JP2015083005A (ja) 2015-04-30
JP2005532057A (ja) 2005-10-27
CN101058800B (zh) 2013-03-13
AU2003249990B2 (en) 2007-06-28
DK1520008T3 (da) 2012-10-15
HK1083635A1 (zh) 2006-07-07
JP6178109B2 (ja) 2017-08-09
JP5485863B2 (ja) 2014-05-07
PT1520008E (pt) 2012-09-26
JP6244294B2 (ja) 2017-12-06
JP2011041580A (ja) 2011-03-03
JP2012034712A (ja) 2012-02-23
DK2287288T3 (da) 2013-01-07
SI1520008T1 (sl) 2012-12-31
CN100591759C (zh) 2010-02-24
PL374782A1 (pl) 2005-10-31
US20110217772A1 (en) 2011-09-08
CN1681917A (zh) 2005-10-12
US7955833B2 (en) 2011-06-07
US8524497B2 (en) 2013-09-03
ES2394085T3 (es) 2013-01-17
HK1108713A1 (en) 2008-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2398706T3 (es) Medio exento de proteínas animales para el cultivo de células
DK1974014T3 (en) OLIGOPEPTID-FREE CELL CULTURE MEDIA
ES2393317T5 (en) Animal protein-free media for cultivation of cells
HK1083635B (en) Animal protein free media for cultivation of cells
HK1108713B (en) Animal protein free media for cultivation of cells
AU2012238257A1 (en) Animal Protein-Free Media for Cultivation of Cells
HK1147110B (en) Animal protein-free media for cultivation of cells
HK1147284B (en) Animal protein-free media for cultivation of cells

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification