PT2236155E - Redução de riscos iatrogénicos potenciais associados às vacinas antigripais - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"REDUÇÃO DE RISCOS IATROGÉNICOS POTENCIAIS ASSOCIADOS ÀS VACINAS ANTIGRIPAIS"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção refere-se à produção e ao controlo de qualidade de vacinas contra o virus da gripe.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

Os virus da gripe para utilização na preparação de vacinas humanas foram desenvolvidos tradicionalmente em ovos de galinha embrionados, embora as técnicas mais modernas desenvolvam o virus em culturas celulares de mamífero, por exemplo, em células Vero, células MDCK ou células PER.C6. A mudança no substrato de crescimento do vírus proporcionou uma oportunidade para uma nova avaliação pela entidade reguladora da segurança da vacina antigripal. Por exemplo, a contaminação com ADN da célula hospedeira tem sido uma objecção da entidade reguladora nas vacinas obtidas a partir de células [1], mas não tem sido uma objecção no passado para as vacinas desenvolvidas em ovos.

Levandowski (Developments in Biological

Standardization, vol. 98, págs. 171-75, (1999)) expõe princípios de segurança relacionados com a produção da vacina antigripal em culturas de células (Vero, MDCK). Reconhece-se o problema de agentes acidentais replicantes em linhas celulares, mas não em ovos. Por isso, sugere-se rastrear as fontes originais do vírus da gripe, assim como as culturas celulares para pesquisar certos agentes virais.

Os princípios de segurança que rodeiam as vacinas antigripais obtidas a partir de ovos são, portanto, diferentes dos que rodeiam as vacinas desenvolvidas em culturas celulares, estando as vacinas obtidas a partir de células sob uma vigilância mais atenta. É um objecto da invenção abordar estes assuntos de segurança diferentes, e 2 em particular, o de proporcionar processos para aumentar a segurança do desenvolvimento de vacinas antigripais em culturas celulares.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Por definição, a utilização de substratos de células de mamífero para a produção da vacina antigripal implica a cultura celular em condições que sejam perfeitamente adequadas para o desenvolvimento e a replicação virai. 0 inventor compreendeu que estas condições aumentam o risco de desenvolvimento de agentes patogénicos diferentes do vírus da gripe na cultura celular, ocorrendo, com isso, a possível contaminação do produto de vacina final. Os ensaios de contaminação não são, em geral, difíceis de levar a cabo, mas um fabricante deve saber primeiro que tipo de ensaios tem que realizar. 0 inventor identificou riscos de contaminação específicos, e o seu trabalho indica que podem ser levados a cabo ensaios adequados durante o fabrico com a finalidade de garantir a segurança e qualidade das vacinas antigripais desenvolvidas em culturas celulares. Alguns dos contaminantes podem ser inócuos num produto de vacina final, mas a sua presença pode interferir com a propagação e purificação posterior do vírus da gripe, assim a sua eliminação é um assunto primordial para a qualidade e reprodutibilidade; outros contaminantes seriam prejudiciais numa vacina final, assim a sua eliminação é um assunto de segurança primordial. 0 risco de contaminação que surge da co-cultura virai não é sem precedentes (por exemplo, certos lotes das primeiras vacinas do vírus da pólio contaminaram-se com vírus de símio 40 ("SV40"), um vírus de polioma) , mas não existia nenhuma divulgação prévia sobre a identificação de riscos específicos associados à cultura celular para a produção da vacina antigripal humana. Os vírus da gripe desenvolvidos em culturas celulares têm um risco particular de contaminação uma vez que as estirpes usadas para a 3 produção da vacina mudam a cada ano e, em consequência, têm de ser estabelecidas novas culturas a cada ano. Esta mudança anual nos materiais de produção significa que a cada novo ano existe um novo risco de contaminação, particularmente porque durante a preparação de vírus semeados pelos fabricantes são realizadas múltiplas passagens, aumentando assim o risco de desenvolvimento paralelo de agentes patogénicos acidentais. 0 inventor identificou agentes infecciosos que podem ser desenvolvidos nas condições usadas para o desenvolvimento do virus da gripe em culturas celulares, mas que não se desenvolvem em ovos de galinha. Estes agentes infecciosos representam um novo risco de contaminação para as vacinas antigripais que nunca foram um problema para as vacinas antigripais tradicionais. Portanto, a invenção proporciona um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do vírus da gripe que se desenvolve numa cultura de uma linha de células de mamífero, que compreende uma etapa na qual se ensaia a vacina e/ou a cultura para determinar a presença de um agente infeccioso que pode ser desenvolvido na dita linha de células, mas que não se desenvolve em ovos de galinha embrionados, em que o dito agente infeccioso é seleccionado a partir do grupo que consiste em: Pneumovirinae; Reoviridae de mamíferos; Birnaviridae; Rubulavírus da família Paramyxoviridae; Coronaviridae; Rhinovírus da família Picornaviridae; vírus de Varicella Zoster; vírus de polioma BK, vírus de polioma JC; vírus ECHO; vírus Coxsackie dos Enterovírus da família Picornaviridae; Rotavírus; Picornavírus porcino; Parvovírus; Circovírus e bactérias Chlamydia. 0 inventor identificou igualmente agentes infecciosos que se desenvolvem em alguns substratos de células usados para a produção de vacina antigripal, mas que não se desenvolvem em outros. De acordo com isso, estes agentes 4 infecciosos são um risco de contaminação unicamente para certas vacinas antigripais. A linha de células de mamífero

As vacinas antigripais da invenção se desenvolvem em linhas celulares de mamífero e não em ovos embrionados. As linhas celulares de mamífero típicas usadas na produção de produtos biológicos são: MDCK; CHO; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; etc. As linhas celulares de mamífero preferidas para o desenvolvimento do vírus da gripe são: células MD-CK [2-5], obtidas a partir de rim canino Madin Darby; células Vero [6-8], obtidas a partir do mono verde africano (Cercopithecus aethiops) ou células PER.C6 [9], obtidas a partir de retinoblastos embrionários humanos.

Estas linhas celulares estão amplamente disponíveis, por exemplo, na colecção do Colecção Americana de Culturas Celulares (ATCC) [10], ou no Coriell Cell Repositories [11]. Por exemplo, a ATCC fornece diversas células Vero diferentes com os números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 e CRL-1587 e fornece células MDCK com o número de catálogo CCL-34.

Além de ser útil para o material obtido do desenvolvimento em linhas celulares de mamífero, a invenção também pode ser ampliada ao material derivado do desenvolvimento em linhas celulares aviares [por exemplo, ref. 12 e 13], incluídas as linhas celulares derivadas de galinhas, por exemplo, fibroblastos de embrião de frango (CEF), etc.

Agentes infecciosos que não se desenvolvem em ovos de galinha embrionados O inventor identificou uma variedade de agentes patogénicos que podem ser desenvolvidos em linhas celulares de mamífero (em particular, tanto em células MDCK como em células Vero) usadas para a preparação do vírus da gripe para a produção de vacinas, mas que não se desenvolvem em ovos de galinha. O ensaio de contaminação para estes 5 agentes patogénicos não era necessário para as vacinas preparadas sobre o substrato de ovo tradicional, mas o inventor comprovou que o controlo de qualidade das vacinas deveria incluir ensaios para um ou mais destes agentes patogénicos com a finalidade de garantir o cumprimento das normas de segurança mais exigentes. Os agentes patogénicos são os seguintes:

Pneumovirinae, tais como os do género Pneumovírus, incluindo o vírus sincicial respiratório (RSV).

Morbilivirus da família Paramyxoviridae, tal como o vírus do sarampo.

Enterovírus da família Picornaviridae, tal como o vírus Coxsackie, vírus ECHO e enterovírus, embora alguns vírus Coxsackie (por exemplo, B3, B4) tenha sido visto que não se desenvolvem em células MDCK.

Reoviridae de mamífero, em particular ortoreovírus (por exemplo, reovírus de mamífero) e rotavírus. Os reovírus podem mostrar desenvolvimento não limitado em células Vero e MDCK, e em consequência, o ensaio dos mesmos é de particular importância. Os rotavírus partilham os requisitos de protease dos vírus da gripe com a finalidade de ser desenvolvida em culturas celulares e este paralelismo poderia ocorrer de maneira inconsciente à activação de rotavírus contaminantes.

Nos casos em que estes agentes patogénicos tenham estirpes diferentes com hospedeiros diferentes (por exemplo, RSV humano e RSV bovino), o ensaio incluirá tipicamente a estirpe ou as estirpes de interesse que possam infectar a humanos. 0 ensaio para estes agentes é particularmente importante para estirpes virais obtidas a partir de técnicas genéticas inversas, já que os vírus semeados para o fabrico de vírus passarão por múltiplas passagens nas culturas de células de mamífero durante os processos de genética inversa, aumentando, com isso, o risco de 6 contaminação por agentes infecciosos acidentais.

Agentes infecciosos que não se desenvolvem em ovos, mas que se desenvolvem em diferentes linhas celulares de mamífero 0 inventor identificou uma variedade de agentes patogénicos que não se desenvolvem em ovos de galinha, que não se desenvolvem em células MDCK, mas que se desenvolvem em células Vero. 0 ensaio de contaminação por estes agentes patogénicos não era necessário para as vacinas preparadas no substrato de ovo tradicional e não é necessário para as vacinas preparadas em células MDCK, mas o inventor comprovou que o controlo de qualidade das vacinas desenvolvidas em células Vero deveria incluir ensaios para um ou mais destes agentes patogénicos com a finalidade de garantir as normas de segurança mais exigentes. Os agentes patogénicos são os seguintes:

Metapneumovírus, da família Paramyxoviridae, tal como metaneumovírus humano (HMPV).

Rubalavírus da família Paramyxoviridae, tal como vírus das paperas, o qual se desenvolve em células Vero.

Togaviridae, tal como Rubellavírus.

Coronaviridae, tal como o coronavírus SARS e outros coronavírus humanos. Estes vírus mostram altas taxas de desenvolvimento em células Vero, mostrando o vírus SARS desenvolvimento não limitado, e em consequência, o ensaio para estes é de particular importância.

Rhinovirus da família Picornaviridae, tais como as estirpes M de Rhinovirus. Vírus de varicella Zoster (VZV) , também conhecido como vírus 2 de herpes humano (HHV3) . 0 VZV pode mostrar desenvolvimento não limitado em células Vero e, em consequência, o seu ensaio é de particular importância.

Polyomaviridae, tais como o vírus de polioma SV-40, o vírus de polioma BK, e o vírus de polioma JC. Estes vírus de polioma podem mostrar desenvolvimento não limitado em células Vero (em particular, em células BK) e, em 7 consequência, o seu ensaio é de particular importância.

Circovirus porcino.

Picornavirus porcino, tais como o virus da doença vesicular porcina (SVDV) e o virus Teschen-Talfan.

Bactérias Chlamydia, incluindo C. trachomatis, C. pneumoniae e C. psittaci. Estas bactérias podem ser desenvolvidas em células Vero e, em consequência, o seu ensaio é de particular importância.

Parvovirus, tais como parvovirus canino (CPV) ou parvovirus porcino.

Nos casos em que estes agentes patogénicos têm estirpes diferentes com hospedeiros diferentes (por exemplo, RSV humano e RSV bovino), o ensaio incluirá tipicamente a estirpe ou as estirpes de interesse que possam infectar a humanos. 0 ensaio para virus não humanos (por exemplo, virus aviar e porcino) é particularmente importante unicamente quando os materiais aviários ou porcinos de interesse foram usados na preparação virai, por exemplo, se as estirpes foram inicialmente isoladas a partir de porcos ou aves, ou se foram usadas passagens de ovos durante o desenvolvimento inicial, ou se foi usada tripsina de porcino nas culturas celulares, etc. Métodos de ensaio

Os métodos para a detecção da presença de agentes patogénicos em culturas celulares e em produtos biofarmacêuticos estão disponíveis de maneira rotineira. Geralmente, os métodos baseiam-se na detecção imunoquímica (imunoensaio, Western blot, ELISA, etc.) e/ou a detecção de ácido nucleico (métodos de hibridação, tais como a Southern blot ou a Slot blots, PCR, etc.). Como uma alternativa, é possível ensaiar a presença de um agente patogénico por meio de inoculação convencional de culturas celulares (isto é, ensaio de se o material conduz à produção do agente patogénico contaminante quando se cultiva em condições adequadas).

Os métodos podem detectar um único agente patogénico (por exemplo, vírus) ou podem detectar múltiplos agentes patogénicos (por exemplo, vários vírus). Quando um ensaio detecta múltiplos agentes patogénicos (por exemplo, "X", "E" ou "Z"), nesse caso, pode dar um resultado específico (por exemplo, o vírus "E" está presente) ou pode dar um resultado geral (por exemplo, está presente um de "X", "E" ou "Z") . Os métodos podem ser quantitativos, semiquantitativos ou qualitativos. Podem ser usados métodos de detecção em tempo real. As directrizes gerais para a detecção de um agente patogénico (por exemplo, vírus) de interesse podem ser encontradas na referência 14. No seguinte parágrafo, são mostrados vários ensaios mais específicos, e o perito na especialidade poderá encontrar ou preparar facilmente um ensaio para a detecção da presença de qualquer agente patogénico escolhido. A referência 15 divulga um ensaio de PCR de transcrição inversa múltipla (RT-PCR), referido como "m-RT-PCR-ELISA", para a detecção de nove agentes patogénicos das vias respiratórias num único ensaio, especificamente: enterovírus, vírus da gripe tipo A e tipo B, vírus sincicial respiratório, vírus de parainfluenza tipo 1 e tipo 3, adenovírus, Mycoplasma pneumoniae e Chlamydia pneumoniae. Na referência 16 divulga-se um método RT-PCR para a detecção de reovírus de mamífero. A referência 17 divulga um ensaio RT-PCR em tempo real para a detecção do metapneumovírus humano procedente de todas as linhagens genéticas conhecidas. A referência 18 divulga um único ensaio RT-PCR para a detecção do vírus sincicial respiratório humano (HRSV), vírus de parainfluenza humano 1, 2, e 3 e da gripe A e B. A referência 19 divulga um ensaio RT-PCR múltiplo para detectar e diferenciar o vírus do sarampo, o vírus da rubéola e o parvovírus B19. Na referência 20 divulga-se um ensaio RT-PCR em tempo real 9 para detectar rinovírus humano com discriminação exacta de outros vírus procedentes da família Picornaviridae. A referência 21 divulga um ensaio RT-PCR múltipla com conjuntos de iniciador nested dirigidos a regiões conservadas da hemaglutinina do vírus parainfluenza humano, a proteína inoculada de coronavírus humano e os genes de poliproteína de enterovírus e rinovírus humanos, que permite a detecção e determinação do tipo de maneira rápida, sensível e simultânea dos quatro tipos de vírus parainfluenza (1, 2, 3, 4AB), o coronavírus humano 229E e OC43 e a detecção genérica de enterovírus e rinovírus. Na referência 22 divulga-se a detecção de SVDV por meio de RT-PCR. Na referência 23 divulga-se um ensaio RT-PCR quantitativo de uma única etapa para o coronavírus SARS. A referência 24 divulga um ensaio de PCR em tempo real de discriminação alélica TaqMan para o VZV. Na referência 25 divulga-se um ensaio de PCR múltipla para a detecção simultânea e rápida do vírus da pseudorrabia, o parvovírus e o circovírus. Na referência 26 divulga-se um ensaio de PCR de sonda FRET em tempo real para a detecção do vírus de polioma SV-40. Na referência 27 divulga-se um ensaio para a detecção e diferenciação simultânea do vírus de polioma humano JC e BK por meio de um método de PCR-ELAHA rápido e sensível. Na referência 28 divulga-se a detecção de circovírus porcino em linhas celulares humanas por meio de PCR e ensaios de imunofluorescência indirecta. Nas referências 29 e 30 divulgam-se métodos de PCR para a detecção de birnavírus. O método de detecção da invenção pode ser levado a cabo em qualquer fase ou fases durante o fabrico da vacina, a partir do vírus semeado e/ou o substrato de células e/ou o meio de cultura, por meio das fases de infecção virai e de desenvolvimento, por meio da recolecção de vírus, por meio de qualquer processamento virai (por exemplo, corte e/ou extracção da proteína de superfície), por meio da 10 formulação da vacina e, finalmente, a embalagem da vacina. Portanto, o ensaio usado de acordo com a invenção pode ser levado a cabo nos materiais usados para criar a cultura virai, na própria cultura virai e no material extraído e obtido a partir da cultura virai. O ensaio não necessita ser levado a cabo em todas e cada uma das vacinas ou culturas, mas pode ser usado a intervalos apropriados como parte do controlo de qualidade normal. É particularmente útil quando se muda a produção de vacina para as novas estirpes recomendadas a cada ano pelas autoridades sanitárias, em cuja fase se estabelecem novas culturas que devem ser submetidos a um novo controlo de qualidade. Os ensaios da invenção são levados a cabo de maneira vantajosa em vírus semeados usados para o fabrico de vacinas.

Nos métodos da invenção, as linhas celulares usadas para desenvolver vírus da gripe podem ser cultivados em qualquer meio adequado, por exemplo, em meios sem soro, em meios sem proteína, etc. Na referência 2 divulgam-se métodos para a cultura sem soro do vírus da gripe, e na referência 31 divulgam-se métodos para a cultura sem proteínas. Não obstante, um meio "sem proteína" pode incluir uma ou mais proteases (por exemplo , tripsina) que podem ser necessárias para a propagação do vírus da gripe. Um meio sem soro pode incluir suplementos de soro.

Também se prefere que a vacina tenha sido desenvolvida numa cultura sem a adição de material bovino, garantindo, desta forma, que a cultura esteja livre de qualquer contaminação possível de BSE e de vírus bovinos. Os meios que não incluem componentes associados a nenhuma encefalopatia espongiforme transmissível são os preferidos. A vacina antigripal A presente invenção refere-se ao controlo de qualidade de vacinas antigripais. A vacina pode estar na forma de um vírus vivo ou, preferivelmente, um vírus inactivado. Tipicamente, os vírus inactivados implicam o tratamento com 11 um produto químico, tal como formalina ou β-propiolactona. Quando se usa um vírus inactivado, a vacina pode ser um vírus completo, um vírus fraccionado ou subunidades virais. Os vírus fraccionados são obtidos por meio do tratamento de viriões com detergentes (por exemplo, éter etílico, polisorbato 80, desoxicolato, fosfato de tri-N-butilo, Triton X-100, Triton N101, brometo de cetiltrimetilamónio, etc.) para produzir preparações de subviriões. As vacinas de subunidades compreendem os antigénios de superfície da hemaglutinina e neuraminidase do vírus da gripe. Os antigénios do vírus da gripe podem estar presentes igualmente na forma de virossomas [32].

As vacinas antigripais da invenção podem estar baseadas em qualquer estirpe ou estirpes adequadas. Tipicamente, as vacinas incluem antigénios de pelo menos uma estirpe do vírus da gripe A e/ou pelo menos uma estirpe do vírus da gripe B. As estirpes recomendadas para vacinas mudam de uma temporada a outra. No período interpandémico actual, tipicamente, as vacinas incluem tipicamente duas estirpes do vírus da gripe A (H1N1 e H3N2) e uma estirpe do vírus da gripe B, e preferem-se as vacinas trivalentes. A invenção é também adequada para a preparação de vírus a partir de estirpes pandémicas, tais como as estirpes H5 ou H7, isto é, estirpes às quais a população humana não foi imunologicamente exposta. As vacinas em situações pandémicas podem ser monovalentes, ou podem estar baseadas numa vacina trivalente normal suplementada com uma estirpe pandémica. O vírus ou tipos do vírus da gripe usados nos métodos da invenção podem ser estirpes reordenadas, e/ou podem ter sido obtidos por meio de técnicas genéticas inversas. O vírus ou tipos de vírus podem estar atenuados. O vírus ou tipos de vírus podem ser sensíveis à temperatura. O vírus ou tipos de vírus podem estar adaptados ao frio.

Nos casos em que uma vacina inclui mais de uma estirpe 12 do vírus da gripe, tipicamente, as diferentes estirpes desenvolvem-se em separado e misturam-se após os vírus terem sido colhidos e os antigénios preparados. Portanto, os métodos da invenção podem incluir a etapa de mistura de antigénios procedentes de mais de uma estirpe do vírus da gripe. 0 ensaio para agentes patogénicos pode ser levado a cabo antes ou depois da dita mistura.

Tipicamente, a vacina será preparada para administração a um paciente por meio de injecção (por exemplo, injecção subcutânea ou injecção intramuscular), embora sejam conhecidas outras vias de administração para vacinas antigripais, por exemplo, intranasal [33-35], oral [36], intradérmica [37,38], transcutânea, transdérmica [39], etc.

As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar tanto a crianças como a adultos. As vacinas antigripais são recomendadas actualmente para utilização em imunização pediátrica e de adultos, a partir da idade de 6 meses. As exigências de segurança são mais elevadas para as vacinas pediátricas, particularmente devido a que os indivíduos imunologicamente não expostos recebem, tipicamente, duas doses de vacinas num curto período de tempo (por exemplo, com 1 a 2 meses de intervalo).

As vacinas da invenção podem incluir um adjuvante. Os adjuvantes que foram usados em vacinas antigripais incluem sais de alumínio [40,41], quitosano [42], oligodesoxinucleótidos CpG, tais como CpG 7909 [43], emulsões de óleo em água, tais como MF59 [44], emulsões de água em óleo [45], toxina termolábil de E. coli [34, 46] e os seus mutantes destoxifiçados [47-48], lípido monofosforilo A [49] e o seu derivado 3-o-desacetilado [50], mutantes de toxina pertussis [51], dipéptidos muramilo [52], etc. A hemaglutinina (HA) é o imunogénio principal nas 13 vacinas antigripais inactivadas e as doses de vacina estão normalizadas com referência às concentrações de HA, tipicamente medidas por meio de um ensaio de imunodifusão radial único (SRID). Tipicamente, as vacinas contêm aproximadamente 15 pg de HA por estirpe, embora também sejam usadas doses mais baixas, por exemplo, para crianças, ou em situações pandémicas. Foram usadas doses fraccionadas tais como 1/2 (isto é, 7,5 pg de HA por estirpe), 1/4 e 1/8 [40,53]. Portanto, as vacinas podem incluir entre 1 e 20 pg de HA por estirpe do vírus da gripe, preferivelmente, por exemplo, aproximadamente 15, aproximadamente 10, aproximadamente 7,5, aproximadamente 5, aproximadamente 3,8, aproximadamente 1,9, etc.

As vacinas podem incluir conservantes, tais como tiomersal ou 2-fenoxietanol. No entanto, prefere-se gue a vacina esteja substancialmente livre de especialidade mercurial (isto é, menos de 5 pg/ml), por exemplo, livre de tiomersal [54,55]. As vacinas que não contêm mercúrio são mais preferidas.

Preferivelmente, as vacinas da invenção contêm menos de 10 ng (preferivelmente menos de 1 ng e mais preferivelmente menos de 100 pg) de ADN da célula hospedeira residual por dose, embora podem estar presentes quantidades traços de ADN da célula hospedeira. O ADN contaminante pode ser eliminado durante a preparação da vacina usando métodos de purificação convencionais, por exemplo, cromatografia, etc. A eliminação do ADN da célula hospedeira residual pode ser aumentado por meio de tratamento com nuclease, por exemplo, por meio da utilização de Benzonase™ DNase [1] . As vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 15 pg de hemaglutinina são as preferidas, como as vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 0,25 ml de volume. As vacinas que contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de 14 ADN da célula hospedeira por 50 pg de hemaglut inina são mais preferidas, como as vacinas gue contêm <10 ng (por exemplo, <1 ng, <100 pg) de ADN da célula hospedeira por 0,5 ml de volume.

Estas diferentes caracteristicas das vacinas podem ser obtidas incluindo etapas adequadas nos métodos da invenção. Assim, as etapas especificas incluem: uma etapa de inactivação; uma etapa de mistura de três estirpes de virus para obter uma vacina trivalente; uma etapa de formulação da vacina para injecção; uma etapa de administração da vacina a um paciente; uma etapa de combinação da vacina com o adjuvante; uma etapa de medição do conteúdo de HA; uma etapa de ajuste do conteúdo de HA, por exemplo, por diluição; uma etapa de adição de um conservante; uma etapa de eliminação dos ácidos nucleicos da célula hospedeira residuais; etc.

Agentes acidentais preferidos para ensaio

As formas de realização preferidas da invenção implicam agentes acidentais, e particularmente vírus, que foram encontrados em amostras respiratórias, já que é mais provável que estejam presentes em isolados clínicos iniciais do virus da gripe. Os agentes patogénicos respiratórios incluem: RSV, PIV-3, coronavírus SARS, adenovirus, rinovírus, reovírus ("vírus órfão entérico respiratório"), etc. O vírus herpes simples pode ser encontrado também em amostras respiratórias.

Os agentes patogénicos particularmente preferidos para os quais se usa a invenção são: reovírus (particularmente reovírus de mamífero); vírus de polioma; birnavírus; circovírus e parvovírus. O ensaio do vírus herpes simples é também preferido.

Nos casos em que uma vacina tenha sido tratada com detergente (por exemplo, uma vacina fraccionada ou uma subunidade de vacina) , então esta etapa de tratamento oferece um grau de segurança extra, uma vez que pode também 15 destruir os vírus contaminantes. No entanto, se o contaminante não tiver envelope, então, o tratamento com detergente habitualmente não terá efeito sobre a vacina e, portanto, não melhora por si mesmo a segurança. Portanto, o ensaio para os agentes patogénicos seguintes é particularmente importante, já que não têm envelope: Picornaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Parvoviridae, Circoviridae, Adenoviridae, Polyomaviridae. A resistência a detergentes destes vírus combinada com o seu alto desenvolvimento em células Vero indica que é particularmente importante ensaiar os enterovírus humanos, os Reoviridae humanos, os Adenoviridae e os Polyomaviridae quando se usa um substrato de células Vero. Igualmente, os Reoviridae de mamíferos desenvolvem-se em altas taxas em células MDCK. Estes vírus estão igualmente entre os mais resistentes à inactivação. 0 ensaio para determinar a presença de Reoviridae de mamíferos é uma forma de realização preferida da invenção, dado que: (a) os vírus não se desenvolvem facilmente em ovos de galinha e, portanto, o ensaio dos mesmos não formou parte do fabrico do vírus da gripe tradicional; (b) os vírus podem mostrar desenvolvimento não limitado tanto em linhas celulares MDCK como Vero; (c) os vírus são altamente resistentes à inactivação e permanecem estáveis durante o processamento da vacina; (d) os vírus não têm envelope e, por isso, podem sobreviver ao tratamento com detergente do vírus da gripe e (e) os vírus estão implicados nas infecções respiratórias e, por isso, poderiam contaminar isolados virais iniciais. 0 ensaio de Reoviridae aviar é igualmente importante nos casos em que foram usados materiais aviares durante a preparação do vírus e os critérios (b) a (e) enumerados anteriormente aplicam-se igualmente a retrovírus aviares.

Generalidades 0 termo "compreende" abrange "inclui", assim como 16 "constituído", por exemplo, uma composição que "compreende" X pode estar constituída exclusivamente por X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + E. 0 termo "aproximadamente" em relação a um valor numérico x, significa, por exemplo, x±10%. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que está "substancialmente sem" E pode estar completamente livre de E. Em casos necessários, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

Nos capítulos 17 e 18 da referência 57 pode ser encontrada informação geral adicional sobre vacinas antigripais, incluindo estirpes, linhas celulares para desenvolvimento, doses, combinações, formulações, etc. No capítulo 46 da referência 14 podem ser encontrados pormenores adicionais sobre vírus da gripe, incluindo pormenores sobre o seu ciclo de vida durante o desenvolvimento virai.

MODOS PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO Células MDCK 0 inventor tem ampla experiência no desenvolvimento do vírus da gripe em células MDCK em cultura sem soro para a preparação de vacinas. 0 autor comprovou que as células são também hospedeiros adequados para outros agentes patogénicos e, portanto, ensaiou-se a capacidade de outros agentes patogénicos para serem desenvolvidos nas mesmas condições (especificamente, cultura de MDCK 33016, depositada como DSM ACC2219, em meio sem soro, tal como é divulgado na referência 2).

Quando se ensaia para determinar a replicação do vírus activo ou o desenvolvimento em células MDCK, os ensaios para os vírus sinciciais respiratórios RSV-A2 e RSV-B foram negativos. Detectaram-se estirpes de vírus parainfluenza PI-3 e SV-5. Os ensaios para coronavírus humano 229E e SARS foram negativos, assim como os ensaios para o vírus da 17 polio I, vírus ECHO 6, vírus coxsackie A16 e vírus coxsackie B3. Os ensaios de rinovírus Tipo Ib, 37 e NL.9501841 foram negativos. Os ensaios para reovírus Reo3 foram positivos, assim como os ensaios para o vírus do herpes simples HSV-1. Os ensaios para adenovírus humano 1, 5 e 6 foram negativos. Os ensaios para SV-40 foram negativos, e os títulos de inoculo mantiveram-se estáveis durante 14 dias. Os ensaios de parvovírus canino e de vírus diminuto do ratinho foram negativos, de maneira similar com o do vírus do sarcoma de Rous. O ensaio de Mycoplasma hyorhinis foi negativo. O ensaio de Chlamydia trachomatis foi negativo, embora não possa ser excluído um nível muito pequeno de desenvolvimento durante os dias 3-5 depois da infecção. A investigação adicional revelou que as células MDCK podem suportar o desenvolvimento do vírus da estomatite vesicular (Indiana), vírus vaccinia, vírus coxsackie B5, reovírus 2, adenovírus humano tipos 4 e 5, exantema vesicular de vírus porcino e vírus da hepatite canina infecciosa [58].

De entre os vírus que poderiam ser desenvolvidos em células MDCK, os vírus de parainfluenza, o vírus do herpes simples e os adenovírus podem ser desenvolvidos também em ovos de galinha embrionados. Pelo contrário, os reovírus humanos (e reovírus de outros mamíferos) não se desenvolvem facilmente em ovos. Se for usado MDCK como um sistema de cultura celular para a produção do vírus da gripe, então, o ensaio de controlo de qualidade deveria comprovar a contaminação por reovírus humano. O inventor estima que as concentrações de reovírus poderiam ser incrementadas em 5 log ou mais durante passagens repetidas em culturas de suspensão de MDCK, enquanto que as concentrações de um vírus, tal como o adenovírus diminuiriam em 6 a 10 log. As concentrações do vírus herpes simples deveriam igualmente ser comprovadas, já que é possível o desenvolvimento de HSV 18 em pelo menos 8 log. De maneira similar, observou-se o desenvolvimento de PIV-3 em 8 log depois de 1 semana de cultura. Células Vero Após os investigou-se trabalhos de ensaio em células MDCK, a replicação de agentes patogénicos em células Vero. As células Vero servem de suporte para o desenvolvimento de agentes patogénicos tais como: neumovirus, tais como RSV-A e RSV-B; metaneumovirus humano (HMPV); morbilivirus, tal como o vírus do sarampo; paramixovírus, tais como o vírus do sarampo e o vírus parainfluenza; vírus da rubéola; coronavírus humano e aviar; picornavírus, tais como enterovírus, vírus ECHO e vírus coxsackie e vírus SVDV e Teschen-Talfan porcinos; reovírus de mamífero e aviar; vírus do herpes, tais como HSV-1 e HSV-2; adenovírus de símio e humano; vírus zoster de varicela (VZV); vírus de polioma, tais como JC, BK e SV-40; birnavírus, tal como gumbovírus; circovírus porcino; parvovírus canino e Chlamydia.

De entre estes agentes patogénicos, os seguintes não se desenvolvem em ovos de galinha e, portanto, existem novos riscos de contaminação das vacinas antigripais quando se usam células Vero como substrato: RSV; HMPV; vírus do sarampo; vírus da rubéola; coronavírus humanos; enterovírus; reovírus; VZV; vírus de polioma; picornavírus porcinos; parvovírus e circovírus. Muitos destes agentes patogénicos não se desenvolvem em células MDCK, o que mostra que MDCK é um substrato mais seguro para a produção de vacina antigripal. Os vírus emergentes, tais como coronavírus SARS desenvolvem-se em células Vero, mas não em células MDCK. De maneira similar, VZV desenvolve-se em células Vero, mas não em ovos de galinha ou em células MDCK. A vacinação com uma vacina antigripal obtida a partir de células Vero que tenham sido contaminadas inadvertidamente com este coronavírus ou com VZV poderia 19 ocorrer a um surto iatrogénico de SARS e/ou varicela, o qual seria desastroso tanto para a população como para a reputação das vacinas. No entanto, uma vez identificados estes riscos podem ser estabelecidos os mecanismos de controlo de qualidade apropriados.

Além das células Vero, as células PER.C6 suportam o desenvolvimento de adenovirus [59,60] . Com base em caracteristicas virais conhecidas, pode ser esperado também que as células PER.C6 suportem o desenvolvimento de pelo menos virus de parainfluenza e de reovirus.

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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • NL 9501841 [0045] • US 5948410 A [0051] • WO 9737000 A [0051] • WO 03076601 A [0051] • WO 2005042728 A [0051] • WO 9615231 A [0051] • US 6372223 B [0051] • US 6534065 B [0051] • WO 9419013 A [0051] • EP 0721782 A [0051] • US 5292506 A [0051] • WO 0122992 A [0051] • WO 02097072 A [0051]

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Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do vírus da gripe que se desenvolve numa cultura de uma linha celular de mamífero, que compreende uma etapa na qual o vírus semeado e/ou a vacina e/ou a cultura é testada para determinar a presença de um agente infeccioso que pode ser desenvolvido na dita linha celular, mas que não se desenvolve em ovos de galinha embrionados, em que o agente infeccioso é seleccionado a partir do grupo que consiste em: Pneumovirinae; Reoviridae de mamíferos; Birnaviridae; Rubulavírus da família Paramyxoviridae; Coronaviridae; Rhinovírus da família Picornaviridae; vírus de Varicella Zoster; vírus de polioma BK, vírus de polioma JC; vírus ECHO; vírus Coxsackie dos Enterovírus da família Picornaviridae; Rotavírus; Picornavírus porcino; Parvovírus; Circovírus e bactérias Chlamydia.

2. Um processo para a preparação de uma vacina antigripal a partir do vírus da gripe que se desenvolve numa cultura de uma linha celular de mamífero, que compreende uma etapa na qual a vacina e/ou a cultura é tratada para eliminar e/ou inactivar um agente infeccioso que se pode desenvolver na linha celular, mas que não se desenvolve em ovos de galinha embrionados, em que o agente infeccioso é seleccionado a partir do grupo que consiste em: Pneumovirinae; Reoviridae de mamíferos; Birnaviridae; Rubulavírus da família Paramyxoviridae; Coronaviridae; Rhinovírus da família Picornaviridae; vírus de Varicella Zoster; vírus de polioma BK, vírus de polioma JC; vírus ECHO; vírus Coxsackie dos Enterovírus da família Picornaviridae; Rotavírus; Picornavírus porcino; Parvovírus; Circovírus e bactérias Chlamydia.

3. 0 processo da reivindicação 1 ou da reivindicação 1, 2 em que a linha celular de mamífero é uma linha celular MDCK, uma linha celular Vero ou uma linha celular PER.C6.

4. 0 processo da reivindicação 1, que compreende além disso uma ou mais das etapas seguintes: uma etapa de inactivação; uma etapa de mistura de três estirpes de vírus para obter uma vacina trivalente; uma etapa de formulação da vacina para injecção; uma etapa de combinação da vacina com um adjuvante; uma etapa de medição do conteúdo em HA; uma etapa de ajuste do conteúdo em HA, por exemplo, por diluição; uma etapa de adição de um conservante; uma etapa de eliminação dos ácidos nucleicos da célula hospedeira residuais.

5. 0 processo de qualquer das reivindicações anteriores, que compreende além disso uma etapa em que a vacina e/ou a cultura é testada para determinar a presença de um agente patogénico seleccionado do grupo que consiste em virus parainfluenza; Herpesviridae; Mycoplasma e circovirus aviário.

6. 0 processo da reivindicação 2, que compreende além disso outra etapa em que depois de dita eliminação e/ou inactivação, a vacina e/ou a cultura é testada para determinar a presença do dito agente infeccioso.

7. 0 processo de qualquer das reivindicações anteriores, em que a cultura é testada por meio de detecção imunoquimica e/ou detecção de ácidos nucleicos.

8. 0 processo da reivindicação 7, em que a detecção é por meio de ELISA e/ou PCR (incluindo a RT-PCR).