PT2179744E

PT2179744E - Redução de riscos iatrogénicos pontenciais associados às vacinas contra a gripe

Info

Publication number: PT2179744E
Application number: PT09075377T
Authority: PT
Inventors: Jens Peter Gregersen
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2004-09-09
Filing date: 2005-09-09
Publication date: 2011-03-09
Also published as: US20160251631A1; SI1789084T1; HRP20100673T1; EP1789084A1; SI2179744T1; JP2012025784A; CY1111180T1; PL2578229T3; PL2179744T3; EP2471551A2; US9358280B2; RS51665B; ATE488248T1; CA2579859C; EP2236155A1; WO2006027698A1; JP2013100358A; RS51721B; EP1789084B1; JP2011207911A

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "REDUÇÃO DE RISCOS IATROGÉNICOS PONTENCIAIS ASSOCIADOS ÀS VACINAS CONTRA A GRIPE"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção diz respeito à produção e controlo de qualidade de vacinas de vírus influenza.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os vírus influenza para uso na preparação de vacinas para seres humanos têm sido, tradicionalmente, postos as crescer em ovos de galinha embrionados, embora existam técnicas mais modernas de crescimento de vírus em culturas celulares de mamíferos por exemplo, em células Vero, células MDCK ou células PER.C6. A variação no substrato de crescimento dos vírus tem fornecido uma oportunidade para reavaliação reguladora da segurança de vacinas influenza. Por exemplo, a contaminação com DNA da célula hospedeira tem sido uma preocupação na regulação de vacinas derivadas de células [1], mas, no passado, não era uma preocupação para o crescimento de vacinas em ovos.

As questões de segurança em torno das vacinas de influenza derivadas de ovos são assim diferentes daquelas em torno de vacinas com crescimento em cultura celular, com vacinas derivadas de células estando sob análise atenta. É um objecto da invenção resolver estas diferentes questões de segurança, e em particular fornecer métodos para melhorar a segurança de vacinas influenza com crescimento em cultura de células. 1 A referência [3] discute questões de segurança relacionadas com as vacinas do vírus influenza que crescem em células MDCK. Durante o processo de preparação a jusante de sete passos (DSP), foi testada a clearance virai numa gama de vírus modelos, tal como HSV, polio e reovírus, mas não o reovírus mamífero.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Por definição, o uso de substratos de células de mamíferos para produção de vacinas influenza envolve a cultura de células sob condições que estão bem adequadas para crescimento e replicação virai. 0 inventor percebeu que estas condições aumentam o risco que agentes patogénicos diferentes do vírus influenza possam crescer na cultura de células, levando assim a uma contaminação potencial do produto de vacina final. Os testes para a contaminação geralmente não são difíceis de realizar, mas um fabricante deve conhecer primeiro quais os testes que tem que realizar. 0 inventor identificou riscos de contaminação específicos, e o seu trabalho mostrou que podem ser feitos testes adequados durante o fabrico de modo a garantir a segurança e qualidade das vacinas influenza com crescimento em cultura celular. Alguns contaminantes podem não ser prejudicais num produto de vacina final, mas a sua presença pode interferir com a propagação do vírus influenza e a sua purificação a jusante, e assim a sua remoção é prioritária no que diz respeito à qualidade e reprodutibilidade; outros contaminantes podem ser prejudiciais numa vacina final, e a sua remoção é prioritária no que diz respeito à segurança. 0 risco de contaminação que aparece a partir da co-cultura virai tem precedentes (por exemplo, determinados lotes de vacina de poliovirus iniciais foram contaminados por vírus símio 40 ('SV40'), um poliomavirus), mas não existem 2 revelações anteriores na identificação de riscos específicos associados com a cultura de células para a produção de vacinas influenza humana. Os vírus influenza com crescimento em cultura de células têm um risco particular de contaminação por causa das estirpes usadas para a produção da vacina que variam todos os anos, e assim novas culturas têm que ser produzidas a cada ano. Esta variação anual nos materiais de produção significa que todos os novos anos trazem um novo risco de contaminação, particularmente quando estão envolvidas passagens múltiplas durante a preparação dos vírus de sementeira para fabricantes, aumentando assim o risco de crescimento paralelo de agentes patogénicos adventícios. 0 inventor identificou agentes infecciosos que podem crescer nas condições usadas para o crescimento dos vírus influenza em cultura de células mas que não crescem em ovos de galinha. Estes agentes infecciosos representam um novo risco de contaminação para as vacinas influenza que nunca foi uma preocupação para as vacinas influenza tradicionais. Assim, a invenção fornece um processo para a preparação duma vacina influenza a partir de vírus influenza que são postos a crescer numa cultura de uma linha de células MDCK, que compreende um passo em que os vírus de sementeira e/ou a vacina e/ou a cultura são testados para a presença de um agente infeccioso que pode crescer na referida linha celular mas que não pode crescer em ovos de galinha embrionados, em que o referido agente infeccioso é um ou mais dos seguintes patogénicos: Reoviridae de mamíferos; Pneumoviridae; Pneumovírus da família Pneumoviridae; Morbilivírus da família Paramyxoviridae; Echovírus dos Enterovírus da família Picornaviridae; ou Rotavírus; 0 inventor também identificou agentes infecciosos que crescem nalguns substratos celulares usados para a produção de vacinas influenza mas que não crescem noutros. Estes agentes 3 infecciosos são assim um risco de contaminação apenas para determinadas vacinas influenza. A linha celular de mamíferos

As vacinas influenza da invenção são postas a crescer em linhas celulares de mamíferos, em vez de serem postas a crescer em ovos embrionados. As linhas celulares para o crescimento de vírus influenza são linhas de células MDCK [2-5], derivadas de rins de canino Madin Darby.

Estas linhas celulares estão largamente disponíveis por exemplo, a partir da colecção de culturas celulares americana (ATCC - American Type Cell Culture Collection) [10], ou a partir dos Repositórios Celulares Coriell [11]. Por exemplo, as células MDCK na ATCC estão sob o número de catálogo CCL-34.

Agentes infecciosos que não crescem em ovos de galinha embrionados O inventor identificou uma variedade de patogénicos que podem crescer em linhas de células de mamíferos (em particular nas células MDCK e células Vero) usadas para preparar os vírus influenza para a produção de vacinas mas que não crescem em ovos de galinha. Os testes para a contaminação por estes patogénicos não foram necessários para vacinas preparadas no substrato de ovos tradicionais, mas o inventor verificou que o controlo de qualidade da vacina deve incluir testes para um ou mais destes patogénicos de modo a garantir os mais elevados padrões de segurança. Os patogénicos são como se segue: • Pneumoviridae, tais como os do género Pneumovírus, que inclui o vírus sincicial respiratório (RSV). • Morbillivírus da família Paramyxoviridae, tais como o vírus do sarampo. 4 • Enterovírus da família Picornaviridae, tais como vírus

Coxsackie, echovírus e enterovírus, embora alguns vírus Coxsackie (por exemplo, B3, B4) verificou-se que não cresciam em células MDCK. • Reoviridae de mamíferos, em particular orthoreovírus (por exemplo, reovírus de mamíferos) e rotavírus. Reovírus podem apresentar crescimento sem restrições em células Vero e MDCK, e, por isso, os testes para eles são de particular importância. Rotavírus partilham os requisitos de protease dos vírus influenza de modo a crescerem na cultura de células, e esta analogia pode involuntariamente conduzir à activação da contaminação por rotavírus.

Quando estes patogénicos têm estirpes diferentes que têm hospedeiros diferentes (por exemplo, RSV humano e RSV bovino), o teste irá, tipicamente, estar relacionado com as estirpes que podem infectar seres humanos.

Os testes para estes agentes são particularmente importantes para estirpes virais derivadas de técnicas de genética reversa, como os vírus de sementeira para a produção de vírus que irão sofrer múltiplas passagens na cultura de células de mamíferos durante o procedimento de genética reversa, aumentando por isso o risco de contaminação por agentes infecciosos adventícios.

Agentes infecciosos que não crescem em ovos, mas crescem em diferentes linhas celulares de mamíferos 0 inventor identificou uma variedade de patogénicos que não crescem em ovos de galinha, não crescem em células MDCK, mas crescem em células Vero. Os testes para a contaminação por estes patogénicos não foram necessários para vacinas preparadas no substrato de ovos tradicionais e não são 5 necessários para as vacinas preparadas em células MDCK, mas o inventor verificou que o controlo de qualidade das vacinas que cresceram em células Vero devem incluir testes para um ou mais destes patogénicos de modo a garantir os mais elevados padrões de segurança. Os patogénicos são como se segue: • Metapneumovírus da família Paramyxoviridae, tais como metapneumovírus humano (HMPV). • Rubulavirus da família Paramyxoviridae, tais como o vírus da papeira, que crescem bem em Vero. • Togaviridae, tal como Rubellavirus. • Coronaviridae, tais como o coronavírus SARS e outros coronavírus humanos. Estes vírus mostram níveis elevados de crescimento em células Vero, com o vírus SARS apresentando crescimento sem restrições e, assim, o seu teste é de particular importância. • Rhinovírus da família Pícornavírídae, tais como as estirpes M de Rhinovírus. • Vírus Varicella Zoster (VZV), também conhecido como vírus do herpes humano 2 (HHV3). VZV podem apresentar crescimento sem restrições em células Vero e, por isso, os seus testes são de particular importância. • Polyomaviridae, tais como o poliomavírus SV-40, o poliomavírus BK e o poliomavírus JC. Estes poliomavírus podem apresentar crescimento sem restrições em células Vero (particularmente células BK) e, por isso, os testes para eles são de particular importância. • Circovírus de suíno. • Picornavírus de suíno, tais como vírus da doença vesicular suína (SVDV) e vírus de Teschen-Talfan. • Bactéria Chlamydia, que inclui C. trachomatis, C. pneumoniae e C. psittaci. Estas bactérias podem crescer 6 em células Vero e, por isso, os seus testes são de particular importância. • Parvovírus tais como parvovirus canino (CPV) ou parvovirus suino.

Os testes para virus não humanos (por exemplo, virus aviários e suínos) dizem respeito principalmente apenas quando materiais aviários ou suínos foram usados em preparações virais por exemplo, se as estirpes foram inicialmente isoladas a partir de porcos ou pássaros, ou se foram usadas passagens de ovos durante o crescimento inicial, ou se foi usada tripsina suína na cultura de células, etc.

Agentes infecciosos que crescem em ovos e linhas de células de mamíferos 0 inventor também identificou patogénicos que, ao contrário daqueles descritos acima, crescem tanto em linhas de células de mamíferos e em ovos de galinha. Um processo da invenção pode envolver um passo de teste para tais patogénicos, mas este passo também pode ser parte do controlo qualidade melhorado do crescimento de vírus em ovos de galinha. Estes patogénicos incluem: • Vírus Parainfluenza (PIV) , membros de PâramyxovirÍdae paramyxovirinae, incluindo PIV-1, PIV-2 e PIV-3. • Herpesviridae, tais como vírus herpes simplex 1 e 2. • Adenoviridae, tais como adenovírus, que inclui adenovírus humanos e símios. • Mycoplasma. 7 • Circovírus aviários. • Reovirídae aviário, em particular orthoreovirus, tais como reovirus aviários que podem crescer em linhas celulares de mamíferos. 0 inventor também identificou patogénicos que crescem em ovos de galinha e em células Vero, mas que não crescem ou é pouco provável que cresçam em células MDCK. Um processo da invenção pode envolver um passo de teste para tais patogénicos, mas este passo também pode ser parte do controlo de qualidade melhorado do crescimento de vírus em ovos de galinha e o passo não é necessário se for usado um substrato de MDCK. Estes patogénicos incluem: • Birnaviridae, tais como vírus da doença infecciosa da bursa (também conhecido como vírus gumboro). 0 teste para agentes que crescem, quer em ovos de galinha quer em linhas celulares, é importante para estirpes virais derivadas após múltiplas passagens em ovos por exemplo, vírus de sementeiras para produção de vírus.

Como estes agentes patogénicos crescem em ovos quando se pesquisa quanto à sua presença, os mesmos podem também ser utilizados para vírus preparados a partir de vírus que crescem em ovos. Assim, a invenção não se limita a vacinas que crescem em culturas de células, mas podem ser também usadas para vacinas à base de ovos tradicionais. Métodos de Teste

Estão disponíveis rotineiramente métodos para a detecção da presença de agentes patogénicos em culturas de células e em biofarmacêuticos. Os métodos baseiam-se geralmente na detecção imunoquímica (imunoensaio, western blot, ELISA, etc.) e/ou na 8 detecção de ácidos nucleicos (métodos de hibridização, tais como Southern blots ou slot blots, PCR, etc.). Em alternativa, é possível testar a presença de um agente patogénico por inoculação de culturas de células convencional (i.e., testar se o material leva à produção do agente patogénico contaminante quando cultivado sob condições convenientes).

Os métodos podem detectar apenas um agente patogénico (por exemplo, um vírus) ou podem detectar agentes patogénicos múltiplos (por exemplo, vários vírus). Quando um ensaio detecta agentes patogénicos múltiplos (por exemplo, 'X' , Ύ' ou 'Z') então pode obter-se um resultado específico (por exemplo, o vírus Ύ' encontra-se presente) ou pode obter-se um resultado geral (por exemplo, um dos vírus 'X', Ύ' ou 'Z' encontra-se presente) . Os métodos podem ser quantitativos, semi-quantitativos ou qualitativos. Podem usar-se métodos de detecção em tempo real. Pode encontrar-se uma orientação geral para a detecção de um agente patogénico de interesse (por exemplo, vírus) na referência 14. No parágrafo que se segue é apresentada uma variedade de ensaios mais específicos e um especialista na arte pode encontrar ou preparar prontamente um ensaio para detectar a presença de qualquer agente patogénico escolhido.

A referência 15 revela um teste de PCR de transcrição reversa multiplex (RT-PCR), designado por 'm-RT-PCR-ELISA', para a detecção de nove agentes patogénicos do tracto respiratório num único ensaio, nomeadamente: enterovírus, vírus influenza tipo A e tipo B, vírus sincicial respiratório, parainfluenzavírus tipo 1 e tipo 3, adenovírus, Mycoplasma pneumoniae e Chlamydia pneumoniae. É revelado um método RT-PCR para detectar o reovírus de mamíferos na referência 16. A referência 17 revela um ensaio de RT-PCR em tempo real para a detecção de metapneumovírus humanos de todas as linhagens genéticas conhecidas. A referência 18 revela um ensaio RT-PCR 9 único para a detecção do vírus sincicial respiratório humano (HRSV) , parainfluenzavírus 1, 2, e 3 e influenza A e B humanos. A referência 19 revela um ensaio multiplex RT-PCR para a detecção e diferenciação do vírus do sarampo, rubéola e parvovírus B19. Na referência 20 é revelado um ensaio RT-PCR em tempo real para a detecção do rhinovírus humano com discriminação precisa dos outros vírus da família Pícornaviridae. A referência 21 revela um ensaio RT-PCR multiplex com conjuntos de ninhos de primário dirigidos a regiões conservadas da hemaglutinina do vírus humano de parainfluenza, à proteína pico do coronavírus humano e aos genes poliproteicos de rhinovírus e enterovírus humano, o que permite uma detecção rápida, sensível e simultânea e a escrita dos quatro tipos de vírus parainfluenza (1, 2, 3, 4AB) , do coronavírus humano 229E e OC43, e a detecção genérica de enterovírus e de rhinovírus. A detecção de SVDV por RT-PCR é revelada na referência 22. Um ensaio quantitativo RTPCR de um único passo para o coronavírus SARS é revelado na referência 23. A referência 24 revela um ensaio de PCR em tempo real de discriminação alélica TaqMan para VZV. Um ensaio de PCR multiplex para detecção rápida simultânea de vírus de pseudoraiva, parvovírus e circovírus é revelado na referência 25. Um ensaio de PCR por sonda FRET em tempo real para a detecção do vírus do polioma SV-40 é revelado na referência 26. A referência 27 revela um ensaio para a detecção simultânea e diferenciação dos vírus do polioma humanos JC e BK por um método de PCR-ELAHA rápido e sensível. A detecção de circovírus suínos em linhas de células humanas por ensaios de PCR e imunofluorescência indirecta é revelada na referência 28. Métodos de PCR para a detecção de birnavírus são revelados nas referências 29 e 30. O método de detecção da invenção pode ser levado a cabo em qualquer fase ou fases durante a fabricação de vacinas, a 10 partir do vírus de sementeira e/ou do substrato de células e/ou do meio de cultura, através das fases de crescimento e infecção virais, através da colheita virai, através de qualquer processamento virai (por exemplo, divisão e/ou extracção da proteína de superfície), através da formulação da vacina e depois através do embalamento da vacina. Assim, o ensaio utilizado de acordo com a invenção pode ser executado nos materiais utilizados para criar a cultura virai, na própria cultura virai e no material extraído e derivados da cultura virai. 0 ensaio não precisa ser levado a cabo em cada vacina ou cultura, mas pode ser usado em intervalos adequados no âmbito do controlo de qualidade normal. É particularmente útil quando a produção de vacinas é alterada para novas estirpes anuais recomendadas pelas autoridades reguladoras, em cuja fase são estabelecidas novas culturas e devem ser submetidas a novo controlo de qualidade. Ensaios da invenção são levados a cabo vantajosamente no vírus de sementeira utilizado para a fabricação de vacinas.

Nos métodos da invenção, as linhas celulares usadas para crescer os vírus influenza podem ser cultivadas em qualquer meio adequado, por exemplo, em meios isentos de soro, em meios livres de proteínas, etc. Métodos para a cultura livre de soro do vírus influenza são divulgados na referência 2 e métodos para a cultura livre de proteína e/ou isenta de proteína são divulgados na referência 31. Um meio "livre de proteína" pode, no entanto, incluir uma ou mais proteases (por exemplo, tripsina) que podem ser necessárias para propagação do vírus influenza. Um meio isento de soro pode incluir suplementos de soro. É também preferido que a vacina tenha sido produzida numa cultura sem a adição de material derivado de bovino, assegurando que a cultura não tem qualquer possibilidade de contaminação com BSE e de vírus bovinos. Meios que não incluam 11 componentes associados com qualquer encefalopatia espongiforme transmissível são preferidos. A vacina contra a gripe A invenção diz respeito a controle de qualidade de vacinas contra a gripe. A vacina pode estar sob a forma de um vírus vivo ou, de preferência, de um vírus inactivado. A inactivação de vírus geralmente envolve o tratamento com uma substância química como formalina ou β-propiolactona. No caso de um vírus inactivado, a vacina pode ser um vírus inteiro, um vírus dividido ou subunidades virais. Os vírus divididos são obtidos por tratamento de viriões com detergentes (por exemplo, éter etílico, polisorvato 80, desoxiquolato, fosfato de tri-N-butilo, Triton X-100, Triton N101, brometo de cetilotrimetilamonia, etc.) para produzir preparações de subvirões. As subunidades de vacinas compreendem os antigénios de superfície de influenza hemaglutinina e neuraminidase. Os antigénios de influenza podem também ser apresentados sob a forma de virossomas [32].

As vacinas contra a gripe da invenção podem basear-se em qualquer estirpe adequada. As vacinas normalmente incluem antigénios de pelo menos uma estirpe do vírus influenza A e/ou, pelo menos, uma estirpe do vírus influenza B. As estirpes recomendadas para vacinas variam de época para época. No actual período inter-pandémico, as vacinas normalmente incluem duas variedades de influenza A (H1N1 e H3N2) e uma de influenza B, e as vacinas trivalentes são as preferidas. A invenção também é adequada para a preparação de vírus de estirpes de pandemia, tais como as estirpes H5 ou H7, isto é, estirpes a que a população humana imunologicamente é vulnerável. Vacinas em situações de pandemia podem ser monovalentes, ou podem basear-se numa vacina trivalente normal, suplementada por uma estirpe pandémica. 12

Os vírus influenza utilizados nos processos da invenção podem ser estirpes reordenadas ou obtidas através de técnicas de genética inversa. Os vírus podem ser atenuados. Os vírus podem ser sensíveis à temperatura. Os vírus podem ser adaptados ao frio.

Quando uma vacina inclui mais de uma estirpe de influenza, as diferentes estirpes normalmente são cultivadas separadamente e são misturadas após os vírus terem sido colhidos e os antigénios preparados. Assim, os processos da invenção podem incluir a etapa da mistura de antigénios de mais do que uma estirpe de influenza. Os ensaios para patogénicos podem ser realizados antes ou após essa mistura. A vacina será normalmente preparada para administração a um paciente por injecção (por exemplo, injecção subcutânea ou injecção intramuscular), embora se conheçam outras vias de administração para as vacinas contra a gripe, por exemplo, intranasal [33-35], oral [36], intradérmica [37, 38], transcutânea, transdérmica [39], etc.

As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar tanto crianças como adultos. As vacinas contra a gripe são correntemente recomendadas para uso na imunização pediátrica e de adultos, a partir dos 6 meses de idade. As preocupações com a segurança são mais graves para as vacinas pediátricas, particularmente porque os pacientes imunologicamente vulneráveis normalmente recebem duas doses de vacina num curto período (por exemplo, num intervalo de 1 ou 2 meses).

As vacinas da invenção podem incluir um adjuvante. Os adjuvantes que têm sido usados em vacinas contra a gripe incluem sais de alumínio [40, 41] , Quitosana [42], oligodesoxinucleotídeos CpG como CpG 7909 [43], emulsões de óleo em água, como MF59 [44], emulsões de água em óleo em água [45], toxina lábil ao calor de E. colí [34,46] e os seus 13 mutantes destoxificados [47-48], monofosforilo de lípido A [49] e os seus derivados 3-o-deacilados [50], mutantes da toxina da tosse convulsa [51], dipéptidos de muramilo [52], etc. A hemaglutinina (HA) é o principal imunogénico em vacinas inactivadas contra influenza, e as doses das vacinas são normalizadas por referência aos niveis de HA, normalmente medidos por ensaio único de imunodifusão radial (SRID). As vacinas normalmente contêm cerca de 15 μg de HA por estirpe, embora doses inferiores também sejam usadas por exemplo para crianças, ou em situações de pandemia. Doses fraccionárias, como ^ (ou seja, 7,5 ng HA por estirpe), H e H têm sido usadas [40, 53]. Assim, as vacinas podem incluir entre 1 e 20 μρ de HA por estirpe de influenza, preferencialmente, por exemplo, cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, aproximadamente 3.8, aproximadamente 1,9, etc.

As vacinas podem incluir conservantes como tiomersal ou 2-fenoxietanol. É preferível, no entanto, que a vacina seja substancialmente isenta de (ou seja, menos de 5 μρ/πιΐ) do material com mercúrio, por exemplo, livre de tiomersal [54, 55]. Vacinas não contendo mercúrio são mais preferidas.

As vacinas da invenção preferencialmente contêm menos de 10 ng (de preferência menos de 1 ng e mais preferencialmente menos de 100 pg) do DNA residual da célula hospedeira por dose, apesar de quantidades vestigiais do DNA da célula hospedeira possam estar presentes. O DNA contaminante pode ser removido durante a preparação da vacina utilizando processos de purificação padrão, por exemplo, cromatografia, etc. A remoção do DNA residual da célula hospedeira pode ser reforçada através do tratamento com nuclease, por exemplo, usando a DNase de Benzonase™ [1] . As vacinas contendo < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira 14 por 15 μς de hemaglutinina são preferidas, assim como vacinas contendo < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por 0,25 ml de volume. Vacinas contendo < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por 50 μρ de hemaglutinina são mais preferidas, como vacinas contendo < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) DNA da célula hospedeira por 0,5 ml de volume.

Essas caracteristicas diferentes das vacinas podem ser conseguidas incluindo etapas adequadas nos processos da invenção. As etapas especificas, portanto, incluem: um passo de inactivação; uma etapa de mistura de três estirpes de virus para fazer uma vacina trivalente; um passo de formular a vacina para injecção; um passo de administrar a vacina a um paciente; um passo de combinar a vacina com adjuvante; um passo de medição do teor em HA; um passo de ajuste do teor de HA, por exemplo, por diluição; uma etapa da adição de conservantes; uma etapa de remoção dos ácidos nucleicos residuais da célula hospedeira; etc.

Agentes adventícios preferenciais para testes

As modalidades preferidas da invenção envolvem agentes adventícios e particularmente vírus, que se encontram em amostras respiratórias, dado que estas são mais susceptíveis de estar presentes nos casos clínicos isolados iniciais do vírus influenza. Agentes patogénicos respiratórios incluem: RSV, PIV-3, Coronavírus SARS, adenovírus, rinovírus, reovírus ('vírus respiratório órfão enterítico' - respiratory enteritic orphan virus), etc. O vírus do herpes simplex também pode ser encontrado em amostras respiratórias.

Os agentes patogénicos particularmente preferidos para os quais a invenção é usada são: reovírus (especialmente reovírus de mamíferos); poliomavírus; birnavírus; circovírus; e 15 parvovírus. 0 teste para o vírus herpes simplex também é preferido.

Quando uma vacina foi tratada com detergente (por exemplo, uma vacina de divisão ou uma vacina de subunidade) então este passo de tratamento oferece um grau extra de segurança, uma vez que também pode destruir os vírus contaminantes. Se o contaminante não tiver invólucro, no entanto, o tratamento com detergentes geralmente não terá nenhum efeito sobre a vacina, não melhorando deste modo a segurança. Assim, o teste para os seguintes agentes patogénicos é particularmente importante, uma vez que estes não possuem invólucro: Picornaviridae, Reovíridae, Birnaviridae, Parvoviridae, Circoviridae, Adenoviridae, Polyomaviridae. A resistência destes vírus aos detergentes combinada com a sua elevada taxa de crescimento de células Vero significa que é particularmente importante testar para a presença do enterovírus humano, do Reovíridae de mamíferos, do Adenoviridae e do Polyomaviridae ao usar um substrato de células Vero. 0 Reovíridae de mamíferos também apresenta taxas elevadas de crescimento em células MDCK. Estes vírus estão também entre os que apresentam maior resistência à inactivação. 0 teste para a presença de Reoviridae de mamífero é uma modalidade preferida da invenção, dado que: (a) os vírus não crescem facilmente em ovos de galinha, e deste modo o ensaio para a sua presença não tem feito parte do fabrico de vírus de gripe tradicional; (b) os vírus podem apresentar crescimento ilimitado tanto em linhas de células MDCK como Vero; (c) os vírus são altamente resistentes à inactivação e permanecem estáveis durante o processamento da vacina; (d) os vírus não têm invólucro e, portanto, podem sobreviver ao tratamento com detergente do vírus influenza; e (e) os vírus estão envolvidos em infecções respiratórias e assim poderiam contaminar os 16 isolados virais iniciais. 0 ensaio para os Reoviridae aviários também é importante quando se utilizaram materiais aviários durante a preparação do vírus, e os critérios (b) a (e) listados acima também se aplicam igualmente aos reovírus aviários.

Outros Agentes Biológicos

Assim como é útil no teste das vacinas contra a gripe, a invenção pode ser também utilizada para outros agentes biológicos, tais como proteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos [56], factores de crescimento, citoquinas, linfoquinas, receptores, hormonas, antigénios de vacinas, antigénios de diagnóstico, etc.

Geral 0 termo "compreendendo" abrange "incluindo" assim como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou podem incluir algo mais, por exemplo, X + Y. 0 termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x ± 10%. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Sempre que necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

Mais informações gerais sobre vacinas contra a gripe, incluindo estirpes, linhas de células para crescimento, doses, combinações, formulações, etc. podem ser encontradas nos capítulos 17 e 18 da referência 57. Mais detalhes sobre o vírus influenza, incluindo detalhes sobre o seu ciclo de vida durante o crescimento virai, podem ser encontrados no Capítulo 46 da referência 14. 17

MODOS PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO Células MDCK O inventor tem uma vasta experiência no crescimento do vírus influenza em células MDCK em cultura livre de soro para a preparação de vacinas. Apercebeu-se que as células são também hospedeiros convenientes para outros agentes patogénicos, e assim foi testada a capacidade de diversos outros agentes patogénicos para crescer nas mesmas condições (especificamente, cultura de MDCK 33016, depositada como DSM ACC2219, em meio livre de soro, conforme divulgado na referência 2) .

Quando se testou a replicação do vírus activo ou o crescimento em células MDCK, os ensaios para os vírus sinciciais respiratórios RSV-A2 e RSV-B foram negativos. Detectaram-se as estirpes PI-3 e 5 SV de Parainfluenzavírus. Os ensaios para os coronavírus humanos 229E e SARS foram negativos, assim como os ensaios para o vírus da poliomielite I, ecovírus 6, coxsackievírus A16 e coxsackievírus B3. Os rinovírus Tipo Ib, 37 e NL.9501841 deram resultado negativo. Os ensaios para reovírus Reo3 foram positivos, assim como foram positivos os ensaios para o vírus herpes simplex HSV-1. Os ensaios para os adenovírus humanos 1, 5 e 6 foram negativos. Os ensaios para SV-40 foram negativos e os títulos do inoculo ficaram estáveis durante 14 dias. O parvovírus canino e o vírus minuto de ratos (MVM) deram resultado negativo, tal como o vírus do sarcoma de Rous. O Mycoplasma hyorhinis deu resultado negativo. Chlamydia trachomatis deu resultado negativo, embora não se possa excluir um nível muito baixo de crescimento durante 3 a 5 dias após a infecção.

Outras investigações revelaram que as células MDCK podem suportar o crescimento do vírus da estomatite vesicular (Indiana), vírus vaccinia, coxsackievírus B5; reovírus 2; 18 adenovírus humanos tipos 4 e 5; exantema vesicular do virus suíno e vírus de hepatite infecciosa canina [58].

Dentre os vírus que podem ser cultivados em células MDCK, parainfluenzavírus, vírus herpes simplex e adenovírus podem igualmente crescer em ovos de galinha embrionados. Por outro lado, os reovírus humanos (e outros reovírus de mamíferos) não crescem facilmente em ovos. Se, no entanto, a MDCK for usada como sistema de cultura de células para produção de vírus influenza, os testes de controlo de qualidade devem verificar a contaminação por reovírus humanos. 0 inventor estima que os níveis de reovírus poderiam aumentar em 5 ordens de grandeza ou mais durante repetidas passagens em culturas de MDCK em suspensão, enquanto que os níveis de um vírus tal como adenovírus iria diminuir entre 6 a 10 ordens de grandeza. Os níveis do vírus herpes simplex também deverão ser verificados, uma vez que o crescimento do HSV em pelo menos 8 ordens de grandeza é possível. Da mesma forma, tem-se verificado um crescimento de PIV-3 em 8 ordens de grandeza após 1 semana de cultura. Células Vero

Na sequência do trabalho de testes em células MDCK, a replicação de agentes patogénicos nas células Vero foi investigada. As células Vero suportam o crescimento de agentes patogénicos, tais como: pneumovírus, tais como RSV-A e RSV-B; metapneumovírus humano (HMPV); morbillivírus, como o vírus do sarampo; paramixovírus, tais como o vírus da papeira e o vírus parainfluenza; Rubellavírus; coronavírus humanos e aviários; picornavírus, como enterovírus, ecovírus e vírus coxsackie e vírus SVDV suino e Teschen-Talfan; reovírus de mamíferos e aviários; herpesvírus, como o HSV-1 e HSV-2; adenovírus de símios e humanos; vírus varicella zoster (VZV); poliomavírus, 19 tais como JC, BK e SV-40; birnavírus, tais como gumborovírus; circovirus suinos; parvovírus canino; e clamídia.

Dentre estes agentes patogénicos, os seguintes não crescem em ovos de galinha e constituem, portanto, novos riscos de contaminação de vacinas contra a gripe quando são usadas células Vero como substrato: RSV; HMPV; virus do sarampo; Rubellavirus; coronavirus humanos; enterovírus; reovírus; WZ; poliomavirus; picornavirus suinos, parvovírus e circovirus. Muitos destes agentes patogénicos não crescem em células MDCK, mostrando que o MDCK é um substrato mais seguro para a produção de vacinas contra a gripe. Os vírus emergentes como a Coronavirus SARS crescem em células Vero, mas não em células MDCK. Da mesma forma, VZV cresce em células Vero, mas não em ovos de galinha ou em células MDCK. A vacinação com uma vacina contra a gripe derivada de Vero que inadvertidamente foi contaminada com este Coronavirus ou com VZV poderia levar a um surto iatrogénico de SARS e/ou varicela, o que seria desastroso para a população e para a reputação da vacina. Tendo identificado estes riscos, no entanto, podem ser implementados mecanismos de controlo de qualidade adequados.

Além de células Vero, as células PER.C6 suportam o crescimento de adenovírus [59, 60]. Com base nas características de vírus conhecidas, também se pode esperar que as células PER.C6 suportem o crescimento de pelo menos parainfluenzavírus e reovírus.

Entende-se que a invenção está descrita acima apenas a título de exemplo, e podem ser feitas modificações mantendo-se dentro do âmbito da invenção.

Lisboa, 1 de Março de 2011 20

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a preparação duma vacina contra a gripe a partir de virus influenza que são postos a crescer numa cultura de uma linha de células MDCK, que compreende um passo em que os virus de sementeira e/ou a vacina e/ou a cultura são testados para a presença de um agente infeccioso que pode crescer na referida linha celular mas que não pode crescer em ovos de galinha embrionados, caracterizado por o referido agente infeccioso ser um ou mais dos seguintes patogénicos: Reoviridae de mamíferos; Pneumoviridae; Pneumovírus da família Pneumoviridae; Morbilivírus da família Paramyxoviridae; Echovírus dos Enterovírus da família Picornaviridae; ou Rotavírus. 2. 0 processo, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por o agente infeccioso ser um ou mais dos seguintes patogénicos: vírus sincicial respiratório (RSV); vírus do sarampo. 3. 0 processo, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por compreender ainda um ou mais dos seguintes passos: um passo de inactivação; um passo da mistura de três estirpes de vírus para fazer uma vacina trivalente; um passo da formulação de vacina para injecção; um passo de combinação da vacina com um adjuvante; um passo da medição do conteúdo de HA; um passo de ajuste do conteúdo de HA por exemplo, por diluição; um passo de adição de um conservante; um passo de remoção de ácidos nucleicos de células hospedeiras residuais. 4. 0 processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a cultura ser testada por detecção imunoquímica; testes de inoculação da cultura de células e/ou detecção de ácido nucleico. 5. 0 processo, de acordo com a reivindicação N°.4, caracterizado por a detecção ser por ELISA e/ou PCR. 1 6. 0 processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o teste ser realizado numa das seguintes etapas: infecção virai, fases de crescimento, recolha virai, processamento virai, separação, extracção da proteína da superfície, formulação da vacina, embalamento da vacina.
7. O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a vacina ser uma vacina de vírus atenuado vivo. 8. 0 processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l-N°.6, caracterizado por a vacina ser uma vacina de vírus inactivado. 9. 0 processo, de acordo com a Reivindicação N°.8, caracterizado por a vacina ser uma vacina de vírus inteiro, uma vacina de vírus dividido, ou uma vacina de uma subunidade virai.
10. O processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.9, caracterizado por a vacina ser uma vacina trivalente contra a gripe. 11. 0 processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por a vacina ser uma vacina pandémica monovalente contra a gripe.
12. O processo, de acordo com a reivindicação N°.ll, caracterizado por a vacina incluir uma estripe do vírus influenza H5 ou H7. Lisboa, 1 de Março de 2011 2