JPH1175833A - トリレオウイルスの調製法 - Google Patents
トリレオウイルスの調製法Info
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- JPH1175833A JPH1175833A JP19368198A JP19368198A JPH1175833A JP H1175833 A JPH1175833 A JP H1175833A JP 19368198 A JP19368198 A JP 19368198A JP 19368198 A JP19368198 A JP 19368198A JP H1175833 A JPH1175833 A JP H1175833A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 株化細胞を宿主として用いるトリレオウイル
ス（ＡＲＶ）の調製法を提供する。 【構成】 ＡＲＶを鳥類又は哺乳類由来の株化細胞に感
染させ、この株化細胞を培養することによりＡＲＶを調
製する方法、該方法により得られたＡＲＶの抗原を主成
分とするトリレオウイルス感染症ワクチン、並びにこの
ワクチンを用いたトリレオウイルス感染症の予防法。
ス（ＡＲＶ）の調製法を提供する。 【構成】 ＡＲＶを鳥類又は哺乳類由来の株化細胞に感
染させ、この株化細胞を培養することによりＡＲＶを調
製する方法、該方法により得られたＡＲＶの抗原を主成
分とするトリレオウイルス感染症ワクチン、並びにこの
ワクチンを用いたトリレオウイルス感染症の予防法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、株化細胞を用いた
トリレオウイルス（ＡＲＶ）の調製法に関する。更に詳
細には、本発明は、ＡＲＶを鳥類又は哺乳動物由来の株
化細胞に感染させ、この株化細胞を培養することにより
ＡＲＶを増殖させ、該ウイルス感染細胞からＡＲＶを調
製する方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法に
より得られたＡＲＶの抗原を主成分とするトリレオウイ
ルス感染症ワクチン及びこのワクチンを用いたトリレオ
ウイルス感染症の予防法にも関する。
トリレオウイルス（ＡＲＶ）の調製法に関する。更に詳
細には、本発明は、ＡＲＶを鳥類又は哺乳動物由来の株
化細胞に感染させ、この株化細胞を培養することにより
ＡＲＶを増殖させ、該ウイルス感染細胞からＡＲＶを調
製する方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法に
より得られたＡＲＶの抗原を主成分とするトリレオウイ
ルス感染症ワクチン及びこのワクチンを用いたトリレオ
ウイルス感染症の予防法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】トリレオウイルス（以下、「ＡＲＶ」と
も称する）感染症は、腱鞘炎による脚弱、下痢あるいは
発育不良を誘発するウイルス性疾病である。ＡＲＶは広
く鶏群に浸潤しており、多くの血清型がある。又、株に
よって病原性が異なり、発症の程度はその病原性の違
い、感染量、感染経路、鶏の日齢又は免疫状態によって
大きく影響される。鶏がＡＲＶに罹患すると経済的損失
は大きい。
も称する）感染症は、腱鞘炎による脚弱、下痢あるいは
発育不良を誘発するウイルス性疾病である。ＡＲＶは広
く鶏群に浸潤しており、多くの血清型がある。又、株に
よって病原性が異なり、発症の程度はその病原性の違
い、感染量、感染経路、鶏の日齢又は免疫状態によって
大きく影響される。鶏がＡＲＶに罹患すると経済的損失
は大きい。
【０００３】これまでに、ＡＲＶの感染を予防するため
に、数種のワクチンが開発され、市販されている。ＡＲ
Ｖ感染症ワクチンを製造するための抗原材料は、例え
ば、ＡＲＶを鶏胚初代細胞（ＣＥＦ）に感染・増殖さ
せ、該感染細胞から調製する方法により生産されていた
（内村哲也、鶏病研究会報、第２６巻、増刊号，１−１
５、１９８２）。
に、数種のワクチンが開発され、市販されている。ＡＲ
Ｖ感染症ワクチンを製造するための抗原材料は、例え
ば、ＡＲＶを鶏胚初代細胞（ＣＥＦ）に感染・増殖さ
せ、該感染細胞から調製する方法により生産されていた
（内村哲也、鶏病研究会報、第２６巻、増刊号，１−１
５、１９８２）。
【０００４】しかしながら、この様な鶏胚初代細胞を用
いる従来の方法では、組織培養に使用するための発育鶏
卵からの鶏胚採材、細切及び酵素処理などのＣＥＦを得
るための操作に、多くの労力と時間を必要とするという
問題があった。更に、この方法では、ワクチンの製造の
度にウイルス増殖に使用する培養細胞又は組織の出発材
料が異なり、一定の品質を維持することが容易ではな
い。
いる従来の方法では、組織培養に使用するための発育鶏
卵からの鶏胚採材、細切及び酵素処理などのＣＥＦを得
るための操作に、多くの労力と時間を必要とするという
問題があった。更に、この方法では、ワクチンの製造の
度にウイルス増殖に使用する培養細胞又は組織の出発材
料が異なり、一定の品質を維持することが容易ではな
い。
【０００５】これに対し、株化細胞にウイルスを感染・
増殖させ、該細胞からワクチン製造に用いる抗原材料を
取得する方法は、上述したようなウイルスを生産するた
めの材料調製の手間を省き、生産性を高めることがで
き、更に、一定品質のワクチンを維持することを可能に
する。
増殖させ、該細胞からワクチン製造に用いる抗原材料を
取得する方法は、上述したようなウイルスを生産するた
めの材料調製の手間を省き、生産性を高めることがで
き、更に、一定品質のワクチンを維持することを可能に
する。
【０００６】これまで、哺乳類又は鶏組織由来の株化細
胞が数多く報告されており（WitterR.L. and Committee
Avian Pathol. 8, 487-498, 1979）、例えば、ハムス
ター肺由来のＨｍＬｕ−１細胞（Hideo Okumura, Cance
r Cells in Culture,292-298,1968）、ハムスター腎臓
由来のＢＨＫ−２１細胞（IAN Macpherson and Michae
l Stoker Virology 16: 147-151, 1962）、エイブ系株
化細胞であるＶｅｒｏ細胞（安村美博、川喜愛郎、日本
臨床 ２１巻６号，１２０１−１２１９、１９６３）、
鶏のリンパ芽球由来の株化細胞（Akiyama and Kato,Bik
en J. 17:105-116,1974）、ラウス肉腫ウイルス又は発
癌物質で処理した鶏の繊維芽細胞（Kaadenet al. In Vi
tro 18:827-834,1982、Ogura et al.Gann. 75:410-414,
1984、Dinowitz,M. J. Natl. Cancer Inst.58:307-312,
1977、Lerman et al. J.Natl. Cancer Inst. 57:295-30
1,1976）、鶏胚繊維芽細胞をニトロソグアニジンで処理
したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞（Hajime Ogura et al. Acta
Med Okayama 41(3)141-143,1987）及び発癌物質で処理
した鶏の唯一の上皮系肝細胞癌由来のＬＭＨ細胞（Kawa
guchi et al. Cancer Res. 47:4460-4464,1987）等があ
る。しかしながら、これらの株化細胞は、株化の誘導に
使用したウイルスを産生していたり、ウイルスの細胞に
対する増殖性が記載されているのみで得られるウイルス
抗原の免疫原性については全く言及されていない等、前
記株化細胞がＡＲＶ感染症ワクチンの製造に適している
か否かは明らかにされていない。
胞が数多く報告されており（WitterR.L. and Committee
Avian Pathol. 8, 487-498, 1979）、例えば、ハムス
ター肺由来のＨｍＬｕ−１細胞（Hideo Okumura, Cance
r Cells in Culture,292-298,1968）、ハムスター腎臓
由来のＢＨＫ−２１細胞（IAN Macpherson and Michae
l Stoker Virology 16: 147-151, 1962）、エイブ系株
化細胞であるＶｅｒｏ細胞（安村美博、川喜愛郎、日本
臨床 ２１巻６号，１２０１−１２１９、１９６３）、
鶏のリンパ芽球由来の株化細胞（Akiyama and Kato,Bik
en J. 17:105-116,1974）、ラウス肉腫ウイルス又は発
癌物質で処理した鶏の繊維芽細胞（Kaadenet al. In Vi
tro 18:827-834,1982、Ogura et al.Gann. 75:410-414,
1984、Dinowitz,M. J. Natl. Cancer Inst.58:307-312,
1977、Lerman et al. J.Natl. Cancer Inst. 57:295-30
1,1976）、鶏胚繊維芽細胞をニトロソグアニジンで処理
したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞（Hajime Ogura et al. Acta
Med Okayama 41(3)141-143,1987）及び発癌物質で処理
した鶏の唯一の上皮系肝細胞癌由来のＬＭＨ細胞（Kawa
guchi et al. Cancer Res. 47:4460-4464,1987）等があ
る。しかしながら、これらの株化細胞は、株化の誘導に
使用したウイルスを産生していたり、ウイルスの細胞に
対する増殖性が記載されているのみで得られるウイルス
抗原の免疫原性については全く言及されていない等、前
記株化細胞がＡＲＶ感染症ワクチンの製造に適している
か否かは明らかにされていない。
【０００７】ルカート等（P.D.Lukert Am J Vet Res,Vo
l36,No.4 1975：539〜540）は、鶏胚腎細胞（chicken e
mbryo kidney cell）で増殖させたＩＢＤＶ抗原で免疫
した鶏とアフリカミドリザルの株化腎細胞（Vero細胞）
に適応させたＩＢＤＶ（Vero-cell-adapted virus）で
免疫した鶏とでは、投与ルートによってウイルス攻撃に
対する防御能が異なることを報告している。すなわち、
鶏胚腎細胞由来のＩＢＤＶ抗原で免疫された鶏は、皮下
投与又は飲水投与のいずれの投与方法であってもウイル
ス攻撃から完全に防御されたのに対し、Vero細胞由来の
ＩＢＤＶを皮下投与された鶏はウイルス攻撃から防御さ
れたものの、飲水投与された鶏は全く防御されなかっ
た。このように投与ルートにより防御効果に差異が認め
られるのは、該哺乳類由来の細胞を用いた場合と鳥類由
来の細胞を用いた場合とでは異なる糖鎖を有するウイル
ス抗原が産生されることとなり、この糖鎖の違いが抗原
性に変化を生じ、その結果、ワクチンとしての免疫誘導
能に影響を及ぼしたことが推察される。すなわち、ウイ
ルスの細胞に対する感受性及び細胞に対するウイルスの
増殖性が共に認められるが、ウイルスと宿主細胞の組み
合わせによっては得られるウイルスの抗原性が異なる場
合があり、それ故、ワクチンとしての適性を有する抗原
を産生するか否かを明らかにするには、それぞれのウイ
ルス／細胞の組み合わせで得たウイルス抗原につき免疫
原性を調べる必要がある。
l36,No.4 1975：539〜540）は、鶏胚腎細胞（chicken e
mbryo kidney cell）で増殖させたＩＢＤＶ抗原で免疫
した鶏とアフリカミドリザルの株化腎細胞（Vero細胞）
に適応させたＩＢＤＶ（Vero-cell-adapted virus）で
免疫した鶏とでは、投与ルートによってウイルス攻撃に
対する防御能が異なることを報告している。すなわち、
鶏胚腎細胞由来のＩＢＤＶ抗原で免疫された鶏は、皮下
投与又は飲水投与のいずれの投与方法であってもウイル
ス攻撃から完全に防御されたのに対し、Vero細胞由来の
ＩＢＤＶを皮下投与された鶏はウイルス攻撃から防御さ
れたものの、飲水投与された鶏は全く防御されなかっ
た。このように投与ルートにより防御効果に差異が認め
られるのは、該哺乳類由来の細胞を用いた場合と鳥類由
来の細胞を用いた場合とでは異なる糖鎖を有するウイル
ス抗原が産生されることとなり、この糖鎖の違いが抗原
性に変化を生じ、その結果、ワクチンとしての免疫誘導
能に影響を及ぼしたことが推察される。すなわち、ウイ
ルスの細胞に対する感受性及び細胞に対するウイルスの
増殖性が共に認められるが、ウイルスと宿主細胞の組み
合わせによっては得られるウイルスの抗原性が異なる場
合があり、それ故、ワクチンとしての適性を有する抗原
を産生するか否かを明らかにするには、それぞれのウイ
ルス／細胞の組み合わせで得たウイルス抗原につき免疫
原性を調べる必要がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】このような状況下、経
済的に安価で、一定品質を保証できるＡＲＶ感染症ワク
チンの開発が望まれる。本発明の目的は、鶏系株化細胞
であるＬＭＨ細胞を用いて、及び哺乳類系株化細胞であ
るＶｅｒｏ細胞、ＨｍＬｕ−１細胞もしくはＢＨＫ−２
１細胞を用いてＡＲＶに対する中和抗体を惹起しうるＡ
ＲＶ抗原を調製するための方法を提供することにある。
済的に安価で、一定品質を保証できるＡＲＶ感染症ワク
チンの開発が望まれる。本発明の目的は、鶏系株化細胞
であるＬＭＨ細胞を用いて、及び哺乳類系株化細胞であ
るＶｅｒｏ細胞、ＨｍＬｕ−１細胞もしくはＢＨＫ−２
１細胞を用いてＡＲＶに対する中和抗体を惹起しうるＡ
ＲＶ抗原を調製するための方法を提供することにある。
【０００９】また、本発明の他の目的は、上記の方法に
より得られるＡＲＶ抗原又はその抗原成分を含有するＡ
ＲＶ感染症ワクチンを提供することにある。
より得られるＡＲＶ抗原又はその抗原成分を含有するＡ
ＲＶ感染症ワクチンを提供することにある。
【００１０】また、本発明の更に他の目的は、上記のＡ
ＲＶ感染症ワクチンの少なくとも一方と、別のウイル
ス、マイコプラズマ、細菌及び寄生虫よりなる群から選
ばれた少なくとも１種類の微生物に由来する抗原とを含
有する混合ワクチンを提供することにある。
ＲＶ感染症ワクチンの少なくとも一方と、別のウイル
ス、マイコプラズマ、細菌及び寄生虫よりなる群から選
ばれた少なくとも１種類の微生物に由来する抗原とを含
有する混合ワクチンを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究に取り組んだ結果、特定の株
化細胞を用いて、ＡＲＶを感染・増殖させた場合に、ウ
イルスの細胞に対する感受性、細胞に対するウイルスの
増殖性、及び得られたウイルス抗原の免疫原性のいずれ
の点においても優れたウイルス又はその抗原成分が得ら
れ，ＡＲＶに対する中和活性を有する抗体を誘発しうる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、
ＡＲＶは、外来性の微生物の汚染が無く、細胞増殖性の
良い鶏の唯一の上皮系肝細胞癌由来の株化細胞であるＬ
ＭＨ細胞に対し高い感受性を有すること、及びＡＲＶに
感染したＬＭＨ細胞から得られるウイルス量は、ＣＥＦ
に感染させた場合に得られるウイルス量に匹敵すること
を見出した。更に、上記のＬＭＨ細胞から得られるウイ
ルス抗原でワクチンを調製し、これを鶏に注射したとこ
ろ、該鶏の血清中に、ＡＲＶに対する高い中和抗体価を
有する抗体が誘導されているとの知見を得た。また、Ａ
ＲＶは、哺乳類系株化細胞であるＶｅｒｏ細胞、ＨｍＬ
ｕ−１細胞、ＢＨＫ−２１細胞に対し高い感受性を有
し、ウイルス増殖性がよいこと、及び該ウイルス抗原を
用いて調製したワクチンは、ＡＲＶに対し十分な免疫原
性を有することを見出した。
を達成するために鋭意研究に取り組んだ結果、特定の株
化細胞を用いて、ＡＲＶを感染・増殖させた場合に、ウ
イルスの細胞に対する感受性、細胞に対するウイルスの
増殖性、及び得られたウイルス抗原の免疫原性のいずれ
の点においても優れたウイルス又はその抗原成分が得ら
れ，ＡＲＶに対する中和活性を有する抗体を誘発しうる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、
ＡＲＶは、外来性の微生物の汚染が無く、細胞増殖性の
良い鶏の唯一の上皮系肝細胞癌由来の株化細胞であるＬ
ＭＨ細胞に対し高い感受性を有すること、及びＡＲＶに
感染したＬＭＨ細胞から得られるウイルス量は、ＣＥＦ
に感染させた場合に得られるウイルス量に匹敵すること
を見出した。更に、上記のＬＭＨ細胞から得られるウイ
ルス抗原でワクチンを調製し、これを鶏に注射したとこ
ろ、該鶏の血清中に、ＡＲＶに対する高い中和抗体価を
有する抗体が誘導されているとの知見を得た。また、Ａ
ＲＶは、哺乳類系株化細胞であるＶｅｒｏ細胞、ＨｍＬ
ｕ−１細胞、ＢＨＫ−２１細胞に対し高い感受性を有
し、ウイルス増殖性がよいこと、及び該ウイルス抗原を
用いて調製したワクチンは、ＡＲＶに対し十分な免疫原
性を有することを見出した。
【００１２】
【発明の構成と効果】本発明の方法は、ＡＲＶ及び該ウ
イルスを増殖させるために使用する哺乳類又は鳥類由来
の株化細胞によって特徴づけられる。
イルスを増殖させるために使用する哺乳類又は鳥類由来
の株化細胞によって特徴づけられる。
【００１３】製造用ＡＲＶ株として、例えば、５８−１
３２Ｅ５０株、Ｓ１１３３株、Ｐ１００株及びＣＯ８株
等が挙げられるが、好ましくは、５８−１３２Ｅ５０株
が使用される。ウイルス増殖に用いる宿主細胞は、上記
のＡＲＶが増殖し、かつ不純ウイルスを産生しない哺乳
類又は鳥類由来の株化細胞であるならばどのような細胞
も使用可能である。鳥類由来の株化細胞では、好ましく
は、鶏系株化細胞が使用され、更に好ましくはＬＭＨ細
胞が使用される。また、哺乳類由来の株化細胞では、好
ましくは、エイブ系細胞もしくはハムスター系細胞の株
化細胞、更に好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞、 ＨｍＬｕ−
１細胞もしくはＢＨＫ−２１細胞が使用される。
３２Ｅ５０株、Ｓ１１３３株、Ｐ１００株及びＣＯ８株
等が挙げられるが、好ましくは、５８−１３２Ｅ５０株
が使用される。ウイルス増殖に用いる宿主細胞は、上記
のＡＲＶが増殖し、かつ不純ウイルスを産生しない哺乳
類又は鳥類由来の株化細胞であるならばどのような細胞
も使用可能である。鳥類由来の株化細胞では、好ましく
は、鶏系株化細胞が使用され、更に好ましくはＬＭＨ細
胞が使用される。また、哺乳類由来の株化細胞では、好
ましくは、エイブ系細胞もしくはハムスター系細胞の株
化細胞、更に好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞、 ＨｍＬｕ−
１細胞もしくはＢＨＫ−２１細胞が使用される。
【００１４】細胞の調製及びＡＲＶを増殖させるための
細胞培養に用いる培地は、一般に組織培養に使用されて
いるものを使用すれば良い。例えば、イーグルＭＥＭ培
地に牛、鶏又はヤギ血清を０〜３０％、好ましくは２〜
５％になるように添加した培地が用いられる。
細胞培養に用いる培地は、一般に組織培養に使用されて
いるものを使用すれば良い。例えば、イーグルＭＥＭ培
地に牛、鶏又はヤギ血清を０〜３０％、好ましくは２〜
５％になるように添加した培地が用いられる。
【００１５】ウイルスを増殖させる際には、上記細胞を
培養液１ｍｌ中に１ｘ１０4〜３ｘ１０6個、好ましく
は、１ｘ１０5〜１ｘ１０6個の密度になるよう調製し、
これにウイルス液を混合した混合液が用いられる。培養
の方法としては、この混合液をルー瓶又はローラーボト
ル等に静置させて培養する静置培養、ホローファイバー
を用いる付着培養、マイクロキャリアなどの担体に細胞
を付着させてこれを浮遊して培養する浮遊培養又は担体
を用いずに細胞を浮遊させて培養する浮遊培養等が挙げ
られる。また、細胞のみを上記培養法により１〜３日間
培養した後、これにウイルス液を接種し、培養すること
もできる。細胞培養は３０〜４２℃の温度で実施可能で
あるが、好ましくは３２〜３８℃の範囲内で行われる。
培養日数としては、ウイルス量が最高に達する日数が適
宜調整されるが、好ましくは２〜８日間の培養期間が設
定される。ファーメンターを用いる大量培養は、水素イ
オン濃度（ｐＨ）を６〜８好ましくは６．５〜７．５、
溶存酸素（ＤＯ）を１〜６ｐｐｍ好ましくは２〜４ｐｐ
ｍの条件下で行われる。
培養液１ｍｌ中に１ｘ１０4〜３ｘ１０6個、好ましく
は、１ｘ１０5〜１ｘ１０6個の密度になるよう調製し、
これにウイルス液を混合した混合液が用いられる。培養
の方法としては、この混合液をルー瓶又はローラーボト
ル等に静置させて培養する静置培養、ホローファイバー
を用いる付着培養、マイクロキャリアなどの担体に細胞
を付着させてこれを浮遊して培養する浮遊培養又は担体
を用いずに細胞を浮遊させて培養する浮遊培養等が挙げ
られる。また、細胞のみを上記培養法により１〜３日間
培養した後、これにウイルス液を接種し、培養すること
もできる。細胞培養は３０〜４２℃の温度で実施可能で
あるが、好ましくは３２〜３８℃の範囲内で行われる。
培養日数としては、ウイルス量が最高に達する日数が適
宜調整されるが、好ましくは２〜８日間の培養期間が設
定される。ファーメンターを用いる大量培養は、水素イ
オン濃度（ｐＨ）を６〜８好ましくは６．５〜７．５、
溶存酸素（ＤＯ）を１〜６ｐｐｍ好ましくは２〜４ｐｐ
ｍの条件下で行われる。
【００１６】本発明の方法により調製されるＡＲＶ抗原
は、生ワクチンとして、又は必要に応じて該ウイルス抗
原を不活化することにより不活化ワクチンとして使用す
ることが出来る。すなわち、上記の培養法により得られ
る培養液を、１５００ｒｐｍの遠心にかけ、その上清を
ウイルス浮遊液とし、これに安定剤、例えば、乳糖を添
加し凍結乾燥することにより生ワクチンが調製される。
不活化ワクチンを調製する場合は、上記ウイルス浮遊液
に、ホルマリン、グルタルアルデヒド又はベータープロ
ピオラクトンなどの不活化剤でウイルスを不活化した
後、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸
カリウム、ミネラルオイル又はノンミネラルオイルなど
の免疫賦活化剤を添加することにより行われる。このよ
うにして調製した本発明のワクチンは、ウイルスの中和
活性を有する抗体を誘導し得るものであり、たとえば、
筋肉内、皮下もしくは卵内注射する方法により、スプレ
ー形態で吸入させる方法により、点眼器具を用いて点
眼、点鼻する方法により、又は飲水に混合して飲ませる
方法により、家禽に投与される。
は、生ワクチンとして、又は必要に応じて該ウイルス抗
原を不活化することにより不活化ワクチンとして使用す
ることが出来る。すなわち、上記の培養法により得られ
る培養液を、１５００ｒｐｍの遠心にかけ、その上清を
ウイルス浮遊液とし、これに安定剤、例えば、乳糖を添
加し凍結乾燥することにより生ワクチンが調製される。
不活化ワクチンを調製する場合は、上記ウイルス浮遊液
に、ホルマリン、グルタルアルデヒド又はベータープロ
ピオラクトンなどの不活化剤でウイルスを不活化した
後、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸
カリウム、ミネラルオイル又はノンミネラルオイルなど
の免疫賦活化剤を添加することにより行われる。このよ
うにして調製した本発明のワクチンは、ウイルスの中和
活性を有する抗体を誘導し得るものであり、たとえば、
筋肉内、皮下もしくは卵内注射する方法により、スプレ
ー形態で吸入させる方法により、点眼器具を用いて点
眼、点鼻する方法により、又は飲水に混合して飲ませる
方法により、家禽に投与される。
【００１７】また、本発明のＡＲＶ感染症ワクチンは、
混合ワクチンとして使用することが出来る。生ワクチン
の場合、ＡＲＶ感染症生ワクチンと、ニューカッスル病
ウイルス（ＮＤＶ）、鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢ
Ｖ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤ
Ｖ）、マレック病ウイルス及び鶏脳脊髄炎ウイルスに対
する生ワクチンの群から選択される少なくとも１種類の
ワクチンとを組み合わせることができる。不活化ワクチ
ンの場合、ＡＲＶ感染症不活化ワクチンと、ＮＤＶ、Ｉ
ＢＶ、産卵低下症候群1976ウイルス、ＩＢＤＶ、細菌
（例えば大腸菌及びサルモネラ菌、ヘモフィルス・パラ
ガリナラム菌など）、マイコプラズマ（例えばマイコプ
ラズマ・ガリセプティカム及びマイコプラズマ・シノビ
エなど）及び寄生虫（例えばアイメリア属）に対する不
活化ワクチンの群から選択される少なくとも１種類のワ
クチンを組み合わせることができる。
混合ワクチンとして使用することが出来る。生ワクチン
の場合、ＡＲＶ感染症生ワクチンと、ニューカッスル病
ウイルス（ＮＤＶ）、鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢ
Ｖ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤ
Ｖ）、マレック病ウイルス及び鶏脳脊髄炎ウイルスに対
する生ワクチンの群から選択される少なくとも１種類の
ワクチンとを組み合わせることができる。不活化ワクチ
ンの場合、ＡＲＶ感染症不活化ワクチンと、ＮＤＶ、Ｉ
ＢＶ、産卵低下症候群1976ウイルス、ＩＢＤＶ、細菌
（例えば大腸菌及びサルモネラ菌、ヘモフィルス・パラ
ガリナラム菌など）、マイコプラズマ（例えばマイコプ
ラズマ・ガリセプティカム及びマイコプラズマ・シノビ
エなど）及び寄生虫（例えばアイメリア属）に対する不
活化ワクチンの群から選択される少なくとも１種類のワ
クチンを組み合わせることができる。
【００１８】本発明によると、ＡＲＶ感染症ウイルス感
染症を予防するためのＡＲＶ感染症ウイルスワクチンが
提供される。本発明の方法により、従来の方法に比べ、
一定品質のワクチンを、低コストで安定的に提供するこ
とが可能となる。以下、実施例に従い本発明をさらに詳
細に説明するが、下記の実施例に何等限定されるもので
はない。
染症を予防するためのＡＲＶ感染症ウイルスワクチンが
提供される。本発明の方法により、従来の方法に比べ、
一定品質のワクチンを、低コストで安定的に提供するこ
とが可能となる。以下、実施例に従い本発明をさらに詳
細に説明するが、下記の実施例に何等限定されるもので
はない。
【００１９】
【実施例】実施例１ ＬＭＨ及びＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞に対するウ
イルスの感受性 牛血清５％を含むイーグルＭＥＭ培地（ｐＨ７．２）
に、ＬＭＨ細胞（ATCC No.CRL-2117）又はＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２細胞を６ｘ１０5個／mlの密度になるように浮遊
し、シャーレに５ml分注後、炭酸ガスフラン器内で、３
７℃、２４時間培養した。培養上清を除いた後、これら
の細胞にＡＲＶ（５８−１３２Ｅ５０株）、ＩＢＤＶ
（Ｋ株）、ＩＬＴＶ（ＣＥ株）、七面鳥ヘルペスウイル
ス（ＹＴ−７株）、ＮＤＶ（Ｂ１株）、ＩＢＶ（練馬
株）又はＥＤＳＶ（ＫＥ−８０株）をそれぞれ０．１ｍ
ｌ接種し（ｍｏｉ＝１）、３７℃、１時間静置した後、
牛血清５％を含むイーグルＭＥＭ培地を５ml加え、更に
３７℃、５〜７日間培養した。培養開始後経時的に培養
液を採取し、ウイルス含有量を測定した。ウイルス含有
量は、ＡＲＶ及びＩＢＤＶでは鶏胚細胞を用いた５０％
感染価、ＩＬＴＶでは鶏腎細胞を用いた５０％感染価、
ＨＶＴでは鶏胚細胞を用いたプラーク測定法（ＰＦ
Ｕ）、ＮＤＶ及びＩＢＶでは発育鶏卵を用いた５０％感
染価、ＥＤＳＶでは鶏胚肝細胞を用いた５０％感染価に
より測定した。その結果を表１に示す。
イルスの感受性 牛血清５％を含むイーグルＭＥＭ培地（ｐＨ７．２）
に、ＬＭＨ細胞（ATCC No.CRL-2117）又はＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２細胞を６ｘ１０5個／mlの密度になるように浮遊
し、シャーレに５ml分注後、炭酸ガスフラン器内で、３
７℃、２４時間培養した。培養上清を除いた後、これら
の細胞にＡＲＶ（５８−１３２Ｅ５０株）、ＩＢＤＶ
（Ｋ株）、ＩＬＴＶ（ＣＥ株）、七面鳥ヘルペスウイル
ス（ＹＴ−７株）、ＮＤＶ（Ｂ１株）、ＩＢＶ（練馬
株）又はＥＤＳＶ（ＫＥ−８０株）をそれぞれ０．１ｍ
ｌ接種し（ｍｏｉ＝１）、３７℃、１時間静置した後、
牛血清５％を含むイーグルＭＥＭ培地を５ml加え、更に
３７℃、５〜７日間培養した。培養開始後経時的に培養
液を採取し、ウイルス含有量を測定した。ウイルス含有
量は、ＡＲＶ及びＩＢＤＶでは鶏胚細胞を用いた５０％
感染価、ＩＬＴＶでは鶏腎細胞を用いた５０％感染価、
ＨＶＴでは鶏胚細胞を用いたプラーク測定法（ＰＦ
Ｕ）、ＮＤＶ及びＩＢＶでは発育鶏卵を用いた５０％感
染価、ＥＤＳＶでは鶏胚肝細胞を用いた５０％感染価に
より測定した。その結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】ＡＲＶとＩＢＤＶはＬＭＨ及びＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞で増殖し、ＩＬＴＶはＬＭＨ細胞で、ＮＤＶ
はＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞でのみ増殖した。その他のウイ
ルスはいずれの細胞においても増殖しなかった。
ＯＵ２細胞で増殖し、ＩＬＴＶはＬＭＨ細胞で、ＮＤＶ
はＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞でのみ増殖した。その他のウイ
ルスはいずれの細胞においても増殖しなかった。
【００２２】実施例２ ＡＲＶ抗原の調製 牛血清５％を含むイーグルＭＥＭ培地（ｐＨ７．２）２
００ｍｌに、 ＬＭＨ細胞（ATCC No. CRL-2117）、Ｖｅ
ｒｏ細胞（ATCC No. CCL-81）又はＨｍＬｕ−１細胞
（農林水産省家畜衛生試験場より分与）又はＢＨＫ−２
１細胞（ATCC No.CCL-10）を６ｘ１０5個／ｍｌの密度
になるように浮遊し、ローラーボトル内で撹拌しながら
３７℃、１日間培養後、これにＡＲＶ５８−１３２Ｅ５
０株（社団法人 動物用生物学的製剤協会会報 ２３
（２）３８、１９９０）をｍｏｉ１になるように接種
し、更に３７℃、７日間培養した。対照として、上記の
ＭＥＭ培地２００ｍｌにＣＥＦを２ｘ１０6個／ｍｌの
密度になるように浮遊し、ローラーボトル内で撹拌しな
がら３７℃、１日間培養後、これにＡＲＶ５８−１３２
Ｅ５０株をｍｏｉ０．００１になるよう接種し、更に、
３７℃、４日間培養した。これらの培養液を１５００ｒ
ｐｍの遠心にかけ、得られた上清をウイルス浮遊液とし
た。
００ｍｌに、 ＬＭＨ細胞（ATCC No. CRL-2117）、Ｖｅ
ｒｏ細胞（ATCC No. CCL-81）又はＨｍＬｕ−１細胞
（農林水産省家畜衛生試験場より分与）又はＢＨＫ−２
１細胞（ATCC No.CCL-10）を６ｘ１０5個／ｍｌの密度
になるように浮遊し、ローラーボトル内で撹拌しながら
３７℃、１日間培養後、これにＡＲＶ５８−１３２Ｅ５
０株（社団法人 動物用生物学的製剤協会会報 ２３
（２）３８、１９９０）をｍｏｉ１になるように接種
し、更に３７℃、７日間培養した。対照として、上記の
ＭＥＭ培地２００ｍｌにＣＥＦを２ｘ１０6個／ｍｌの
密度になるように浮遊し、ローラーボトル内で撹拌しな
がら３７℃、１日間培養後、これにＡＲＶ５８−１３２
Ｅ５０株をｍｏｉ０．００１になるよう接種し、更に、
３７℃、４日間培養した。これらの培養液を１５００ｒ
ｐｍの遠心にかけ、得られた上清をウイルス浮遊液とし
た。
【００２３】ウイルス浮遊液のウイルス含有量は、これ
を牛血清１％を含むイーグルＭＥＭ培地（ｐＨ７．２）
で１０倍段階希釈し、各段階の希釈液をマイクロプレー
トで２４時間培養したＣＥＦ細胞に接種後、４日間培養
し、５０％感染価を求め、表２の結果を得た。
を牛血清１％を含むイーグルＭＥＭ培地（ｐＨ７．２）
で１０倍段階希釈し、各段階の希釈液をマイクロプレー
トで２４時間培養したＣＥＦ細胞に接種後、４日間培養
し、５０％感染価を求め、表２の結果を得た。
【００２４】
【表２】
【００２５】上記の結果より明らかなように、本発明に
従うＬＭＨ細胞及びＶｅｒｏ細胞を用いたＡＲＶ培養法
はＣＥＦ培養法と比較すると、細胞播種密度当たりのウ
イルス産生量は同じ程度であり、ＨｍＬｕ−１細胞及び
ＢＨＫ−２１細胞を用いた方法では、ＣＥＦ培養法に比
べ、細胞播種密度当たりのウイルス産生量は約１０倍高
い。
従うＬＭＨ細胞及びＶｅｒｏ細胞を用いたＡＲＶ培養法
はＣＥＦ培養法と比較すると、細胞播種密度当たりのウ
イルス産生量は同じ程度であり、ＨｍＬｕ−１細胞及び
ＢＨＫ−２１細胞を用いた方法では、ＣＥＦ培養法に比
べ、細胞播種密度当たりのウイルス産生量は約１０倍高
い。
【００２６】実施例３ ＡＲＶ抗原による鶏の免疫 ＬＭＨ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、 ＨｍＬｕ−１細胞又はＢ
ＨＫ−２１細胞で増殖させたＡＲＶ浮遊液に、ホルマリ
ンを０．２％の濃度になるように加え、３７℃、８日間
感作しウイルスを不活化した後、これにアルミニウム量
で１．９ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムゲル溶液を等
量加え、不活化ワクチンを試作した。該試作ワクチン又
はＣＥＦで増殖させたＡＲＶを用い製造した市販の不活
化ワクチンを３５日齢の特定病原体に感染していない鶏
（ＳＰＦ鶏）に外側筋肉内に注射し、注射４週後に採血
し、この免疫血清について中和抗体価を測定した。中和
抗体価の測定には、ＳＰＦ鶏群由来の鶏腎細胞を牛血清
５％（Ｖ／Ｖ）を含むイーグルＭＥＭ培地（ｐＨ７．
２）でシャーレに培養し単層となったものを用いた。免
疫血清を上記のイーグルＭＥＭ培地で希釈した後、各希
釈血清と０．１ｍｌ中２００ＰＦＵを含む中和用ウイル
ス液と等量混合し、４℃で１８時間感作した。次いで、
この各感作液０．１ｍｌずつを培養細胞に接種し、３７
℃で６０分間静置吸着させた後、１次寒天培地を加え、
４日間培養し、その後、２次寒天培地（寒天１％を含む
０．５％ニュートラルレッドを２％になるように添加し
たイーグルＭＥＭ培地、ｐＨ７．２）を重層し、プラッ
ク数を測定した。プラック数を９０％減少させる血清の
最高希釈倍数で中和抗体価を表したところ、表３の結果
を得た。
ＨＫ−２１細胞で増殖させたＡＲＶ浮遊液に、ホルマリ
ンを０．２％の濃度になるように加え、３７℃、８日間
感作しウイルスを不活化した後、これにアルミニウム量
で１．９ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムゲル溶液を等
量加え、不活化ワクチンを試作した。該試作ワクチン又
はＣＥＦで増殖させたＡＲＶを用い製造した市販の不活
化ワクチンを３５日齢の特定病原体に感染していない鶏
（ＳＰＦ鶏）に外側筋肉内に注射し、注射４週後に採血
し、この免疫血清について中和抗体価を測定した。中和
抗体価の測定には、ＳＰＦ鶏群由来の鶏腎細胞を牛血清
５％（Ｖ／Ｖ）を含むイーグルＭＥＭ培地（ｐＨ７．
２）でシャーレに培養し単層となったものを用いた。免
疫血清を上記のイーグルＭＥＭ培地で希釈した後、各希
釈血清と０．１ｍｌ中２００ＰＦＵを含む中和用ウイル
ス液と等量混合し、４℃で１８時間感作した。次いで、
この各感作液０．１ｍｌずつを培養細胞に接種し、３７
℃で６０分間静置吸着させた後、１次寒天培地を加え、
４日間培養し、その後、２次寒天培地（寒天１％を含む
０．５％ニュートラルレッドを２％になるように添加し
たイーグルＭＥＭ培地、ｐＨ７．２）を重層し、プラッ
ク数を測定した。プラック数を９０％減少させる血清の
最高希釈倍数で中和抗体価を表したところ、表３の結果
を得た。
【００２７】
【表３】
【００２８】上記の結果から明らかなように、本発明に
従うＬＭＨ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｍＬｕ−１細胞及び
ＢＨＫ−２１細胞で増殖させて得たＡＲＶ不活化ワクチ
ンは、ほぼ市販品と同程度に鶏に対し中和抗体を惹起す
る力価を有する。
従うＬＭＨ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｍＬｕ−１細胞及び
ＢＨＫ−２１細胞で増殖させて得たＡＲＶ不活化ワクチ
ンは、ほぼ市販品と同程度に鶏に対し中和抗体を惹起す
る力価を有する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/15 ＡＦＥ Ａ６１Ｋ 39/15 ＡＦＥ
Claims (12)
- 【請求項１】トリレオウイルスを鳥類又は哺乳類由来の
株化細胞に感染させて該ウイルスを増殖させることを特
徴とするトリレオウイルス又はその抗原成分の調製法。 - 【請求項２】鳥類由来の株化細胞が鶏系株化細胞である
請求項１に記載の調製法。 - 【請求項３】鶏系株化細胞がＬＭＨ細胞である請求項２
に記載の調製法。 - 【請求項４】哺乳類由来の株化細胞がエイブ系株化細胞
である請求項１に記載の調製法。 - 【請求項５】エイブ系株化細胞がＶｅｒｏ細胞である請
求項４に記載の調製法。 - 【請求項６】哺乳類由来の株化細胞がハムスター系株化
細胞である請求項１に記載の調製法。 - 【請求項７】ハムスター系株化細胞がＨｍＬｕ−１又は
ＢＨＫ−２１細胞である請求項６に記載の調製法。 - 【請求項８】請求項１ないし７のいずれかに記載の調製
法により得られるトリレオウイルス又はその抗原成分。 - 【請求項９】トリレオウイルスに対する中和活性を有す
る抗体を誘発しうる、請求項８に記載のトリレオウイル
ス又はその抗原成分。 - 【請求項１０】請求項８又は９に記載のトリレオウイル
ス又はその抗原成分を含有することを特徴とするトリレ
オウイルス感染症ワクチン。 - 【請求項１１】請求項１０に記載のワクチンを家禽に投
与することを特徴とするトリレオウイルス感染症の予防
法。 - 【請求項１２】請求項１０に記載のワクチンと、他のウ
イルス、マイコプラズマ、細菌及び寄生虫よりなる群か
ら選ばれた少なくとも１種類の微生物に由来する抗原と
を含有することを特徴とする混合ワクチン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19368198A JPH1175833A (ja) | 1997-06-23 | 1998-06-23 | トリレオウイルスの調製法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18312197 | 1997-06-23 | ||
| JP9-183121 | 1997-06-23 | ||
| JP19368198A JPH1175833A (ja) | 1997-06-23 | 1998-06-23 | トリレオウイルスの調製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1175833A true JPH1175833A (ja) | 1999-03-23 |
Family
ID=26501670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19368198A Pending JPH1175833A (ja) | 1997-06-23 | 1998-06-23 | トリレオウイルスの調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1175833A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012025784A (ja) * | 2004-09-09 | 2012-02-09 | Novartis Vaccines & Diagnostics Gmbh & Co Kg | インフルエンザワクチンに関連する潜在的医原性リスクの減少 |
-
1998
- 1998-06-23 JP JP19368198A patent/JPH1175833A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012025784A (ja) * | 2004-09-09 | 2012-02-09 | Novartis Vaccines & Diagnostics Gmbh & Co Kg | インフルエンザワクチンに関連する潜在的医原性リスクの減少 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050425 |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070814 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20071211 |