CN1202378A - 使用细胞系来制备传染性囊病病毒及禽呼肠病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备传染性囊病病毒(IBDV)或禽呼肠病毒(ARV)的方法,该方法包括用IBDV或ARV感染来自禽类或来自哺乳动物的细胞系,培养所说的细胞系以增殖病毒以及从所说的细胞系中回收所说的病毒;传染性囊病或禽呼肠病毒传染病的疫苗,其中所说的疫苗包括作为活性成分的IBDV或ARV抗原;以及一种通过使用所说的疫苗来预防传染性囊病或禽呼肠病毒传染病的方法。

Description

使用细胞系来制备传染性囊 病病毒及禽呼肠病毒的方法

本发明涉及一种使用细胞系制备传染性囊(bursal)病病毒(IBDV)和禽呼肠病毒(ARV)的方法。更具体地讲，本发明涉及一种用于制备IBDV和ARV的方法，该方法包括用IBDV或ARV感染细胞系，培养所说的受到感染的细胞系以便增殖IBDV或ARV以及从所说的受病毒感染的细胞中回收IBDV或ARV。对IBDV而言，上述细胞系为那些从禽类得到的细胞系，而对ARV而言为从禽类或者哺乳动物中得到的细胞系。本发明还涉及传染性囊病和禽呼肠病毒传染病的疫苗以及用所说的疫苗预防传染性囊病和禽呼肠病毒传染病的方法，而所说的疫苗包括作为主要成分的由所说的方法获得的IBDV或ARV抗原。

传染性囊病为一种由传染性囊病病毒(下文也称作“IBDV”)引起的鸡急性传染病。传染性囊病为一种病毒疾病，该病的主要症状为包括法氏囊在内的淋巴组织发生坏死。当感染鸡时，IBDV抑制宿主的免疫应答，从而通过疫苗免疫作用的减小或者宿主抵抗力的降低而造成诱发并加剧了由机会性感染引起的多种疾病。针对IBDV，已经鉴定出两种血清型(血清型1和2)。尽管血清型1和2都感染鸡，但是血清型1的病毒诱导传染性囊病的发作。

禽呼肠病毒(下文也称作“ARV”)为一种由于腱鞘炎、腹泻或者生长迟缓引起腿虚弱的传染病。ARVs广泛分布于鸡中并且被分成许多的血清型。每种血清型都表现出不同的致病性，并且疾病的严重性在很大程度上受到上述多种致病性、感染的程度和途径或者鸡的年龄和免疫力的影响。IBDV或ARV对鸡的感染将造成很大的经济损失。

迄今为止，为了预防各种IBDV或ARV的感染，已经研制出了几种疫苗并且可以通过商业途径得到它们。通过把IBDV接种到鸡中以使上述病毒在法氏囊中增殖、通过把IBDV接种到正在形成胚胎的蛋中以使上述病毒在绒毛膜尿囊的膜、胚胎或者尿囊中增殖、通过在鸡胚成纤维细胞(CEF)中培养上述病毒以及类似的方法(家禽疾病，第8版，566-576，1984)已经生产出用于制备传染性囊病疫苗的抗原物质。例如通过用ARV感染CEF以便增殖所说的病毒并从中回收该病毒，已经生产出用于制备ARV传染病疫苗的抗原物质(T.Uchimura，日本家禽疾病协会杂志，第26卷，26-30，1990)。

但是，如上所述的常规方法因其耗费体力和时间而有不足之处，这表现在以下方面：当使用鸡时，需要孵化许多的鸡并从这些鸡中无菌地取出法氏囊；在蛋的生产中，当使用正在形成胚胎的蛋时，需要孵化这些蛋并从正在形成胚胎的蛋中无菌地取出绒毛膜尿囊的膜、鸡的胚胎或者尿囊液；或者当使用CEFs时，从正在形成胚胎的蛋中得到鸡的胚胎，切割该胚胎并用酶法进行处理以便得到CEFs。另外在这些方法中，由于在生产疫苗时使用了不同的起始培养细胞或组织，所以也不容易保持疫苗质量的稳定。

反之，使用用于感染并增殖病毒的细胞系以便从受感染的细胞中获得用于生产疫苗的病毒抗原将会使用于生产病毒的起始物质的制备更加容易，提高了生产率并且可以保持疫苗质量的稳定。

迄今为止，已经报道了许多从哺乳动物或禽类得到的细胞系(Witter R.L.与禽类病理学委员会，8，487-498，1979)，其中包括例如从仓鼠的肺中得到的HmLu-1细胞(H.Okumura，培养物中的癌细胞，292-298，1968)，从仓鼠的肾中得到的BHK-21细胞(LAN Macpherson和Michael Stoker，病毒学，16：147-151，1962)，Vero细胞、即一种类人猿的细胞系(Y.Yasumura，A.Kawayoshi，Nippon Rinsho，第21卷，第6期，1201-1219，1963)，从鸡的成淋巴细胞中得到的细胞系(Akiyama和Kato，BikenJ.，17：105-116，1974)，用劳斯肉瘤病毒或致癌物处理的鸡成纤维细胞(Kaaden等人，In Vitro，18：827-834，1982；H.Ogura等人，Gann.，75：410-414，1984；Dinowitz M.，国家癌症研究院杂志，58：307-312，1977；Lerman等人，国家癌症研究院杂志，57：295-301，1976)，用亚硝基胍处理的鸡胚成纤维细胞CHCC-OU2细胞(H.Ogura等人，Acta Med Okayama，41(3)141-143，1987)，从用致癌物处理的特有的鸡上皮肝细胞癌中得到的LMH细胞(Kawaguchi等人，癌症研究，47：4460-4464，1987)以及类似的细胞。

但是，这些常规的细胞系或者生产出一些用于无限增殖化的病毒，或者由于上述报道公开了病毒在宿主细胞中的增殖能力但却从未公开所得到的病毒抗原的免疫原性从而证实上述细胞系不适于生产传染性囊病或禽呼肠病毒传染病的疫苗。

P.D.Lukert等人公开了IBDV在来自类人猿的哺乳动物细胞系中的增殖(Am.J.Vet.Res.，第36卷，第4期，1975：539-540；日本专利公开号2-78634)。但是，Lukert等人也报道了随给药途径而定在用在鸡胚肾细胞中增殖的IBDV抗原免疫接种的鸡和用为IBDV所适应的Vero细胞(非洲绿猴的肾细胞系)免疫接种的鸡之间，保护鸡免受IBDV病毒攻击的能力有所不同。即用从鸡胚肾细胞中得到的IBDV抗原免疫接种的那些鸡表现为通过皮下给药及通过饮水给药都能完全地保护鸡不受病毒的攻击，而用从Vero细胞得到的IBDV免疫接种的那些鸡在皮下给药时可以保护鸡不受病毒的攻击，但通过饮水给药时却不能对鸡进行保护。以不同的给药途径而观察到的保护效果有所不同的理由可能在于用来自哺乳动物的细胞和来自禽类的细胞生产的病毒抗原在其糖类结构方面有所区别、从而引起抗原性的不同，结果可能会影响作为疫苗诱导免疫力的能力。也就是说，即使观察到了病毒对宿主细胞的敏感性以及病毒在宿主细胞中的增殖，所得到的病毒的抗原性可能会随着病毒与宿主细胞的结合而改变。因此，为了证实从病毒/宿主细胞的每种结合得到的病毒抗原适用于疫苗，就必须测定每种病毒抗原的免疫原性。Lukert等人的上述报道也表明来自哺乳动物的细胞系不利于生产传染性囊病的疫苗。

从实施例1所示的结果显而易见，尽管IBDV和ARV可以感染来自禽类的细胞系、LMH和CHCC-OU2，但除了IBDV和ARV以外还有多种禽类传染性病毒仅仅可以感染LMH和CHCC-OU2中的一种或者这两种细胞系都不能被感染。即存在多种禽类传染性病毒，这些病毒在其对宿主细胞的敏感性以及在宿主细胞中的增殖方面可以有所不同。因此，尽管Lukert等人揭示出IBDV可以感染来自哺乳动物的细胞系并在其中进行增殖，但Lukert等人的公开文件中从未表明IBDV和ARV可以感染来自鸡(禽类)的细胞系以及在其中进行的增殖。

在这种情况下，本发明人已经研究开发了一种通过简单的方式用于制备作为疫苗的抗原物质的IBDV或ARV的方法，该方法生产率高并且质量稳定，结果发明人已经发现使用对病毒的感染和增殖具有特异性的细胞系可以生产出病毒或其抗原组分，其中病毒对宿主细胞的敏感性、病毒在宿主细胞中的增殖以及得到的病毒抗原的免疫原性都很显著，而且病毒抗原可以诱导对IBDV或ARV具有中和活性的抗体的生产。即本发明人已经发现了IBDV对LMH细胞、对来自鸡特有的上皮肝细胞癌的细胞生长良好的细胞系具有高敏感性，并且从受到IBDV感染的LMH细胞中得到的病毒的数量与从受IBDV感染的CEF细胞中得到的量相当。而且，本发明人已经制备了一种含有从LMH细胞得到的病毒抗原的疫苗并用所说的疫苗免疫接种鸡，结果本发明人已经发现在鸡的血清中诱导出了对IBDV具有高度中和活性的抗体。

本发明人也已经发现ARV对禽类的细胞系LMH细胞以及哺乳动物细胞系Vero、BHK-21和HmLu-1细胞具有高的敏感性并且在上述细胞中生长良好，并且发现生所说的病毒抗原制备的疫苗对ARV具有足够的免疫原性。

本发明的一个目的为提供一种通过使用禽类细胞系LMH细胞来制备可以诱导对IBDV具有中和活性的抗体生产的IBDV抗原的方法以及一种通过使用禽类细胞系LMH细胞或哺乳动物细胞系Vero、BHK-21或HmLu-1细胞来制备可以诱导对ARV具有中和活性的抗体生产的ARV抗原的方法。

本发明的另一个目的为提供传染性囊病和ARV传染病的疫苗，该疫苗包括IBDV或ARV或生上述方法生产的这些病毒的抗原成分。

本发明的再一个目的为提供一种混合疫苗，该疫苗包括所说的传染性囊病和ARV传染病的疫苗中的至少一种疫苗以及一种来自至少一种微生物的抗原，而所说的微生物选自生其它的病毒、支原体、细菌和寄生虫组成的组中。

本发明的方法的特征在于使用了来自哺乳动物或者禽类的细胞系来增殖IBDV或ARV。

可以根据本发明的方法进行生产的IBDV菌株例如包括菌株SAL，D-78，OH，Variabt-A，2512，03，03BF，FK-78，K以及类似的菌株，其中优选减毒的IBDV菌株K。用于增殖病毒的宿主细胞可以是来自禽类的任意的细胞系，只要IBDV可以在其中进行增殖并且不生产不希望有的病毒即可。优选使用鸡的细胞系。上述细胞系优选包括来自鸡特有的上皮肝细胞癌的LMH细胞以及CHCC-OU2细胞，其中优选LMH细胞。

可以根据本发明的方法进行生产的ARV菌株例如包括菌株58-132E50，S1133，P100，CO8以及类似的菌株，其中优选菌株58-132E50。用于增殖病毒的宿主细胞可以是来自哺乳动物或禽类的任意的细胞系，只要ARV可以在其中进行增殖并且不生产不希望有的病毒即可。一种来自哺乳动物的细胞系优选包括类人猿的细胞系或仓鼠的细胞系，更优选Vero细胞、BHK-21细胞或HmLu-1细胞。一种来自禽类的细胞系优选包括一种鸡的细胞系，更优选LMH细胞。

用于制备增殖IBDV或ARV的细胞和细胞培养物的培养基可以是任意的用于通常的组织培养的培养基。例如，可以使用补充有0至30％的小牛、鸡或山羊血清的Eagle MEM培养基，其中补充的上述血清的量优选为2至5％。

为了增殖病毒，将制备成密度为每1ml培养基1×10⁴至3×10⁶个细胞的上述细胞的悬浮液与病毒溶液混合，其中优选的细胞密度为每1ml培养基1×10⁵至1×10⁶个细胞。可以通过使混合物在Roux烧瓶或滚瓶中保持静止的静置培养来培养上述细胞，可以通过采用中空纤维的附着培养来培养细胞，通过悬浮并培养附着在载体(例如微载体)上的细胞可以进行悬浮培养，或者可以通过悬浮并培养细胞而不必把细胞附着在载体上的悬浮培养以及类似的方式来培养细胞。另一方面，首先通过上述任意一种培养方法单独培养细胞1至3天，之后将病毒溶液接种到培养的细胞中并继续进行培养。可以在30至42℃、优选32至38℃的温度范围内进行细胞的培养。可以将培养持续到病毒的数量达到最大值时为止，优选的培养时间为2至8天。在氢离子浓度(pH)在6至8、优选6.5到7.5的范围内以及溶氧(DO)在1至6 ppm、优选2至4ppm的范围内可以使用发酵罐进行大规模培养。

可以使用通过本发明的方法制备的IBDV和ARV抗原作活疫苗或者在按照需要将所说的病毒抗原灭活后作为灭活疫苗。通过在1500rpm下离心由上述培养方法得到的培养溶液、移走用作病毒悬浮液的上清液、向其中加入稳定剂(例如乳糖)并且冻干悬浮液便可以制备出活疫苗。为了制备灭活疫苗，向上述病毒悬浮液中加入如福尔马林、戊二醛或β-丙醇酸内酯等的灭活剂从而使病毒灭活，然后向其中加入免疫增强剂，如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钾、矿物油或非矿物油等。

本发明经过如上制备的疫苗可以诱导对病毒具有中和活性的抗体的生产，并且通过肌肉或皮下注射疫苗或将疫苗注射进入蛋中、通过喷雾的方式吸入、通过用滴注设备在眼或鼻中滴注或者把疫苗和饮用水混合来向家禽给药。

也可以把本发明的传染性囊病和禽呼肠病毒传染病的疫苗按照混合疫苗来使用。当本发明的疫苗为活疫苗的形式时，将至少一种用于传染性囊病或禽呼肠病毒传染病的活疫苗与至少一种抗其它病毒的活疫苗结合起来，其中上述病毒选自由鸡瘟病毒(NDV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)、Marek’s病病毒(MDV)和禽脑脊髓炎病毒组成的组中。当本发明的疫苗为灭活疫苗的形式时，将至少一种用于传染性囊病或禽呼肠病毒传染病的灭活疫苗与至少一种抗其它病毒、细菌(例如大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌等)、支原体(例如鸡败血支原体、滑液支原体等)和寄生虫(例如艾美球虫属)的灭活疫苗结合起来，其中上述病毒选自由NDV、IBV、卵下垂综合症-1976病毒(egg drop syndrome-1976 virus)(EDSV)组成的组中。

根据本发明提供了传染性囊病和禽呼肠病毒传染病的疫苗来分别预防传染性囊病和禽呼肠病毒传染病。根据本发明的方法，可以在与常规方法相比成本更低的情况下稳定地供应质量恒定的疫苗。

通过下面的实施例将更为详细地解释本发明，但这不应构成对本发明的限制。实施例1(病毒对LMH和CHCC-OU2细胞的敏感性)

将LMH细胞(ATCC No.CRL-2117)或CHCC-OU2细胞悬浮在补充有5％小牛血清的Eagle MEM培养基(pH 7.2)中，其中细胞的密度为6×10⁵/ml，在把5ml悬浮液转移到培养皿中之后，在37℃下、在CO₂培养箱中培养细胞24小时。在移走培养上清液后，将各0.1ml(感染复数＝1)的ARV(菌株58-132E50)、IBDV(菌株K)、ILTV(菌株CE)、火鸡的疱疹病毒(HVT)(菌株YT-7)、NDV(菌株B1)、IBV(菌株Nerima)或EDSV(菌株KE-80)接种到细胞中。在37℃下保持细胞静止1小时并加入5ml补充有5％小牛血清的EagleMEM培养基之后，在37℃下再继续培养5至7天。在培养开始后，定期地取出培养溶液以测定病毒的含量。用鸡胚细胞通过50％的感染滴度来测定ARV和IBDV的病毒含量，用鸡肾细胞通过50％的感染滴度测定病毒含量，用鸡胚细胞通过噬斑方法(噬斑形成单位；PFU)测定HVT的病毒含量，用正在形成胚胎的鸡蛋通过50％的感染滴度来测定NDV和IBV的病毒含量，用鸡胚肝细胞通过50％的感染滴度来测定EDSV的病毒含量。结果显示在表1中。

表1

病毒        菌株        细胞(TCID₅₀/ml)

                        LMH    CHCC-OU2

ARV      58-132E50     10^9.0   10^9.0

IBDV          K        10^8.1   10^8.6

ILTV         CE        10^6.5     -¹⁾

HVT         YT-7         -        -

NDV          B1          -      10^6.3

IBV        Nerima        -        -

EDSV        KE-80        -        -(注释)1)：没有增殖

如表1所示，ARV和IBDV在LMH和CHCC-OU2细胞中都进行了增殖，ILTV仅在LMH细胞中增殖，而NDV仅在CHCC-OU2细胞中增殖。其它的病毒对上述细胞没有表现出敏感性。实施例2(制备IBDV抗原)

将LMH细胞(ATCCNo.CRL-2117)以2×10⁵/ml的密度悬浮在200ml补充有5％小牛血清的EagleMEM培养基(pH7.2)中。在感染复数为1的条件下，将悬浮液与减毒的IBDV菌株K(Y.Ohtaki，本家禽疾病协会杂志，第18卷，特刊，1-15，1982)混合并且在滚瓶中搅拌混合物的同时在37℃下培养细胞3天。作为对照，将CEF细胞以2×10⁶/ml的密度悬浮在200ml上述MEM培养基中，在感染复数为0.001的条件下将悬浮液与减毒的IBDV菌株K混合并且在滚瓶中搅拌混合物的同时在37℃下培养细胞3天。

在1500rpm下离心上述每种培养液并将得到的上清液当作病毒溶液来使用。根据日本用于动物的生物制品的最低需求量(由日本兽医生物药品协会出版，178-183，1993年6月)来测定病毒溶液的病毒含量。即在补充有5％小牛血清的EagleMEM培养基(pH7.2)中以1.2×10⁶/ml的密度制备CEF细胞的悬浮液，在把0.5ml的悬浮液转移到24孔板之后，在37℃下培养细胞24小时。在移走培养上清液后，向5个孔的每个孔中各加入0.2ml用病毒稀释剂(磷酸盐缓冲盐水：PBS)稀释了10倍的样品病毒溶液。在吸附1小时后，加入0.5ml补充有5％小牛血清的EagleMEM培养基(pH7.2)，在37℃下培养细胞6天并通过Behrens-Karber方法计算TCID₅₀。在表2中显示了结果。

表2

细胞    病毒的含量    每个细胞所生产的病毒的数量

        (TCID₅₀/ml)   (TCID₅₀/2×10⁵细胞)

LMH       10^8.1               10^8.2

CEF       10^8.2               10^7.2

如表2所示，结果表明按每个接种的细胞计算，根据本发明采用LMH细胞进行IBDV的培养可以生产出比采用CEF细胞培养高出大约10倍量的病毒。实施例3(用IBDV抗原免疫接种鸡)

在PBS中，在10⁵²TCID₅₀/ml的条件下制备出用在LMH细胞中增殖的IBDV制得的活疫苗以及用在CEF细胞中增殖的IBDV制得的可以通过商业途径得到的活疫苗。将各0.2ml的疫苗经口服给药至14天大的SPF鸡，并在给药后两周按照日本用于动物的生物制品的最低需求量(由日本兽医生物制品协会出版，178-183，1993年6月)来测定中和抗体滴度。即在1.2×10⁶/ml的密度下在补充5％小牛血清的EagleMEM培养基(pH7.2)中制备CEF细胞的悬浮液并将5ml的悬浮液转移到培养皿中。在培养24小时后，除去培养上清液并向其中接种0.1ml用等量的病毒溶液连续稀释的血清的混合物来进行在4℃下温育18小时的中和试验(200PFU/0.1ml)。

在37℃下保持混合物静止1小时后，加入第一层琼脂培养基(含有1％琼脂、0.295％胰蛋白  磷酸盐肉汤和2％小牛血清的Eagle MEM培养基，pH7.2)并在37℃下静止培养2天。然后，铺制第二层琼脂培养基(含有1％琼脂、0.295％胰蛋白磷酸盐肉汤和0.01％中性红的EagleMEM培养基，pH7.2)，在37℃下静止培养24小时。将可以使噬斑的数目减少50％的血清的最大稀释度表示为中和抗体滴度。在表3中显示出结果。

                    表3

疫苗              细胞   鸡的数量         中和抗体滴度

                                     ＜200  200  800  ≥3200

本发明的疫苗      LMH       10          0    0    4      6

可以通过商业途径  CEF       10          0    0    3      7

得到的疫苗

如表3所示，根据本发明从在LMH细胞中增殖的病毒制备的IBDV活疫苗表现出与可以通过商业途径得到的疫苗的滴度相同，而该滴度足以预防鸡感染上IBDV。实施例4(制备ARV抗原)

在6×10⁵/ml的密度下，把Vero细胞(ATCC No.CCL-81)、HmLu-1细胞(由农业与林业部发放，国家动物健康研究院)、BHK-21细胞(ATCCNo.CCL-10)或LMH细胞(ATCC No.CRL-2117)悬浮在200ml补充有5％小牛血清的EagleMEM培养基(pH7.2)中。在感染复数为1的条件下，将上述悬浮液与ARV菌株58-132E50(日本家禽疾病协会杂志，23(2)38，1990)混合，并在滚瓶中搅拌混合物的同时在37℃下培养细胞7天。作为对照，将CEF细胞以2×10⁶/ml的密度悬浮在200ml的上述MEM培养基中，在滚瓶中搅拌混合物的同时在37℃下培养细胞1天，在感染复数为0.001的条件下用ARV菌株58-132E50接种上述细胞并在37℃下再培养4天。在1500rpm下离心上述培养溶液并把得到的上清液当作病毒悬浮液来使用。

通过用补充有1％小牛血清的EagleMEM培养基(pH7.2)连续10倍地稀释病毒悬浮液、把每种稀释的悬浮液接种到在微滴板上培养了24小时的CEF细胞中、培养上述CEF细胞4天并测定50％的感染滴度来测定病毒悬浮液的病毒含量。在表4中显示出结果。

表4

细胞       病毒的含量    每个细胞所生产的病毒的数量

           (TCID₅₀/ml)      (TCID₅₀/6×10⁵细胞)

Vero          10^8.0                10^8.0

HmLu-1        10^8.9                10^8.9

BHK-21        10^8.9                10^8.9

LMH           10^8.3                10^8.3

CEF           10^8.5                10^8.0

如表4所示，结果表明按每个接种的细胞计算，根据本发明采用Vero细胞或LMH细胞进行ARV的培养可以生产出与采用CEF细胞培养相同量的病毒，而按每个接种的细胞计算，采用HmLu-1细胞或BHK-21细胞进行ARV的培养可以生产出比采用CEF细胞培养高出大约10倍量的病毒。实施例5(用ARV抗原免疫接种鸡)

向在LMH细胞、Vero细胞或HmLu-1细胞中增殖的ARV病毒的悬浮液中加入浓度为0.2％的福尔马林，并且在37℃下使上述细胞致敏8天从而使病毒灭活。向其中加入等量的铝含量为1.9mg/ml的氢氧化铝凝胶的悬浮液，从而制备出灭活疫苗。

在大腿肌处，把如上制备的疫苗和用在CEF细胞中增殖的ARV制备的可以通过商业途径得到的灭活疫苗经肌肉注射到35天大的SPF鸡中。在注射后四周，从鸡的体内取血并测定免疫接种的血清的中和抗体滴度。为了测定中和抗体滴度，在培养皿中在补充有5％(V/V)小牛血清的Eagle MEM培养基(pH7.2)上培养来自SPF鸡的鸡肾细胞，从而生成一单层细胞。

在用上述EagleMEM培养基稀释免疫接种的血清后，将每种稀释的血清与等量的含有200PFU/0.1ml的用于中和的病毒溶液混合，并且在4℃下致敏18小时。然后，将各0.1ml的致敏溶液接种到培养的细胞中并在37℃下保持上述混合物静止60分钟以进行吸附。之后加入第一琼脂培养基并培养细胞4天，铺制第二琼脂培养基(含有1％琼脂和0.5％中性红的EagleMEM培养基，含量为2％，pH7.2)并测定噬斑的数量。将可以使噬斑的数量减少90％的血清的最大稀释度表示为中和抗体滴度。在表5中显示了结果。

                    表5

疫苗             细胞   鸡的数量      中和抗体滴度

                                  ＜160  160  640 2560

本发明的疫苗     LMH       10        0    6    3    1

本发明的疫苗     Vero      10        1    7    2    0

本发明的疫苗     HmLu-1    10        0    7    3    0

可以通过商业途径 CEF       10        0    6    4    0

得到的疫苗

如表5所示，根据本发明从在Vero细胞、LMH细胞或HmLu-1细胞中增殖的病毒中制备的ARV疫苗表现出与可以通过商业途径得到的疫苗的滴度相同，其中所说的滴度可以诱导在鸡中生产中和抗体。

Claims (20)

1.一种用于制备传染性囊病病毒或其抗原成分的方法，该方法包括用传染性囊病病毒感染来自禽类的细胞系，培养所说的细胞系以增殖所说的病毒以及从所说的细胞系中回收所说的病毒。

2.权利要求1的方法，其中所说的来自禽类的细胞系为鸡的细胞系。

3.权利要求2的方法，其中所说的鸡的细胞系为LMH细胞或CHCC-OU2细胞。

4.通过如权利要求1至3之任一所述的方法制备的传染性囊病病毒或其抗原成分。

5.叔利要求4的传染性囊病病毒或其抗原成分，其中它们可以诱导对传染性囊病病毒具有中和活性的抗体的生产。

6.一种传染性囊病的疫苗，该疫苗包括如权利要求4或5所述的传染性囊病病毒或其抗原成分。

7.一种用于预防传染性囊病的方法，该方法包括把如权利要求6所述的疫苗向家禽给药。

8.一种混合疫苗，该疫苗包括如权利要求6所述的疫苗以及一种来自至少一种微生物的抗原，而所说的微生物选自由其它的病毒、支原体、细菌和寄生虫组成的组中。

9.一种用于制备禽呼肠病毒或其抗原成分的方法，该方法包括用禽呼肠病毒感染来自禽类或来自哺乳动物的细胞系，培养所说的细胞系以增殖所说的病毒以及从所说的细胞系中回收所说的病毒。

10.权利要求9的方法，其中所说的来自禽类的细胞系为鸡的细胞系。

11.权利要求10的方法，其中所说的鸡的细胞系为LMH细胞。

12.权利要求9的方法，其中所说的来自哺乳动物的细胞系为类人猿的细胞系。

13.权利要求12的方法，其中所说的类人猿的细胞系为Vero细胞。

14.权利要求9的方法，其中所说的来自哺乳动物的细胞系为仓鼠的细胞系。

15.权利要求14的方法，其中所说的仓鼠的细胞系为HmLu-1细胞或BHK-21细胞。

16.通过如权利要求9至15之任一所述的方法制备的禽呼肠病毒或其抗原成分。

17.权利要求16的禽呼肠病毒或其抗原成分，其中它们可以诱导对禽呼肠病毒具有中和活性的抗体的生产。

18.一种禽呼肠病毒传染病的疫苗，该疫苗包括如权利要求16或17所述的禽呼肠病毒或其抗原成分。

19.一种用于预防禽呼肠病毒传染病的方法，该方法包括把如权利要求18所述的疫苗向家禽给药。

20.一种混合疫苗，该疫苗包括如权利要求18所述的疫苗以及一种来自至少一种微生物的抗原，而所说的微生物选自由其它的病毒、支原体、细菌和寄生虫组成的组中。