CN103923885B - 鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株，属于生物工程领域。本发明涉及的鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株命名为：Ck/Jiangsu/NJ-23/2008；该毒株的保藏编号为CGMCC？NO.8852；该毒株从野毒分离、鸡胚传代、Vero细胞传代适应，最终获得能够在无血清培养的Vero细胞上高效增殖的毒株；该毒株在无血清培养的Vero细胞上连续传代培养，TCID₅₀可保持在10^8.5/mL以上；将病毒培养液灭活，制备成油乳剂，免疫鸡体后经检测具有很好的免疫原性。本发明提供的IBDV毒株与其生产工艺简单、安全、高效、适合工业放大培养。

Description

鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株及其应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病（InfectiousBursalDisease,IBD），是由传染性法氏囊病毒（IBDV）引起的鸡的一种高度接触性传染病，最早发生于美国Delaware州的Gamboro地区，主要感染3~6周龄的青年鸡，病毒在法氏囊的淋巴细胞中迅速繁殖，损伤法氏囊的B淋巴细胞，引起严重的免疫抑制。1980年以后该病传入我国并大面积暴发和持续流行，严重影响了我国养鸡业的发展，当前对于该病普遍采用接种疫苗进行预防。

目前，国内生产的IBDV疫苗通常是采用鸡胚成纤维细胞培养增殖病毒。鸡胚成纤维细胞在培养过程中需要添加一定量的新鲜血清，常用胎牛血清或小牛血清，但是血清成份在提纯和收获细胞产物的过程中带来很大困难，且每批血清的质量不同，从而影响疫苗的稳定性，同时在疫苗使用过程中还可能诱发过敏反应。

随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括Vero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清悬浮培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。

当前，国内生产的IBDV疫苗的病毒效价偏低，且免疫保护效率偏低；在生产方式上仍使用转瓶接种IBDV的生产方式，培养体积0.5L左右，无法进行大规模制备。

发明内容

本发明的目的是提供鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株，能够在Vero细胞上稳定增殖，培养过程中不需要添加血清，安全性高，病毒效价高，免疫原性强。

本发明的另一个目的是提供所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液的制备方法。采用微载体悬浮培养技术，适合大规模培养，该方法简单，安全，得到的病毒液效价高、质量稳定。

本发明的再一目的是提供所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用，采用该鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株制备的疫苗接种后，抗体效价高，持续期长，能够有效保护接种动物。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株，为鸡传染性法氏囊病毒Ck/Jiangsu/NJ-23/2008株，保藏编号为CGMCCNO.8852。

本发明还提供所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。

本发明还提供所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液。

本发明所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液的制备方法，包括：在无血清培养的Vero细胞上增殖所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株，得到病毒液。

在本发明中，所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株增殖过程中，Vero细胞贴附在微载体上，在动物细胞反应器内悬浮培养。

在本发明中，所述Vero细胞采用IVT培养基培养得到。

在本发明中，所述增殖过程中，细胞维持液为乳清蛋白水解物与IVT培养基的混合物。

本发明还提供一种疫苗组合物，其特征在于活性成分为灭活的所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株。

本发明还提供所述疫苗组合物的制备方法，将所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液灭活，然后与佐剂混合、乳化得到疫苗组合物。

有益效果：

本发明提供的鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株，能够在Vero细胞上稳定增殖，培养过程中不需要使用血清，安全性高，病毒效价高，免疫原性强。

本发明提供鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液的制备方法，采用微载体悬浮培养技术，适合大规模培养，该方法简单、安全、高效，得到的病毒液效价高、质量稳定，适合工业放大培养。

采用所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株制备的疫苗接种后，抗体效价高，持续期长，能够有效保护接种动物。

附图说明

图1显示传代次数对IBDV病毒NJ-23株效价的影响。

图2是接毒前Vero细胞的电镜图。

图3显示了粘附在微载体上的Vero细胞培养增殖IBDV过程。

具体实施方式

实施例1IBDV病毒的获得与特性测定

采用从我国江苏地区发病鸡群中分离的疑似鸡传染性法氏囊病料，接种无特定病原体（SpecificPathogenFree，SPF）鸡胚分离病毒，将该毒株在SPF鸡胚上增殖后，在鸡胚成纤维细胞上进行蚀斑纯化，通过不同蚀斑的纯化、筛选，最终获得病毒NJ株。

将病毒NJ株进行下列特性鉴定：

（1）病毒NJ株扩增：将病毒NJ株用无菌PBS缓冲液稀释10³倍后，以绒毛尿囊膜途径接种10~11日龄SPF鸡胚，接种量为0.2mL/胚，37℃培养，在36~48h内收获鸡胚的尿囊液。

（2）病毒的EID₅₀：将步骤（1）获得的鸡胚尿囊液用无菌PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，取稀释10⁶~10⁹倍的尿囊液，接种10~11日龄SPF鸡胚，接种量为0.2ml/胚，置37℃培养，弃去24h内死亡的鸡胚，剖检观察24h后至168h内死亡的鸡胚和168h仍健活的鸡胚的胚体情况，按出现有头部、颈部出血且胚体缩小，判为感染。检测结果为：步骤（1）获得的鸡胚尿囊液中病毒含量为10^7.5EID₅₀/mL。

（3）病毒特异性鉴定：设立病毒对照组和中和组，每组设有5个10~11日龄SPF鸡胚。将步骤（1）收获的尿囊液用无菌PBS稀释至10^4.0EID₅₀/mL，与等体积的抗鸡传染性法氏囊病特异性血清（购于中国兽医药品监察所）混合，室温中和1h后，以绒毛尿囊膜途径接种中和组鸡胚，每个鸡胚接种0.2mL；病毒对照组鸡胚，接种相同量病毒NJ株。接种后168h，中和组鸡胚全部健活，病毒对照鸡胚中死亡4个。将所有鸡胚尿囊液进行鸡红细胞凝集实验，均为阴性，说明该病毒NJ株为IBDV纯化病毒。

（4）病毒纯净性鉴定：按照现行《中国兽药典》附录进行细菌、霉菌、支原体及外源病毒检测，结果均为阴性。

（5）测定病毒NJ株的结构蛋白基因（VP2基因）序列，其序列如SEQIDNO：1所示。病毒NJ株VP2基因序列与当前IBDVOKYM日本超强毒株、B87中毒毒力疫苗株、PBG98弱毒株的同源性均在90%以上，说明病毒NJ株为鸡传染性法氏囊病毒，命名为鸡传染性法氏囊病毒NJ株，缩写为IBDV病毒NJ株。

实施例2鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的筛选

本实施将鸡传染性法氏囊病毒NJ株在无血清培养的Vero细胞上进行增殖，通过有限稀释法，筛选获得一株病毒滴度高、具有稳定遗传特性的IBDV病毒NJ-23。

具体方法：

（1）Vero细胞采用IVT培养基（无血清培养基，购于Gibico公司）培养至95%的汇合度，将Vero细胞采用0.1%胰酶消化后1000rpm离心，用新鲜的IVT培养基重悬细胞。将细胞进行计数，按照8×10⁵cell/孔铺制96孔板。

（2）筛选：用添加有终浓度为0.25~2.5%（质量百分浓度）乳清蛋白水解物（Sigma）的IVT培养基稀释NJ株病毒液，用5个稀释度(10^-4～10^-8)的病毒液感染步骤（1）铺满96孔板的单层Vero细胞，置37℃培养120h，收获病毒液。反复冻融3次，在鸡胚成纤维细胞上检测每孔病毒效价TCID₅₀（病毒效价测定详细步骤参照《中国兽药典》）。将病毒效价较高的培养物传代至铺满24孔板的单层Vero细胞继续培养，显微镜下观察细胞病变(CPE)，培养120h后收获病毒液。以相同方法重复克隆纯化3次，筛选获得病毒滴度高的鸡传染性法氏囊病毒Ck/Jiangsu/NJ-23/2008株，缩写为鸡传染性法氏囊病毒NJ-23株。

（3）病毒特异性鉴定：设立病毒对照组和中和组，每组设有5个10~11日龄SPF鸡胚。将鸡传染性法氏囊病毒NJ-23株培养液用无菌PBS稀释至10^4.0TID₅₀/mL，与等体积的抗鸡传染性法氏囊病特异性血清（购于中国兽医药品监察所）混合，室温中和1h后，以绒毛尿囊膜途径接种中和组鸡胚，每个鸡胚接种0.2mL；病毒对照组鸡胚，接种相同量病毒NJ-23株。结果显示：接种后168h，中和组鸡胚全部健活，病毒对照鸡胚中死亡4个。将所有鸡胚尿囊液进行鸡红细胞凝集实验，均为阴性，说明该病毒NJ-23株为IBDV纯化病毒。

（4）病毒稳定性检测：将IBDV病毒NJ-23株在Vero细胞（采用IVT培养基培养获得）上进行传代，并检测每个代次的病毒效价，结果见图1，发现在传代至30代后仍保持较高的病毒效价。

IBDV病毒NJ-23株的保藏信息如下：

生物材料（毒株）：Ck/Jiangsu/NJ-23/2008；

分类命名：鸡传染性法氏囊病毒；

拉丁文学名：InfectiousBursalDiseaseVirus,（IBDV）；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2014年3月6日；

保藏编号：CGMCCNo.8852。

实施例3在无血清微载体悬浮培养的Vero细胞上培养IBDV病毒NJ-23株病毒液

在无血清微载体悬浮培养的Vero细胞上培养IBDV病毒NJ-23株病毒液的方法，如下：

（1）无血清培养Vero细胞：在IVT培养基中培养Vero细胞，当细胞达到95%的汇合度，采用0.1%的胰酶消化后1000rpm离心，用新鲜的IVT培养基重悬细胞，将细胞按照一定比例分传至新的培养瓶中，继续培养至细胞达到95%的汇合度，获得Vero细胞。

（2）初始Vero细胞在无血清微载体悬浮培养：在IVT培养基中添加终浓度为0.25%（质量百分浓度）的乳清蛋白水解物后得到病毒维持液，其pH值为7.1。将步骤（1）获得的Vero细胞用0.1%的胰酶消化、离心后，重悬于新鲜的IVT培养基中，1500rpm离心10min后，取沉淀，获得Vero细胞。将Vero细胞按照3~4×10⁵cell/mL的初始密度加入微载体Cytodex1（购于GEHealthcare公司）中，同时加入病毒维持液，进入动物细胞反应器培养。培养条件：控制培养液pH值为7.1，悬浮培养搅拌速度35rpm、溶氧30%、温度37℃。

（3）IBDV病毒的增殖：待Vero细胞在微载体上的粘球率达到40~50%（图2），按照感染复数为0.01~0.2接种IBDV病毒NJ-23株，增殖病毒NJ-23株。增殖过程中，控制培养液pH值7.2、悬浮培养搅拌速度35rpm、溶氧30%、温度37℃。接毒后24h取样观察，发现Vero细胞仍处于生长阶段，Vero细胞密度可以达到5~8×10⁵cell/mL；接毒后48h，部分Vero细胞从微载体上脱落；接毒后72h，有50%左右细胞脱落；接毒后120h，大部分Vero细胞从微载体上脱落（图3），收获病毒培养物。

（4）病毒液效价的测定：将病毒培养物反复冻融3次，释放病毒，得到病毒液。在制备好的鸡胚成纤维细胞上测定病毒液的效价。

按照相同方法，在无血清微载体悬浮培养的Vero细胞上培养鸡传染性法氏囊病毒常规疫苗株B87（购于中国兽医药品监察所）；采用常规方法在鸡胚成纤维细胞上培养鸡传染性法氏囊病毒NJ株。

结果显示：

IBDV病毒NJ-23株在无血清微载体悬浮培养的Vero细胞增殖培养，在24h病毒液的效价TCID₅₀为10^4.5/mL，在120h病毒液的效价TCID₅₀为10^8.5/mL。

鸡传染性法氏囊病毒常规疫苗株B87在无血清微载体悬浮培养的Vero细胞上增殖，在120h病毒液的效价TCID₅₀为的10^6.0/mL；

鸡传染性法氏囊病毒NJ株在鸡胚成纤维细胞上培养，病毒液的最高效价TCID₅₀为10^7.0/mL。

结果表明，通过无血清微载体悬浮培养Vero细胞增殖的IBDV病毒NJ-23株的TCID₅₀远高于常规疫苗株B87，同时也比常规鸡胚成纤维细胞增殖IBDVNJ株的病毒效价高。

经过多次实验，发现IBDV病毒NJ-23株在无血清培养的Vero细胞上连续传代培养，TCID₅₀为可保持在10^8.5/mL以上。

实施例4IBDV病毒NJ-23株疫苗的免疫效果

为了验证IBDV病毒NJ-23株的免疫原性，制成疫苗后免疫，检测抗体效价、持续期、攻毒保护实验；同时免疫同类制品的商品苗:鸡传染性法氏囊病灭活疫苗（G株，哈尔滨维科生物技术开发公司），比较病毒免疫原性。

（1）、病毒液和疫苗制备：按照实施例3方法制备IBDV病毒NJ-23株病毒液，接毒后培养120h收获病毒液。病毒液经检测TCID₅₀效价大于等于10^8.0EID₅₀/mL后，经甲醛灭活获得灭活病毒液。将灭活病毒液与吐温-80按照体积比为96:4混合，获得水相。将白油与司本-80按照体积比为94:6混合获得油相。将油相与水相按照体积比为1:3混合，得到IBDV病毒NJ-23株疫苗。

（2）、SPF鸡：SPF鸡胚购自购自山东家禽所济南赛斯家禽科技有限公司，经自行孵化至出壳，饲养于隔离器内。

（3）、试验动物分组和免疫

取21日龄SPF鸡70只，随机选30只作为NJ-23株免疫组，每只皮下免疫IBDV病毒NJ-23株疫苗0.2mL；另选30只作为常规疫苗免疫组，每只皮下免疫同类制品的商品苗（G株，哈尔滨维科生物技术开发公司）0.2mL；剩余的10只，不免疫作空白对照组。免疫疫苗后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14W（周），采血分离血清，测定鸡传染性法氏囊病毒中和抗体。

（4）、抗体效价检测

采用固定病毒稀释血清法进行血清中和试验（中和实验详细步骤参照《中国兽药典》），检测血清中鸡传染性法氏囊病毒抗体效价。当血清稀释2500倍后仍能中和100TCID₅₀的病毒，不产生病变，认为合格，判为阳性血清。

（5）、攻毒和保护效率检测

免疫后4W，从免疫组（NJ-23株免疫组和常规疫苗免疫组）随机挑选10只鸡、空白对照组5只鸡进行攻毒。空白对照组另外5只鸡作为阴性对照组，不免疫不攻毒。具体攻毒方法如下：将攻毒毒株标准强毒株BC6-85（购于中国药检所）稀释到10⁵BID/ml（鸡体法氏囊感染量），经口接种，200uL/只。接种后3天剖检，观察病变。

（6）、结果描述

6.1免疫后抗体水平检测：①NJ-23株免疫组的鸡，在免疫后2W，抗体阳性率为20％，3、4W抗体阳性率升高到83.3％、96.7％，说明由无血清微载体悬浮增殖的IBDV病毒NJ-23株免疫原性很好。免疫后4W抗体效价达到最高，维持到12W后，抗体阳性率开始下降。②常规疫苗免疫组，在免疫后2W，未能检测到抗体，免疫后4W抗体阳性率最高，升高至83.3％，维持到10W后，抗体阳性率开始下降。（表2）

6.2免疫后4W，攻毒结果如表1所示：①NJ-23株免疫组的鸡，用BC6-85攻毒后3天剖检显示法氏囊无明显病变，胸肌、腿肌正常；②常规疫苗免疫组的鸡，用BC6-85攻毒后3天剖检显示，10只鸡中出现1只法氏囊胸肌出血、1只出现法氏囊萎缩现象；③空白对照组剖检结果显示，5只鸡均出现不同的病变，法氏囊有不同程度的损伤，同时还出现了胸肌和腿肌出血现象，这是典型的法氏囊感染病症；④阴性对照组无明显病毒。上述结果说明，相比较与常规疫苗组，NJ-23株疫苗可以更加有效保护免疫鸡只抵抗BC6-85病毒的攻击。

表1攻毒试验结果

表2NJ-23油苗和常规苗免疫后抗体阳性率

SEQUENCELISTING

<110>江苏省农业科学院

<120>鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株及其应用

<130>201404161

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1366

<212>DNA

<213>鸡传染性法氏囊病毒Ck/Jiangsu/NJ-23/2008株

<400>1

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Claims (9)

1.一种鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株，其特征在于所述Vero细胞适应株为鸡传染性法氏囊病毒Ck/Jiangsu/NJ-23/2008株，保藏编号为CGMCCNO.8852。

2.权利要求1所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。

3.权利要求1所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液。

4.权利要求3所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液的制备方法，其特征在于：在无血清培养的Vero细胞上增殖所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株，得到病毒液。

5.根据权利要求4所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液的制备方法，其特征在于：所述增殖过程中，Vero细胞贴附在微载体上，在动物细胞反应器内悬浮培养。

6.根据权利要求4或5所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液的制备方法，其特征在于：所述Vero细胞采用IVT培养基培养得到。

7.根据权利要求6所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液的制备方法，其特征在于：所述增殖过程中，细胞维持液为乳清蛋白水解物与IVT培养基的混合物。

8.一种疫苗组合物，其特征在于：活性成分为灭活的权利要求1所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株。

9.权利要求8所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于：将权利要求3所述鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株的病毒液灭活，然后与佐剂混合、乳化得到疫苗组合物。