CN112094819B - 一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法 - Google Patents

一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及疫苗制备技术领域，公开了一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：S1、取冷冻复苏的鸡胚细胞，离心；S2、将细胞悬液置入到培养瓶中，并将培养瓶放置于轨道摇床上；S3、对步骤S2中的鸡胚细胞每间隔3h取样一次进行细胞计数，监测细胞生长情况；S4、鸡传染性法氏囊病病毒的接种，接毒完成后，将培养瓶放置于CO2培养箱中，补加牛血清，并放回到CO2培养箱中，在混合培养液中插入阳极电极板和阴极电极板并通第二直流电，并在搅拌状态下进行继续培养；S5、接毒后，每隔6h取样测定病毒的TCID50，在病毒TCID50达到最高时收获病毒并保存。本发明能够能够在更短的时间培养出悬浮培养鸡传染性法氏囊病病毒，利于工厂化的大规模生产。

Description

一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法。
背景技术
鸡传染性法氏囊病(简称IBD)是由传染性法氏囊病毒引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病，该病毒对免疫器官造成不同程度的损伤，最终导致鸡的法氏囊萎缩而引起鸡的免疫抑制，严重影响其他疫苗的免疫预防效果，导致疫苗免疫失败，死亡率达80％以上，给养鸡业带来了巨大的经济损失。
在鸡IBD的疫情防疫方面，除了严格的环境卫生制度外，疫苗的使用仍然是目前鸡IBD的主要防控手段，目前对于鸡IBD的疫苗主要为冻干疫苗，但目前的冻干疫苗存在贮存和运输过程中都要保持在较低的温度状态下的“冷链”环境，包装及运输成本较高、在使用中对稀释水质要求很高等缺陷。
新兴的泡腾片技术可以很好的解决传统冻干苗的上述缺点，甚至取代全球家禽养殖者沿用数十年的传统安瓿瓶和针筒接种，其具有降低家禽养殖者的成本，同时维持可靠的病毒保护：简化的混合和操作步骤，符合良好疫苗接种实践；针对操作者和家禽的改良安全性；减少废弃物、环保型包装和减少运输途中的碳足迹所带来的环境效益的优点。
在鸡传染性法氏囊病中等毒力泡腾片活疫苗的生产过程中，需要进行鸡传染性法氏囊病毒的大规模生产。申请号为CN201811172273.9的专利公开了一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞系的复苏与传代培养。步骤2：采用二阶培养法，向全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞系接种鸡传染性法氏囊病病毒，实现病毒大规模培养。步骤3：接毒后，每隔12h取样测定病毒的TCID50，在病毒TCID50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸡传染性法氏囊病病毒。
上述专利申请方案的全悬浮培养方法还存在以下问题：该方案在悬浮培养鸡传染性法氏囊病病毒培育的时间周期较长，不利于工厂化的大规模生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，能够在更短的时间培养出悬浮培养鸡传染性法氏囊病病毒，利于工厂化的大规模生产。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：
S1、取冷冻复苏的鸡胚细胞，在鸡胚细胞中加入15-20倍体积的牛血清中，离心，倒掉上清液；
S2、使用牛血清作为培养液将细胞吹打悬浮均匀，然后将细胞悬液置入到培养瓶中，并将培养瓶放置于轨道摇床上，在培养瓶中插入阳极电极板和阴极电极板并通第一直流电；
S3、对步骤S2中的鸡胚细胞每间隔3h取样一次进行细胞计数，监测细胞生长情况，培养24-36小时后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代；
S4、全悬浮培养的鸡胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种，接毒完成后，将培养瓶放置于3-5％CO2培养箱中，在低转速下吸附0.5-1h，补加牛血清，得到混合培养液，并放回到3-5％CO2培养箱中，在混合培养液中插入阳极电极板和阴极电极板并通第二直流电，并在搅拌状态下进行继续培养；
S5、接毒后，每隔6h取样测定病毒的TCID50，在病毒TCID50达到最高时收获病毒并保存。
进一步，所述第一直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.1-0.3V，电流为1-2mA。在电刺激下可以加快鸡胚细胞的繁殖，提高鸡胚细胞生产效率。
进一步，所述第二直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.5-1.0V，电流为3-5mA。在电刺激过程中，若电压过低，时间过短，起不到刺激鸡传染性法氏囊病病毒繁殖的效果，而电压过高，时间过长，则会由于导致鸡传染性法氏囊病病毒受刺激过大，导致鸡传染性法氏囊病病毒死亡或者降低繁殖速率，该电流的通入，鸡传染性法氏囊病病毒的繁殖速率更高。
进一步，所述步骤S2中鸡胚细胞衍生的传代细胞培养温度为35℃-37℃；培养转速为100-120r/min。
进一步，所述步骤S4中，在补加牛血清之后，在培养瓶中加入培养液10-20％体积的氯化钠和氯化钾的混合溶液，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.3-0.5g/L，所述氯化钾溶液的质量浓度为0.5-0.8g/L。氯化钠和氯化钾的加入，使得培养液中具有可电解质，可以加速电刺激，加快鸡传染性法氏囊病病毒的繁殖。
进一步，所述步骤S1中离心的速率为3000-5000r/min，离心时间10-20min。离心可以将死亡的鸡胚细胞。
进一步，所述步骤S2中悬浮培养中，每间隔6-8小时，向第一混合培养液中添加第一混合培养液体积10-15％的牛血清。
进一步，所述步骤S4中，吸附完成后不加牛血清的体积为原始培养液的1-2倍，所述培养箱的温度为35-37℃。适宜的培养箱温度将有利于病毒的繁殖。
进一步，所述步骤S4中鸡传染性法氏囊病病毒的接种病毒感染复数为0.01MOI-0.1MOI。
进一步，所述步骤S4中在对混合培养液通入第二直流电的同时，对混合培养液进行红外线波长为850-1600纳米的红外线照射。利用低波长的红外线的照射，可以起到优质对病毒的筛选，红外线杀灭部分繁殖能力较差的劣质病毒，优质病毒占用更多的繁育环境，使得病毒总体繁育更快。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过采用全悬浮传代细胞系鸡胚细胞衍生的传代细胞系进行传染性法氏囊病病毒培养，培养过程采用全悬浮培养方式，在培养中，对培养液加入电解质，并通入微弱的电流，刺激病毒的繁殖，大大提高了病毒培养规模和效率，利于工厂化的大规模生产。
(2)本发明培养的传染性法氏囊病病毒，具有较高的病毒滴度，免疫原性好，且生产工艺简单，培养周期更短，利于工厂化的大规模生产。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明进行详细说明：
实施例原材料说明：
传染性法氏囊病病毒和鸡胚细胞衍生的传代细胞由浙江美保龙生物技术有限公司鉴定、保管和供应。
牛血清使用的是北京北纳创联生物技术研究院生产的编号为BNCC339181的牛血清。
实施例1、
一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：
S1、取冷冻的鸡胚细胞，在37℃左右的温水中逐渐融化，然后在鸡胚细胞中加入鸡胚细胞15倍体积的牛血清中，离心10min，离心的速率为3000r/min，倒掉上清液；
S2、使用牛血清作为培养液将细胞吹打悬浮均匀，然后将细胞悬液置入到培养瓶中，并将培养瓶放置于轨道摇床上，在培养瓶中插入阳极电极板和阴极电极板并通第一直流电，所述第一直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.1V，电流为1mA，每间隔6小时，向第一混合培养液中添加第一混合培养液体积10％的牛血清，整个培养过程中，培养温度为35℃；培养转速为100r/min；
S3、对步骤S2中的鸡胚细胞每间隔3h取样一次进行细胞计数，监测细胞生长情况，培养24小时后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代；
S4、全悬浮培养的鸡胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种，鸡传染性法氏囊病病毒的接种病毒感染复数为0.01MOI，接毒完成后，将培养瓶放置于3％CO2培养箱中，在低转速下吸附0.5h，吸附完成后不加牛血清的体积为原始培养液的1倍，然后在培养瓶中加入培养液10％体积的氯化钠和氯化钾的混合溶液，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.3g/L，所述氯化钾溶液的质量浓度为0.5g/L，得到混合培养液，并放回到3％CO2培养箱中，培养箱的温度为35℃，在混合培养液中插入阳极电极板和阴极电极板并通第二直流电，所述第二直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.5V，电流为3mA，在对混合培养液通入第二直流电的同时，对混合培养液进行红外线波长为850-1600纳米的红外线照射，并在搅拌状态下进行继续培养；
S5、接毒后，每隔6h取样测定病毒的TCID50，在病毒TCID50达到最高时收获病毒并进行传染性法氏囊病病毒的TCID50检测。
实施例2、
一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：
S1、取冷冻的鸡胚细胞，在37℃左右的温水中逐渐融化，然后在鸡胚细胞中加入鸡胚细胞17倍体积的牛血清中，离心15min，离心的速率为4000r/min，倒掉上清液；
S2、使用牛血清作为培养液将细胞吹打悬浮均匀，然后将细胞悬液置入到培养瓶中，并将培养瓶放置于轨道摇床上，在培养瓶中插入阳极电极板和阴极电极板并通第一直流电，所述第一直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.2V，电流为1.5mA，每间隔7小时，向第一混合培养液中添加第一混合培养液体积12％的牛血清，整个培养过程中，培养温度为36℃；培养转速为110r/min；
S3、对步骤S2中的鸡胚细胞每间隔3h取样一次进行细胞计数，监测细胞生长情况，培养30小时后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代；
S4、全悬浮培养的鸡胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种，鸡传染性法氏囊病病毒的接种病毒感染复数为0.05MOI，接毒完成后，将培养瓶放置于4％CO2培养箱中，在低转速下吸附0.7h，吸附完成后不加牛血清的体积为原始培养液的1.5倍，然后在培养瓶中加入培养液15％体积的氯化钠和氯化钾的混合溶液，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.4g/L，所述氯化钾溶液的质量浓度为0.75g/L，得到混合培养液，并放回到4％CO2培养箱中，培养箱的温度为36℃，在混合培养液中插入阳极电极板和阴极电极板并通第二直流电，所述第二直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.75V，电流为4mA，在对混合培养液通入第二直流电的同时，对混合培养液进行红外线波长为850-1600纳米的红外线照射，并在搅拌状态下进行继续培养；
S5、接毒后，每隔6h取样测定病毒的TCID50，在病毒TCID50达到最高时收获病毒并保存。
实施例3、
一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：
S1、取冷冻的鸡胚细胞，在37℃左右的温水中逐渐融化，然后在鸡胚细胞中加入鸡胚细胞20倍体积的牛血清中，离心20min，离心的速率为5000r/min，倒掉上清液；
S2、使用牛血清作为培养液将细胞吹打悬浮均匀，然后将细胞悬液置入到培养瓶中，并将培养瓶放置于轨道摇床上，在培养瓶中插入阳极电极板和阴极电极板并通第一直流电，所述第一直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.3V，电流为2mA，每间隔8小时，向第一混合培养液中添加第一混合培养液体积15％的牛血清，整个培养过程中，培养温度为37℃；培养转速为120r/min；
S3、对步骤S2中的鸡胚细胞每间隔3h取样一次进行细胞计数，监测细胞生长情况，培养36小时后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代；
S4、全悬浮培养的鸡胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种，鸡传染性法氏囊病病毒的接种病毒感染复数为0.1MOI，接毒完成后，将培养瓶放置于5％CO2培养箱中，在低转速下吸附1h，吸附完成后不加牛血清的体积为原始培养液的2倍，然后在培养瓶中加入培养液20％体积的氯化钠和氯化钾的混合溶液，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.5g/L，所述氯化钾溶液的质量浓度为0.8g/L，得到混合培养液，并放回到5％CO2培养箱中，培养箱的温度为37℃，在混合培养液中插入阳极电极板和阴极电极板并通第二直流电，所述第二直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为1.0V，电流为5mA，在对混合培养液通入第二直流电的同时，对混合培养液进行红外线波长为850-1600纳米的红外线照射，并在搅拌状态下进行继续培养；
S5、接毒后，每隔6h取样测定病毒的TCID50，在病毒TCID50达到最高时收获病毒并保存。
对比实施例、
对比实施例与实施例3对比，其区别在步骤S4，对比实施例的步骤S4的步骤如下：
S4、全悬浮培养的鸡胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种，鸡传染性法氏囊病病毒的接种病毒感染复数为0.1MOI，接毒完成后，将培养瓶放置于5％CO2培养箱中，在低转速下吸附1h，吸附完成后不加牛血清的体积为原始培养液的2倍，并放回到5％CO2培养箱中，培养箱的温度为37℃，在搅拌状态下进行继续培养。
对实施例1-3和对比实施例所得传染性法氏囊病病毒的TCID50检测，具体的检测方法如下：
使用10日龄SPF鸡胚制备鸡胚成纤维细胞，加入到96孔板中，使用含10％FBS的DMEM基作为培养基，放置于37℃、5％CO2培养箱中，待单层细胞长满孔底后，培养基更换为含2％FBS的DMEM；将收获的传染性法氏囊病病毒样品做离心处理后，吸取上清后用无菌DMEM溶液做10倍系列稀释，稀释度从10-1至10-11，吸取100μl病毒液加入一个孔，每个稀释度做8个重复，留出8个孔作为空白对照；把96孔板放入37℃、5％CO2培养箱，每天观察细胞病变情况，直至病变孔数不再增加，记录各个稀释度出现细胞病变孔的数量，使用Reed-Muench法计算TCID50。
最终实施例1-实施例3全悬浮培养的传染性法氏囊病病毒的TCID50检测结果如下：
Figure BDA0002631846200000081
从上述的TCID50数据可以看出，传染性法氏囊病病毒能在全悬浮培养的鸡胚细胞衍生的传代细胞系中繁殖，繁殖受到接毒量和培养时间的影响，在接毒量过低或者过高都不能达到最佳的培养效果，实施例3中当接毒量为0.1MOI，接种36小时后，所得到传染性法氏囊病病毒的TCID50滴度最高，达到105.8/0.1mL。因此本发明在更短的时间培育除了滴度更好的传染性法氏囊病病毒，其生产周期短，培养效果更好，利于工厂化生产。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (5)

1.一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取冷冻复苏的鸡胚细胞，在鸡胚细胞中加入15-20倍体积的牛血清中，离心，倒掉上清液；
S2、使用牛血清作为培养液将细胞吹打悬浮均匀，然后将细胞悬液置入到培养瓶中，并将培养瓶放置于轨道摇床上，在培养瓶中插入阳极电极板和阴极电极板并通第一直流电，所述第一直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.1-0.3V，电流为1-2mA；
S3、对步骤S2中的鸡胚细胞每间隔3h取样一次进行细胞计数，监测细胞生长情况，培养24-36小时后，进行细胞传代；细胞经已连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代；
S4、全悬浮培养的鸡胚细胞衍生的传代细胞的密度培养生长至适于接毒时，进行鸡传染性法氏囊病病毒的接种，接毒完成后，将培养瓶放置于3-5％CO2培养箱中，在低转速下吸附0.5-1h，补加牛血清，在补加牛血清之后，在培养瓶中加入培养液10-20%体积的氯化钠和氯化钾的混合溶液，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.3-0.5g/L，所述氯化钾溶液的质量浓度为0.5-0.8g/L，得到混合培养液，并放回到3-5％CO2培养箱中，在混合培养液中插入阳极电极板和阴极电极板并通第二直流电，在对混合培养液通入第二直流电的同时，对混合培养液进行红外线波长为850-1600纳米的红外线照射，并在搅拌状态下进行继续培养，所述第二直流电中，对阳极电极板和阴极电极板通的电压为0.5-1.0V，电流为3-5mA；所述鸡传染性法氏囊病病毒的接种病毒感染复数为0.01MOI-0.1MOI；
S5、接毒后，每隔6h取样测定病毒的TCID50，在病毒TCID50达到最高时收获病毒并保存。
2.根据权利要求1所述的一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，其特征在于：所述步骤S2中鸡胚细胞衍生的传代细胞培养温度为35℃-37℃；培养转速为100-120r/min。
3.根据权利要求2所述的一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，其特征在于：所述步骤S1中离心的速率为3000-5000r/min，离心时间10-20min。
4.根据权利要求3所述的一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，其特征在于：所述步骤S2中悬浮培养中，每间隔6-8小时，向第一混合培养液中添加第一混合培养液体积10-15%的牛血清。
5.根据权利要求4所述的一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法，其特征在于：所述步骤S4中，吸附完成后不加牛血清的体积为原始培养液的1-2倍，所述培养箱的温度为35-37℃。
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