CN116769871B - 一种鸡胚细胞的计数方法 - Google Patents
一种鸡胚细胞的计数方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116769871B CN116769871B CN202311023414.1A CN202311023414A CN116769871B CN 116769871 B CN116769871 B CN 116769871B CN 202311023414 A CN202311023414 A CN 202311023414A CN 116769871 B CN116769871 B CN 116769871B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chick embryo
- cell
- incubation
- counting
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 20
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 16
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims abstract description 15
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 claims abstract description 8
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 11
- 230000012447 hatching Effects 0.000 claims description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 124
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 45
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 13
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 8
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 3
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001739 density measurement Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002233 benzalkonium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M benzododecinium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940070527 tourmaline Drugs 0.000 description 1
- 229910052613 tourmaline Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011032 tourmaline Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种鸡胚细胞的计数方法，所述方法包含以下步骤：往鸡胚细胞悬液中加入含有0.008‑0.01vol%美蓝染色液的第一缓冲液进行染色孵育，接着进行低温速冻，速冻后加入含0.1‑0.2vol%吐温‑20、10‑15vol%甘油、3‑5wt%蔗糖的第二缓冲液进行二次孵育，最后浊度测定。本方法通过加入低浓度的美蓝溶液对细胞进行染色后冷冻处理，加入特定缓冲液稳定细胞悬液，测试结果准确且重复性高，操作简单方便，技术成本低，在细胞计数领域有极大的推广空间。
Description
技术领域
本发明涉及细胞计数领域，更具体地，涉及了一种鸡胚细胞的计数方法。
背景技术
在细胞培养工作中，常常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，以及确保在恰当的时间点进行细胞实验，就需要对细胞进行计数。通过细胞计数，我们可以判断细胞数量是否满足实验需求，以及细胞活力状态是否正常，所以细胞计数准确性对细胞的研究实验有至关重要的作用。
病毒类疫苗在生产过程中病毒感染细胞时，需要对细胞基质（原代鸡胚细胞）进行计数，原代鸡胚细胞计数的准确性对疫苗生产的稳定性及产量起着重要的作用。
现有的原代鸡胚细胞计数方法主要为血球计数法、细胞计数仪计数法。
血球计数法：将鸡胚细胞悬液用0.4%台盼蓝染色、梯度稀释后，取少量样品（约20μl）加至血球计数板，于显微镜下观察并逐个计数。但是，采用血球计数法时，制备的原代鸡胚细胞悬液密度一般为1.0*107个/ml以上，需将样品进行多次稀释，操作繁琐，且在稀释过程中极易受人工影响，产生误差，且细胞成团时，观察者难以计数，重复性及准确性差。
细胞仪计数法：将鸡胚细胞悬液混匀后，取少量样品（一般20μl以下）加至计数仪特定载片上，按照计数仪要求进行相关操作（如调节焦距等，部分细胞计数仪有计数范围，需要进行稀释，有些需要加入特定试剂、计数前需要进行震荡等特殊处理等）后进行自动计数。但是，目前市面上各种琳琅满目的细胞计数仪，细胞计数依赖于计数仪中安装的对象识别软件、图像聚焦情况等，是基于视觉技术从少量样品进行推断计数，如中国公开专利201310399802.X所提出的图像识别法细胞计数仪器，虽然计数效率比人工方法大大提高，但是仪器设定的视野面积近似于血球计数板上一个细胞计数单位的面积，没有考虑样品深度，导致体积不准确，而且仪器视野面积极易受放大倍数影响，计数出来的细胞浓度准确度低。而且多数细胞计数仪体积庞大且价格昂贵，需要特殊的耗材和试剂，计数成本高。
针对血球计数法和细胞仪计数法存在的缺点，亟需建立一种准确及重复性好、计数成本低的原代鸡胚细胞计数方法，以提高在病毒类疫苗（原代鸡胚细胞）生产过程中的稳定性。
发明内容
针对血细胞板计数法和细胞计数仪计数法存在的缺点，本发明提出了一种准确度高，重复性好、计数成本低的鸡胚细胞计数方法，以满足细胞研究实验的要求。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下所述的技术方案：
一种鸡胚细胞的计数方法，所述方法包含以下步骤：往鸡胚细胞悬液中加入含有0.008-0.01vol%美蓝染色液的第一缓冲液进行染色孵育，接着进行低温速冻，速冻后往速冻液中加入含0.1-0.2vol%吐温-20、10-15vol%甘油、3-5wt%蔗糖的第二缓冲液进行二次孵育，最后浊度测定。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
由于美蓝染色液对细胞膜和染色体的亲和力较弱，只有在活细胞中才能充分渗透并染成蓝色，而死细胞膜已经破裂，美蓝无法渗透到细胞内部染色体上，因此死细胞不能被染色。本发明通过加入低浓度的美蓝对细胞进行染色，有效区分活细胞跟死细胞。
本发明采用速冻处理使细胞活力下降，细胞质变小，经染色的细胞核代偿性的增大，增加光强度的减弱程度，大大增加了浊度测定的准确度。
在细胞混悬液中加入甘油、蔗糖、吐温-20，甘油、蔗糖可增加溶液的粘滞系数，减缓溶液流动性，从而减缓混悬液中细胞的沉降速度；吐温-20在浓度较低时能与细胞磷脂双分子层（PBS）结合，且其又具有亲水亲油特性，能与甘油、蔗糖融合，故有利于提高细胞混悬液的均一性，从而提高浊度测定的准确性以及重复性。
本发明步骤简单方便，采用便携式浊度计，价格便宜，无特殊耗材及试剂，计数成本低，且设备小巧，使用方便。
附图说明
为了更清楚地说明本申请或现有技术中的方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1标准曲线图，线性关系R2为0.998；
图2为本发明实施例2标准曲线图，线性关系R2为0.9944；
图3为本发明实施例3标准曲线图，线性关系R2为0.9955；
图4为本发明实施例4标准曲线图，线性关系R2为0.9931；
图5为本发明实施例5标准曲线图，线性关系R2为0.9923；
图6为本发明对比例1标准曲线图，线性关系R2为0.8921；
图7为本发明对比例2标准曲线图，线性关系R2为0.9262；
图8为本发明对比例3标准曲线图，线性关系R2为0.9363；
图9为本发明对比例4标准曲线图，线性关系R2为0.9287；
图10为本发明对比例5标准曲线图，线性关系R2为0.9357；
图11为本发明对比例6标准曲线图，线性关系R2为0.9596；
图12为本发明对比例7标准曲线图，线性关系R2为0.9394；
图13中的（A）、（B）分别为实施例1细胞接种24h、48h显微镜下观察的细胞生长情况；
图14中的（A）、（B）分别为实施例2细胞接种24h、48h显微镜下观察的细胞生长情况；
图15中的（A）、（B）分别为实施例3细胞接种24h、48h显微镜下观察的细胞生长情况；
图16中的（A）、（B）分别为实施例4细胞接种24h、48h显微镜下观察的细胞生长情况；
图17中的（A）、（B）分别为实施例5细胞接种24h、48h显微镜下观察的细胞生长情况；
从图13-17看出，按照实施例1-5计数结果接种的细胞，在24h时基本铺满50%，48h时细胞铺满为90%，5个实施例鸡胚细胞培养相同时间后铺满度情况基本一致，说明其初始接种的计数结果较准确。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
如背景技术所述的，鸡胚细胞现有的计数方法中，血球计数法存在操作繁琐且在稀释过程中极易受人工影响，产生误差，且细胞成团时观察者难以计数，重复性及准确性差的问题；细胞仪计数法存在没有考虑样品深度，导致体积不准确，而且仪器视野面积极易受放大倍数影响，计数出来的细胞浓度准确度低，而且多数细胞计数仪体积庞大且价格昂贵，需要特殊的耗材和试剂，计数成本高的问题。
为了解决此技术问题，本发明提供了一种鸡胚细胞的计数方法，包含以下步骤：往鸡胚细胞悬液中加入含有0.008-0.01vol%美蓝染色液的第一缓冲液进行染色孵育，接着进行低温速冻，速冻后往速冻液中加入含0.1-0.2vol%吐温-20、10-15vol%甘油、3-5wt%蔗糖的第二缓冲液进行二次孵育，最后浊度测定。
进一步地，染色孵育的孵育温度为35~37℃，孵育时间为8~10min。如此，采用0.008-0.01vol%美蓝染色液染色液对鸡胚活细胞进行染色及孵育，低浓度的美蓝染色液染色后无需进行洗涤，通过35~37℃孵育能促进美蓝对活细胞细胞核的染色。优选地，在染色孵育阶段，所述鸡胚细胞悬液与第一缓冲液的体积比为(1~2):(1~2)。
进一步地，鸡胚活细胞染色后，采用-20℃以下条件进行速冻处理，低温条件下细胞活力下降，细胞质变小，经染色的细胞核代偿性的增大，增加光强度的减弱程度，有利于浊度的精准测定。优选地，低温速冻的速冻温度为-20℃以下，速冻时间为3~5min。
进一步地，二次孵育的孵育温度为35~37℃，孵育时间为8~10min。鸡胚细胞混悬液中加入甘油、蔗糖、吐温-20，并于35-37℃孵育，温度的提高能增加甘油、蔗糖的粘滞系数，减缓溶液流动性，从而减缓鸡胚混悬液中细胞的沉降速度；吐温-20在浓度较低时能与细胞磷脂双分子层结合，且其又具有亲水亲油特性，能与甘油、蔗糖融合，故有利于提高鸡胚细胞混悬液的均一性，从而提高浊度测定的准确性。优选地，二次孵育过程中，所述速冻液与第二缓冲液的体积比为(1~6):(10~15)。
更具体地，上述鸡胚细胞的计数方法包括如下步骤：
（1）种蛋孵化：选用SPF种蛋，于37.5-38.5℃孵化9-11日后，灯检去除死胚；
（2）原代鸡胚细胞悬液制备：从SPF种蛋中挑取鸡胚，去除头部后将胚体剪切成细小组织块，经胰蛋白酶消化、室温离心去除消化液后，加入培养液吹打分散，制备成原代鸡胚细胞悬液；
（3）染色、孵育：将鸡胚细胞悬液混合均匀，取样加入到含有0.008-0.01vol%美蓝染色液的第一缓冲液中，并置于35-37℃孵育染色8-10min；
（4）低温速冻：染色后将鸡胚细胞悬液放入-20℃以下速冻3-5min；
（5）加入缓冲液、二次孵育：速冻后加入含0.1-0.2vol%吐温-20、10-15vol%甘油、3-5wt%蔗糖的第二缓冲液，混合均匀，置于35-37℃二次孵育8-10min；
（6）浊度测定：从步骤（5）得到活细胞已染色的均一性混悬液后，采用浊度计进行浊度值测定，并绘制浊度数-鸡胚细胞数标准曲线。
浊度计，浊度是表现水中悬浮物对光线透过时所发生的阻碍程度。水中含有泥土、粉尘、微细有机物、浮游动物和其他微生物等悬浮物和胶体物都可使水中呈现浊度。浊度仪（浊度计）采用900散射光原理。由光源发出的平行光束通过溶液时，一部分被吸收和散射，另一部分透过溶液。在一定浊度范围内，散射光强度与溶液的混浊度成正比。
标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。建立标准曲线的目的是推导待测物质的理化属性。标准曲线的横坐标(X)表示可以精确测量的变量(如标准溶液的浓度)，称为普通变量，纵坐标(Y)表示仪器的响应值(也称测量值，如吸光度、浊度等)，称为随机变量。
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
需要说明的是，本发明涉及到的种蛋孵化、原代鸡胚细胞悬液制备过程，并不局限于下述各实施例所述的实施方式，可以理解为现有技术中其他方式的种蛋孵化、原代鸡胚细胞悬液制备过程也可用。本发明所用的第一缓冲液和第二缓冲液，在下述各实施例中选用PBS缓冲液，可以理解的是，也并不局限于此。
实施例1
本实施例示出了一种可用于鸡胚细胞的计数方法。
主要原材料如下：
种蛋：新兴大华农SPF级种蛋；
溶液：0.25%胰蛋白酶；细胞培养液，PBS溶液（Ph7.4）；含0.008vol%美蓝染色液PBS溶液；含0.1vol%吐温-20、10vol%甘油、3wt%蔗糖的PBS溶液、0.2%新洁尔灭；
仪器设备：浊度计、倒置显微镜、AUTO 1000细胞计数仪、恒温培养箱、水浴箱、离心机、孵蛋箱。
一种鸡胚细胞的计数方法，具体包含以下步骤：
种蛋孵化：选用来自新兴大华农的SPF种蛋，于37.5℃孵化9日后，灯检去除死胚，并用0.2%新洁尔灭浸泡消毒，待用；
原代鸡胚细胞悬液制备：从消毒后的SPF种蛋中挑取鸡胚，去除头部后将胚体剪切成细小组织块，用PBS溶液洗涤后加入0.25%胰蛋白酶溶液于37℃水浴箱中消化20min，按1:1比例加入细胞培养液终止消化，置于离心机中转速2500rpm室温离心8min，去除上清液后加入培养液吹打分散，制备成原代鸡胚细胞悬液；
染色、孵育：将原代鸡胚细胞悬液混合均匀并取样，按照1:1比例加入含0.008vol%美蓝染色液的PBS溶液，并置于35℃孵育染色8min；
速冻处理：染色后将鸡胚细胞悬液于-20℃条件下速冻3min；
加入缓冲液、二次孵育：速冻后按照速冻液与缓冲液体积比为1:15、2:14、3:13、4:12、5:11、6:10加入含0.1vol%吐温-20、10vol%甘油、3wt%蔗糖的PBS溶液稀释，置于35℃二次孵育8min；
浊度测定：步骤（5）得到活细胞已染色的均一性混悬液后，采用浊度计进行浊度值测定，并绘制浊度数与细胞数标准曲线，如图1所示；
建立本发明计数公式：根据绘制的标准曲线，即可获得每浊度对应的细胞数量，故建立以下相应的计数公式：
细胞数量(个/ml)=((浊度数-b)/k)×稀释倍数×104
注：k为标准系数，b为截距；
细胞接种：根据测定的细胞计数结果将细胞调整为1.0*106个/ml，并接种至T75细胞瓶，置于37℃、5%CO2培养箱培养，细胞接种24h及48h时用显微镜对细胞生长情况进行观察，结果如图13中的（A）、（B）所示。
实施例2
本实施例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本实施例与实施例1的区别在于：步骤（3）-（5）的部分条件不同，具体如下：
步骤（3）中，按照1:1比例加入含0.009vol%美蓝染色液的PBS溶液，并置于36℃孵育染色9min；
步骤（4）中，染色后将鸡胚细胞悬液放入-25℃条件下速冻4min；
步骤（5）中，速冻后按照速冻液与缓冲液体积比为1:15、2:14、3:13、4:12、5:11、6:10加入含0.15vol%吐温-20、12.5vol%甘油、4wt%蔗糖的PBS溶液稀释，置于36℃二次孵育9min。
实施例2的浊度数与细胞数标准曲线如图2所示，细胞接种后生长情况如图14中的（A）、（B）所示。
实施例3
本实施例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本实施例与实施例1的区别在于：步骤（3）-（5）的部分条件不同，具体如下：
步骤（3）中，按照1:1比例加入含0.01vol%美蓝染色液的PBS溶液，并置于37℃孵育染色10min；
步骤（4）中，染色后将鸡胚细胞悬液放入-30℃条件下速冻5min；
步骤（5）中，速冻后按照速速冻液与缓冲液体积比为1:15、2:14、3:13、4:12、5:11、6:10加入含0.2vol%吐温-20、15vol%甘油、5wt%蔗糖的PBS溶液稀释，置于37℃二次孵育10min。
实施例3的浊度数与细胞数标准曲线如图3所示，细胞接种后生长情况如图15中的（A）、（B）所示。
实施例4
本实施例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本实施例与实施例2的区别仅在于：将步骤（2）中制备的原代鸡胚细胞悬液，用培养液稀释10倍后再取样检测。
实施例4的浊度数与细胞数标准曲线如图4所示，细胞接种后生长情况如图16中的（A）、（B）所示。
实施例5
本实施例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本实施例与实施例2的区别仅在于：将步骤（2）中制备的原代鸡胚细胞悬液，通过离心将细胞悬液调至原浓度的10倍后再取样检测。
实施例5的浊度数与细胞数标准曲线如图5所示，细胞接种后生长情况如图17中的（A）、（B）所示。
对比例1
本对比例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本对比例与实施例2的区别在于：
未进行步骤（3）的染色、孵育处理；
未进行步骤（4）的速冻处理；
用PH7.4的PBS缓冲液替代步骤（5）中含0.15vol%吐温-20、12.5vol%甘油、4wt%蔗糖的PBS溶液稀释。
对比例1的浊度数与细胞数标准曲线如图6所示。
对比例2
本对比例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本对比例与实施例2的区别仅在于：用PH7.4的PBS缓冲液替代步骤（5）中含0.15vol%吐温-20、12.5vol%甘油、4wt%蔗糖的PBS溶液稀释。
对比例2的浊度数与细胞数标准曲线如图7所示。
对比例3
本对比例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本对比例与实施例2的区别仅在于：未进行步骤（4）中的速冻处理。
对比例3的浊度数与细胞标准曲线如图8所示。
对比例4
本对比例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本对比例与实施例2的区别仅在于：未进行步骤（3）中的染色、孵育处理。
对比例4的浊度数与细胞标准曲线如图9所示。
对比例5
本对比例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本对比例与实施例2的区别仅在于：将步骤（3）中的染色颜色改为台盼蓝。
对比例5的浊度数与细胞标准曲线如图10所示。
对比例6
本对比例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本对比例与实施例2的区别仅在于：将步骤（4）中冷冻温度为-15℃。
对比例6的浊度数与细胞标准曲线如图11所示。
对比例7
本对比例示出了一种鸡胚细胞的计数方法。
本对比例与实施例2的区别仅在于：将步骤（3）中美蓝占比为0.015%，即含0.015vol%美蓝染色液的PBS溶液。
对比例7的浊度数与细胞标准曲线如图12所示。
表1 实施例浊度数-鸡胚细胞数曲线结果（R2值）比较
| 序号 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
| R2 | 0.998 | 0.9944 | 0.9955 | 0.9931 | 0.9923 |
表2 对比例浊度数-鸡胚细胞数曲线结果（R2值）比较
| 序号 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 |
| R2 | 0.8921 | 0.9262 | 0.9363 | 0.9287 | 0.9357 | 0.9596 | 0.9394 |
从表1及表2的对比结果可以看出，本发明的计数方法其标准曲线线性关系R2均在0.99以上，呈良好的线性关系，而在对比例中其标准曲线线性关系较差，且随着鸡胚细胞数浓度的增加，光强度减弱情况下降，说明悬液的均匀性较差，细胞沉降速度过快，从而影响计数方法的准确性，而本发明方法中浊度数与鸡胚细胞数之间呈现较好的倍增关系，说明其溶液均一性较好，细胞对光强度的削减识别较精准，可见本发明方法的准确性较高。
在本发明中，对美蓝的浓度进行了严格的范围控制，本发明浓度将其降低到0.008-0.01%，浓度降低后通过孵育促进其染色；并通对比例将美蓝浓度调至0.015%以说明该浓度范围的重要性；本发明采用美蓝对活细胞进行染色、速冻等处理，使悬液中要计数的细胞更为突出，增强细胞与光强度减弱的关系，以降低悬液中其他杂质的干扰。进一步地，实施例4将细胞数量减少至曲线范围的十分之一，实施例5将细胞数量减少至曲线范围的10倍，其线性关系仍然在0.99以上，且接种的细胞生长情况与实施例1-3基本一致，说明其测定范围较广，不限于曲线范围内数值。
各计数方法对比
采用本发明的原代鸡胚细胞计数方法（实施例2）、血球计数法、细胞仪计数（以本实验室AUTO 1000细胞计数仪计数情况为例）方法对3份不同密度的鸡胚细胞悬液进行重复性和中间精密性验证，以比较3种方法的准确性（重复性和中间精密性的CV值越小，表示准确性越好）。具体包含以下步骤：
（1）重复性：取3份鸡胚细胞悬液，由同一操作者采用上述3种计数方法对每份样品进行细胞密度测定，重复测定3次，记下每份样品细胞密度，并计算3种计数方法的测定的细胞密度的平均值、标准差SD值和变异系数CV（%）值。
（2）中间精密性：取3份鸡胚细胞悬液，分别由3个不同操作者采用上述3种计数方法对每份样品进行细胞密度测定，记下每份样品细胞密度，并计算不同操作者测定的细胞密度的平均值、SD值和CV（%）值。
表3重复性试验结果（*104个/ml）
表4中间精密性结果（*104个/ml）
注：标准差是反映一组数据离散程度最常用的一种量化形式，是表示精确度的重要指标，计算结果的数值越小，说明数据越聚集；计算结果的数值越大，说明数据越离散；CV值为变异系数，为标准差和平均值之比，CV=SD/平均值x。
从表3、表4结果可以看出，本发明方法重复性试验CV值平均为3.6%；中间精密性CV值平均为4.1%，误差范围在5%以内，与血球计数法及细胞仪计数法比较，其重复性和中间精密性均有较大提高，可见本发明方法与传统方法比较，其准确性有了显著提高。
显然，以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，附图中给出了本申请的较佳实施例，但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现，相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来而言，其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本申请专利保护范围之内。
Claims (3)
1.一种鸡胚细胞的计数方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：往鸡胚细胞悬液中加入含有0.008-0.01vol%美蓝染色液的第一缓冲液进行染色孵育，接着进行低温速冻，速冻后往速冻液中加入含0.1-0.2vol%吐温-20、10-15vol%甘油、3-5wt%蔗糖的第二缓冲液进行二次孵育，最后浊度测定；
所述低温速冻的速冻温度为-20℃以下，速冻时间为3~5min；
所述染色孵育的孵育温度为35~37℃，孵育时间为8~10min；
在染色孵育阶段，所述鸡胚细胞悬液与第一缓冲液的体积比为(1~2):(1~2)；
所述二次孵育的孵育温度为35~37℃，孵育时间为8~10min；
二次孵育过程中，所述速冻液与第二缓冲液的体积比为(1~6):(10~15)；
所述鸡胚细胞为原代鸡胚细胞。
2.根据权利要求1所述的鸡胚细胞的计数方法，其特征在于，所述鸡胚细胞是从SPF种蛋孵化后挑取得到的。
3.根据权利要求1所述的鸡胚细胞的计数方法，其特征在于，所述浊度测定包括以下步骤：二次孵育得到活细胞已染色的均一性混悬液，采用浊度计进行浊度值测定，并绘制浊度数-鸡胚细胞数标准曲线。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311023414.1A CN116769871B (zh) | 2023-08-15 | 2023-08-15 | 一种鸡胚细胞的计数方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311023414.1A CN116769871B (zh) | 2023-08-15 | 2023-08-15 | 一种鸡胚细胞的计数方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116769871A CN116769871A (zh) | 2023-09-19 |
| CN116769871B true CN116769871B (zh) | 2023-10-27 |
Family
ID=88013698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311023414.1A Active CN116769871B (zh) | 2023-08-15 | 2023-08-15 | 一种鸡胚细胞的计数方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116769871B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101798566A (zh) * | 2010-01-08 | 2010-08-11 | 西北农林科技大学 | 一种猪羊水干细胞系的建立及检测方法 |
| CN103386127A (zh) * | 2013-08-09 | 2013-11-13 | 浙江美保龙生物技术有限公司 | 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法 |
| CN103865888A (zh) * | 2014-04-03 | 2014-06-18 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 狂犬病病毒ctn-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法 |
| CN103865889A (zh) * | 2014-04-03 | 2014-06-18 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 狂犬病病毒ctn鸡胚细胞适应株 |
| CN112094819A (zh) * | 2020-08-13 | 2020-12-18 | 浙江美保龙生物技术有限公司 | 一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法 |
| CN113781378A (zh) * | 2020-05-20 | 2021-12-10 | 广州博大博聚科技有限公司 | 用于获取细胞悬液中微量细胞的数量的绝对值计数方法 |
-
2023
- 2023-08-15 CN CN202311023414.1A patent/CN116769871B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101798566A (zh) * | 2010-01-08 | 2010-08-11 | 西北农林科技大学 | 一种猪羊水干细胞系的建立及检测方法 |
| CN103386127A (zh) * | 2013-08-09 | 2013-11-13 | 浙江美保龙生物技术有限公司 | 用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法 |
| CN103865888A (zh) * | 2014-04-03 | 2014-06-18 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 狂犬病病毒ctn-1株对原代鸡胚成纤维细胞的适应方法 |
| CN103865889A (zh) * | 2014-04-03 | 2014-06-18 | 深圳市卫光生物制品股份有限公司 | 狂犬病病毒ctn鸡胚细胞适应株 |
| CN113781378A (zh) * | 2020-05-20 | 2021-12-10 | 广州博大博聚科技有限公司 | 用于获取细胞悬液中微量细胞的数量的绝对值计数方法 |
| CN112094819A (zh) * | 2020-08-13 | 2020-12-18 | 浙江美保龙生物技术有限公司 | 一种鸡传染性法氏囊病毒的全悬浮培养方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens;Christian Seliger et al.;Vet Immunol Immunopathol.;第145卷(第1-2期);86-99 * |
| 鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定;郗蒙雪 等;南京农业大学学报;第44卷(第2期);353-358 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116769871A (zh) | 2023-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SE448100B (sv) | Forfarande for metning av koncentrationen av atp i mikrobiella celler i ett biologiskt prov, som omfattar en blandning av mikrobiella och somatiska celler | |
| CN109266717B (zh) | 一种通过单细胞分析检测细菌耐药性的方法和装置 | |
| CN116769871B (zh) | 一种鸡胚细胞的计数方法 | |
| Smith | Quantitative measurement of the growth of pleuropneumonia-like organisms | |
| US20240002899A1 (en) | Evaluation method of pathogen inactivation effect | |
| CN115372107A (zh) | 前处理试剂及制备方法和细胞染色方法及前处理方法 | |
| CN112903634A (zh) | 对免疫细胞进行细胞数、活力或凋亡测定的高精密度方法 | |
| CN111020060A (zh) | 一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法 | |
| CN101029332A (zh) | 细菌总数测试液及其测试瓶 | |
| CN112391441B (zh) | 一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法 | |
| CN105112497A (zh) | 一种河口及近岸海洋环境中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分离筛选及抗生素抗性评估方法 | |
| CN114544468A (zh) | 一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法 | |
| CN113249428A (zh) | 一种快速检测活菌量的方法 | |
| CN106906273B (zh) | 确定细黄连霉菌培养物中细菌数量的方法 | |
| CN108037089B (zh) | 一种快速测定鸡肉脂肪中四环素的方法 | |
| CN111718976A (zh) | 一种cip清洗残留水中耐热菌的检测方法 | |
| CN112574938A (zh) | 一种用于膜过滤富集细菌的痰处理液及其应用 | |
| CN109777856A (zh) | 一种一万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法 | |
| CN113804593B (zh) | 一种裂解疫苗裂解效果的检测方法及应用 | |
| CN110241048B (zh) | 一种利用三唑酮筛选螺旋形螺旋藻藻丝的方法 | |
| CN112782137B (zh) | 10-50μm活体浮游生物活细胞流式细胞仪检测方法 | |
| CN110095329B (zh) | 一种快速测定小麦种子纯度的染色方法 | |
| CA2518053C (en) | Method for detecting micro-organisms in an electrocoating process | |
| CN116837142B (zh) | 一种断裂点簇集区艾贝尔逊白血病病毒校准品及其制备方法和应用 | |
| CN116219077A (zh) | 杆状病毒微滴式数字pcr检测方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |