CN112903634A - 对免疫细胞进行细胞数、活力或凋亡测定的高精密度方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种对免疫细胞进行细胞数测定、活力测定或细胞凋亡测定的高精密度方法。本发明提供了一种新的对免疫细胞进行计数(浓度、活率，细胞凋亡功能检测)的方法，可应用于基于免疫细胞治疗为基础的一系列功能检测研究。本发明的方法成本低廉，为小型实验室和诊所进行免疫细胞相关研究，尤其为在无法获得流式细胞仪、激光扫描仪和荧光显微镜或需要快速分析数据的场景下的检测提供了一种快速、简单且廉价的检测手段。
Description
技术领域
本发明属于细胞学领域，更具体地，本发明涉及对免疫细胞进行细胞数测定、活力测定或细胞凋亡测定的高精密度方法。
背景技术
免疫细胞治疗是一种新兴的治疗方式，是被认为最有前途的癌症治疗方法之一。其中，嵌合抗原受体(CAR-T)细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。目前在全球已有两款药物获得FDA的批准上市，分别是诺华的Kymriah和凯特的Yescarta，全世界有多家公司产品进入临床申报阶段，这种疗法已成为许多患者的选择。
免疫细胞作为“活”的药物，其浓度活率是产品的重要指标之一，FDA 在2011年颁布的法规(Guidance for industry:Preclinical Assessment of InvestigationalCellular and Gene Therapy Products)要求对细胞的浓度活率进行监控；另外免疫细胞培养过程中，对浓度活率的准确监控，有助于了解细胞状态，优化细胞培养方案。
免疫细胞不同于其它细胞的特点是：免疫细胞直径比较小，大概在 9-12um，在细胞因子的刺激下容易分化，不易准确计数。在培养过程中，免疫细胞也存在着生长缓慢，不易培养等问题。
现有技术中，动物细胞活力测定的方法主要分为2大类，一种是基于台盼蓝(TB)细胞活力测定方法，即细胞样品用台盼蓝染色后，基于血细胞计数器和基于成像的细胞计数仪进行测定。第二种是，基于荧光染料(比如与核酸结合的荧光染料：DAPI，Hoechst 33342，ethidium bromide(EB)，propidium iodide(PI)，SYTOX green/red等，酶催化染料：acridine orange(AO)，calcein AM和CFDA等)的细胞活力测定法，细胞样品用荧光染料染色后，进一步用流式细胞仪和基于成像的荧光细胞计数仪来测定。基于荧光染料的细胞活力测定方法，由于荧光染料是要么与核酸结合，要么需要进入细胞，被细胞内酶催化产生荧光，从而可实现细胞的计数。目前，有一些自动化的荧光成像细胞计数仪，能够快速进行细胞计数，捕捉明场和荧光下细胞图片，进行视觉确认。目前已有相关仪器用于免疫细胞培养过程中浓度和活力测定，比如 Cellometer Vision(Nexcelom Bioscience)，Tali(Invitrogen)，NucleoCounter (Chemometec)。
但是，本领域中还存在细胞计数和分析方面的一些缺陷：一方面，不同的染料对于不同的细胞对象的染色效果存在不确定性，使得研究过程中存在计数不准的问题；另一方面，现有的计数仪器对于不同的应用场景、不同的检测目标，还存在不稳定性。例如，对于外周血单个核细胞(PBMCs)此类免疫细胞，在研究过程中发现，当应用常规的计数以及常规染色条件时，染色效果不理想、检测误差较大，甚至还有检测过程中细胞状态不理想的情况，难以找到较为理想的检测条件。
本领域中，也会采用常规的基于流式细胞仪的细胞活力测定，特别是应用于测试细胞凋亡。流式细胞仪可同时针对百万级别的细胞进行计数，减少统计学误差，但是流式细胞方法的检测在实践中也常遇到染料运用不当导致检测精密度不稳定的问题；同时，流式细胞仪成本高昂，仪器维护成本也很高，而且对用户操作技能要求较高，使得一些小型实验室或中小医院等检测机构望之却步。此外，流式细胞仪没有成像结果，无法对异常结果进行判定，而无法满足大多数用户的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供对免疫细胞进行细胞数测定、活力测定或细胞凋亡测定的高精密度方法。
在本发明的第一方面，提供一种对免疫细胞进行细胞数(浓度)、活力或凋亡测定的方法，包括：利用
Rigel荧光分析仪进行测定，其中，测定免疫细胞的细胞数(浓度)或活力时，以吖啶橙(Acridine Orange；AO)和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)混合染料进行染色；或，测定免疫细胞的凋亡时，以异硫氰酸荧光素(FITC)和氨基放线菌素D(7-AAD)混合染料进行染色。
在另一优选例中，所述的方法为高精密度测定方法，所述的高精密度为当细胞在8×106～0.625×105时，变异系数平均值小于3％(在1.5～4.5％范围内)。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括：外周血单个核细胞(PBMCs)，或来自于外周血单个核细胞的细胞。
在另一优选例中，所述来自于外周血单个核细胞的细胞包括：淋巴细胞，单核细胞，NK细胞。
在另一优选例中，所述的淋巴细胞包括：T细胞，B细胞。
在另一优选例中，所述的淋巴细胞为携带有嵌合抗原受体的重组细胞，如CAR-T细胞。
在另一优选例中，吖啶橙和碘化丙啶混合染料中，AO:PI为0.8～1.2:0.8～ 1.2；较佳地为1:1。
在另一优选例中，异硫氰酸荧光素和7-氨基放线菌素D混合染料中，按照体积比，异硫氰酸荧光素和7-氨基放线菌素D的比例为1.5:4。
在另一优选例中，测定时，
Rigel荧光分析仪的明场、FL1、 FL2增益设置为2.5～3.5、3～4、3～4；较佳地为2.8～3.2、3.3～3.7、3.3～ 3.7；更佳地为3、3.5、3.5。
在另一优选例中，测定时，
Rigel荧光分析仪的曝光时间设置为200～300ms、7000～9000ms、7000～9000ms；较佳地为280～320ms、7600～ 8400ms、7800～8200ms；更佳地为250ms、8000ms、8000ms。
在另一优选例中，所述免疫细胞的浓度为：1×104～1×107个细胞/ml。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A、AO染料对于PBMCs细胞进行染色的结果。
图1B、PI染料对于PBMCs细胞进行染色的结果。
图2、
Rigel荧光细胞分析仪对PBMCs细胞浓度计数，以台盼蓝和AO/PI为染料。
图3、
Rigel荧光细胞分析仪对PBMCs活率计数，以台盼蓝和 AO/PI为染料。
图4、AO/PI-
Rigel测定法、AO/DAPI-NC200测定法、手动台盼蓝计数法对于PBMCs计数的精确度或准确性的线性图。
图5、AO/PI-
Rigel测定法、AO/DAPI-NC200测定法、手动台盼蓝计数法和流式细胞仪计数法对于PBMCs活率检测的精确度或准确性的线性图。
图6、
Rigel捕获的热诱导PBMCs的荧光图像。
图7、PBMCs在流式细胞仪和
Rigel测得细胞凋亡的结果。
图8、随着温度从37℃上升到60℃，流式细胞仪和
Rigel测得PBMCs细胞凋亡结果。
具体实施方式
本发明人经过一系列的筛选和优化，提供了一种新的对免疫细胞进行计数(浓度、活率，细胞凋亡功能检测)的方法，克服了现有技术中对于免疫细胞缺乏高精密度的测定方法的缺陷。本发明的方法可应用于基于免疫细胞治疗为基础的一系列功能检测研究。本发明的方法成本低廉，为小型实验室和诊所进行免疫细胞相关研究，尤其为在无法获得流式细胞仪、激光扫描仪和荧光显微镜或需要快速分析数据的场景下的检测提供了一种快速、简单且廉价的检测手段。
测定方法
基于本发明的新发现，提供了一种对免疫细胞进行细胞数(浓度)、活力或凋亡测定的方法，包括：利用
Rigel荧光分析仪进行测定，其中，测定免疫细胞的细胞数(浓度)或活力时，以吖啶橙(Acridine Orange；AO)和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)混合染料进行染色；测定免疫细胞的凋亡时，以异硫氰酸荧光素(FITC)和氨基放线菌素D(7-AAD)混合染料进行染色。
如本发明所用，所述的“免疫细胞”包括外周血单个核细胞(PBMCs)或来自于PBMCs的细胞等；所述来自于外周血单个核细胞的细胞包括：淋巴细胞，单核细胞，NK细胞等。所述的淋巴细胞包括：T细胞，B细胞。
本发明中，所述的免疫细胞可以是天然存在的免疫细胞、分离的免疫细胞、免疫细胞培养物或传代的细胞。
本发明中，所述的免疫细胞可以是经过人工改造的基因重组细胞、经修饰的细胞，例如其为携带有嵌合抗原受体的重组淋巴细胞，更具体地如 CAR-T细胞。
如本发明所用，所述的“明场、FL1、FL2”
Rigel仪器的三个通道，明场，FL1通道，FL2通道。
如本发明所用，所述的“增益”是一种
Rigel仪器程序参数，可是可调节的。
目前，本领域中应用于进行细胞染色的染料种类繁多，包括DAPI， Hoechst33342，ethidium bromide(EB)，propidium iodide(PI)，SYTOX green/red 等，酶催化染料：Acridine Orange(AO)，calcein AM和CFDA等，而本发明人经过筛选和优化，发现AO和PI的混合染料对于免疫细胞以及结合
Rigel荧光细胞分析仪的染色和检测效果非常理想。
作为本发明的优选方式，AO和PI混合染料中，AO:PI为0.8～1.2:0.8～1.2；较佳地为1:1。本发明人发现，这样的比例下，染料对于细胞的影响最小，细胞状态最为理想，检测精密度高。
作为本发明的优选方式，对应于1×104～1×107浓度的细胞，20ulAOPI 染料与20ul细胞悬液1：1均匀混合1分钟后，吸取20ul上样在
Rigel 荧光细胞分析仪进行检测。作为本发明的优选方式，细胞浓度可以是 3-5×105cells/ml。
作为本发明的优选方式，FITC和7-AAD混合染料中，按照体积比，AO 和PI的比例为：的比例为1.5:4。本发明人发现，这样的比例下，染料对于细胞的影响最小，细胞状态最为理想，检测精密度高。
除了对于染料的筛选和优化，本发明人也优化了利用
Rigel 荧光分析仪进行检测的检测方法。在
Rigel荧光分析仪的控制条件中，本发明人发现，明场、FL1、FL2增益以及曝光时间对于免疫细胞的检测结果影响明显，从而对于这些条件进行了优化。
因此，作为本发明的优选方式，测定时，
Rigel荧光分析仪的明场、FL1、FL2增益设置为2.5～3.5、3～4、3～4；较佳地为2.8～3.2、3.3～ 3.7、3.3～3.7；更佳地为3、3.5、3.5。
作为本发明的优选方式，测定时，
Rigel荧光分析仪的曝光时间设置为200～300ms、7000～9000ms、7000～9000ms；较佳地为280～320ms、 7600～8400ms、7800～8200ms；更佳地为250ms、8000ms、8000ms。
作为本发明的优选方式，所述免疫细胞的浓度为：1×104-1×107个细胞/ml (检测低限和高限)。本发明的方法可以检测的细胞浓度低限仅为1×104个细胞/ml，说明其精密度非常理想。
在本发明的具体实施例中，对PBMCs浓度、活率和凋亡进行了一些列的适用性、准确性、稳定性测试与对比。结果显示，本发明的方法精密度高，呈现良好的准确性和稳定性。
应用
本领域中目前常用台盼蓝(TB)染色细胞样品后加到血细胞计数器上，置于光学显微镜下通过人工计数死活细胞测定。虽然这是测定细胞浓度和活率的标准方法，但是这种方法仍然存在以下几个缺陷：第一，TB有毒性，必须短时间内对细胞染色后进行计数。第二，由于TB是细胞蛋白结合，因此可能会与非细胞物质结合，特别是在临床和原代细胞样品中，可能会导致测定结果不准确。第三，目前没有标准化的用于测量细胞活力的TB浓度。第四，这种方法需要凭借用户在光学显微镜下判定细胞死活的条件下来计数，这对于细胞形态多样、有许多非细胞碎片的细胞样品时就容易产生误差，不仅费时，而且具有操作依赖性。手动台盼蓝检测的低精确度和对操作者的依赖性 (不同操作者测得的细胞浓度和活率相差很大)是这一技术的一个瓶颈。此外，移液和转移过程中的错误可能会导致CV值的增加。
与上段情形相比，本发明针对免疫细胞，提出了比TB染料更为适用的染料，即AO/PI染料，其对于免疫细胞的毒性低，使得细胞状态良好，有利于检测。同时，本发明人也发现，AO/PI染料与
Rigel荧光细胞分析仪的配合度高于TB染料，有利于实现高精密度地检测。
本领域中也已开发了基于图像的细胞计数(IBC)系统，例如Cellometer AutoT4(Nexcelom Bioscience)，Countess(Invitrogen)和NucleoCounter， NC-200(Chemometec)，解决人工计数方法的已知问题。但这些自动细胞计数器还是需要在明场下依据台盼蓝染色与否来区别死活细胞。对于复杂的细胞样品时，比如含细胞碎片和污染了无核的细胞样品，大大影响了其测定的准确性。流式细胞术测量中也发现，移液和转移过程中的错误可能会导致CV 值的增加。
以上问题通过本发明的方法可以得到有效地解决，本发明的方法中选用
Rigel荧光细胞分析仪，并对该仪器进行控制条件的优化，调节曝光时间和曝光强度，得出AO/PI染料对PBMCs的浓度、活率可以准确计数。利用所述
Rigel荧光细胞分析仪，相比于NC-200有明场视野， AO/PI染料在测试细胞活率方面比NC-200使用AO/DAPI染料更加的准确。
在经典的Annexin-V测试细胞凋亡的基础上，传统染料组合为FITC+PI，改进后的染料组合为FITC+7-AAD，利用此染料组合对同一批PBMCs进行流式细胞仪和
Rigel进行比较，结果显示
Rigel荧光细胞分析仪达到了与流式细胞仪相一致的水平，具有高度的一致趋势性，可用
Rigel荧光细胞分析仪替代流式细胞仪(目前普遍使用但高成本)检测细胞凋亡水平。
因此，本发明的方法不仅可以进行细胞计数以及活率测定，而且还可以应用于细胞凋亡的检测，以一台仪器以及适当的染料即可完成。可用
Rigel全自动荧光计数仪代替流式细胞仪，达到甚至超过流式细胞仪的检测精密度，同时成本降低、程序简单且省时。
此外，也可基于本发明的方法开发出快速检测试剂盒，从而为小型实验室和诊所进行免疫细胞相关研究，尤其是在无法获得流式细胞仪、激光扫描仪和荧光显微镜条件下或需要快速分析数据情况下，提供一种快速、简单且廉价的替代方法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
PBMCs浓度、活率制备
PBMCs先在-196℃下的液氮罐里进行冻存，冻存一段时间后，从液氮罐里拿出一株细胞进行复苏，复苏细胞的步骤，大致可分为以下几步。第一，打开水浴锅加热至37℃；第二，将从液氮罐中拿出的细胞，用镊子夹在水浴锅中，放置3-5min；第三，在无菌操作台中，将细胞转移至T25方瓶中，并放在37℃，5％CO2恒温培养箱中进行培养。每隔48h进行换液，并用
Rigel荧光分析仪器(上海睿玉生物科技有限公司)对细胞每天计数。
当PBMCs长到4×106细胞/ml，并且细胞活率也在95％之上时，取部分细胞，将其浓度调至4×106细胞/ml，然后以2倍梯度稀释，稀释至2×106， 1×106，0.5×106，0.25×106，0.125×106，0.625×105细胞/ml。另取部分细胞，浓缩2倍，制成8×106细胞/ml。
将活率在95％之上，浓度在1～4×106细胞/ml的PBMCs，取部分细胞出来，将其中的一部分放在99℃的水浴锅中煮沸20min，制成活率为0％的 PBMCs，接着以活率在95％以上的细胞近似于100％。如表1中制成不同细胞活率的细胞样品，应用于后续实验。
表1
诱导凋亡检测，将PBMCs放置热诱导温度：37℃，45℃，50℃，55℃， 60℃各放置20min，并设置对照空白PBMCs，室温下即可。
台盼蓝手动计数
分别取每个浓度和活率的样品细胞，将50毫升样品与50毫升0.4％台盼蓝混合轻轻吹打，然后将20毫升混合物装入每个中血细胞计数器的腔室。根据标准方法，在40X物镜下一式三份地进行计数。
AO/PI荧光染料
Rigel荧光分析仪计数
分别取每个浓度和活率的样品细胞，将60毫升样品与60毫升AO/PI荧光染料混合轻轻吹打，然后将20毫升混合物装入每个
Rigel计数板中，一个板中有5个槽，每次打3个槽的样品，计数板装入
Rigel 荧光分析仪器中，对细胞的浓度和活率进行测试。
对应于1×104-1×107浓度的细胞，AO/PI荧光染料的终浓度为20ul AO/PI 染料与20ul细胞悬液1：1均匀混合1分钟后，吸取20ul上样在
Rigel 荧光细胞分析仪进行检测。
计数时，对染色后的细胞1分钟后上样到
Rigel荧光细胞分析仪。
AO/DAPI荧光染料NC-200计数仪计数
分别取每个浓度和活率的样品细胞，由于NC-200的AO/DAPI染料已经在计数板中了，所以不需要细胞样品与染料进行混合，直接用NC-200的计数板吸取细胞样品即可(每次取的细胞样品不低于200毫升)，同时NC-200 每次只能上一个样，所以需一个一个样进行测试，每组做3个平行。
计数时，对染色后1分钟的细胞进行计数。
流式细胞仪对PBMCs活率的测试
分别取不同活率的样品细胞，加入PI染料，进行样品细胞与PI混合，2 分钟后上流式细胞仪测试，每组做三个平行。
测试时，对染色后呈现2分钟后的细胞进行计数。
测试细胞凋亡实验步骤
(1)每个样品收集约30-50万个细胞于1.5ml离心管内(如细胞密度为100万个/mL，则取500μl体积悬液用于后续实验)；将细胞在400g转速条件下离心3min，弃上清，用200μlPBS进行重悬；用移液枪轻轻吹打混匀， 400g转速条件下离心3min，弃上清，用100μlAnnexin V Buffer重悬；
(2)向细胞悬液中加入1.5μl Annexin V FITC染色液；
(3)加入4μl 7-AAD染色液；
(4)混匀，室温避光孵育10-15min；
(5)400g转速条件下离心3min，弃上清，用100μl Annexin V Buffer进行重悬；
(6)再次400g转速条件下离心3min，弃上清，用100μl Annexin V Buffer 混匀样本，并在30min内完成检测。
染料中，FITC和7-AAD的比例为1.5ul：4ul。
实施例1、
Rigel荧光分析仪检测PBMCs的染色方案研究
1、不同染料的初步研究
本发明人利用
Rigel荧光细胞分析仪对PBMCs进行检测，检测之前，对PBMCs进行染色。现有的基于荧光显色的染料是较多的，包括 DAPI，Hoechst 33342，Ethidium Bromide(EB)，Propidium Iodide(PI)，SYTOX green/red等，酶催化染料：Acridine Orange(AO)，calcein AM和CFDA等。
本发明人分析了一系列染料后，初步选择台盼蓝、acridine orange(AO)、propidium iodide(PI)以及AO和PI混合的染料AO/PI进行测试。结果显示， AO染料使得PBMCs细胞在
Rigel荧光分析仪中呈现绿色荧光，染的是全部的细胞(图1A)；PI染料使得细胞在
Rigel荧光分析仪中呈现红色荧光，染了很多死细胞(图1B)；台盼蓝染料使得细胞片段也被染色，导致结果不准确；而AO/PI处理细胞则较为理想，可以特异且清楚地染 PBMCs细胞。
利用
Rigel荧光细胞分析仪(明场、FL1、FL2增益设置为3、3.5、 3.5；曝光时间设置为250ms、8000ms、8000ms)对PBMCs浓度计数，AO和 PI相结合的染料(AO/PI，或称为AOPI)与台盼蓝染料的染色后计数的结果如图 2，可见AO和PI相结合的染料(AO/PI)相较于台盼蓝染料，线性显著更为理想。
预先进行细胞活力设定，使其活力分别为100％，80％，60％，40％，20％和0，记录预设值。之后，以不同和染料结合
Rigel测定方法(明场、 FL1、FL2增益设置为3、3.5、3.5；曝光时间设置为250ms、8000ms、8000ms) 分别对预设细胞体系进行细胞活率的检测，获得测定值。根据获得的测定值制作曲线，如图3，可见AO/PI染料结合
Rigel测定法的线性最为理想，而台盼蓝结合
Rigel测定法的线性最低。
2、运用不同染料进行PBMCs细胞浓度测定的精密度和准确性
本发明人设置了相对较低的细胞浓度，在不同细胞浓度梯度(0.49×104， 0.98×104，1.95×104，3.91×104，7.81×104，15.63×104，31.25×104，62.50×104， 125×104，250×104，500×104细胞/ml)下测定了运用不同染料的细胞浓度测试的精密度。结果如表2。其中，AO/PI-
Rigel测定时，
Rigel 荧光分析仪设置为明场、FL1、FL2增益设置为3、3.5、3.5；曝光时间设置为250ms、8000ms、8000ms。
表2
根据表2中测得的变异系数(CV)值，在细胞浓度较低的情况下， AO/PI-
Rigel测定法的CV值显著更低(
Rigel-AOPI> 
Rigel-TB)，呈现显著更高的精密度。
3、运用不同染料进行细胞活率测定的精密度和准确性
比较运用不同染料进行
Rigel测定，PBMCs活率检测的精确度或准确性。其中，AO/PI-
Rigel测定时，
Rigel荧光分析仪设置为明场、FL1、FL2增益设置为3、3.5、3.5；曝光时间设置为250ms、 8000ms、8000ms。
预先进行细胞活力设定，使其活力分别为100％，75％，50％，25％和0，记录预设值。比较运用不同染料进行
Rigel测定，PBMCs活率检测的精确度或准确性。结果如表3。
表3
根据，PBMCs活率测定中，利用AO/PI染料结合
Rige测定法，要比运用其它染料的细胞状态更为理想，测量精确度高。
综上，反复实验论证后，本发明人选择AO/PI染料，其为AO和PI染料的复合染色。
实施例2、
Rigel荧光分析仪检测PBMCs的影响因素研究
本发明人利用
Rigel荧光细胞分析仪对PBMCs进行检测，同时优化检测方法，以找到提高其对PBMCs的检测准确性的关键性因素。经由多条件、多参数反复研究后显示，针对PBMCs，仪器对细胞的曝光强度以及曝光时间是一个较为重要的影响因素。其中，检测前的细胞染色步骤，采用AO/PI染料。
在细胞浓度梯度的测试中，本发明人分别对
Rigel荧光细胞分析仪明场，FL1和FL2进行曝光时间和曝光强度的变化，包括如下：明场、 FL1、FL2增益设置分别为：1、1、1；1.5、1.5、1.5；2、2、2；2.5、2.5、 2.5；3、3、3；3.5、3.5、3.5；4、4、4；4.5、4.5、4.5；5、5、5等。
大量测试后，本发明人发现，对于PBMCs细胞而言，当明场、FL1、FL2 增益过低，低于1.5、2、2时，导致细胞在
Rigel荧光细胞分析仪呈现出暗淡的颜色，影响了计数；当明场、FL1、FL2曝光时间过高，高于 4.0、4.5、4.5时，导致细胞在
Rigel荧光细胞分析仪呈现过于明亮的颜色，影响了计数。而明场、FL1、FL2设置为3、3.5、3.5是显著有利于 PBMCs检测的最优情形。
同时，本发明人也发现曝光强度对于PBMCs细胞的计数而言也是较为重要的。当曝光时间过低，明场、FL1、FL2曝光时间低于100ms、2000ms、 2000ms时，导致细胞在
Rigel荧光细胞分析仪中计数不准确；明场、FL1、FL2曝光强度高于400ms、10000ms、10000ms时，导致细胞在
Rigel荧光细胞分析仪中计数不准确。
因此，本发明人将明场、FL1、FL2增益设置为3、3.5、3.5；曝光时间设置为250ms、8000ms、8000m。
实施例3、利用多种设备进行PBMCs检测的比较
1、PBMCs浓度线性、相关性和精确性分析
比较AO/PI-
Rigel测定法(即应用AO/PI作为染料及应用
Rigel荧光分析仪计数)、AO/DAPI-NC200测定法(即应用AO/DAPI 作为染料及应用NC200细胞活力计数仪计数)、手动台盼蓝计数法对于 PBMCs计数的精确度或准确性。其中，AO/PI-
Rigel测定法中，
Rigel荧光分析仪设置为明场、FL1、FL2增益设置为3、3.5、3.5；曝光时间设置为250ms、8000ms、8000ms；其它测定法中，利用前面材料和方法中所提供的方法，没有详述的条件根据厂商建议的条件。
对细胞进行浓度梯度稀释，记录每个稀释系统中的细胞浓度(预设浓度)。之后，利用三种方法分别进行检测，获得测定值。
在浓度梯度(8×106，4×106，2×106，1×106，0.5×106，0.25×106，0.125×106，0.625×105细胞/ml)下测定了三种方法的细胞浓度测试的线性关系。结果发现，这三种方法都能呈现一定的线性关系，但是线性理想程序为： AO/PI-
Rigel>AO/DAPI-NC200>Trypan Blue-Manual。本发明人统计了三种方法的测定值，并与预设细胞浓度进行比较，获得变异系数(CV)，结果如表4和图4。
表4、使用三种染色方法对浓度梯度稀释的细胞的检测(n＝3)
根据表4中测得的CV值，AO/PI-
Rigel测定法(平均为2.8875％) 比AO/DAPI-NC200测定法(平均为3.525％)和手动台盼蓝法(平均为6.7375％) 的CV值显著低。
上述测定结果说明，AO/PI-
Rige测定法要比AO/DAPI-NC200 测定法和手动台盼蓝法测量精确度高。
并且，手动台盼蓝完成表4计数所需时间为20分钟，而采用 AO/PI-
Rigel测定法缩短为2分钟。
2、PBMCs活率线性、相关性和精确性分析
比较AO/PI-
Rigel测定法(即应用AO/PI作为染料及应用
Rigel荧光分析仪计数)、AO/DAPI-NC200测定法(即应用AO/DAPI 作为染料及应用NC200细胞活力计数仪计数)、手动台盼蓝计数法和流式细胞仪计数法对于PBMCs活率检测的精确度或准确性。其中， AO/PI-
Rigel测定法中，
Rigel荧光分析仪设置为明场、 FL1、FL2曝光时间设置为3ms、3.5ms、3.5ms；曝光强度设置为250、8000、 8000；其它测定法中，利用前面材料和方法中所提供的方法，没有详述的条件根据厂商建议的条件。
预先进行细胞活力设定，使其活力分别为100％，75％，50％，25％和0，记录预设值。之后，利用四种方法分别对预设细胞体系进行细胞活率的检测，获得测定值。
结果显示，与预设值相比较，这四种方法均呈现一定的线性关系，线性比较结果为：AO/PI-
Rige>Flow Cytometry>Trypan Blue-Manual>AO/DAPI-NC200。本发明人进一步统计了三种方法的测定值，并与预设细胞活力水平进行比较，获得变异系数(CV)，如表5和图5。
表5、使用四种染色方法对活率梯度稀释细胞的检测(n＝3)
因此，PBMCs活率测定中，利用AO/PI-
Rige测定法，要比 AO/DAPI-NC200测定法，手动台盼蓝法，流式细胞仪法(Flow Cytometry)测量精确度高。
3、PBMCs细胞凋亡测定的分析(并非用
比较
Rigel测定法、流式细胞仪测定法对于PBMCs细胞凋亡进行测定。其中，
Rigel测定法中，
Rigel荧光分析仪设置为明场、FL1、FL2增益设置为3、3.5、3.5；曝光时间设置为250ms、8000ms、 8000ms；流式细胞仪测定法中，利用前面材料和方法中所提供的方法，没有详述的条件根据厂商建议的条件。
由
Rigel捕获的热诱导PBMCs的荧光图像显示在图6中。细胞凋亡的PBMCs细胞发出明亮的绿色荧光，坏死细胞发出强烈的红色荧光。随着温度升高，绿色凋亡细胞和红色坏死细胞的数量也增加。
流式细胞仪和
Rigel的每个孵育温度下的荧光强度散点图如图7所示。象限的左下方代表活细胞(膜联蛋白V阴性，7-AAD阴性)，右下方代表凋亡细胞(膜联蛋白V阳性，7-AAD阴性)，右上代表坏死细胞(膜联蛋白V阳性，7-AAD阳性)，左上方代表碎片或非特异性荧光。热处理导致坏死细胞群的增加。随着温度从37℃升高到60℃，分别用流式细胞仪和
Rigel检测得到坏死细胞群分别从7.25％增加到78.5％和8.57％到81.93％。同理，热处理也导致活细胞的减少。随着温度从37℃升高到60℃，分别用流式细胞仪和
Rigel检测得到活细胞群，分别从83.7％减少到2.65％和72.6％减少到8.38％。对于流式细胞仪和
Rigel数据，观察到活细胞，凋亡细胞和坏死细胞群分散的界限很清楚。
不同温度下，两种不同测定方式的活细胞百分比统计数据如图8，可见，流式细胞仪和
Rigel测得PBMCs细胞凋亡的活细胞都在有序的递减，流式细胞仪和
Rigel具有良好的一致相关性。
这一结果说明，本发明优化的
Rigel检测方法能够替代价格昂贵的流式细胞检测方法，大大降低细胞凋亡的检测成本。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种对免疫细胞进行细胞数、活力或凋亡测定的方法，包括：利用
Rigel荧光分析仪进行测定，其中，
测定免疫细胞的细胞数或活力时，以吖啶橙和碘化丙啶混合染料进行染色；
测定免疫细胞的凋亡时，以异硫氰酸荧光素和氨基放线菌素D混合染料进行染色。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的免疫细胞包括：
外周血单个核细胞，或
来自于外周血单个核细胞的细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述来自于外周血单个核细胞的细胞包括：淋巴细胞，单核细胞，NK细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的淋巴细胞包括：T细胞，B细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的淋巴细胞为携带有嵌合抗原受体的重组细胞，如CAR-T细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，吖啶橙和碘化丙啶混合染料中，AO:PI为0.8～1.2:0.8～1.2；较佳地为1:1。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，异硫氰酸荧光素和7-氨基放线菌素D混合染料中，按照体积比，异硫氰酸荧光素和7-氨基放线菌素D的比例为1.5:4。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，测定时，
Rigel荧光分析仪的明场、FL1、FL2增益设置为2.5～3.5、3～4、3～4；较佳地为2.8～3.2、3.3～3.7、3.3～3.7；更佳地为3、3.5、3.5。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，测定时，
Rigel荧光分析仪的曝光时间设置为200～300ms、7000～9000ms、7000～9000ms；较佳地为280～320ms、7600～8400ms、7800～8200ms；更佳地为250ms、8000ms、8000ms。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞的浓度为：1×104～1×107个细胞/ml。
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911135469.5A Pending CN112903634A (zh) | 2019-11-19 | 2019-11-19 | 对免疫细胞进行细胞数、活力或凋亡测定的高精密度方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112903634A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113670696A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-19 | 上海睿钰生物科技有限公司 | 一种用于细胞染色的染色液及其配制方法 |
| CN114791411A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-07-26 | 广州先康达生物科技有限公司 | 评估人体免疫功能的指标组合、试剂盒和方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101225428A (zh) * | 2007-01-19 | 2008-07-23 | 华南农业大学 | 一种染色液及其染色方法和应用 |
-
2019
- 2019-11-19 CN CN201911135469.5A patent/CN112903634A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101225428A (zh) * | 2007-01-19 | 2008-07-23 | 华南农业大学 | 一种染色液及其染色方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| INGRID SCHMID ET.AL: "A rapid method for measuring apoptosis and dual-color immunofluorescence by single laser flow cytometry", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 * |
| LEO LI-YING CHAN ET.AL: "A high-throughput AO/PI-based cell concentration and viability detection method using the Celigo image cytometry", 《CYTOTECHNOLOGY》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113670696A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-19 | 上海睿钰生物科技有限公司 | 一种用于细胞染色的染色液及其配制方法 |
| CN114791411A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-07-26 | 广州先康达生物科技有限公司 | 评估人体免疫功能的指标组合、试剂盒和方法 |
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