CN112301086A - 一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用。所述评价方法中，将携带荧光标记A的靶细胞与自然杀伤细胞共培养，再使用荧光标记B对共培养后产生的死细胞进行染色标记，而后分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道对染色标记后的细胞进行显微成像，得到显微图像，再通过图像识别对所得到的显微图像中的细胞进行识别，并将同一区域的识别结果进行叠加合成分析，根据分析结果评估所述自然杀伤细胞的免疫活性。本发明中采用由图像直接得到检测结果的“直读法”，检测结果更加准确直观，适用于标准化要求较高的医疗诊断和生物医药产业化等领域。

Description

一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，涉及一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用。
背景技术
体外自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)的免疫活性评价对肿瘤、血液病、感染性疾病、免疫性疾病、器官移植等病因的分析、治疗监控、预后情况及转归等方面都有重要的指导意义。NK细胞主要存在于外周血、脾脏和骨髓中，淋巴结中含量极少。其不同于T细胞和B细胞，对靶细胞杀伤时既不需特异性抗体参加，也不需抗原预先致敏，即可对多种肿瘤细胞或感染细胞有迅速杀伤和溶解作用。
NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。在血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性减低；宿主抗移植物反应者，NK活性升高。因其与多种疾病的发生、发展及治疗转归密切相关，所以NK细胞的杀伤效力可以较大程度地反映机体的细胞免疫功能。
研究表明，多数肿瘤患者特别是中晚期及伴有转移的癌症患者，淋巴细胞的自然杀伤细胞活性往往降低，并随着肿瘤的发展进一步下降。癌症患者手术后，如果NK细胞活性继续低下，预示着肿瘤呈进行性生长或转移，相反如果NK活性恢复正常，预示治疗有效且预后良好。此外，白血病患者、器官移植患者、习惯性流产患者生理机能的相应变化，都能在NK细胞活性指标上得到明显体现。因此，这一指标对诊治多种疾病以及判断预后都有很大帮助。
常用的NK细胞杀伤检测方法包括：51Cr释放试验、乳酸脱氢酶(LDH)释放法和Calcein释放实验等。其中经典的方法是51Cr释放实验，该方法可重复性好，但是因其使用同位素标记靶细胞，从而存在半衰期短、同位素废弃物处理及实验防护要求高等多种限制因素，尤其是放射性同位素的使用对健康以及环境具有巨大威胁，使该类方法的应用受到局限，因此，很多研究者会采用其它替代方法进行生物学效力检测。
但是目前，用于检测NK细胞杀伤效力的方法都是通过释放物质的量来间接测定的，即先用某一试剂对靶细胞进行标记，然后和不同浓度的NK细胞进行共孵育，当靶细胞受到NK细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，这些物质会释放到上清中，通过测定释放物质的含量可以测定NK细胞的活性。这些方法不能直接反应细胞的变化，且反应时间的长短、仪器检测的时间点都会对读取的数值造成影响。
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。例如，CN104928243A公开了一种实体瘤患者自体NK细胞分离、活化扩增及活性检测方法。其中，NK细胞活性检测方法中使用荧光标记CFSE标记靶细胞，效靶细胞共培养后再使用流式细胞仪分析细胞杀伤率，该方法可以在单个细胞水平检测细胞的杀伤功能，在过继免疫细胞治疗肿瘤的临床应用前基础研究方面具有重要意义。但是，流式细胞术存在一定的缺陷，其检测过程受操作人和分析人的主观误差影响较大，且检测结果不直观，无法直接重复验证检测结果的准确性，若需要验证结果的准确性，还需要借助显微镜或其他仪器观察进行佐证。
因此，本领域亟需提供一种基于显微图像识别、直观可视并且准确的评估方法来评价NK细胞等免疫细胞的杀伤活性。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用。所述评价方法能够快速、直观、准确地对靶细胞和自然杀伤细胞进行分类并计数，从而得到自然杀伤细胞的免疫活性评价结果。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法，所述评价方法包括如下步骤：
(1)将携带荧光标记A的靶细胞与自然杀伤细胞(NK细胞)共培养，再使用荧光标记B对共培养后产生的死细胞进行染色标记；
其中，荧光标记A与荧光标记B对应的激发光波长不同；
(2)分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道对染色标记后的细胞进行显微成像，得到显微图像；
(3)通过图像识别对所得到的显微图像中的细胞进行识别，并将同一区域的识别结果进行叠加合成分析，根据分析结果评估所述自然杀伤细胞的免疫活性；
其中，所述叠加合成分析过程中，仅显示荧光标记A的细胞为活的靶细胞，仅显示荧光标记B的细胞为死的自然杀伤细胞，同时显示荧光标记A和荧光标记B的细胞为死的靶细胞，无荧光标记的细胞为活的自然杀伤细胞；
具体分类方法如下表1所示。
表1
Figure BDA0002748032260000031
Figure BDA0002748032260000041
本发明中，所述评价方法先通过两种不同的荧光标记对细胞进行染色，即用两种不同激发光波段的荧光试剂A和荧光标记B分别对靶细胞和死细胞进行染色标记，区分活靶细胞、死靶细胞、活自然杀伤细胞和死自然杀伤细胞，而后结合实现荧光显微成像和图像合成分析，在同一位置或同一视野分别用明场和适合2种荧光标记的显微荧光通道进行显微成像，再将同一视场的显微图像进行叠加合成分析，得到评估结果。
本发明中采用的是由图像直接得到检测结果的“直读法”，对比镉51释放实验以及流式细胞术采用的间接法，本发明的检测结果更加准确和直观，在需要标准化可重复验证的医疗诊断和生物医药产业化领域具有重要的应用价值。
本发明中，所述NK细胞可以由人外周血提取得到，可以从人组织中分离纯化得到，也可以来源于体外培养的NK细胞。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中所述荧光标记A包括荧光蛋白或细胞染料。其中，所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或荧光素酶中(Luc)的任意一种。
优选地，所述荧光标记A是细胞活性染料，例如荧光染料CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)或钙黄绿素AM(Calcein-AM)等。
优选地，步骤(1)中使用荧光标记A对靶细胞进行染色标记后，还包括洗涤的操作。
优选地，步骤(1)中所述荧光标记B为死细胞染料。可以是例如Annexin-V(膜联蛋白-V)、SYTOX Green(绿菁SYTOX)、PI(溴化丙啶)和7-AAD(7-氨基放线菌素D)等中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(1)中所述靶细胞包括免疫细胞相对应的各种肿瘤细胞和/或病毒感染的细胞。例如，所述靶细胞可以是无荧光蛋白标记的或有荧光蛋白(如GFP、RFP或Luc等)标记的K562细胞、Jurkat细胞、神经母细胞瘤细胞(如SK-N-BE(2)、CHLA 155或CHP134等)，也可以是其他与前述细胞具有相同作用机理的细胞。
优选地，步骤(1)中所述自然杀伤细胞包括人外周血PBMC细胞、从组织中分离纯化得到的NK细胞或经体外扩增培养的NK细胞中的任意一种或至少两种的组合；也可以是其他与前述细胞具有相同作用机理的细胞。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中将靶细胞与自然杀伤细胞共培养时，还分别单独培养靶细胞和自然杀伤细胞作为对照组。
优选地，所述评价方法还包括如下步骤：
对所述对照组分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道进行显微成像，得到显微图像；
对所述对照组的显微图像进行图像识别，并将识别结果进行叠加合成分析，得到对照组的靶细胞死亡率和/或对照组的自然杀伤细胞死亡率。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述识别结果包括细胞的位置信息、尺寸信息或荧光强度中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，通过明场图像识别方法对明场图像中的目标进行识别，获得检测目标的位置信息、尺寸信息等；通过荧光图像识别方法对荧光标记A和荧光标记B荧光图像中的荧光目标进行识别，获得检测目标的位置信息、尺寸信息等；而后对所得到的同一区域明场、荧光标记A和荧光标记B显微图像识别结果进行叠加合成分析。
其中，能够同时在荧光标记A和荧光标记B的显微图像中获取到死靶细胞的位置信息和尺寸信息；活靶细胞的位置信息和尺寸信息仅能在荧光标记A的显微图像中获取。
死自然杀伤细胞的位置信息和尺寸信息仅能在荧光标记B的显微图像中获取；而活自然杀伤细胞的位置信息和尺寸信息无法在荧光标记A和荧光标记B的显微图像中获取，仅能在明场图像中获取。
优选地，步骤(3)所述分析结果包括：
靶细胞和自然杀伤细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活自然杀伤细胞数、死自然杀伤细胞数、靶细胞死亡率或自然杀伤细胞死亡率中的任意一种或至少两种的组合。
其中，所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：
靶细胞死亡率＝死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；
所述自然杀伤细胞死亡率采用如下公式进行计算：
自然杀伤细胞死亡率＝死自然杀伤细胞数/(活自然杀伤细胞数+死自然杀伤细胞数)×100％。
优选地，步骤(3)所述评估的方法为：
将所述分析结果中的靶细胞死亡率与死亡率阈值进行比较，所述死亡率阈值包括上限和下限，并根据比较结果得到所述自然杀伤细胞的免疫活性水平。
本发明中，若所得靶细胞死亡率大于等于死亡率阈值的上限，则评估自然杀伤细胞的免疫活性较好；若所得靶细胞死亡率小于死亡率阈值的上限，但是大于等于死亡率阈值的下限，则评估自然杀伤细胞的免疫活性正常；若所得靶细胞死亡率小于死亡率阈值的下限，则评估自然杀伤细胞的免疫活性较差。
例如，所得靶细胞死亡率为45％，而死亡率阈值的上限和下限分别为30％和70％，则所得自然杀伤细胞的免疫活性正常。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)所述分析结果还包括：细胞特异杀伤率和/或自然杀伤细胞自伤率。
其中，所述细胞特异杀伤率采用如下公式进行计算：
细胞特异杀伤率(％)＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；
所述自然杀伤细胞自伤率采用如下公式进行计算：
自然杀伤细胞自伤率(％)＝自然杀伤细胞死亡率-对照组自然杀伤细胞死亡率。
作为本发明优选的技术方案，所述检测方法包括如下步骤：
(1)先使用荧光标记A标记靶细胞，将标记后的靶细胞与自然杀伤细胞共培养，并单独培养靶细胞和自然杀伤细胞作为对照组细胞；
所述荧光标记A可以是荧光蛋白，荧光蛋白标签通过基因编辑转入靶细胞当中，使其在生长的过程中同时表达荧光蛋白，常用的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或荧光素酶中的任意一种；
所述荧光标记A也可以是细胞染料，如果所选细胞染料容易产生背景荧光，需进行洗涤，如果所选试剂没有背景荧光或背景荧光不影响分析，可免除此步骤；
(2)使用荧光标记B对步骤(1)得到的共培养细胞进行孵育染色，所述荧光标记B为死细胞染料；
其中，荧光标记A与荧光标记B对应的激发光波长不同；
(3)将所述染色后得到的细胞转移至加入血球计数板或与血球计数板有类似固定距离微缝结构的细胞计数板；
(4)将步骤(3)步制备的已经加样的计数板放置到显微荧光成像系统下摄像，对同一位置或同一视野分别摄取明场通道、A荧光试剂匹配通道、B荧光试剂匹配通道下的显微图像，得到3张显微成像图片；
(5)图像合成分析计数；以明场通道获得的图像进行细胞计数，得到总细胞数；而后叠加分析明场、荧光标记A匹配通道和荧光标记B匹配通道获得的图像；
其中，仅显示荧光标记A的细胞为活的靶细胞，仅显示荧光标记B的细胞为死的自然杀伤细胞，不显示荧光标记的细胞为活的自然杀伤细胞，同时显示荧光标记A和荧光标记B的细胞为死的靶细胞；
最后，计算靶细胞死亡率、自然杀伤细胞死亡率、对照组靶细胞和自然杀伤细胞的死亡率、细胞特异杀伤率和自然杀伤细胞自伤率，得到自然杀伤细胞免疫活性的评估结果。
第二方面，如第一方面所述的评价方法在检测自然杀伤细胞免疫活性、免疫制品质量控制或个体免疫功能评价中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法，使用两种不同激发光波段的荧光标记A和荧光标记B分别对靶细胞和死细胞进行染色标记，结合荧光显微成像和图像合成分析技术，对共培养后的细胞进行显微成像，再对同一视场的显微图像进行叠加合成分析，得到靶细胞和自然杀伤细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活自然杀伤细胞数和死自然杀伤细胞数，并根据对应细胞个数计算得到细胞杀伤率等结果；
(2)本发明提供的免疫活性评价方法，能够获得细胞图像和评估结果，所得结果更加直观准确，且通过荧光标记直接对细胞进行染色和分类，无需理由其他中间物质间接反映细胞数量，使得结果更加标准，可重复验证，因此，该方法在对肿瘤患者、白血病患者、器官移植患者、习惯性流产患者等个体的细胞免疫功能评价中具有重要的应用价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，20μM/mL的荧光染料CFSE(购买自Biolegend，USA)；PI染料(购买自Sigma，USA)；肿瘤细胞的培养基为不含血清的高糖培养基(购买自Hyclone，USA)；分层液为
Figure BDA0002748032260000091
-1077(型号为Sigma-10771-100mL)；其他试剂均可购自常规厂商；
以下实施例中，若无特殊说明，所采用的实验方法均为本领域技术人员知晓的常规方法，且所述实验步骤中，室温均为25℃。
实施例1
本实施例提供一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法。
具体步骤如下：
(1)制备自然杀伤细胞：
将3mL血液样本与3mL生理盐水混合稀释，取4.5mL分层液
Figure BDA0002748032260000092
-1077至15mL离心管中，再将6mL稀释的抗凝血液小心沿管壁加入至分层液上，保持两者界面清晰可见；
室温400g离心30min，离心管内分为四层，最上面为血浆，第二层为所需的PBMC细胞，第三层为分离液，第四层为红细胞，用200μL枪头小心吸取第二层的PBMC细胞并转移至1.5mL EP管中，备用；
(2)标记肿瘤细胞：
收集肿瘤细胞(K562细胞系)，制备成细胞浓度为1×105/mL的悬液，向1mL悬液中加入1μL浓度为20μM的CFSE进行标记，37℃避光孵育30min；
孵育完成后，室温下400g离心3min，吸走上清，加入1mL含有血清的培养基，再向96孔板中加入100μL K562细胞；
(3)自然杀伤细胞与肿瘤细胞共培养：
将步骤(2)中得到的PBMC细胞稀释至1×106/mL，并取100μL加入至已有K562的96孔板中，效靶比设置为10:1，共培养孵育4h；
(4)染色：
共培养结束后，每个孔取全部200μL样品，加入2μL死细胞染料PI，室温孵育10min；
(5)显微成像：
取20μL孵育后的样品至计数板，放置到检测仪器的样品台上，分别摄取明场通道、FL1通道(匹配荧光染料CFSE)、FL2通道(匹配荧光染料PI)；
其中，两个荧光通道信息及顺序分别如下：
FL1：Ex 480nm，Em 535nm；FL2：Ex 525nm，Em 600LP，FL1通道激发与采集CFSE荧光，FL2通道激发与采集PI荧光；
在同一位置分别用明场和适合2种荧光试标记的显微荧光通道进行显微成像，得到3张显微成像图片；
(6)图像合成分析：
图像识别软件会将明场、FL1通道以及FL2通道下的荧光图片进行识别，具体方法如下：
(I)以明场图像判断细胞，区分杂质，计算总细胞数；
(II)仅显示荧光标记A的为活的靶细胞，统计活靶细胞数；
(III)仅显示荧光标记B的为死的自然杀伤细胞，统计死的自然杀伤细胞数；
(IV)无荧光显示的为活自然杀伤细胞，统计活的自然杀伤细胞数。
(V)同时显示荧光标记A和荧光标记B的为死的靶细胞，统计死的靶细胞数；
(VI)计算靶细胞死亡率和自然杀伤细胞死亡率；
其中，明场通道下拍摄图片识别的目标为总细胞(包含靶细胞与自然杀伤细胞)；
FL1通道下拍摄图片识别的目标为靶标细胞(包含活的与死的靶细胞)；
FL2通道下拍摄图片识别的目标为总的死细胞(包含死的靶标细胞和死的自然杀伤细胞)；
三张图片叠加后，软件对细胞所在的同一位置进行标示：
无荧光信号，标示并统计数目为a；只有FL1信号，标示并统计数目为b；同时有FL1和FL2信号，标示并统计数目为c；只有FL2信号，标示并统计数目为d；
自定义编辑公式如下：
活靶细胞数＝b、死靶细胞数＝c；
靶细胞死亡率＝c/(b+c)×100％；
活自然杀伤细胞数＝a、死自然杀伤细胞数＝d；
自然杀伤细胞死亡率＝d/(a+d)×100％。
(7)将靶细胞死亡率与死亡率阈值进行比较，所述死亡率阈值根据不同的情况进行设定，本实施例中死亡率阈值的上限设为40％，下限设为20％；
需要注意的是，此处死亡率阈值的上限和下限需要根据实际情况综合评定，此处数值仅作为示例或者参考。
所得检测结果中：
靶细胞死亡率大于等于40％的实验组中，其自然杀伤细胞的免疫活性较好；
靶细胞死亡率小于等于20％的实验组中，其自然杀伤细胞的免疫活性较差；
靶细胞死亡率大于20％小于40％的实验组中，其自然杀伤细胞的免疫活性正常。
实施例2
本实施例提供一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法。
与实施例1的区别在于，本实施例中，还单独培养靶细胞和自然杀伤细胞作为对照组。
具体方法如下：
在将制备得到的PBMC细胞与靶细胞混合后，同时设置对照组，在靶细胞中直接加入100μL培养基(作为靶细胞对照组)，PBMC细胞中同样加入100μL培养基(作为自然杀伤细胞对照组)，并在与实验组相同的条件下进行培养；
在检测时，也与实验组使用相同的检测和分析方法。
所得分析结果除了活靶细胞数、死靶细胞数、靶细胞死亡率、活自然杀伤细胞数、死自然杀伤细胞数、自然杀伤细胞死亡率之外，还包括：细胞特异杀伤率和自然杀伤细胞自伤率；
其中，细胞特异杀伤率(％)＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；
自然杀伤细胞自伤率(％)＝自然杀伤细死亡率-对照组自然杀伤细胞死亡率。
本实施例中所得分析结果包括：
活靶细胞数、死靶细胞数、靶细胞死亡率、活自然杀伤细胞数、死自然杀伤细胞数、自然杀伤细胞死亡率、细胞特异杀伤率和自然杀伤细胞自伤率；
其中，明场通道下拍摄图片识别的目标为总细胞(包含靶细胞与自然杀伤细胞)；
FL1通道下拍摄图片识别的目标为靶细胞(包含活的与死的靶细胞)；
FL2通道下拍摄图片识别的目标为总的死细胞(包含死的靶标细胞和死的自然杀伤细胞)；
靶细胞死亡率＝死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；
自然杀伤细胞死亡率＝死自然杀伤细胞数/(活自然杀伤细胞数+死自然杀伤细胞数)×100％；
细胞特异杀伤率(％)＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；
自然杀伤细胞自伤率(％)＝自然杀伤细胞死亡率-对照组自然杀伤细胞死亡率。
在设置对照的情况下，排除细胞自然死亡等情况对自然杀伤细胞免疫活性评估结果的影响，提高检测精确度。
综上所述，本发明提供的评估方法能够同时得到待测细胞的图像信息和数据处理结果，该方法直观、准确，便于重复验证。因此，该方法在对肿瘤患者、白血病患者、器官移植患者、习惯性流产患者等个体的细胞免疫功能评价中具有重要的应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法，其特征在于，所述评价方法包括如下步骤：
(1)将携带荧光标记A的靶细胞与自然杀伤细胞共培养，再使用荧光标记B对共培养后产生的死细胞进行染色标记；
其中，荧光标记A与荧光标记B对应的激发光波长不同；
(2)分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道对染色标记后的细胞进行显微成像，得到显微图像；
(3)通过图像识别对所得到的显微图像中的细胞进行识别，并将同一区域的识别结果进行叠加合成分析，根据分析结果评估所述自然杀伤细胞的免疫活性；
其中，所述叠加合成分析过程中，仅显示荧光标记A的细胞为活的靶细胞，仅显示荧光标记B的细胞为死的自然杀伤细胞，同时显示荧光标记A和荧光标记B的细胞为死的靶细胞，无荧光标记的细胞为活的自然杀伤细胞。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤(1)中所述荧光标记A包括荧光蛋白或细胞染料；
优选地，所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或荧光素酶中的任意一种；
优选地，步骤(1)中使用荧光标记A对靶细胞进行染色标记后，还包括洗涤的操作；
优选地，步骤(1)中所述荧光标记B包括死细胞染料。
3.根据权利要求1或2所述的评价方法，其特征在于，步骤(1)中所述靶细胞包括病毒感染的细胞和/或免疫细胞靶向的肿瘤细胞；
优选地，步骤(1)中所述靶细胞包括免疫细胞靶向的肿瘤细胞和/或病毒感染的细胞；
优选地，步骤(1)中所述靶细胞包括无荧光蛋白标记或有荧光蛋白标记的K562细胞、Jurkat细胞或神经母细胞瘤细胞中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)中所述自然杀伤细胞包括人外周血PBMC细胞、从组织中分离纯化得到的NK细胞或经体外扩增培养的NK细胞中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1～3任一项所述的评价方法，其特征在于，步骤(1)中将靶细胞与自然杀伤细胞共培养时，还分别单独培养靶细胞和自然杀伤细胞作为对照组。
5.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，所述评价方法还包括如下步骤：
对所述对照组分别使用明场、荧光标记A匹配的荧光通道和荧光标记B匹配的荧光通道进行显微成像，得到显微图像；
对所述对照组的显微图像进行图像识别，并将识别结果进行叠加合成分析，得到对照组的靶细胞死亡率和/或对照组的自然杀伤细胞死亡率。
6.根据权利要求1～5任一项所述的评价方法，其特征在于，步骤(3)所述识别结果包括细胞的位置信息、尺寸信息或荧光强度中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求1～6任一项所述的评价方法，其特征在于，步骤(3)所述分析结果包括：
靶细胞和自然杀伤细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、活自然杀伤细胞数、死自然杀伤细胞数、靶细胞死亡率或自然杀伤细胞死亡率中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(3)所述评估的方法为：
将所述分析结果中的靶细胞死亡率与死亡率阈值进行比较，所述死亡率阈值包括上限和下限，并根据比较结果得到所述自然杀伤细胞的免疫活性水平。
8.根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于，所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：
靶细胞死亡率＝死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；
优选地，所述自然杀伤细胞死亡率采用如下公式进行计算：
自然杀伤细胞死亡率＝死自然杀伤细胞数/(活自然杀伤细胞数+死自然杀伤细胞数)×100％。
9.根据权利要求1～8任一项所述的评价方法，其特征在于，步骤(3)所述分析结果还包括：细胞特异杀伤率和/或自然杀伤细胞自伤率；
优选地，所述细胞特异杀伤率采用如下公式进行计算：
细胞特异杀伤率＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；
优选地，所述自然杀伤细胞自伤率采用如下公式进行计算：
自然杀伤细胞自伤率＝自然杀伤细胞死亡率-对照组自然杀伤细胞死亡率。
10.如权利要求1～9任一项所述的评价方法在检测自然杀伤细胞免疫活性、免疫制品质量控制或个体免疫功能评价中的应用。
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