CN113899725A - 一种实时定量检测nk类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法 - Google Patents

一种实时定量检测nk类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113899725A
CN113899725A CN202111186870.9A CN202111186870A CN113899725A CN 113899725 A CN113899725 A CN 113899725A CN 202111186870 A CN202111186870 A CN 202111186870A CN 113899725 A CN113899725 A CN 113899725A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
effector cells
effector
target cells
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111186870.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113899725B (zh
Inventor
朱毅
徐大来
何远清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Original Assignee
Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University filed Critical Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority to CN202111186870.9A priority Critical patent/CN113899725B/zh
Publication of CN113899725A publication Critical patent/CN113899725A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113899725B publication Critical patent/CN113899725B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法：利用NK类效应细胞的独有的功能特点，通过用荧光标记示踪效应细胞的溶酶体和示踪靶细胞的活性，联合应用高内涵、流式技术，在效‑靶共培养体系中实时观察与定量检测效应细胞和靶细胞的荧光标记在共培养前后的变化，统计分析与准确评估不同处理组的NK类效应细胞将分泌性溶酶体定向递送入靶细胞的效率和对其的杀伤力。与现有的检测NK类效应细胞的胞吐、脱颗粒功能的方法相比，本发明方法具有动态、实时、全程可视化与定量化的显著优势，填补了NK类效应细胞的分泌性溶酶体胞吐‑脱颗粒与定向转运能力和杀伤能力的实时定量的系统的检测方法的空白。

Description

一种实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法
技术领域
本发明属于医学检测技术，特别属于一种实时观察与定量检测NK类效应细胞胞吐-脱颗粒和杀伤能力的方法。
背景技术
NK类效应细胞包括从人体外周血或者脐带血中分离和原代培养的天然杀伤（NK）细胞，与已经建立的NK细胞株（NK92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS、NKL细胞等）。体内的NK细胞是机体抵御感染和肿瘤的重要免疫防线，它们能够有效的杀伤清除“异己”。
NK类效应细胞的分泌性溶酶体(secretory lysosomes，简称SLs)是存贮、运输和释放NK杀伤介质（细胞毒性内容物/颗粒）的载体，是NK类效应细胞杀伤能力的执行者。作为一种特殊的细胞器，分泌性溶酶体是能够响应外部刺激而进行调节分泌的溶酶体。免疫系统的许多细胞使用分泌性溶酶体来释放参与其特殊效应机制的蛋白质。
胞吐（exocytosis）是指储存在细胞囊泡内的物质通过囊泡膜和细胞膜的融合而被释放到胞外的过程。靶细胞识别可诱导NK类效应细胞与其靶标之间发生裂解性免疫突触，然后激活NK类效应细胞的分泌性溶酶体SLs的极化胞吐作用，SLs在裂解突触处释放包含细胞毒性内容物的颗粒，这些由刺激引发的以胞吐-脱颗粒方式向胞外区大量释放颗粒内物质的过程，也被定义为脱颗粒(degranulation)。SLs的胞吐-脱颗粒作用在NK类效应细胞的细胞毒性功能中起着至关重要的作用。
迄今为止，检索文献，缺乏明确的实时定量地检测效-靶共培养体系内SLs的胞吐、定向转移等变化情况的方法。
现有的常用的评价NK类效应细胞活化与脱颗粒功能的方法是用流式细胞术检测溶酶体相关膜蛋白（LAMP）1 / CD107a在NK类效应细胞膜上的阳性表达率与平均荧光强度，依据的原理是当NK类效应细胞被激活时，释放的SLs膜与NK类效应细胞的细胞质膜的融合，导致溶酶体相关蛋白CD107a在NK类效应细胞的细胞膜表面暴露。
也有文献报道使用定量检测β-己糖氨酶的方法来评价NK类效应细胞胞吐-脱颗粒功能，依据的原理是杀伤介质(如颗粒酶、穿孔素)和β-己糖氨酶都存贮在NK类效应细胞的SLs中，受活化刺激后，杀伤介质和β-己糖氨酶通过相似的囊泡运动同时被排出胞外，二者释放量具有相关性。
但是，使用CD107a与β-己糖氨酶的检测方法都无法观察到NK类效应细胞SLs胞吐-脱颗粒、包含裂解颗粒的SLs定向递送至靶细胞、靶细胞死亡的连续的动态进程，因此现有的方法不能准确评估不同类型和/或不同刺激、处理的NK类效应细胞的能力。特别是，随着嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)工程的发展，设计不同的CAR基因修饰的NK类效应细胞的实验研究越来越多，更多新型的NK类效应细胞的能力待准确评估。
因此，基于文献已证实的NK类效应细胞的功能特点（即，NK类效应细胞中存在预先停放且可释放的SLs，经靶细胞刺激后，NK胞吐-脱颗粒反应的增强是由于包含裂解颗粒的SLs 从不可释放状态转变为可释放状态。经靶细胞刺激后，NK类效应细胞内的包含裂解颗粒的易于释放的SLs能够以更高的速率分泌和传递到靶细胞的细胞质中），本发明首次通过分别示踪NK类效应细胞的溶酶体和示踪靶细胞的活性，实现了在效-靶共培养体系中实时观察与定量检测SLs的胞吐、定向转移等变化情况的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种实时、定量检测NK类效应细胞对贴壁生长的肿瘤靶细胞的反应力、分泌性溶酶体(secretory lysosomes，简称SLs)胞吐-脱颗粒、毒性颗粒的定向递送至靶细胞的能力，和杀伤能力的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，包括以下步骤：
使用第一荧光素特异性标记活的贴壁生长的肿瘤靶细胞，对肿瘤靶细胞进行实时监测并获取肿瘤靶细胞的第一荧光平均荧光强度值；
使用第二荧光素特异性标记NK类效应细胞的分泌性溶酶体，对NK类效应细胞进行实时监测并获取效应细胞的第二荧光平均荧光强度值；
使用中性磷酸盐缓冲溶液清洗标记完成的肿瘤靶细胞和NK类效应细胞两遍直至细胞表面无残留染料，向肿瘤靶细胞中加入NK类效应细胞，立即对共培养的效靶细胞进行不间断的图像采集；NK类效应细胞和肿瘤靶细胞共培养90min后，将共培养孔内的悬浮生长的NK类效应细胞用移液枪转移，记录NK类效应细胞的第二荧光平均荧光强度值，用中性磷酸盐缓冲溶液清洗共培养后的肿瘤靶细胞，记录肿瘤靶细胞的图像并分析第一荧光平均荧光强度值和第二荧光平均荧光强度值的变化；
计算NK类效应细胞的第二荧光平均荧光强度的衰减率、肿瘤靶细胞第一荧光平均荧光强度的衰减率，以及NK类效应细胞的分泌性溶酶体从NK类效应细胞胞内定向转移至肿瘤靶细胞胞内的效率。
进一步的，第一荧光素和第二荧光素为两种荧光染料，两种荧光素具有不同的激发波长与发射波长，不存在光谱重叠；第一荧光素只能与活细胞结合并标记，不会抑制任何的细胞功能如增殖或趋化性，对细胞无毒性；第二荧光素适用于活细胞溶酶体的荧光标记。
进一步的，使用第一荧光素特异性标记活的贴壁生长的肿瘤靶细胞具体采用以下步骤：取肿瘤靶细胞预先接种于细胞培养孔板器皿内，培养12h后，细胞贴壁稳定，加入第一荧光素，孵育肿瘤靶细胞使第一荧光素进入和留在靶细胞内，实现其对活的靶细胞的荧光标记和示踪。
进一步的，对肿瘤靶细胞、NK类效应细胞及效靶细胞的实时监测和第一荧光平均荧光强度值的获取采用高内涵成像系统进行监测和获取。
进一步的，使用第二荧光素特异性标记NK类效应细胞的分泌性溶酶体具体采用以下步骤：取NK类效应细胞通过使用离心力300g离心5min，收集悬浮培养的NK类效应细胞，加入第二荧光素，孵育NK类效应细胞使第二荧光素进入效应细胞的胞质内，实现其对活细胞溶酶体的荧光标记和示踪。
进一步的，第二荧光平均荧光强度值的获取采用流式细胞仪，所用仪器满足激光管可激发第二荧光对应的荧光素且可同时检测第二荧光。
进一步的，向肿瘤靶细胞中加入NK类效应细胞，NK类效应细胞的数量与肿瘤靶细胞的数量形成效-靶比。
进一步的，NK类效应细胞分泌性溶酶体的第二荧光平均荧光强度值的衰减率的计算采用式1：
Figure 140757DEST_PATH_IMAGE002
（1）
所述E-MFI为第二荧光平均荧光强度值。
进一步的，肿瘤靶细胞第一荧光平均荧光强度值的衰减率的计算采用式2：
Figure 401974DEST_PATH_IMAGE004
（2）
所述T-MFI为第一荧光平均荧光强度值。
进一步的，NK类效应细胞的分泌性溶酶体从NK类效应细胞胞内定向转移至肿瘤靶细胞胞内的效率的计算采用肿瘤靶细胞第二荧光平均荧光强度从共培养前为0至共培养后能检测到的增加值。
与现有的检测NK类效应细胞对贴壁生长的肿瘤靶细胞的反应力和杀伤力的方法相比，本发明方法具有显著优势：
（1）利用NK类效应细胞的独有的功能特点（即使在静息期，NK类效应细胞中也存在预先停放且可释放的分泌性溶酶体SLs，并且在被激活后，预先停放在NK类细胞胞质内的SLs能够以更高的速率分泌和传递到靶细胞的细胞质中。与此不同的是，静息期的T淋巴效应细胞不具有SLs，T细胞只有被靶细胞激活后才能触发SLs的生物发生），本发明设计了在效-靶细胞共培养前，清洗干净多余的附着在表面的荧光染料探针，避免了靶细胞溶酶体也被标记上的可能，使用高内涵实时监测共培养前后和共培养期间的全程变化，精准示踪了SLs从NK类效应细胞中被胞吐-脱颗粒、定向递送至靶细胞的全程。
（2）本发明利用了NK 类效应细胞悬浮生长的特性，设计了针对贴壁生长的肿瘤靶细胞的反应力、分泌性溶酶体胞吐-脱颗粒与定向转运能力和杀伤能力的检测方法。
（3）系统性、多个层面的观测数据的相互印证性。可同时检测NK类效应细胞SLs胞吐-脱颗粒、包含毒性颗粒SLs的定向递送至靶细胞的效率，与对靶细胞的杀伤力。
（4）利用高内涵显微成像系统和流式技术的优势，实现了动态、实时、全程可视化与定量化。
附图说明
图1是本发明实施例中采用的Calcein-AM染色原理示意图。
图2是本发明实施例中采用的Lyso-Tracker Red分子的化学结构式参考图。
图3是本发明实施例中采用的Lyso-Tracker Red的激发光谱和发射光谱参考图。
图4是本发明实施例中可视化动态观察NK92类细胞对PD-L1highMP细胞的杀伤作用过程，从左至右依次为效-靶细胞共培养实验12个顺序时间点的图像。A图和B图的效应细胞分别为NK92和CAR-NK92。在A图和B图中，从上至下，第一排为用于观察Calcein-AM的绿色荧光(FITC)通道，第二排为用于观察Lyso-Tracker Red的红色荧光（Cy5）通道，第三排为双色荧光叠加。可动态观察到：2组效靶细胞共培养后，伴随着靶细胞形态的改变和Calcein-AM荧光的减弱，靶细胞胞内的红色荧光渐多，与已标记的绿色荧光叠加成黄色（图中用箭头指出了形态和荧光变化显著的细胞，框内为效应细胞溶酶体进入到靶细胞胞内的时间点）。
图5左边是本发明实施例中，共培养前、后效应细胞红色荧光强度变化的高内涵与流式检测的代表性图示，右边是流式技术精确定量检测效应细胞在与靶细胞共培养前后的荧光强度的变化，统计分析2组间的差异，n=5，***P<0. 001。Lyso-Tracker Red红色荧光探针特异性标记的是分泌性溶酶体，效应细胞和靶细胞结合后，分泌性溶酶体从效应细胞中被胞吐-脱颗粒出来，在相同的共培养时间段内，平均荧光强度的减少率直接反映效应细胞的脱颗粒效率。
图6是本发明实施例中，在效靶细胞共培养前、后（已将悬浮的效应细胞轻轻吹起用于流式检测），通过显微镜明场观察靶细胞的形态学变化的代表性图。箭头标注显示肿瘤靶细胞由梭形（共培养前）变为圆形（共培养后），部分区域的靶细胞在共培养后缺失，在CAR-NK92组变化更显著。
图7是本发明实施例中，效靶细胞共培养前、后，使用高内涵成像系统定量检测靶细胞胞内的绿色荧光强度的变化。左边是通过显微镜绿色荧光通道观察和记录的靶细胞胞内的绿色荧光强度变化的代表性图。右边是分析组间差异的统计图，n=5个不同的区域，***P<0.001。靶细胞内的Calcein-AM平均荧光强度的衰减率直接反映2组效应细胞对其杀伤能力的差异。
图8是本发明实施例中效靶细胞共培养前、后，使用高内涵成像系统定量检测靶细胞胞内的红色荧光强度的变化。左边是通过显微镜红色荧光通道观察和记录的靶细胞胞内的红色荧光强度变化的代表性图。右边是分析组间差异的统计图，n=5个不同的区域，**P<0.01。靶细胞内Lyso-Tracker Red平均荧光强度的增加值直接反映2组效应细胞将分泌性溶酶体定向转运至靶细胞能力的差异。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语 “包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
一种在效-靶共培养体系中实时观察与定量检测NK类效应细胞胞吐-脱颗粒和杀伤能力的方法：在未激活时事先用一种特异性标记溶酶体的红色荧光探针标记NK类效应细胞的分泌性溶酶体，用另一种特异性标记活细胞的绿色荧光探针标记靶细胞，共培养前均清洗干净多余的附着在表面的荧光染料，在高内涵成像系统中进行效-靶细胞直接接触的互相作用的共培养实验，使用高内涵成像系统，对效-靶细胞共培养模型每隔1分钟进行延时成像，记录90分钟。我们通过联合应用高内涵和流式技术，定量检测与分析效应细胞和靶细胞的荧光标记在共培养前后的变化，统计分析与比较不同处理组的NK类效应细胞将SLs定向递送入靶细胞的效率和对其的杀伤力。
如上所述检测方法，包括以下具体步骤：
步骤一、用荧光染料Calcein-AM Green特异性标记活的贴壁生长的肿瘤靶细胞：
S11、Calcein-AM Green，中文名称钙黄绿素（同仁化学研究所，DojindoLaboratories，产品货号C326；上海阿拉丁公司，CAS号为148504-34-1），是一种可对活细胞进行荧光标记和示踪的细胞染色试剂，由于它在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光（见附图1）。与其它同类试剂(如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate)相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。使用了Calcein的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的51Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。Calcein-AM可与荧光染料Propidium Iodide（碘化丙啶，简称PI）结合使用，分别对活细胞和死细胞染色，可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。
S12、细胞活性染料钙黄绿素溶解于PBS中待用；
S13、取1×104 个肿瘤靶细胞预先接种于48孔板内；
S14、培养12h后，细胞贴壁稳定，加入钙黄绿素至工作浓度0.1μM，37℃，避光孵育15min；
S15、弃去孔内培养基，利用PBS清洗细胞两遍；
S16、将48孔板放入高内涵成像系统的卡槽。调整成像参数：物镜选择20×；Camerabinning值调整为1；成像模式选择60 um pinhole；样品板选择Costar 3548；在acquisition栏勾选“enable laser-based focusing”；autofocus中的well to wellautofocus选择focus on well bottom，site focus选择all sites；通道设置选择2种，分别为TL50——明场，FITC——钙黄绿素标记的绿色荧光；在选择了 Laser with z-offset之后，点击“Test Settings”,自动聚焦一次，点击“Calculate Offset”自动获取“Post-laser offset”值，点击” Auto Exposure”来获得最佳曝光时间。
S17、在Run栏中输入实验名称，而后点击acquire plate采集图像；
S18、图像采集完成后，在“Review Plate Data”中打开采集的图像。在“RunAnalysis”中选择“Cell Scoring”分析模块，选择S17拍摄的FITC通道，并通过测量细胞最小宽度值、最大宽度值和高于背景的最小荧光强度来确保软件准确识别单个细胞；而后点击“Configure Summary Log”选择每个视野图像需要分析的数据，包括：细胞数，平均荧光强度。点击“Run Analysis for all Position”对所有图像进行分析。分析完毕后，在Measurement 标签中通过“Open Log”——“Log Data”将分析所得的靶细胞数据导出，得到的靶细胞绿色荧光平均荧光强度（median fluorescence intensity of green，简称 G-MFI）。
步骤二、一种特异性标记溶酶体的红色荧光探针（Lyso-Tracker Red）标记与示踪NK类效应细胞的分泌性溶酶体：
S21、Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology, China，产品货号C1046) 是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，能通透细胞膜,可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。
Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND-99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，其中仅弱碱可部分提供质子，以维持pH在中性,可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。Lyso-Tracker Red适用于活细胞溶酶体的荧光染色，但不适合用于固定细胞溶酶体的荧光染色。
Lyso-Tracker Red的分子式为C20H24BF2N5O（见附图2），分子量为399.25，最大激发波长为577nm，最大发射波长为590nm（见附图3）。
S22、溶酶体红色荧光探针溶解于含钙镁离子的HBSS中待用；
S23、取1×106个效应细胞，用离心力为300g，离心5min，弃去上清；
S24、加入1ml终浓度为0.1μM的溶酶体红色荧光探针，混匀后37℃避光孵育15min；
S25、孵育完成后，利用PBS清洗细胞两遍，再用完全培养基重悬，并计数，调整细胞密度为2.5×105 个/mL；
S26、将效应细胞加入到48孔板中，按照步骤一中的S16-S18设置参数采集图像。同时，收集部分效应细胞，然后使用流式细胞仪APC通道检测，得到效应细胞的红色平均荧光强度（median fluorescence intensity of red，简称 R-MFI）。
步骤三、全程实时拍摄及观察共培养模型中效靶细胞的变化：
S31、向钙黄绿素标记完成的1×104 个靶细胞中加入5×104 个效应细胞；
S32、立即将48孔板放入高内涵成像系统的卡槽，成像基础参数与步骤一中的S16相同，同时在“Acquisition”勾选 Acquire Time Series，通道设置选择3种，分别为TL50——明场，FITC——钙黄绿素标记的绿色荧光，Cy5——效应细胞溶酶体的红色荧光；timelapse栏中设置Number of timepoints为91，Interval为1min，Duration为90min，即进行时间间隔为1min，总时长为90min的延时连续拍摄。
S33、在Run栏中输入实验名称，而后点击acquire plate采集图像；
S34、在“Screening”——“Review plate date”里打开采集到的数据。Data view选项选择“Time point vs Well”，鼠标右击采集数据的孔，选中后显示为绿色，在Site中选择一个靶细胞生长均匀的视野，在Display里选中“Color Composite”，点击“loadImages”，三个通道采集的图片均被加载出来后，右击保存图片为“. tif”格式；
S35、点击Overlay，将三个通道加载出来的图片进行叠加，分别选用对应荧光的伪彩：FITC——绿色，Cy5——红色，明场不做调整；将得到的叠加图进行保存。
S36、通过延时连续拍摄，实时记录到：效靶细胞共培养后，效应细胞与靶细胞结合，效应细胞中的红色溶酶体胞吐-进入靶细胞中，靶细胞的红色荧光渐多，与共培养前已经标记的绿色荧光叠加成黄色，杀伤过程中，肿瘤靶细胞的细胞形态逐渐发生改变，绿色荧光减弱。
步骤四、联合使用高内涵成像系统和流式细胞术定量检测共培养前后荧光
S41、效应细胞和靶细胞共培养90分钟后，利用效应细胞的悬浮生长性，轻柔地将共培养孔内的效应细胞用移液枪转移，参照步骤二的S26，用高内涵成像系统与流式细胞仪记录效应细胞的R-MFI值；
S42、转移效应细胞后，PBS轻柔地清洗一遍培养后的靶细胞，并参照步骤一的S16-S18用高内涵成像系统记录靶细胞的图像及分析R-MFI值和G-MFI值；
S43、计算效应细胞的R-MFI值的衰减率、靶细胞G-MFI值的衰减率；以及靶细胞R-MFI从共培养前为0至共培养后能检测到的增加值
S44、在共培养前后，效应细胞的R-MFI值的衰减率的计算公式如下所示：
Figure 116858DEST_PATH_IMAGE006
S45、在共培养前后，靶细胞G-MFI值的衰减率的计算公式如下所示：
Figure 906960DEST_PATH_IMAGE008
S46、用高内涵检测到：靶细胞R-MFI从共培养前为0至共培养后能检测到的增加值。
注：R-MFI值是红色平均荧光强度（median fluorescence intensity of red）的英文缩写；
G-MFI值是绿色荧光平均荧光强度（median fluorescence intensity of green）的英文缩写。
步骤五、统计分析与准确判断出：针对相同的靶细胞的刺激，两种NK类效应细胞中，哪种的反应更快，SLs胞吐-脱颗粒作用发生得更早，将SLs定向递送入靶细胞的效率更高，对靶细胞的杀伤力更强。
本发明适用于任何种类的NK效应细胞，例如对原代分离的NK类效应细胞进行不同体外刺激，使用本发明方法，能够精确比较各个实验分组的NK类效应细胞的脱颗粒能力的变化。 例如设计不同的CAR基因修饰的NK类效应细胞，以其亲本株为对照，评估新型CAR-NK类效应细胞的能力。
在本实施例中，使用两种NK类效应细胞，分别为NK92细胞与我们创建的CAR-NK92细胞，本实施例是通过观察两种NK类效应细胞分别与同一株靶细胞共培养过程及分析细胞荧光前后变化，来比较评估两种效应细胞脱颗粒及杀伤能力。
NK92细胞由H. Klingemann 博士的实验室分离和鉴定，细胞来自患有 NK 细胞淋巴瘤的患者。NK92有NK类效应细胞的优点，不仅对多种人和小鼠的肿瘤细胞具有广泛细胞毒性活性，而且非常易于大规模培养和进行基因操作。更重要的是，临床试验证实了NK92的安全性。 因此，人NK92 细胞系已被用作NK细胞功能研究和免疫疗法的工具细胞。
有希望的体外实验结果使得NK92细胞早期被用于超过40种人类恶性肿瘤。然而，尽管重复注射的NK92细胞比较安全，效果仍然有限，因此，许多团队正在探索利用CAR修饰与改装NK92以进一步提高其抗肿瘤活性。
在本发明的具体示范例中，我们通过慢病毒载体介导，将CAR(Sushi-IL15-PD1)基因转染入NK92，利用NK92依赖外源性添加IL-2或IL-15等细胞因子存活的特性，在无外源性添加细胞因子的培养基中长期培养，建立稳定表达CAR基因的新型CAR-NK92克隆细胞系。同时，我们通过用介导PD-L1表达的慢病毒转染胰腺癌细胞MIA PaCa-2，筛选建立了高表达PD-L1的胰腺癌细胞系，命名PD-L1highMP细胞，是贴壁生长特性。将PD-L1highMP细胞作为本实施例中的靶细胞。
我们用特异性标记溶酶体的红色荧光探针（Lyso-Tracker Red）示踪NK92类细胞的溶酶体，同时用钙黄绿素（Calcein-AM Green）示踪活的靶细胞PD-L1highMP。预先接种靶细胞，在靶细胞黏附后加入效应细胞，使用高内涵成像系统，对效靶细胞共培养模型每隔1分钟进行延时成像，记录细胞运动和物质转移持续90分钟。随机各挑选NK92组和CAR-NK92组的一个视野，将得到的照片合成视频，截取12个有代表性的顺序时间点的图（见附图4），显示：在NK92和CAR-NK92细胞介导的细胞毒作用中，随着共培养的时间延长，在绿色荧光（FITC）通道中，肿瘤靶细胞钙黄绿素荧光的逐渐减弱，靶细胞形态由梭形变为圆形，表明：肿瘤靶细胞正在被杀伤；伴随着靶细胞形态的改变和钙黄绿素荧光的减弱，NK92类效应细胞中的红色溶酶体进入靶细胞中，靶细胞的红色荧光渐多，与已标记的绿色荧光叠加成黄色，表明一定数量的溶酶体不断从效应细胞转移到靶细胞。结果显示在10分钟时，CAR-NK92共培养组已经有溶酶体进入靶细胞，而NK92组在大约40分钟时才开始出现。
进一步，定量检测与分析效应细胞和靶细胞的荧光标记在共培养前后的变化，统计分析与比较2组效应细胞对同一株靶细胞的脱颗粒、细胞性颗粒内容物的定向递送效率和杀伤力。
对于悬浮生长特征的效应细胞的荧光定量检测，在共培养前后，可用流式技术精确定量检测细胞荧光强度的变化。如附图5所示：与共培养前相比，2组效应细胞的平均荧光强度都下降，统计显示：与NK92细胞相比，CAR-NK92细胞的平均荧光强度下降率显著增大（74.1%±2.2 vs. 58.6%±1.6%，P<0.001）。此结果证明：与共培养过程中的实时成像记录吻合，效应细胞和靶细胞结合后，分泌性溶酶体从效应细胞中的被胞吐-脱颗粒出来，在相同的共培养时间段内，平均荧光强度的减少率直接反映效应细胞的脱颗粒效率。与NK92细胞相比，CAR-NK92细胞的脱颗粒效率更高。
对于贴壁生长特征的靶细胞，可用高内涵活细胞工作站进行系统成像记录与定量检测细胞荧光强度的动态变化，在显微镜明场、绿色和红色荧光通道分别观察与比较组间差异：①共培养后，将悬浮的效应细胞轻轻吹起（用于上述的流式检测），通过显微镜明场观察，显示：贴壁的胰腺癌肿瘤细胞形态改变（红色箭头标注），由共培养前的梭形变为共培养后的圆形。CAR-NK92组改变更明显，甚至在部分区域，靶细胞在共培养后缺失（附图6）；②通过高内涵显微镜的绿色荧光通道观察，显示（附图7）：与共培养前相比，2组靶细胞的平均荧光强度都下降，与NK92组相比，CAR-NK92组的平均荧光强度下降率显著增大（72.7%±2.7%vs. 50.0%±2.5%，P<0.001）；③通过高内涵显微镜的红色荧光通道观察，显示：与共培养前相比，2组靶细胞的平均荧光强度都上升，与NK92组相比，CAR-NK92组的平均荧光强度上升幅度显著增大（4363.3±257 vs. 2270±358，P=0.004，附图8）；因此，明场和绿色荧光强度的变化均表明CAR-NK92细胞具有较高的杀伤活性。红色荧光强度的变化为CAR-NK92细胞具有更强溶酶体递送效率提供了又一证据。CAR-NK92显示出更强的脱颗粒能力，并且相比较单一的CD107a检测，本方法将免疫细胞脱颗粒过程可视化与定量化，是一种强大的评估手段。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于包括以下步骤：
使用第一荧光素特异性标记活的贴壁生长的肿瘤靶细胞，对肿瘤靶细胞进行实时监测并获取肿瘤靶细胞的第一荧光平均荧光强度值；
使用第二荧光素特异性标记NK类效应细胞的分泌性溶酶体，对NK类效应细胞进行实时监测并获取效应细胞的第二荧光平均荧光强度值；
使用中性磷酸盐缓冲溶液清洗标记完成的肿瘤靶细胞和NK类效应细胞两遍直至细胞表面无残留染料，向肿瘤靶细胞中加入NK类效应细胞，立即对共培养的效靶细胞进行不间断的图像采集；NK类效应细胞和肿瘤靶细胞共培养90min后，将共培养孔内的悬浮生长的NK类效应细胞用移液枪转移，记录NK类效应细胞的第二荧光平均荧光强度值，用中性磷酸盐缓冲溶液清洗共培养后的肿瘤靶细胞，记录肿瘤靶细胞的图像并分析第一荧光平均荧光强度值和第二荧光平均荧光强度值的变化；
计算NK类效应细胞的第二荧光平均荧光强度的衰减率、肿瘤靶细胞第一荧光平均荧光强度的衰减率，以及NK类效应细胞的分泌性溶酶体从NK类效应细胞胞内定向转移至肿瘤靶细胞胞内的效率。
2.根据权利要求1所述的实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于：所述第一荧光素和第二荧光素为两种荧光染料，两种荧光素具有不同的激发波长与发射波长，不存在光谱重叠；第一荧光素只能与活细胞结合并标记，不会抑制任何的细胞功能如增殖或趋化性，对细胞无毒性；第二荧光素适用于活细胞溶酶体的荧光标记。
3.根据权利要求1所述的实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于：所述使用第一荧光素特异性标记活的贴壁生长的肿瘤靶细胞具体采用以下步骤：取肿瘤靶细胞预先接种于细胞培养孔板器皿内，培养12h后，细胞贴壁稳定，加入第一荧光素，孵育肿瘤靶细胞使第一荧光素进入和留在靶细胞内，实现其对活的靶细胞的荧光标记和示踪。
4.根据权利要求1所述的实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于：所述对肿瘤靶细胞、NK类效应细胞及效靶细胞的实时监测和第一荧光平均荧光强度值的获取采用高内涵成像系统进行监测和获取。
5.根据权利要求1所述的实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于：所述使用第二荧光素特异性标记NK类效应细胞的分泌性溶酶体具体采用以下步骤：取NK类效应细胞通过使用离心力300g离心5min，收集悬浮培养的NK类效应细胞，加入第二荧光素，孵育NK类效应细胞使第二荧光素进入效应细胞的胞质内，实现其对活细胞溶酶体的荧光标记和示踪。
6.根据权利要求1所述的实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于：所述第二荧光平均荧光强度值的获取采用流式细胞仪，所用仪器满足激光管可激发第二荧光对应的荧光素且可同时检测第二荧光。
7.根据权利要求1所述的实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于：所述向肿瘤靶细胞中加入NK类效应细胞，NK类效应细胞的数量与肿瘤靶细胞的数量形成效-靶比。
8.根据权利要求1所述的实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于：所述NK类效应细胞分泌性溶酶体的第二荧光平均荧光强度值的衰减率的计算采用式1：
Figure 529904DEST_PATH_IMAGE002
（1）
所述E-MFI为第二荧光平均荧光强度值。
9.根据权利要求1所述的实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于：所述肿瘤靶细胞第一荧光平均荧光强度值的衰减率的计算采用式2：
Figure 532798DEST_PATH_IMAGE004
（2）
所述T-MFI为第一荧光平均荧光强度值。
10.根据权利要求1所述的实时定量检测NK类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法，其特征在于：所述NK类效应细胞的分泌性溶酶体从NK类效应细胞胞内定向转移至肿瘤靶细胞胞内的效率的计算采用肿瘤靶细胞第二荧光平均荧光强度从共培养前为0至共培养后能检测到的增加值。
CN202111186870.9A 2021-10-12 2021-10-12 一种实时定量检测nk类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法 Expired - Fee Related CN113899725B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111186870.9A CN113899725B (zh) 2021-10-12 2021-10-12 一种实时定量检测nk类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111186870.9A CN113899725B (zh) 2021-10-12 2021-10-12 一种实时定量检测nk类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113899725A true CN113899725A (zh) 2022-01-07
CN113899725B CN113899725B (zh) 2022-04-29

Family

ID=79191483

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111186870.9A Expired - Fee Related CN113899725B (zh) 2021-10-12 2021-10-12 一种实时定量检测nk类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113899725B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150212064A1 (en) * 2011-08-12 2015-07-30 The Childrens's Hospital Of Philadelphia Degranulation indicator and methods of use thereof
CN105315988A (zh) * 2015-01-12 2016-02-10 中南大学 一种细胞溶酶体定位用荧光染料及其制备方法和应用
CN107064085A (zh) * 2017-03-16 2017-08-18 中国人民解放军三〇七医院 自然杀伤细胞活性测定方法
CN110231275A (zh) * 2019-05-20 2019-09-13 西安交通大学 一种基于流式细胞术检测nk细胞杀伤活性的方法
CN111175112A (zh) * 2020-01-13 2020-05-19 浙江卫未生物医药科技有限公司 一种改良的微载体活细胞荧光染色方法
CN112285083A (zh) * 2020-10-28 2021-01-29 上海睿钰生物科技有限公司 一种细胞杀伤效力的评价方法
CN112285081A (zh) * 2020-10-28 2021-01-29 上海睿钰生物科技有限公司 一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用
CN112301086A (zh) * 2020-10-28 2021-02-02 上海睿钰生物科技有限公司 一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用
CN112813133A (zh) * 2021-01-29 2021-05-18 上海睿钰生物科技有限公司 一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150212064A1 (en) * 2011-08-12 2015-07-30 The Childrens's Hospital Of Philadelphia Degranulation indicator and methods of use thereof
CN105315988A (zh) * 2015-01-12 2016-02-10 中南大学 一种细胞溶酶体定位用荧光染料及其制备方法和应用
CN107064085A (zh) * 2017-03-16 2017-08-18 中国人民解放军三〇七医院 自然杀伤细胞活性测定方法
CN110231275A (zh) * 2019-05-20 2019-09-13 西安交通大学 一种基于流式细胞术检测nk细胞杀伤活性的方法
CN111175112A (zh) * 2020-01-13 2020-05-19 浙江卫未生物医药科技有限公司 一种改良的微载体活细胞荧光染色方法
CN112285083A (zh) * 2020-10-28 2021-01-29 上海睿钰生物科技有限公司 一种细胞杀伤效力的评价方法
CN112285081A (zh) * 2020-10-28 2021-01-29 上海睿钰生物科技有限公司 一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用
CN112301086A (zh) * 2020-10-28 2021-02-02 上海睿钰生物科技有限公司 一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用
CN112813133A (zh) * 2021-01-29 2021-05-18 上海睿钰生物科技有限公司 一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGFANG LIU: "Rapid biogenesis and sensitization of secretory lysosomes in NK cells mediated by target-cell recognition", 《PNAS》 *
赵宁宁等: "靶向性近红外荧光染料在肝癌模型研究中的应用", 《中国比较医学杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113899725B (zh) 2022-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104330346B (zh) 用于声学流式细胞计量术的方法
US8280142B2 (en) Predetermined site luminescence measuring method, predetermined site luminescence measuring apparatus, expression amount measuring method, and measuring apparatus
US20020168657A1 (en) Rare event detection system
US20080169431A1 (en) Method and device for detecting photosynthetic inhibition
Bongaerts et al. Green fluorescent protein as a marker for conditional gene expression in bacterial cells
CN112285081B (zh) 一种细胞杀伤效力的检测方法及其应用
EP3516392A1 (en) Micro-screening and sorting apparatus, process, and products
CN110231275A (zh) 一种基于流式细胞术检测nk细胞杀伤活性的方法
CN112813133B (zh) 一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用
Tjin et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies
JP2011223924A (ja) プランクトン計数方法およびプランクトン計数装置
CN113899725B (zh) 一种实时定量检测nk类效应细胞脱颗粒和杀伤能力的方法
CN112304851B (zh) 一种体外自然杀伤细胞免疫活性的评价方法及其应用
Magarinos et al. Viability of starved Pasteurella piscicida in seawater monitored by flow cytometry and the effect of antibiotics on its resuscitation
JP2006340684A (ja) 微生物の計測方法
Nascimento et al. High‐throughput detection and quantification of mitochondrial fusion through imaging flow cytometry
Latt et al. Energy transfer-enhanced chromosome banding. An overview
Schiffenbauer et al. A cell chip for sequential imaging of individual non-adherent live cells reveals transients and oscillations
CN114414541A (zh) 一种应用3d细胞成像分析系统检测t细胞杀伤效力的方法
Varadarajan et al. Real‐time visualization and quantitation of cell death and cell cycle progression in 2D and 3D cultures utilizing genetically encoded probes
JP2002034594A (ja) 生細胞の検出方法
Burns et al. Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry
Zink et al. Analyzing trogocytosis of T lymphocytes by flow cytometry and confocal microscopy
Buzgariu et al. Studying Stem Cell Biology in Intact and Whole-Body Regenerating Hydra by Flow Cytometry
CN106841147A (zh) 用于循环中干细胞在体实时无损检测及归巢动力学研究方法与装置

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220429