JP2002034594A - 生細胞の検出方法 - Google Patents
生細胞の検出方法Info
- Publication number
- JP2002034594A JP2002034594A JP2000222563A JP2000222563A JP2002034594A JP 2002034594 A JP2002034594 A JP 2002034594A JP 2000222563 A JP2000222563 A JP 2000222563A JP 2000222563 A JP2000222563 A JP 2000222563A JP 2002034594 A JP2002034594 A JP 2002034594A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- diacetate
- enzyme substrate
- dye
- medium
- absorber
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来の生細胞の検出方法における欠点である
背景光の増加に伴う検出感度の低下を解消することによ
り、特異性が高く且つリアルタイムで行うことができる
生細胞の検出方法を提供すること。 【解決手段】 細胞を含む媒体に色素または蛍光性酵素
基質を添加して色素または蛍光を検出又は測定すること
を含む生細胞の検出方法において、細胞膜を透過でき
ず、且つ上記色素または蛍光性酵素基質の発光を吸収す
る吸収体の存在下で検出又は測定を行うことを特徴とす
る方法。
背景光の増加に伴う検出感度の低下を解消することによ
り、特異性が高く且つリアルタイムで行うことができる
生細胞の検出方法を提供すること。 【解決手段】 細胞を含む媒体に色素または蛍光性酵素
基質を添加して色素または蛍光を検出又は測定すること
を含む生細胞の検出方法において、細胞膜を透過でき
ず、且つ上記色素または蛍光性酵素基質の発光を吸収す
る吸収体の存在下で検出又は測定を行うことを特徴とす
る方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生細胞の検出方法に
関する。さらに詳しくは、本発明は、細胞を含む媒体に
色素または蛍光性酵素基質を添加して色素または蛍光を
検出又は測定する際に、細胞外の発光のみを吸収する吸
収体の存在下で検出又は測定を行うことを特徴とする方
法に関する。本発明はまた、上記方法で使用するための
試薬キット、並びに上記方法を実施するための生細胞検
出装置にも関する。
関する。さらに詳しくは、本発明は、細胞を含む媒体に
色素または蛍光性酵素基質を添加して色素または蛍光を
検出又は測定する際に、細胞外の発光のみを吸収する吸
収体の存在下で検出又は測定を行うことを特徴とする方
法に関する。本発明はまた、上記方法で使用するための
試薬キット、並びに上記方法を実施するための生細胞検
出装置にも関する。
【０００２】
【従来の技術】媒体中における生細胞の検出は、滅菌状
態の確認や、細胞の生存状態の異常を検出すること、あ
るいは有用な微生物を土壌等から分離培養する上で非常
に重要な手段の一つである。特に有用微生物の検出につ
いては、生細胞を可視化することにより多様性に富む土
壌中の微生物からやみくもに分離する従来の技術に比
し、その微生物の状態や生息域を判定しながら分離する
ことができる点において、現在まで分離されていない希
少な種や、その特質を見極めながら分離することができ
るため非常に有効な技術となる。
態の確認や、細胞の生存状態の異常を検出すること、あ
るいは有用な微生物を土壌等から分離培養する上で非常
に重要な手段の一つである。特に有用微生物の検出につ
いては、生細胞を可視化することにより多様性に富む土
壌中の微生物からやみくもに分離する従来の技術に比
し、その微生物の状態や生息域を判定しながら分離する
ことができる点において、現在まで分離されていない希
少な種や、その特質を見極めながら分離することができ
るため非常に有効な技術となる。
【０００３】生細胞を特異的に検出する方法としては、
生体染色法（Darzynkiewicz,Z. etal., Experimental C
ell Research,95,143-153(1975)）や、蛍光性酵素基質
または色素を媒体に添加し、媒体中に存在する細胞内で
発せられる蛍光を測定する方法（Lundgren,B et al.,Oi
kos,36,17-22(1981)）が知られている。しかしながら、
これらの染色法では、細胞外の非特異的分解や吸着によ
り背景光が増加するため生細胞の検出効率が低下する問
題点があった。特に土壌等天然に存在するものを媒体と
する場合、細胞以外に媒体内に存在する種々の夾雑物に
よって背景光が増加するため、生細胞を特異的に検出す
ることが困難であった。
生体染色法（Darzynkiewicz,Z. etal., Experimental C
ell Research,95,143-153(1975)）や、蛍光性酵素基質
または色素を媒体に添加し、媒体中に存在する細胞内で
発せられる蛍光を測定する方法（Lundgren,B et al.,Oi
kos,36,17-22(1981)）が知られている。しかしながら、
これらの染色法では、細胞外の非特異的分解や吸着によ
り背景光が増加するため生細胞の検出効率が低下する問
題点があった。特に土壌等天然に存在するものを媒体と
する場合、細胞以外に媒体内に存在する種々の夾雑物に
よって背景光が増加するため、生細胞を特異的に検出す
ることが困難であった。
【０００４】本発明者らは特開平１０−１７９１９１号
公報にて、生細胞内でｐＨ依存性の蛍光性物質に変化し
得る蛍光性酵素基質を媒体に添加し、検出を該蛍光物質
のｐＨに適した励起光を照射して行うことを特徴とする
生細胞の検出方法を提案している。しかしこの方法にお
いても、ｐＨ依存性の蛍光性酵素基質のみしか使用でき
ないこと、時間とともに細胞外の背景光の強度も増加す
るため検出可能時間が非常に短いこと、またこの背景光
を除去するために洗浄を行った場合、洗浄操作中に細胞
を損失したり、洗浄による背景光の除去では不十分であ
ること等、改良を要する点があった。
公報にて、生細胞内でｐＨ依存性の蛍光性物質に変化し
得る蛍光性酵素基質を媒体に添加し、検出を該蛍光物質
のｐＨに適した励起光を照射して行うことを特徴とする
生細胞の検出方法を提案している。しかしこの方法にお
いても、ｐＨ依存性の蛍光性酵素基質のみしか使用でき
ないこと、時間とともに細胞外の背景光の強度も増加す
るため検出可能時間が非常に短いこと、またこの背景光
を除去するために洗浄を行った場合、洗浄操作中に細胞
を損失したり、洗浄による背景光の除去では不十分であ
ること等、改良を要する点があった。
【０００５】さらに発明者らは特開平１０−２１５８９
４号公報にて、蛍光性酵素基質を媒体に添加し、その蛍
光画像を記録した後、この染色された媒体を光照射によ
り光退色させ、その蛍光画像を記録し、光退色前の画像
との差画像を取ることを特徴とする生細胞の検出方法を
開示している。この方法は、生細胞を検出するために差
画像を得なければならないため、リアルタイムでの検出
ができず、有用微生物の分離取得等のためのツールとし
ては不向きであった。
４号公報にて、蛍光性酵素基質を媒体に添加し、その蛍
光画像を記録した後、この染色された媒体を光照射によ
り光退色させ、その蛍光画像を記録し、光退色前の画像
との差画像を取ることを特徴とする生細胞の検出方法を
開示している。この方法は、生細胞を検出するために差
画像を得なければならないため、リアルタイムでの検出
ができず、有用微生物の分離取得等のためのツールとし
ては不向きであった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、従来の生細胞の検出方法における
欠点である背景光の増加に伴う検出感度の低下を解消す
ることにより、特異性が高く且つリアルタイムで行うこ
とができる生細胞の検出方法を提供することを解決すべ
き課題とした。
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、従来の生細胞の検出方法における
欠点である背景光の増加に伴う検出感度の低下を解消す
ることにより、特異性が高く且つリアルタイムで行うこ
とができる生細胞の検出方法を提供することを解決すべ
き課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、土壌を純水に懸濁し
た土壌懸濁液に５−カルボキシフルオレセインジアセテ
ートアセトキシメチルエステルを添加し染色した後に、
さらに細胞膜を透過できず、且つ該蛍光性酵素基質によ
り発光した蛍光を吸収する化合物を添加すると、背景光
が吸収され、生細胞が感度良く検出し得ることを発見
し、本発明を完成するに至った。
解決するために鋭意検討した結果、土壌を純水に懸濁し
た土壌懸濁液に５−カルボキシフルオレセインジアセテ
ートアセトキシメチルエステルを添加し染色した後に、
さらに細胞膜を透過できず、且つ該蛍光性酵素基質によ
り発光した蛍光を吸収する化合物を添加すると、背景光
が吸収され、生細胞が感度良く検出し得ることを発見
し、本発明を完成するに至った。
【０００８】即ち、本発明の第１の態様によれば、細胞
を含む媒体に色素または蛍光性酵素基質を添加して色素
または蛍光を検出又は測定することを含む生細胞の検出
方法において、細胞膜を透過できず、且つ上記色素また
は蛍光性酵素基質の発光を吸収する吸収体の存在下で検
出又は測定を行うことを特徴とする方法が提供される。
を含む媒体に色素または蛍光性酵素基質を添加して色素
または蛍光を検出又は測定することを含む生細胞の検出
方法において、細胞膜を透過できず、且つ上記色素また
は蛍光性酵素基質の発光を吸収する吸収体の存在下で検
出又は測定を行うことを特徴とする方法が提供される。
【０００９】本発明の第２の態様によれば、蛍光性酵素
基質または色素を含有する試薬と、吸収体を含有する試
薬を含む、上記した本発明による生細胞の検出方法に使
用するための試薬キットが提供される。
基質または色素を含有する試薬と、吸収体を含有する試
薬を含む、上記した本発明による生細胞の検出方法に使
用するための試薬キットが提供される。
【００１０】本発明の第３の態様によれば、少なくと
も、（ａ）細胞を含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光
性酵素基質または色素を含有する試薬と、吸収体を含有
する試薬とを該媒体に添加する手段、及び（ｃ）染色さ
れた媒体の蛍光又は色素を検出又は測定する手段を有す
ることを特徴とする生細胞検出装置が提供される。
も、（ａ）細胞を含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光
性酵素基質または色素を含有する試薬と、吸収体を含有
する試薬とを該媒体に添加する手段、及び（ｃ）染色さ
れた媒体の蛍光又は色素を検出又は測定する手段を有す
ることを特徴とする生細胞検出装置が提供される。
【００１１】好ましくは、蛍光性酵素基質は、細胞膜を
透過でき、且つ蛍光性物質に生細胞内で変化し得る化合
物である。好ましくは、蛍光性酵素基質が、５−カルボ
キシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエス
テル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテ
ート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−
５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチ
ルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセ
テート、フルオレセインジアセテート、カルサインアセ
トキシメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセイ
ンジアセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセイ
ンジアセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレ
セイン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群
から選択される化合物である。
透過でき、且つ蛍光性物質に生細胞内で変化し得る化合
物である。好ましくは、蛍光性酵素基質が、５−カルボ
キシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエス
テル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテ
ート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−
５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチ
ルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセ
テート、フルオレセインジアセテート、カルサインアセ
トキシメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセイ
ンジアセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセイ
ンジアセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレ
セイン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群
から選択される化合物である。
【００１２】好ましくは、色素は、アクリジンオレン
ジ、ビスベンズイミドフルオロクロム三塩酸塩、４’，
６’−ジアミノ−２−フェニルインドール、ＳＹＴＯ
９、ＳＹＴＯ１０、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹ
ＴＯ１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１５、ＳＹＴＯ１
６、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ２０、ＳＹＴＯ２１、ＳＹ
ＴＯ２２、ＳＹＴＯ２３、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２
５、ヘキシジウムイオダイド及びジヒドロエチジウムよ
りなる群から選択される化合物である。好ましくは、吸
収体は、チトクロームＣ、ヘモグロビン及びブルーデキ
ストランよりなる群から選択される。好ましくは、蛍光
性酵素基質は５−カルボキシフルオレセインジアセテー
トアセトキシメチルエステルであり、吸収体はチトクロ
ームＣである。
ジ、ビスベンズイミドフルオロクロム三塩酸塩、４’，
６’−ジアミノ−２−フェニルインドール、ＳＹＴＯ
９、ＳＹＴＯ１０、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹ
ＴＯ１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１５、ＳＹＴＯ１
６、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ２０、ＳＹＴＯ２１、ＳＹ
ＴＯ２２、ＳＹＴＯ２３、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２
５、ヘキシジウムイオダイド及びジヒドロエチジウムよ
りなる群から選択される化合物である。好ましくは、吸
収体は、チトクロームＣ、ヘモグロビン及びブルーデキ
ストランよりなる群から選択される。好ましくは、蛍光
性酵素基質は５−カルボキシフルオレセインジアセテー
トアセトキシメチルエステルであり、吸収体はチトクロ
ームＣである。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施方法および実
施態様について詳細に説明する。本発明は、細胞を含む
媒体に色素または蛍光性酵素基質を添加して色素または
蛍光を検出又は測定することを含む生細胞の検出方法に
関するものであり、本発明の方法では、細胞膜を透過で
きず、且つ上記色素または蛍光性酵素基質の発光を吸収
する吸収体の存在下で検出又は測定を行うことを特徴と
する。このように、媒体に添加した色素または蛍光性酵
素基質の発光を吸収する吸収体を添加することにより背
景光を吸収除去し、感度良く且つリアルタイムで生細胞
を検出することが可能になる。
施態様について詳細に説明する。本発明は、細胞を含む
媒体に色素または蛍光性酵素基質を添加して色素または
蛍光を検出又は測定することを含む生細胞の検出方法に
関するものであり、本発明の方法では、細胞膜を透過で
きず、且つ上記色素または蛍光性酵素基質の発光を吸収
する吸収体の存在下で検出又は測定を行うことを特徴と
する。このように、媒体に添加した色素または蛍光性酵
素基質の発光を吸収する吸収体を添加することにより背
景光を吸収除去し、感度良く且つリアルタイムで生細胞
を検出することが可能になる。
【００１４】本発明において用いられる蛍光性酵素基質
としては、単独では蛍光を発しないが、生細胞内でエス
テラーゼ等の生体内酵素の作用により蛍光を発する物質
（蛍光性物質）に変化し得る化合物であって、かつ細胞
膜を透過しやすい物質であればいかなるものであっても
よい。蛍光性酵素基質の具体例としては以下のものが挙
げられるがこれらに限定されるものではない。
としては、単独では蛍光を発しないが、生細胞内でエス
テラーゼ等の生体内酵素の作用により蛍光を発する物質
（蛍光性物質）に変化し得る化合物であって、かつ細胞
膜を透過しやすい物質であればいかなるものであっても
よい。蛍光性酵素基質の具体例としては以下のものが挙
げられるがこれらに限定されるものではない。
【００１５】５−カルボキシフルオレセインジアセテー
トアセトキシメチルエステル（5-carboxyfluorescein d
iacetate acetoxymethyl ester；以下、「ＣＦＤＡ−Ａ
Ｍ」と称することがある。）；５−（６−）カルボキシ
フルオレセインジアセテート（5-(and-6)carboxyfluore
scein diacetate；以下、「ＣＦＤＡ」と称することが
ある。）；２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチ
ル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキ
シメチルエステル（2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(an
d-6)carboxyfluorescein acetoxymethyl ester；以下、
「ＢＣＥＣＦ−ＡＭ：１」と称することがある。）；５
−（６−）スルホフルオレセインジアセテート（5-(and
6-)sulfofluorescein diacetate；以下、「ＳＦＤＡ」
と称することがある。）；フルオレセインジアセテート
（fluorescein diacetate；以下、「ＦＤＡ」と称する
ことがある。）；カルサインアセトキシメチルエステル
（calcein acetoxymethyl ester；以下、「Ｃａｌｃｅ
ｉｎ−ＡＭ」と称することがある。）；５−クロロメチ
ルフルオレセインジアセテート（5-chloromethylfluore
sceindiacetate；以下、「ＣＭＦＤＡ」と称することが
ある。）；５−（６−）カルボキシフルオレセインジア
セテートスクシニミジルエステル（5-(and 6-)carboxyf
luorescein diacetate,succinimidyl ester；以下、
「ＣＦＤＡ−ＳＥ」と称することがある。）；及びフル
オレセイン−５−カルボニルアジドジアセテート（fluo
rescein-5-carbonylazide diacetate；以下、「ＣＦＤ
Ａ azide」と称することがある。）：
トアセトキシメチルエステル（5-carboxyfluorescein d
iacetate acetoxymethyl ester；以下、「ＣＦＤＡ−Ａ
Ｍ」と称することがある。）；５−（６−）カルボキシ
フルオレセインジアセテート（5-(and-6)carboxyfluore
scein diacetate；以下、「ＣＦＤＡ」と称することが
ある。）；２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチ
ル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキ
シメチルエステル（2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(an
d-6)carboxyfluorescein acetoxymethyl ester；以下、
「ＢＣＥＣＦ−ＡＭ：１」と称することがある。）；５
−（６−）スルホフルオレセインジアセテート（5-(and
6-)sulfofluorescein diacetate；以下、「ＳＦＤＡ」
と称することがある。）；フルオレセインジアセテート
（fluorescein diacetate；以下、「ＦＤＡ」と称する
ことがある。）；カルサインアセトキシメチルエステル
（calcein acetoxymethyl ester；以下、「Ｃａｌｃｅ
ｉｎ−ＡＭ」と称することがある。）；５−クロロメチ
ルフルオレセインジアセテート（5-chloromethylfluore
sceindiacetate；以下、「ＣＭＦＤＡ」と称することが
ある。）；５−（６−）カルボキシフルオレセインジア
セテートスクシニミジルエステル（5-(and 6-)carboxyf
luorescein diacetate,succinimidyl ester；以下、
「ＣＦＤＡ−ＳＥ」と称することがある。）；及びフル
オレセイン−５−カルボニルアジドジアセテート（fluo
rescein-5-carbonylazide diacetate；以下、「ＣＦＤ
Ａ azide」と称することがある。）：
【００１６】これらの化合物はいずれも既知の化合物で
あり、市販されている。これらのうち、ＣＦＤＡ−ＡＭ
が特に望ましい。ＣＦＤＡ−ＡＭはＣＦＤＡのカルボキ
シル基をアセトキシメチル基によってブロックしたもの
で、親水基が全く無くなっている（この状態では非蛍光
性である）。従って、この誘導体であるＣＦＤＡに比し
て親油性が強いので細胞膜を通過し易く、結果的に細胞
を効率よく染色することができる。
あり、市販されている。これらのうち、ＣＦＤＡ−ＡＭ
が特に望ましい。ＣＦＤＡ−ＡＭはＣＦＤＡのカルボキ
シル基をアセトキシメチル基によってブロックしたもの
で、親水基が全く無くなっている（この状態では非蛍光
性である）。従って、この誘導体であるＣＦＤＡに比し
て親油性が強いので細胞膜を通過し易く、結果的に細胞
を効率よく染色することができる。
【００１７】また本発明で用いることのできる色素とし
ては、細胞膜を透過し易いものであればいかなるもので
あってもよい。具体例としては以下のものが挙げられる
がこれらに限定されるものではない。
ては、細胞膜を透過し易いものであればいかなるもので
あってもよい。具体例としては以下のものが挙げられる
がこれらに限定されるものではない。
【００１８】アクリジンオレンジ（acridine orange；
以下「ＡＯ」と称することがある。）；ビスベンズイミ
ドフルオロクロム三塩酸塩（以下「Ｈｏｅｃｈｓｔ」と
称することがある。）；４’，６’−ジアミノ−２−フ
ェニルインドール（4',6'-diamino-2-phenylindol；以
下「ＤＡＰＩ」と称することがある。）；ＳＹＴＯ９、
ＳＹＴＯ１０、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ
１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１５、ＳＹＴＯ１６、Ｓ
ＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ２０、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ２
２、ＳＹＴＯ２３、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５（Mole
cular Probes社製）；ヘキシジウムイオダイド（hexidi
um iodide）；及びジヒドロエチジウム（dihydroethidi
um）：上記のうち、ＡＯが好ましく用いられる。
以下「ＡＯ」と称することがある。）；ビスベンズイミ
ドフルオロクロム三塩酸塩（以下「Ｈｏｅｃｈｓｔ」と
称することがある。）；４’，６’−ジアミノ−２−フ
ェニルインドール（4',6'-diamino-2-phenylindol；以
下「ＤＡＰＩ」と称することがある。）；ＳＹＴＯ９、
ＳＹＴＯ１０、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ
１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１５、ＳＹＴＯ１６、Ｓ
ＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ２０、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ２
２、ＳＹＴＯ２３、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５（Mole
cular Probes社製）；ヘキシジウムイオダイド（hexidi
um iodide）；及びジヒドロエチジウム（dihydroethidi
um）：上記のうち、ＡＯが好ましく用いられる。
【００１９】本発明の方法で検出する生細胞としては、
バクテリア、酵母、放線菌、カビ類等の微生物、カイコ
のＳｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 77, 4216, (1980)）、ＣＯＳ−７細胞（Ａ
ＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）等の哺乳動物由来の細胞等が
挙げられるが、これらに限定されるものではなく、いず
れの細胞でもよい。
バクテリア、酵母、放線菌、カビ類等の微生物、カイコ
のＳｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 77, 4216, (1980)）、ＣＯＳ−７細胞（Ａ
ＴＣＣ：ＣＲＬ１６５１）等の哺乳動物由来の細胞等が
挙げられるが、これらに限定されるものではなく、いず
れの細胞でもよい。
【００２０】生細胞を検出しようとする媒体としては、
土壌、砂等固体の媒体、水、培養液、酒等の液体の媒
体、寒天、ゲル等の半固体やそれらの混合物等が挙げら
れる。上記の蛍光性酵素基質及び色素はそれ自体単独で
使用することもできるが、複数のものを組み合わせて使
用することもできる。蛍光性酵素基質や色素は一般に水
に難溶性であるので、媒体が水性である場合には、蛍光
性酵素基質や色素を溶媒に溶解した後、媒体に添加する
ことにより行えばよい。媒体が固体の場合にも、同様に
溶媒に蛍光性酵素基質や色素を溶解し、媒体に添加する
ことによって行えばよい。蛍光性酵素基質あるいは色素
を溶解する溶媒としては、通常アセトン、ジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、水等を用いる。こ
れらの溶媒は検出しようとする生細胞中の酵素を失活さ
せたり、細胞自体にダメージを与えないものが望まし
い。また、必要に応じて非イオン性界面活性剤を用いて
溶解してもよい。このような溶媒に溶かした後、媒体を
染色するのに適当な濃度に水あるいは通常生化学的に用
いられる適当な緩衝液を用いて調製する。
土壌、砂等固体の媒体、水、培養液、酒等の液体の媒
体、寒天、ゲル等の半固体やそれらの混合物等が挙げら
れる。上記の蛍光性酵素基質及び色素はそれ自体単独で
使用することもできるが、複数のものを組み合わせて使
用することもできる。蛍光性酵素基質や色素は一般に水
に難溶性であるので、媒体が水性である場合には、蛍光
性酵素基質や色素を溶媒に溶解した後、媒体に添加する
ことにより行えばよい。媒体が固体の場合にも、同様に
溶媒に蛍光性酵素基質や色素を溶解し、媒体に添加する
ことによって行えばよい。蛍光性酵素基質あるいは色素
を溶解する溶媒としては、通常アセトン、ジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、水等を用いる。こ
れらの溶媒は検出しようとする生細胞中の酵素を失活さ
せたり、細胞自体にダメージを与えないものが望まし
い。また、必要に応じて非イオン性界面活性剤を用いて
溶解してもよい。このような溶媒に溶かした後、媒体を
染色するのに適当な濃度に水あるいは通常生化学的に用
いられる適当な緩衝液を用いて調製する。
【００２１】本発明で使用する蛍光性酵素基質あるいは
色素を媒体に添加する方法としては、媒体に応じて適宜
行えばよい。媒体の調製方法としては、土壌のような固
体媒体を染色しようとする場合には、土壌そのままで
も、水等に懸濁したものに、上記した蛍光性酵素基質あ
るいは色素が溶解された液（以下、染色液と称すること
がある）を添加すればよい。液体媒体については、上記
した染色液を液体媒体に添加すればよい。また、細胞密
度が低い場合等は遠心分離法等を用いて濃縮を行うとよ
い。
色素を媒体に添加する方法としては、媒体に応じて適宜
行えばよい。媒体の調製方法としては、土壌のような固
体媒体を染色しようとする場合には、土壌そのままで
も、水等に懸濁したものに、上記した蛍光性酵素基質あ
るいは色素が溶解された液（以下、染色液と称すること
がある）を添加すればよい。液体媒体については、上記
した染色液を液体媒体に添加すればよい。また、細胞密
度が低い場合等は遠心分離法等を用いて濃縮を行うとよ
い。
【００２２】次に、本発明で用いる吸収体について説明
する。本発明で用いられる吸収体としては、媒体に添加
した蛍光性酵素基質あるいは色素の発光特異的に吸収
し、且つ細胞膜を透過しにくい化合物であればいかなる
ものであってもよい。細胞は死滅すると、細胞膜に微少
の穴が開いたり、細胞膜が破壊されたりする。本発明に
より添加された吸収体が、死細胞の細胞膜に開いた穴等
を透過して死細胞中には浸透しその発光を吸収する。一
方該吸収体は生細胞の細胞膜は透過されにくいため、生
細胞が特異的に染色された状態となる。本発明におい
て、媒体の染色に色素を用いた場合で、死細胞の微少な
穴を吸収体が透過できないような分子量の大きい化合物
だった場合、細胞外の背景光については該吸収体により
光吸収されるが、生細胞特異的に染色が行われない場合
がある。このような場合には、生細胞特異的に染色され
る色素、例えばＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔｓ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）等を用いて媒体
を染色すればよい。
する。本発明で用いられる吸収体としては、媒体に添加
した蛍光性酵素基質あるいは色素の発光特異的に吸収
し、且つ細胞膜を透過しにくい化合物であればいかなる
ものであってもよい。細胞は死滅すると、細胞膜に微少
の穴が開いたり、細胞膜が破壊されたりする。本発明に
より添加された吸収体が、死細胞の細胞膜に開いた穴等
を透過して死細胞中には浸透しその発光を吸収する。一
方該吸収体は生細胞の細胞膜は透過されにくいため、生
細胞が特異的に染色された状態となる。本発明におい
て、媒体の染色に色素を用いた場合で、死細胞の微少な
穴を吸収体が透過できないような分子量の大きい化合物
だった場合、細胞外の背景光については該吸収体により
光吸収されるが、生細胞特異的に染色が行われない場合
がある。このような場合には、生細胞特異的に染色され
る色素、例えばＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔｓ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）等を用いて媒体
を染色すればよい。
【００２３】吸収体としては、媒体に添加した蛍光性酵
素基質から発生した蛍光性物質あるいは色素の発光を特
異的に光吸収し、且つ細胞膜を透過しにくい、あるいは
媒体中の細胞以外の蛍光性物質あるいは色素を吸着する
ような化合物であれば特に制限はない。このような化合
物の選択方法として、具体的には分子量が約10000以上
の化合物であること、吸収スペクトルが媒体に添加する
蛍光性酵素基質から発生する蛍光性物質あるいは色素の
発光スペクトルと重なること等を指標にすることができ
る。具体的には例えば、チトクロームＣ、ヘモグロビ
ン、ブルーデキストラン等が挙げられる。このうち、蛍
光性酵素基質にＣＦＤＡ−ＡＭあるいはＳＦＤＡを用
い、その吸収体としてチトクロームＣ等を用いると非常
に良好な結果が得られる。
素基質から発生した蛍光性物質あるいは色素の発光を特
異的に光吸収し、且つ細胞膜を透過しにくい、あるいは
媒体中の細胞以外の蛍光性物質あるいは色素を吸着する
ような化合物であれば特に制限はない。このような化合
物の選択方法として、具体的には分子量が約10000以上
の化合物であること、吸収スペクトルが媒体に添加する
蛍光性酵素基質から発生する蛍光性物質あるいは色素の
発光スペクトルと重なること等を指標にすることができ
る。具体的には例えば、チトクロームＣ、ヘモグロビ
ン、ブルーデキストラン等が挙げられる。このうち、蛍
光性酵素基質にＣＦＤＡ−ＡＭあるいはＳＦＤＡを用
い、その吸収体としてチトクロームＣ等を用いると非常
に良好な結果が得られる。
【００２４】吸収体の媒体への添加方法も、上記蛍光性
酵素基質あるいは色素を添加する方法と同様の方法を用
いることができる。吸収体の添加のタイミングは特には
限定されないが、先に添加した蛍光性酵素基質あるいは
色素が媒体を十分に発光させる時間をおいた後に吸収体
を添加することが好ましい。具体的には、細胞を含む媒
体に色素または蛍光性酵素基質を添加した後に、吸収体
を添加することが好ましい。
酵素基質あるいは色素を添加する方法と同様の方法を用
いることができる。吸収体の添加のタイミングは特には
限定されないが、先に添加した蛍光性酵素基質あるいは
色素が媒体を十分に発光させる時間をおいた後に吸収体
を添加することが好ましい。具体的には、細胞を含む媒
体に色素または蛍光性酵素基質を添加した後に、吸収体
を添加することが好ましい。
【００２５】蛍光性酵素基質あるいは色素の媒体への添
加量としては、媒体が十分に染色される量であれば特に
制限はないが、通常媒体中で最終濃度が１μＭ〜１ｍ
Ｍ、より好ましくはＳＦＤＡの場合は５０μＭ〜１ｍ
Ｍ、その他の蛍光性基質では１〜５００μＭとなるよう
に調製し、添加するのが適当である。色素濃度が低すぎ
ると、蛍光強度の絶対値が低下し検出に不適当になって
しまう。また、色素濃度が高すぎても色素が不溶化して
沈殿したり、細胞外部の蛍光物質による背景光が強く細
胞からの蛍光が隠されてしまうために検出効率が下がる
傾向があるため、ふさわしくない。染色液と媒体との混
合比は、特に制限されない。
加量としては、媒体が十分に染色される量であれば特に
制限はないが、通常媒体中で最終濃度が１μＭ〜１ｍ
Ｍ、より好ましくはＳＦＤＡの場合は５０μＭ〜１ｍ
Ｍ、その他の蛍光性基質では１〜５００μＭとなるよう
に調製し、添加するのが適当である。色素濃度が低すぎ
ると、蛍光強度の絶対値が低下し検出に不適当になって
しまう。また、色素濃度が高すぎても色素が不溶化して
沈殿したり、細胞外部の蛍光物質による背景光が強く細
胞からの蛍光が隠されてしまうために検出効率が下がる
傾向があるため、ふさわしくない。染色液と媒体との混
合比は、特に制限されない。
【００２６】吸収体の溶媒としては、該化合物が溶解さ
れるもので、また細胞にできるだけ無害なものであれば
特に制限はないが、具体的には水あるいは通常生化学的
に用いられる緩衝液等が挙げられる。吸収体の媒体への
添加量は、通常媒体内の最終濃度が１０μＭ〜１０ｍ
Ｍ、より好ましくは１〜１０ｍＭとなるような量が適当
であるが、媒体に添加する蛍光性酵素基質あるいは色素
の種類や添加量によって適宜調整される。吸収液と媒体
との混合比も特に制限はない。吸収液を媒体に添加後は
室温において静置し、生細胞以外の発光が吸収体により
吸収されるに十分な時間インキュベートを行う。インキ
ュベーションの時間は通常０〜１５分程度が適当である
が、吸収体、媒体の種類、及び媒体の染色状態などによ
り適宜調整される。
れるもので、また細胞にできるだけ無害なものであれば
特に制限はないが、具体的には水あるいは通常生化学的
に用いられる緩衝液等が挙げられる。吸収体の媒体への
添加量は、通常媒体内の最終濃度が１０μＭ〜１０ｍ
Ｍ、より好ましくは１〜１０ｍＭとなるような量が適当
であるが、媒体に添加する蛍光性酵素基質あるいは色素
の種類や添加量によって適宜調整される。吸収液と媒体
との混合比も特に制限はない。吸収液を媒体に添加後は
室温において静置し、生細胞以外の発光が吸収体により
吸収されるに十分な時間インキュベートを行う。インキ
ュベーションの時間は通常０〜１５分程度が適当である
が、吸収体、媒体の種類、及び媒体の染色状態などによ
り適宜調整される。
【００２７】上記、媒体の染色及び光吸収の操作は、媒
体をスライドグラスとカバーグラスに挟むか、ホールス
ライドグラスに入れてカバーグラスで密閉した状態で行
ったり、適当な容器、例えばプラスチック容器等の中で
染色及び光吸収操作を行った後に、スライドグラスとカ
バーグラスに挟み蛍光の測定に供される。
体をスライドグラスとカバーグラスに挟むか、ホールス
ライドグラスに入れてカバーグラスで密閉した状態で行
ったり、適当な容器、例えばプラスチック容器等の中で
染色及び光吸収操作を行った後に、スライドグラスとカ
バーグラスに挟み蛍光の測定に供される。
【００２８】蛍光測定の方法としては、特に制限されな
いが、例えば蛍光顕微鏡等のもとで誘導した発光に適し
た励起光を媒体に照射し、発せられる蛍光強度を冷却Ｃ
ＣＤ等の検出機を用い測定する方法等が用いられる。照
射される励起光源としては、蛍光顕微鏡の光源として一
般的に知られているものを用いることができるが、具体
的には超高圧水銀灯やＡｒ+レーザー等を用いることが
できるが、蛍光性酵素基質にＣＦＤＡ−ＡＭを用い、生
成するカルボキシフルオレセインを励起する場合には、
特にＡｒ+レーザーが好ましい。かくして得られた蛍光
の検出値をマイクロコンピューター等を用いた画像処理
システムにより画像化することによれば最も効率よく生
細胞の特異的かつリアルタイムな検出が可能である。
いが、例えば蛍光顕微鏡等のもとで誘導した発光に適し
た励起光を媒体に照射し、発せられる蛍光強度を冷却Ｃ
ＣＤ等の検出機を用い測定する方法等が用いられる。照
射される励起光源としては、蛍光顕微鏡の光源として一
般的に知られているものを用いることができるが、具体
的には超高圧水銀灯やＡｒ+レーザー等を用いることが
できるが、蛍光性酵素基質にＣＦＤＡ−ＡＭを用い、生
成するカルボキシフルオレセインを励起する場合には、
特にＡｒ+レーザーが好ましい。かくして得られた蛍光
の検出値をマイクロコンピューター等を用いた画像処理
システムにより画像化することによれば最も効率よく生
細胞の特異的かつリアルタイムな検出が可能である。
【００２９】本発明の生細胞の検出方法における操作手
順は特に制限はないが、例えば以下のようにして行うこ
とができる。 （１）媒体を染色液の添加にふさわしい状態に調製す
る。例えば媒体が土壌の場合、適当量の水により懸濁
し、土壌懸濁液を調製する。 （２）蛍光性酵素基質あるいは色素を適当な溶媒に溶解
し、染色液を調製する。 （３）吸収体を適当な溶媒に溶解し、光吸収液を調製す
る。 （４）上記（１）の媒体と（２）の染色液を混ぜ、適当
時間反応させ染色を行う。 （５）上記（４）の発光媒体に（３）の光吸収液を投入
する。 （６）上記（５）の媒体をスライドグラスとカバーグラ
スに挟む。 （７）蛍光顕微鏡下で適当な励起光をあて、冷却ＣＣＤ
カメラで蛍光強度を測定する。 （８）上記（７）の測定値をマイクロコンピューターを
用いた画像処理システムにより画像化し、生細胞を検出
する。
順は特に制限はないが、例えば以下のようにして行うこ
とができる。 （１）媒体を染色液の添加にふさわしい状態に調製す
る。例えば媒体が土壌の場合、適当量の水により懸濁
し、土壌懸濁液を調製する。 （２）蛍光性酵素基質あるいは色素を適当な溶媒に溶解
し、染色液を調製する。 （３）吸収体を適当な溶媒に溶解し、光吸収液を調製す
る。 （４）上記（１）の媒体と（２）の染色液を混ぜ、適当
時間反応させ染色を行う。 （５）上記（４）の発光媒体に（３）の光吸収液を投入
する。 （６）上記（５）の媒体をスライドグラスとカバーグラ
スに挟む。 （７）蛍光顕微鏡下で適当な励起光をあて、冷却ＣＣＤ
カメラで蛍光強度を測定する。 （８）上記（７）の測定値をマイクロコンピューターを
用いた画像処理システムにより画像化し、生細胞を検出
する。
【００３０】本発明は、蛍光性酵素基質または色素を含
有する試薬と、吸収体を含有する試薬を含む、上記した
本発明による生細胞の検出方法に使用するための試薬キ
ットにも関する。本発明の試薬キットは、上記した生細
胞の検出方法に基づいて、それ自体既知の通常用いられ
る材料及び手法で調製することができる。
有する試薬と、吸収体を含有する試薬を含む、上記した
本発明による生細胞の検出方法に使用するための試薬キ
ットにも関する。本発明の試薬キットは、上記した生細
胞の検出方法に基づいて、それ自体既知の通常用いられ
る材料及び手法で調製することができる。
【００３１】蛍光性酵素基質または色素を含有する試薬
は、先ず蛍光性酵素基質あるいは色素を溶媒に溶解する
ことにより調製することができる。蛍光性酵素基質ある
いは色素を溶解する溶媒としては、通常アセトン、ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、水等を用
いる。これらの溶媒は検出しようとする生細胞中の酵素
を失活させたり、細胞自体にダメージを与えないものが
望ましい。また、必要に応じて非イオン性界面活性剤を
用いて溶解してもよい。このような溶媒に溶かした後、
媒体を染色するのに適当な濃度に水あるいは通常生化学
的に用いられる適当な緩衝液を用いて調製することがで
きる。キットに含める試薬としては、固体状態の蛍光性
酵素基質又は色素でもよいし、上記したような溶媒に溶
解させた蛍光性酵素基質又は色素でもよい。
は、先ず蛍光性酵素基質あるいは色素を溶媒に溶解する
ことにより調製することができる。蛍光性酵素基質ある
いは色素を溶解する溶媒としては、通常アセトン、ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、水等を用
いる。これらの溶媒は検出しようとする生細胞中の酵素
を失活させたり、細胞自体にダメージを与えないものが
望ましい。また、必要に応じて非イオン性界面活性剤を
用いて溶解してもよい。このような溶媒に溶かした後、
媒体を染色するのに適当な濃度に水あるいは通常生化学
的に用いられる適当な緩衝液を用いて調製することがで
きる。キットに含める試薬としては、固体状態の蛍光性
酵素基質又は色素でもよいし、上記したような溶媒に溶
解させた蛍光性酵素基質又は色素でもよい。
【００３２】吸収体を含有する試薬も、吸収体を適当な
溶媒に溶解することにより調製することができる。吸収
体の溶媒としては、該化合物が溶解されるもので、また
細胞にできるだけ無害なものであれば特に制限はない
が、具体的には水あるいは通常生化学的に用いられる緩
衝液等が挙げられる。
溶媒に溶解することにより調製することができる。吸収
体の溶媒としては、該化合物が溶解されるもので、また
細胞にできるだけ無害なものであれば特に制限はない
が、具体的には水あるいは通常生化学的に用いられる緩
衝液等が挙げられる。
【００３３】本発明はさらに、少なくとも、（ａ）細胞
を含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光性酵素基質また
は色素を含有する試薬と、吸収体を含有する試薬とを該
媒体に添加する手段、及び（ｃ）染色された媒体の蛍光
又は色素を検出又は測定する手段を有することを特徴と
する生細胞検出装置にも関する。
を含む媒体を保持する手段、（ｂ）蛍光性酵素基質また
は色素を含有する試薬と、吸収体を含有する試薬とを該
媒体に添加する手段、及び（ｃ）染色された媒体の蛍光
又は色素を検出又は測定する手段を有することを特徴と
する生細胞検出装置にも関する。
【００３４】本発明の生細胞検出装置は、本発明による
生細胞の検出方法を実施するのに十分な手段（具体的に
は、少なくとも、（ａ）細胞を含む媒体を保持する手
段、（ｂ）蛍光性酵素基質または色素を含有する試薬
と、吸収体を含有する試薬とを該媒体に添加する手段、
及び（ｃ）染色された媒体の蛍光又は色素を検出又は測
定する手段）を有するものであればいかなるものでもよ
い。
生細胞の検出方法を実施するのに十分な手段（具体的に
は、少なくとも、（ａ）細胞を含む媒体を保持する手
段、（ｂ）蛍光性酵素基質または色素を含有する試薬
と、吸収体を含有する試薬とを該媒体に添加する手段、
及び（ｃ）染色された媒体の蛍光又は色素を検出又は測
定する手段）を有するものであればいかなるものでもよ
い。
【００３５】細胞を含む媒体を保持する手段とは、媒体
が水や水に懸濁された固体の場合にはホールスライドグ
ラス等、又物体の表面に付着した微生物等を検索する場
合にはこれを付着するためのテープ及びそれを保持する
ためのスライドグラス等が挙げられる。
が水や水に懸濁された固体の場合にはホールスライドグ
ラス等、又物体の表面に付着した微生物等を検索する場
合にはこれを付着するためのテープ及びそれを保持する
ためのスライドグラス等が挙げられる。
【００３６】蛍光性酵素基質または色素を含有する試薬
と、吸収体を含有する試薬とを該媒体に添加する手段と
は、上記したように保持された媒体に上記試薬を添加す
ることができるものであれば特に制限されないが、通常
は、上記試薬を各々別個に収容するための容器と、該容
器から保持手段に液を滴下するための装置とを有する。
と、吸収体を含有する試薬とを該媒体に添加する手段と
は、上記したように保持された媒体に上記試薬を添加す
ることができるものであれば特に制限されないが、通常
は、上記試薬を各々別個に収容するための容器と、該容
器から保持手段に液を滴下するための装置とを有する。
【００３７】染色された媒体の蛍光又は色素を検出又は
測定する手段とは、蛍光顕微鏡が挙られ、蛍光強度を測
定する装置や励起光を照射する装置などが付属された蛍
光顕微鏡が好ましい。さらに、得られた蛍光の検出値を
画像化するためのマイクロコンピューター等を用いた画
像処理システムを使用してもよい。以下の実施例により
本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に
よって限定されるものではない。
測定する手段とは、蛍光顕微鏡が挙られ、蛍光強度を測
定する装置や励起光を照射する装置などが付属された蛍
光顕微鏡が好ましい。さらに、得られた蛍光の検出値を
画像化するためのマイクロコンピューター等を用いた画
像処理システムを使用してもよい。以下の実施例により
本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に
よって限定されるものではない。
【００３８】
【実施例】実施例１：媒体の染色及び背景光吸収 東京都町田市の玉川大学構内の褐色森林土Ａ１層（図解
土壌の基礎知識、前田正男ら、農山魚村文化協会（197
4））を採取し、４℃にて使用時まで保存した。ＣＦＤ
Ａ−ＡＭは、ジメチルスルホキシドに溶解し１ｍＭの色
素溶液を調製した。ウマチトクロームＣ（和光純薬社
製）を滅菌した純水に溶解し、２００ｍｇ／ｇのチトク
ロームＣ溶液を調製した。染色に用いる緩衝液として、
２０ｍＭビストリスプロパン緩衝液（ｐＨ６．０）を調
製し、界面活性剤としてＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を最終濃度
０．０５％となるように溶解し、さらに孔径０．２μｍ
のメンブランフィルターを用いて濾過滅菌した（この液
を以下、「ＢＴＰ緩衝液」と称する）。
土壌の基礎知識、前田正男ら、農山魚村文化協会（197
4））を採取し、４℃にて使用時まで保存した。ＣＦＤ
Ａ−ＡＭは、ジメチルスルホキシドに溶解し１ｍＭの色
素溶液を調製した。ウマチトクロームＣ（和光純薬社
製）を滅菌した純水に溶解し、２００ｍｇ／ｇのチトク
ロームＣ溶液を調製した。染色に用いる緩衝液として、
２０ｍＭビストリスプロパン緩衝液（ｐＨ６．０）を調
製し、界面活性剤としてＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を最終濃度
０．０５％となるように溶解し、さらに孔径０．２μｍ
のメンブランフィルターを用いて濾過滅菌した（この液
を以下、「ＢＴＰ緩衝液」と称する）。
【００３９】上記した土壌０．０５ｇを滅菌したマイク
ロチューブにいれ、これに滅菌した純水０．１ｍｌを加
え土壌懸濁液を調製した。この土壌懸濁液２０μｌとＢ
ＴＰ緩衝液７９μｌを滅菌したマイクロチューブにい
れ、これに１ｍＭの色素液１μｌを添加した（ＣＦＤＡ
−ＡＭの媒体中最終濃度は１０μＭ）。４５分間、室温
にて静置後、さらにチトクロームＣ溶液１００μｌを添
加した。
ロチューブにいれ、これに滅菌した純水０．１ｍｌを加
え土壌懸濁液を調製した。この土壌懸濁液２０μｌとＢ
ＴＰ緩衝液７９μｌを滅菌したマイクロチューブにい
れ、これに１ｍＭの色素液１μｌを添加した（ＣＦＤＡ
−ＡＭの媒体中最終濃度は１０μＭ）。４５分間、室温
にて静置後、さらにチトクロームＣ溶液１００μｌを添
加した。
【００４０】対照として、チトクロームＣ溶液の代わり
に、１００μｌのＢＴＰ緩衝液を添加したサンプルも作
成した。このようにして作成したサンプルを、直径８ｍ
ｍ、深さ１ｍｍの円柱形のホールを有するスライドグラ
ス（池田理化社製）に１００μｌ滴下し、カバーグラス
（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ社製）をのせた。
に、１００μｌのＢＴＰ緩衝液を添加したサンプルも作
成した。このようにして作成したサンプルを、直径８ｍ
ｍ、深さ１ｍｍの円柱形のホールを有するスライドグラ
ス（池田理化社製）に１００μｌ滴下し、カバーグラス
（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ Ｇｌａｓｓ社製）をのせた。
【００４１】実施例２：蛍光強度の測定と生細胞の検出 実施例１で染色及び背景光の吸収操作を行ったサンプル
は、室温にて１５分間静置後、倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉ
ｓｓ社製；Ａｘｉｏｖｅｒｔ）下、中心波長４９０ｎ
ｍ、半値幅１０ｎｍのフィルター（オメガ社製）を励起
フィルターに用いたＢ励起で、２００倍の倍率で観察
し、細胞の蛍光強度と、背景光の蛍光強度を測定した。
は、室温にて１５分間静置後、倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉ
ｓｓ社製；Ａｘｉｏｖｅｒｔ）下、中心波長４９０ｎ
ｍ、半値幅１０ｎｍのフィルター（オメガ社製）を励起
フィルターに用いたＢ励起で、２００倍の倍率で観察
し、細胞の蛍光強度と、背景光の蛍光強度を測定した。
【００４２】蛍光強度は、冷却ＣＣＤ（Photometrics社
製：Quanix）及びマイクロコンピュータ（Macintosh G3
/400）からなる画像処理システムを用いて、IPLab（Sig
nalAnalysis社製：version 3.2）の画像解析ソフトウェ
アにより測定した。まず、顕微鏡による画像を、冷却Ｃ
ＣＤでランダムに１０視野撮影した（１視野は０．０２
７ｍｍ2）。撮影したデジタル画像データを解析し、個
々の細胞の蛍光強度、背景光の蛍光強度を測定した。測
定はいずれも細胞を染色して６０分後に行った。同サン
プルを写真撮影した結果を図１に示す。チトクロームＣ
を添加し、背景光の吸収を行った場合（図１のＡ）で
は、明瞭に生細胞を観察することができた。チトクロー
ムＣ溶液の代わりにＢＴＰ緩衝液を添加した場合（図１
のＢ）では、時間と共に背景光が速やかに上昇し、細胞
の蛍光が背景光に隠れ、生細胞を検出することが困難で
あった。
製：Quanix）及びマイクロコンピュータ（Macintosh G3
/400）からなる画像処理システムを用いて、IPLab（Sig
nalAnalysis社製：version 3.2）の画像解析ソフトウェ
アにより測定した。まず、顕微鏡による画像を、冷却Ｃ
ＣＤでランダムに１０視野撮影した（１視野は０．０２
７ｍｍ2）。撮影したデジタル画像データを解析し、個
々の細胞の蛍光強度、背景光の蛍光強度を測定した。測
定はいずれも細胞を染色して６０分後に行った。同サン
プルを写真撮影した結果を図１に示す。チトクロームＣ
を添加し、背景光の吸収を行った場合（図１のＡ）で
は、明瞭に生細胞を観察することができた。チトクロー
ムＣ溶液の代わりにＢＴＰ緩衝液を添加した場合（図１
のＢ）では、時間と共に背景光が速やかに上昇し、細胞
の蛍光が背景光に隠れ、生細胞を検出することが困難で
あった。
【００４３】また、以下の表１に、背景光吸収操作を行
った場合（実験区）と行わない場合（対象区）の各々に
ついて、冷却ＣＣＤで撮影した１０視野中に検出された
細胞の１細胞当たりの蛍光強度、背景光の強度、及び背
景光に対する細胞の蛍光強度の割合を示す。比較のため
実験区の細胞の蛍光強度を１００とした時の相対値で示
した。表１中のS.D.は標準偏差を示す。
った場合（実験区）と行わない場合（対象区）の各々に
ついて、冷却ＣＣＤで撮影した１０視野中に検出された
細胞の１細胞当たりの蛍光強度、背景光の強度、及び背
景光に対する細胞の蛍光強度の割合を示す。比較のため
実験区の細胞の蛍光強度を１００とした時の相対値で示
した。表１中のS.D.は標準偏差を示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】対照区においては背景光強度が非常に強い
ため細胞の観察が妨げられる。さらに背景光より蛍光強
度の強い細胞しか検出ができないため、検出細胞数も少
なくなっている。実験区においては背景光の蛍光強度も
弱くなるので、蛍光強度の弱い細胞も明瞭に検出するこ
とができている。
ため細胞の観察が妨げられる。さらに背景光より蛍光強
度の強い細胞しか検出ができないため、検出細胞数も少
なくなっている。実験区においては背景光の蛍光強度も
弱くなるので、蛍光強度の弱い細胞も明瞭に検出するこ
とができている。
【００４６】
【発明の効果】本発明の方法によれば、任意の媒体中背
景光を吸収する物質を添加することにより、特異性が高
く且つリアルタイムで行うことができる生細胞の検出方
法が提供される。
景光を吸収する物質を添加することにより、特異性が高
く且つリアルタイムで行うことができる生細胞の検出方
法が提供される。
【図１】図１は、土壌中の細胞をＣＦＤＡ−ＡＭを用い
て染色した顕微鏡写真である。Ａは、チトクロームＣに
より背景光を吸収したもの、Ｂは対照実験である。
て染色した顕微鏡写真である。Ａは、チトクロームＣに
より背景光を吸収したもの、Ｂは対照実験である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ (72)発明者 吉村 義隆 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 河崎 行繁 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 辻 堯 東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱化 学生命科学研究所内 (72)発明者 倉根 隆一郎 茨城県つくば市東１丁目１番３号 通商産 業省 工業技術院 生命工学工業技術研究 所内 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 BA17 CA03 CA05 DA02 DA06 EA01 EA13 FA02 GA07 GB07 GB21 JA03 KA02 KA05 KA09 LA03 2G054 AB10 CE10 EA03 GB10 2G059 AA00 4B029 AA07 BB01 FA01 FA09 4B063 QA01 QQ05 QQ15 QQ16 QQ18 QQ19 QR43 QR48 QR51 QR58 QR66 QS36 QS39 QX02
Claims (13)
- 【請求項１】 細胞を含む媒体に色素または蛍光性酵素
基質を添加して色素または蛍光を検出又は測定すること
を含む生細胞の検出方法において、細胞膜を透過でき
ず、且つ上記色素または蛍光性酵素基質の発光を吸収す
る吸収体の存在下で検出又は測定を行うことを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】 蛍光性酵素基質が、細胞膜を透過でき、
且つ蛍光性物質に生細胞内で変化し得る化合物である請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 蛍光性酵素基質が、５−カルボキシフル
オレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５
−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、
２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−
（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエ
ステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテー
ト、フルオレセインジアセテート、カルサインアセトキ
シメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセインジ
アセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセインジ
アセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレセイ
ン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群から
選択される化合物である請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 色素が、アクリジンオレンジ、ビスベン
ズイミドフルオロクロム三塩酸塩、４’，６’−ジアミ
ノ−２−フェニルインドール、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１
０、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ１３、ＳＹ
ＴＯ１４、ＳＹＴＯ１５、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ１
７、ＳＹＴＯ２０、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ２２、ＳＹ
ＴＯ２３、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５、ヘキシジウム
イオダイド及びジヒドロエチジウムよりなる群から選択
される化合物である請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 吸収体が、チトクロームＣ、ヘモグロビ
ン及びブルーデキストランよりなる群から選択される請
求項１から４の何れかに記載の方法。 - 【請求項６】 蛍光性酵素基質が５−カルボキシフルオ
レセインジアセテートアセトキシメチルエステルであ
り、吸収体がチトクロームＣである請求項１、２、３又
は５に記載の方法。 - 【請求項７】 蛍光性酵素基質または色素を含む試薬
と、吸収体を含有する試薬を含む、請求項１から６の何
れかに記載の生細胞の検出方法に使用するための試薬キ
ット。 - 【請求項８】 蛍光性酵素基質が、細胞膜を透過でき、
且つ蛍光性物質に生細胞内で変化し得る化合物である請
求項７に記載の試薬キット。 - 【請求項９】 蛍光性酵素基質が、５−カルボキシフル
オレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５
−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート及び
２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−
（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエ
ステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテー
ト、フルオレセインジアセテート、カルサインアセトキ
シメチルエステル、５−クロロメチルフルオレセインジ
アセテート、５−（６−）カルボキシフルオレセインジ
アセテートスクシニミジルエステル、及びフルオレセイ
ン−５−カルボニルアジドジアセテートよりなる群から
選択される化合物である請求項７又は８に記載の試薬キ
ット。 - 【請求項１０】 色素が、アクリジンオレンジ、ビスベ
ンズイミドフルオロクロム三塩酸塩、４’，６’−ジア
ミノ−２−フェニルインドール、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ
１０、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ１３、Ｓ
ＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１５、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ１
７、ＳＹＴＯ２０、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ２２、ＳＹ
ＴＯ２３、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５、ヘキシジウム
イオダイド及びジヒドロエチジウムよりなる群から選択
される化合物である請求項７に記載の試薬キット。 - 【請求項１１】 吸収体が、チトクロームＣ、ヘモグロ
ビン、ブルーデキストランよりなる群から選択される請
求項７から１０の何れかに記載の試薬キット。 - 【請求項１２】 蛍光性酵素基質が５−カルボキシフル
オレセインジアセテートアセトキシメチルエステルであ
り、吸収体がチトクロームＣである請求項７、８、９又
は１１に記載の試薬キット。 - 【請求項１３】 少なくとも、（ａ）細胞を含む媒体を
保持する手段、（ｂ）蛍光性酵素基質または色素を含有
する試薬と、吸収体を含有する試薬とを該媒体に添加す
る手段、及び（ｃ）染色された媒体の蛍光又は色素を検
出又は測定する手段を有することを特徴とする生細胞検
出装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000222563A JP2002034594A (ja) | 2000-07-24 | 2000-07-24 | 生細胞の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000222563A JP2002034594A (ja) | 2000-07-24 | 2000-07-24 | 生細胞の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002034594A true JP2002034594A (ja) | 2002-02-05 |
Family
ID=18716788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000222563A Pending JP2002034594A (ja) | 2000-07-24 | 2000-07-24 | 生細胞の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002034594A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006003696A1 (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Fuji Electric Holdings Co., Ltd. | 生菌数の計測方法及び計測装置 |
| JP2006068002A (ja) * | 2004-08-06 | 2006-03-16 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 生細胞の検出方法 |
| JP2006340684A (ja) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 微生物の計測方法 |
| FR2955121A1 (fr) * | 2010-01-08 | 2011-07-15 | Millipore Corp | Milieu de culture fluorescent pour la detection de microorganismes comprenant un colorant masquant la fluorescence residuelle |
| JP2013046576A (ja) * | 2011-08-29 | 2013-03-07 | Hitachi Engineering & Services Co Ltd | 微生物等の検査方法及び検査装置 |
| JP2017062145A (ja) * | 2015-09-24 | 2017-03-30 | 国立大学法人名古屋大学 | 免疫測定用キット及び免疫測定方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03504975A (ja) * | 1988-06-14 | 1991-10-31 | セル―エスシーアイ コーポレイション | 異種官能性細胞免疫剤、それを含有するワクチン及びその使用方法 |
| JPH05139040A (ja) * | 1991-11-18 | 1993-06-08 | Nikon Corp | Ｐｈｂ光記録媒体 |
| JPH08136448A (ja) * | 1994-11-07 | 1996-05-31 | Hamamatsu Photonics Kk | 散乱吸収体内の散乱特性・吸収特性の測定方法及び装置 |
| JP2000116625A (ja) * | 1998-10-13 | 2000-04-25 | Hitachi Ltd | 光計測方法及び装置 |
-
2000
- 2000-07-24 JP JP2000222563A patent/JP2002034594A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03504975A (ja) * | 1988-06-14 | 1991-10-31 | セル―エスシーアイ コーポレイション | 異種官能性細胞免疫剤、それを含有するワクチン及びその使用方法 |
| JPH05139040A (ja) * | 1991-11-18 | 1993-06-08 | Nikon Corp | Ｐｈｂ光記録媒体 |
| JPH08136448A (ja) * | 1994-11-07 | 1996-05-31 | Hamamatsu Photonics Kk | 散乱吸収体内の散乱特性・吸収特性の測定方法及び装置 |
| JP2000116625A (ja) * | 1998-10-13 | 2000-04-25 | Hitachi Ltd | 光計測方法及び装置 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006003696A1 (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Fuji Electric Holdings Co., Ltd. | 生菌数の計測方法及び計測装置 |
| JP2006068002A (ja) * | 2004-08-06 | 2006-03-16 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 生細胞の検出方法 |
| JP2006340684A (ja) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 微生物の計測方法 |
| FR2955121A1 (fr) * | 2010-01-08 | 2011-07-15 | Millipore Corp | Milieu de culture fluorescent pour la detection de microorganismes comprenant un colorant masquant la fluorescence residuelle |
| JP2013046576A (ja) * | 2011-08-29 | 2013-03-07 | Hitachi Engineering & Services Co Ltd | 微生物等の検査方法及び検査装置 |
| JP2017062145A (ja) * | 2015-09-24 | 2017-03-30 | 国立大学法人名古屋大学 | 免疫測定用キット及び免疫測定方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7582483B2 (en) | Method of detecting viable cells | |
| CN104662425B (zh) | 活性染色方法 | |
| US8642285B2 (en) | Assessment of consumption or release of a gaseous analyte from biological or chemical samples | |
| JP3907508B2 (ja) | 微生物採取チップ、微生物採取キット、微生物計量方法及び微生物計量装置 | |
| JP4913722B2 (ja) | 魚の切り身の鮮度評価方法 | |
| US20090280522A1 (en) | Method For Rapid Detection And Evaluation Of Cultured Cell Growth | |
| US20020168657A1 (en) | Rare event detection system | |
| JP2020519852A (ja) | 蛍光画像における標的分子密度決定 | |
| RU2517618C2 (ru) | Способ и система для определения количества культивируемых клеток | |
| CA2459320A1 (en) | Rapid detection of replicating cells | |
| JP2010521968A (ja) | 透過性を有する細胞膜上の微生物の検知及び識別 | |
| US20120315627A1 (en) | Method for determining the effectiveness of sterilization and/or disinfection process | |
| JP4118927B2 (ja) | 微生物計量装置の正常状態確認検査用検体 | |
| JP2006238779A (ja) | 微生物細胞検出方法 | |
| JP2006284604A5 (ja) | ||
| US20070238145A1 (en) | Phenotypic engineering of spores | |
| JP2002034594A (ja) | 生細胞の検出方法 | |
| JP4590902B2 (ja) | 糸状菌計量方法 | |
| US20120058919A1 (en) | Method For Rapid Detection And Evaluation Of Cultured Cell Growth | |
| JPH10215894A (ja) | 生細胞の検出方法 | |
| JPWO2002052034A1 (ja) | 生死判別方法及び核酸増幅方法 | |
| JP4118930B2 (ja) | 微生物計量方法 | |
| JP4602318B2 (ja) | 微生物細胞壁の透過性を増大させるための組成物および膜上で前記微生物を検出するための方法 | |
| JP2006042677A (ja) | 微生物細胞検出方法 | |
| JP2006174751A (ja) | 有芽胞細菌計量方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070717 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100427 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100625 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100625 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100907 |