JPWO2002052034A1 - 生死判別方法及び核酸増幅方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、核酸定量を応用して細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法、並びに細胞及び／又は核酸の遺伝子を効率よく直接的に増幅させる核酸増幅方法に関する。例えば、生菌、死菌の混合割合の異なる検体について、ＤＮＡの安定部分及び不安定部分をＰＣＲで増幅させると、ＤＮＡ不安定部分では、全て生菌である検体ＡではＰＣＲ産物が確認されるが、全て死菌である検体ＨではＰＣＲ産物が確認されないため、検体の生死やその混合割合が分かる。
Description
技術分野
本発明は、核酸定量を応用して細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法、並びに細胞及び／又は核酸の遺伝子を効率よく直接的に増幅させる核酸増幅方法に関する。
背景技術
従来、最小の生物である単細胞、或いは細菌類や真菌類等の菌類の生死判別方法としては、検体から適当な手段によって採取した菌類を所定の菌数に調整し、寒天培地等を用いて１日乃至２日培養してコロニーの増殖を目視判定する方法や、発色酵素を混合した発色培地に採取した菌類を植菌した後、所定温度に保持されたインキュベータ等の培養器内で１日乃至２日培養し、β−ガラクトシターゼ酵素で発色酵素を分解発色させて判読する方法等がある。
また、菌類の生死を即時に判定する方法として、特開平９−２７５９９８号公報には、フルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光染料とプロピデュームイオダイトとからなる蛍光染料を生理食塩水に混合し、さらに塩、キチネス若しくはセルラーゼからなる染色促進剤を混合した染色溶液中に、採取した菌類を混合し、加温して菌類細胞を染色し、目視で即時に判別する方法が開示されている。
また、特開平１０−２４８５９７号公報には、蛍光染料で染色された菌液を透明セルに注入し、一方向から所定波長で且つパルス間隔が少なくとも７５０μ秒以上のパルス光線を照射させ、このパルス光線の軸光と直交する一方側では生菌からの蛍光発光光線を透過するバンドパスフィルターを介してフォトダイオード検知管で検知し、他方側では死菌細胞からの蛍光発色光線を透過させるバンドパスフィルターを介してフォトダイオード検知管で検知した後、無菌の染色菌液の検知電圧と菌類の存在する染色菌液の検知電圧との差をコンピュータ処理して菌類の生菌・死菌を判別する方法及び装置が開示されている。
また、これらの方法を改良した方法として、蛍光染色菌液を化学的に安定した状態で生菌細胞及び死菌細胞内に浸透染色させた蛍光染料から、蛍光発光強度が強く、且つ鮮明な蛍光画像をフォトダイオードで検知させた後、電気的処理を行って菌種、菌数、生菌数及び死菌数を即座に高い精度で判別する方法が特開平１１−１７８５６８号公報に開示されている。
さらに、人をはじめとする多細胞生物の生死の判定は、死後硬直や直腸温度の測定や外観変化の観察などによって行われている。
しかしながら、検体から採取した菌類を所定の菌数に調整後、寒天培地で培養してコロニーの増殖を観察することによって菌類の生菌と死菌を判別する方法や発色酵素による発色法では、判定に１日乃至２日程度の日数が必要とされ、迅速な判定が必要となる食物等の細菌を検査する方法としては不適当であるという問題があった。
また、蛍光染料で菌細胞を染色して生菌細胞と死菌細胞とを判別する方法は、迅速に判別できる利点はあるものの、判定には専門的知識及び技術が必要とされ、簡便な判別法とは言えない。
さらに、人をはじめとする多細胞生物の死を死後硬直や直腸温度の測定や外観変化の観察で行う検死確認の方法を、細胞中の核酸の定量検査で確実に行う方法の確立が待たれている。
一方、細菌、例えば薬剤耐性菌若しくは毒素産生菌を同定するために細菌遺伝子を検査する場合には、採取した検体の細菌培養を行った後、細菌を検出し、該細菌から核酸の抽出と定量工程を経て核酸増幅法としてのＰＣＲを実施した後、電気泳動を行い、得られたゲルを試薬にて染色して遺伝子のバンドを観察するという方法が一般的に採用されている。この方法は、通常、検査に１乃至２週間の時間と労力を要し、また、熟練した高度専門技術を要するものであった。
このため、細菌培養を行うことなく細菌同定を可能とする手段として、ＰＣＲ法を応用して細菌遺伝子の検査を迅速且つ簡易に行う検査方法やキットが種々開示されている。
例えば、細菌同定を迅速に行う１つの方法として、特開平９−９４１００号公報には、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子に存在する特異な塩基配列を有するＤＮＡをプライマとし、被同定細菌から得た染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を適用し、用いたプライマの塩基配列を含む特定のＤＮＡが増幅されるか否かで細菌種の決定を行う方法が開示されている。
また、特開平６−１１３８９９号公報には、酪酸菌からゲノムＤＮＡを抽出し、ｒＲＮＡ遺伝子を特異なプライマを用いてＰＣＲ法により増幅させ、増幅したｒＤＮＡ断片の長さを電気泳動により解析、比較することによって酪酸菌の同定を行う方法が開示されている。
また、極めて少数の細胞・細菌でのｍＲＮＡの定量を行う方法として、特開平７−２３１９７号公報には、遺伝子のイントロンを含まない部分由来の検出対象のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、該ｃＤＮＡに対応する部分のゲノムＤＮＡと共に増幅させる方法が開示されている。
さらに、採取した検体から核酸を抽出することなく核酸増幅を行う際に増幅を困難にするＰＣＲ阻害物質の作用を抑制する方法として、ＰＣＲ反応液にポリアミンを添加する方法が特開平８−９９９７号公報に、界面活性剤を添加する方法が特開平１０−８０２７９号公報にそれぞれ開示されている。
しかしながら、上述した特開平９−９４１００号公報に開示された方法は、全ての細菌を検出できるプライマを設計したことに特徴があり、ＰＣＲ法を用いれば迅速に細菌の同定が可能であるため、取り立てて迅速な検査方法とは言えない。
また、上述した特開平６−１１３８９９号公報や特開平７−２３１９７号公報にに記載されている方法は、高度の熟練技術を必要とせず、また、少数の試料から同定する方法であるが、それらは特定の菌に関するものであり、種々の検体からＤＮＡ検出を利用して細菌同定や薬剤耐性菌同定を極めて短時間に行う方法を示したものではない。
また、検体から核酸抽出を行うことなくＰＣＲ法を応用して核酸増幅を行う際に、核酸増幅酵素反応を阻害する物質の作用を抑制する目的でＰＣＲ反応液にポリアミンや界面活性剤を添加する方法は、細胞・細菌の遺伝子を直接且つ迅速に検出する方法としては優れた方法ではあるが、ＰＣＲ終了後にリアルタイム定量ＰＣＲ法を用いる場合に、蛍光を物理光学的に阻害する物質が除去されていないため、測定に誤差が生じるという問題があった。
発明の開示
本発明は、上述の実情に鑑みて提案されるものであって、核酸定量を応用することにより菌類をはじめとする細胞の生死判別を行う生死判別方法並びに細胞及び／又は細菌の遺伝子を直接且つ迅速に効率よく増幅する核酸増幅方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出してその少なくとも一部を定量し、上記検体内における上記ＤＮＡ及びＲＮＡの量比を比較することによって生死を判別することを特徴とするものである。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出して増幅させ、増幅産物を定量して上記検体内における上記ＤＮＡ及びＲＮＡの量比を比較することによって生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記ＤＮＡ及びＲＮＡの増幅は、それぞれ定量ＰＣＲ法及び定量逆転写ＰＣＲ法によって行うことができる。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、
上記検体からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、上記ＤＮＡ及びＲＮＡをそれぞれリアルタイムＰＣＲ法、リアルタイム逆転写ＰＣＲ法で増幅し、得られた相対的ＤＮＡ量及び相対的ＲＮＡ量の比に基づいて生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記相対的ＤＮＡ量及び相対的ＲＮＡ量は、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量若しくは増幅ｃＤＮＡ量との関係から得られるサイクルスレッショード値に基づいて求めることができる。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体からＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡの不安定部分を増幅させ、増幅産物を定量することによって生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記増幅産物のゲル電気泳動によって、若しくはサイクルスレッショード値を比較することによって、又は２本鎖ＤＮＡの温度解離曲線の解離温度点或いは２本鎖ＤＮＡの高次構造に由来する温度解離曲線のパターンに基づいて生死を判別することができる。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体から時間差をおいて等量の複数のサンプルを抽出し、上記複数のサンプルからＤＮＡを抽出してリアルタイムＰＣＲ法で増幅させ、増幅されたＤＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記ＤＮＡ量は、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量との関係から得られるサイクルスレッショード値に基づいて求められる。また、上記複数のサンプルは、上記検体から異なる培養時間で抽出されたものであってもよい。また、この際、上記複数のサンプルからＤＮＡを抽出することなく、直接ＰＣＲバッファを用いてリアルタイムＰＣＲで上記ＤＮＡ若しくはＲＮＡを増幅させ、増幅されたＤＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別するようにしてもよい。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体から時間差をおいて等量の複数のサンプルを抽出し、上記複数のサンプルからＲＮＡを抽出してリアルタイム逆転写ＰＣＲ法で増幅させ、増幅されたＲＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記ＲＮＡ量は、ＰＣＲサイクル数と増幅ＲＮＡ量との関係から得られるサイクルスレッショード値に基づいて求められる。また、この際、上記複数のサンプルからＲＮＡを抽出することなく、直接ＰＣＲバッファを用いてリアルタイム逆転写ＰＣＲ法で上記ＲＮＡを増幅させ、増幅されたＲＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別するようにしてもよい。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る核酸増幅方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、上記検体を破壊して核酸を露出させ、破壊産物を濾過して反応阻害物質を除去若しくは抑制し、核酸を増幅させることを特徴とするものである。
ここで、上記核酸の増幅は、ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法によって行うことができる。
本発明の更に他の目的、本発明によって得られる具体的な利点は、以下に説明される実施例の説明から一層明らかにされるであろう。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
第１の実験
第１の実験は、細胞が生きている限り一定量の特定のＤＮＡから一定量の特定のＲＮＡが合成される仕組みを利用して、検体から採取したＤＮＡ及びＲＮＡを増幅させ、増幅産物中のＤＮＡ及びＲＮＡを定量して該ＲＮＡと該ＤＮＡのモル数の比率（ＲＮＡ／ＤＮＡ）を測定することによって細胞の生死を判別するものである。
細胞内でタンパク質を合成する必要が生じると、ＤＮＡ上の必要な塩基配列がＲＮＡに写し取られる転写が生じ、その結果として伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成される。そして、該ｍＲＮＡは細胞核の外に出てリボソームへと移動し、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の助けを借りてタンパク質が作られる翻訳が生じる。
ここで、検体を採取して核酸の定量を行うと、ＤＮＡは比較的安定で壊れにくく、生細胞ではＲＮＡの分解及び生成が常に継続しているのに対して、死細胞ではＲＮＡが生成されず早期に分解されてしまうため、生細胞に対してＲＮＡ／ＤＮＡモル比が相対的に低下する。そこで、このＲＮＡ／ＤＮＡモル比を測定することによって、細胞の生死を判別することが可能となる。
なお、第１の実験で用いる核酸の増幅方法としては、ＤＮＡ断片を利用したＤＮＡクローニング法やＰＣＲ法など、あらゆる核酸増幅法が利用できる。しかし、ＤＮＡクローニング法は、増幅操作に手間がかかると言う欠点があり、また、ＰＣＲ法は、短時間に目的ＤＮＡを増幅できる利点があるが、該目的ＤＮＡが指数級数的に増幅されるため、わずかな増幅効率の違いによって増幅産物量が大きく影響され、定量的解析には問題がある。
そこで、以下では、核酸増幅法の一例として検体から抽出したＲＮＡの定量逆転写ＰＣＲ（定量ＲＴ−ＰＣＲ）とＤＮＡの定量ＰＣＲとを用いるものとするが、この定量ＰＣＲ法及び定量ＲＴ−ＰＣＲ法に限定されないことは勿論である。さらには、核酸増幅有無の制限を受けるものでもない。すなわち、細胞・細菌から抽出されたＤＮＡ量及びＲＮＡ量が多ければ、増幅することなく直接ＤＮＡ／ＲＮＡの量比から細胞・細菌の生死判別を行うことができる。
以下、第１の実験の具体的な実施例について説明するが、この実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例１
実施例１では、先ず定量ＲＴ−ＰＣＲ用のコンペティタを作製する。具体的には、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を操作手順に従って使用し、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡの一部をコードする第１の塩基配列（５‘−ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ−３’）及び第２の塩基配列（５‘−ＡＣＧＡＣＡＣＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＣ−３’）を利用してコンペティタ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を作製した。作製された該コンペティタは、定量して既知濃度コンペティタとした。
また、採取した検体にＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン株式会社製）を添加し、常法通りの操作手順に従って細菌由来のゲノムＤＮＡ及びｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
そして、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡについては、定量後、その２μｇに逆転写プライマとしてｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒを添加して逆転写反応を行った。反応終了後、逆転写産物の５μｌを使用し、第１のプライマ（５’−ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ−３’）及び第２のプライマ（５’−ＡＣＧＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣ−３’）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
この定量ＲＴ−ＰＣＲ反応は、６反応を行い、各反応に夫々０、１（＝１０−９）、２（＝１０−８）、３（＝１０−７）、４（＝１０−６）、５（＝１０−５）Ｍの既知濃度コンペティタを加えた。なお、該反応には、ＰＣＲ ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を操作手順に従って使用した。
反応の終了したＰＣＲ産物は、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、バンドの濃度差を濃度測定器等によって測定した。
そして、コンペティタ濃度をＸ軸、エチジウムブロマイド染色濃度をＹ軸とした検量曲線を作成し、該検量曲線にコンペティタ濃度０のサンプルのエチジウムブロマイド染色濃度を当てはめ、ｍＲＮＡのモル濃度を求めた。
一方、検体から抽出したゲノムＤＮＡについては、定量後、その２μｇを用いてＰＣＲ反応を行い、反応の終了したＰＣＲ産物の５μｌに上記第１のプライマ及び第２のプライマを用いて定量ＰＣＲ反応を実施した。
このようにＰＣＲを２段階で行うことによって、特異性を高めることが可能となるが、１段階目のＰＣＲについては、省略しても構わない。なお、１段階目のＰＣＲに用いられるプライマは、２段階目の定量ＰＣＲで用いられる第１のプライマ及び第２のプライマの外側に位置する。
定量ＰＣＲ反応は、６反応を行い、各反応に夫々０、１（＝１０−９）、２（＝１０−８）、３（＝１０−７）、４（＝１０−６）、５（＝１０−５）Ｍの濃度既知コンペティタを加えた。なお、該反応には、ＰＣＲ ｂｅａｄｓを操作手順に従って使用した。
反応の終了した定量ＰＣＲ産物は、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、バンドの濃度差を濃度測定器等によって測定した。
そして、コンペティタ濃度をＸ軸、エチジウムブロマイド染色濃度をＹ軸とした検量曲線を作成し、該検量曲線にコンペティタ濃度０のサンプルのエチジウムブロマイド染色濃度を当てはめ、ＤＮＡのモル濃度を求めた。
この定量ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＰＣＲにより、検体中の細菌由来１６ＳリボソームＲＮＡのｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの各モル濃度が得られる。生菌では、ＲＮＡ／ＤＮＡ比が高値になり、死菌では逆に低値となるために、その結果から検体に生菌又は死菌が含まれているか否かの判定を行った。
実施例２
実施例２では、死亡したラットの肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺等の内蔵部位、筋肉、皮膚及び眼球を取り出し、実施例１と同様の条件で定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、経時的なＲＮＡの減少が観察された。
以上説明したように、第１の実験においては、検体から抽出したＤＮＡ及びＲＮＡを増幅させ、そのモル比を求めることによって、検体中の細胞の生死を正確且つ迅速に判別することが可能とされる。
ところで、この第１の実験は、細菌ゲノムＤＮＡの検出を基本原理とするものであるため、細菌が死菌であっても菌体にゲノムＤＮＡを保持している限り陽性、すなわち生菌と判定してしまう危険性を内在している。
そこで、以下に示す第２の実験及び第３の実験では、より正確に検体中の細胞・細菌の生死を判別する方法について説明する。
第２の実験
第２の実験では、検体から抽出されたＤＮＡ及びＲＮＡを、それぞれリアルタイムＰＣＲ法及びリアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて増幅させ、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量若しくは増幅ＲＮＡ量との関係から得られるＣｔ（サイクルスレッショード）値を比較することによって細胞・細菌の生死を判別する。
また、この第２の実験では、細胞・細菌から抽出されたゲノムＤＮＡが部位により不安定である性質を利用し、ＰＣＲ法などによって核酸増幅することによっても、細菌の生死を判別する。
すなわち、ＰＣＲ法は、ＤＮＡの特定の標的部位を増幅する技術であるが、ＰＣＲ標的部位に連続性のあることが必須条件となっている。したがって、この部位に不連続性がある場合や、ＤＮＡの不安定性から極端な立体構造の変化を呈した場合には、ＰＣＲは完遂されず標的部位も増幅されない。特に、細胞死という劇的な生体変化が菌体内に起こった際には、標的部位に変化が起きる確率が非常に高くなる。つまり、安定性の高い標的部位は、生菌、死菌共に増幅されるのに対して、不安定性の高い標的部位は、生菌では増幅されるが死菌では増幅されないことを利用して、細菌・細胞の生死を判定することもできる。
なお、ＤＮＡ不安定部位を利用した方法では、ＰＣＲ法を用いることが有用であるが、ＰＣＲ法に限定されるものでなく、あらゆる核酸増幅法が利用できる。さらには、核酸増幅有無の制限を受けるものでもない。細胞・細菌から抽出されたＤＮＡ量及びＲＮＡ量が多ければ、増幅することなく直接ＤＮＡ／ＲＮＡの量比から細胞・細菌の生死判別を行うことができる。
以下、第２の実験の具体的な実施例について説明するが、この実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例３
実施例３では、リアルタイムＰＣＲ法及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を利用して求めた相対的ＤＮＡ量と相対的ＲＮＡ量とを比較することによって細胞の生死を判別した。
ここで、リアルタイムＰＣＲ法は、２本鎖ＤＮＡに取り込まれ蛍光を発する蛍光発色物質を反応液中に存在させることにより、ＰＣＲのサイクル経過と共に増幅する２本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）を蛍光強度の増強として捉えてＰＣＲ産物の増加を知る方法である。
ＰＣＲ産物は、元の鋳型ＤＮＡが多ければ早期のＰＣＲサイクルで増加し、蛍光強度も増強される。したがって、一定の蛍光強度を予め定めておき、この強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数をＣｔ値とすると、鋳型ＤＮＡが多いか又はＰＣＲ効率の高い場合は、早期のＰＣＲサイクル数でこの蛍光強度に到達するためにＣｔ値が低くなり、鋳型ＤＮＡが少ないか又はＰＣＲ効率の低い場合は、相当のＰＣＲサイクル数でこの蛍光強度に到達するためにＣｔ値が高くなる。
そして、このＣｔ値を予め既知量ＤＮＡを用いて求めたＣｔ値と比較し、そのＣｔ値に対応するＤＮＡ量を相対的ＤＮＡ量とする。ＲＮＡについても同様である。
実施例３において、検体からの細菌由来のゲノムＤＮＡ及びｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、採取した検体にＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン株式会社製）を添加し、常法通りの操作で採取することによって行った。
また、リアルタイムＰＣＲ法による相対的ＤＮＡモル数の推定は、以下の表１に示すＰＣＲ反応液を準備して行った。
この表１に示すＰＣＲ反応液をポルテックスにて攪拌した後、波長３６５ｎｍの紫外線を１ｃｍの距離から４分間照射した。
次に、上述した第１のプライマ（１０ｐモル／μｌ）及び第２のプライマ（１０ｐモル／μｌ）を各３μｌと、蛍光インターカレータである１×ＳｙＧｒｅｅｎ（サイバーグリーン）５μｌとを加え、合計５０μｌのＰＣＲ反応試薬とした後、ポルテックスで攪拌してＰＣＲ反応試薬とした。
上記ＰＣＲ反応試薬中に、抽出した細菌ＤＮＡ２μｇを添加し、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールでＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を使用してＰＣＲを４０サイクル行った。そして、ＰＣＲ増幅曲線のプラトー値とベースライン値との中点、或いはＰＣＲ増殖曲線の直線部分の中点における蛍光強度を定め、この蛍光強度に達するサイクル数をＣｔ値とした。このＣｔ値を予め作製した既知量ＤＮＡ−Ｃｔ値の検量曲線に当てはめ、相対的ＤＮＡ量を算定した。
一方、抽出したＲＮＡについては、定量後、その２μｇを逆転写反応に使用した。なお、反応は、Ｙｏｕ−ｐｒｉｍｅ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用して行った。また、逆転写プライマは、ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒを使用した。
そして、このＰＣＲ反応試薬中に、反応の終了した逆転写産物５μｌを添加し、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールでＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を使用してＰＣＲを４０サイクル行った。そして、上述と同様に、Ｃｔを求め、これを予め作製した検量曲線に当てはめて相対的ＲＮＡ量を算定した。
ここで、大腸菌を使用してリアルタイムＰＣＲ及びリアルタイム逆転写ＰＣＲを行い、そのＣｔ値から算定した相対的ＤＮＡ量及び相対的ＲＮＡ量の結果を以下の表２に示す。
表２に示すように、生菌と比較して死菌では相対的ＲＮＡ量／相対的ＤＮＡ量の比が小さくなり、両者が混在している場合には、その中間程度の値となる。したがって、予め実験的に基準値を定めておくことにより、細菌の生死判定を正確かつ容易に行うことができる。
実施例４
実施例４では、細菌ＤＮＡの安定部分及び不安定部分をＰＣＲで増幅させ、増幅産物をゲル電気泳動することによって細菌の生死を判別した。先ず、以下の表３に示す処方のＰＣＲ反応液を用意した。
表３において、検体ＤＮＡ溶液については、ＤＮＡを１μｇ含有する量が用いられ、ｘμｌ＋ｙμｌ＝３５．５μｌとなるように滅菌蒸留水を加えて調製した。
ＤＮＡ安定部分検出用プライマとしては、上述の第１のプライマ及び第２のプライマを使用し、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマとしては、第３のプライマ（５’−ＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＹ−３’）及び第４のプライマ（５’−ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ−３’）を使用した。
ＰＣＲは、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで３０サイクル行った。そして、ＰＣＲ終了後のＰＣＲ産物は、その１０μｌを定法に従い１％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分間電気泳動し、エチジウムブロマイドでＰＣＲ産物を染色後、紫外線照射によってバンドを確認した。
ここで、ＤＮＡ安定部分検出用プライマでは、生菌、死菌共にＰＣＲで増幅されるためにＰＣＲ産物が確認されるが、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマでは、生菌のＰＣＲ産物のみ確認され、死菌のＰＣＲ産物は確認されないか極端に低い増幅が確認される。
生菌、死菌の混合割合の異なる８群について検討した結果を図１に示す。なお、各群における生菌と死菌との比率は、以下の表４の通りであり、図１中、アルファベットは、表４の検体群に対応する。死菌は、１２１℃のオートクレーブで２０分間熱処理することによって作製した。
図１に示すように、ＤＮＡ安定部分では全ての検体において増幅が観察されるが、ＤＮＡ不安定部分では検体中の菌が全て死菌である場合（検体Ａ）、又は過半数が死菌である場合（検体Ｂ−Ｄ）にはＰＣＲで増幅されていないことが判る。また、生菌の一部に死菌が混入している場合（検体Ｅ−Ｇ）には低い増幅のみが観察される。しかし、生菌の場合（検体Ｈ）ではＤＮＡ不安定部分でもＰＣＲは正常に増幅されて検出される。
実施例５
実施例５では、実施例４と同様にＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン株式会社製）を用いて検体から細菌由来のＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法によって生菌と死菌の判別を行った。
ここで、実施例５において、リアルタイムＰＣＲは、以下の表５に示す処方のＰＣＲ反応液を用いて行った。
表５において、検体ＤＮＡ溶液については、ＤＮＡを１μｇ含有する量が用いられ、ｘμｌ＋ｙμｌ＝３５．５μｌとなるように滅菌蒸留水を加えて調整した。
ＤＮＡ安定部分検出用プライマとしては、実施例３で使用した第１のプライマ及び第２のプライマを使用し、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマとしては、実施例４で使用した第３のプライマ及び第４のプライマを使用した。
ＰＣＲは、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで４０サイクル行った。また、リアルタイムＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を使用して行った。
ここで、ＤＮＡ安定部分検出用プライマでは、生菌、死菌共にＰＣＲで増幅されるためにＰＣＲ産物を確認することができるのに対して、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマでは、生菌のＰＣＲ産物のみ確認され、死菌のＰＣＲ産物は確認されないか極端に低い増幅が確認される。
つまり、ＤＮＡ安定部分検出用プライマでのＰＣＲ産物では、生菌、死菌共にほぼ一定のＣｔ値を示すが、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマでのそれは、死菌のＣｔ値が生菌に比べて高い値となるか又はＰＣＲ反応が起こらないので、生菌と死菌とを判別することが可能となる。
実施例４と同様の８群からなる試料を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた結果を以下の表６に示す。
表６に示すように、ＤＮＡ安定部分検出用プライマの場合には、８群の試料のＣｔ値がほぼ一定であるのに対して、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマの場合には、全て死菌の場合（検体Ａ）や生菌に死菌が混入している場合（検体Ｂ−Ｇ）は、全て生菌の場合（検体Ｈ）に比べてＣｔ値が高くなることが確認された。これにより、予め基準Ｃｔ値を検討することによって、生死判別のみならず、死菌混入の程度を推測することが可能となる。
実施例６
実施例６では、紫外線照射、次亜塩素酸ソーダ、強酸、強アルカリで処理してＤＮＡがランダムに破壊される環境下に置いた試料について実施例５と同様の試験を行った。この結果、Ｃｔ値は全て高い値を示した。これは、このような環境下ではＤＮＡ安定部分も破壊されて死菌となるためと推測された。
実施例７
実施例７では、２本鎖ＤＮＡの温度解離変化を検出するＴｍ値或いはＴｍパターンを利用して、細胞・細菌の生死判別を行った。
先ず、ＡＧＰＣ法（酸性グアニジン・フェノール・クロロフォルム法）などの定法に従い、検体から細菌・細菌由来のＤＮＡを抽出して、以下の表７に示す処方の反応液にてリアルタイムＰＣＲを行った。
表７において、検体ＤＮＡ溶液については、ＤＮＡを１μｇ含有する量が用いられ、ｘμｌ＋ｙμｌ＝３５．５μｌとなるように滅菌蒸留水を加えて調整した。
プライマは、実施例４で使用した第３のプライマ及び第４のプライマを使用し、リアルタイム定量ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を使用して９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで４０サイクル行った
ＰＣＲ終了後、６５℃から９５℃までの温度における２本鎖ＤＮＡのＴｍ値或いはＴｍパターンを測定して変化を調べた。
大腸菌死菌１００％と大腸菌生菌１００％との場合について、各１０回測定したＴｍ値を以下の表８に示す。なお、死菌は、１２１℃のオートクレーブで２０分間処理して作製した。
表８に示すように、検体中の菌が死菌である場合、ＤＮＡの不安定部分に変異が生じるため、そのＰＣＲ産物のＴｍ値或いはＴｍパターンは、生菌のＰＣＲ産物のＴｍ値或いはＴｍパターンと異なる値やパターンになる。そこで、このＴｍ値或いはＴｍパターンを調べることによって生菌と死菌とを区別することができる。
また、このＴｍ値やＤＮＡの高次構造に由来するＴｍパターンは、各菌種に特異なものであり、菌種毎に生菌、死菌の解析を行っておくことによって、容易に菌種毎の生死判別が可能となる。
以上説明したように、第２の実験においては、検体から抽出したＤＮＡ及びＲＮＡを増幅後、定量して両者の量比、Ｃｔ値又はＴｍ値或いはＴｍパターンに基づいて、検体中の細胞の生死を正確且つ迅速に判別することが可能とされる。
第３の実験
第３の実験では、時間差をおいて検体からＤＮＡ及びＲＮＡを複数回抽出し、夫々リアルタイムＰＣＲ法及びリアルタイム逆転写ＰＣＲ法で増幅させ、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量若しくは増幅ＲＮＡ量との関係から得られるＣｔ値を比較することによって細胞の生死を判別する。
つまり、時間経過後にＤＮＡ量若しくはＲＮＡ量の増加を認めれば生細胞・生菌であり、ＤＮＡ量若しくはＲＮＡ量に変化を認めなければ死細胞・死菌であると推定される。
また、この判定にリアルタイムＰＣＲ法等を用いた場合、Ｃｔ値が時間経過後に小さくなる場合（ＤＮＡ量若しくはＲＮＡ量の増加を意味する。）は、生細胞・生菌であり、ＣＴ値が時間経過後に変化しない場合は、死細胞・死菌であると推定することができる。特に、リアルタイムＰＣＲ法等を用いた核酸定量法では、プラトーに達する前のＣｔ値を判定基準として用いることができるため、微少なＤＮＡ量若しくはＲＮＡ量の変化をも捉えることができ、検体採取間の時間差が短時間であっても生菌・死菌の判別が可能である。
なお、検体採取間の時間差をさらに短時間とするため、細胞・細菌に最適条件、例えば温度・湿度・酸素濃度・培地供給などを供することが有効である。
また、短時間での微少なＤＮＡ若しくはＲＮＡの変化を捉えるためには、検体から核酸抽出を行わず、検体を直接リアルタイムＰＣＲ法に供することがより有効である。例えば、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（島津製作所製）に代表される直接ＰＣＲバッファなどの併用が可能である。これにより、迅速性、効率性が改善され、条件によっては６０分前後で細胞・細菌の生死判別が可能となる。
以下、第３の実験の具体的な実施例について説明するが、この実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例８
実施例８では、リアルタイムＰＣＲ法を利用し、時間差をおいて検体を複数回採取し、ＤＮＡ量を比較することによって細胞の生死を判別した。
ここで、検体は、生理食塩水中に１０８／ｍｌの濃度で大腸菌を混入させたものを用いた。また、比較のため生菌、死菌（オートクレーブ滅菌）の両者について、同時に同条件で操作を行った。
リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡ量の比較は、以下の表９に示すＰＣＲ反応液を準備して行った。
表９に示したＰＣＲ反応液をボルテックスにて攪拌した後、検体５μｌを加え、合計５５μｌのＰＣＲ反応試薬としてボルテックスで再度攪拌し、反応液とした。
また、リアルタイムＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を用いて測定を行った。プライマは、上述の第１のプライマ及び第２のプライマを使用した。
ＰＣＲは、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで４０サイクル行い、Ｃｔ値を予め作製した検量曲線に当てはめて、評価ＤＮＡ量を算定した。
そして、以下の表１０に示す検体を用いて生菌・死菌の判別を行った。菌の濃度は、何れも１０８／ｍｌであり、菌種は大腸菌を用いた。また、培地はＬＢ培地を用い、培養条件は３７℃加温、１００ｒｐｍ／ｍｉｎ振蕩で行った。
この表１０に示す各検体から５μｌを採取し、表９記載の計５０μｌのＰＣＲ反応液に混ぜてリアルタイムＰＣＲを行い、結果をＣｔ値で評価した。以下の表１１に詳細を記す。
表１１に示すように、生菌の場合は、時間差をおいて増殖させた場合、ＤＮＡ量が増加するためＣｔ値は小さくなる。これに対して死菌の場合は、時間差をおいても増殖しないためＤＮＡ量の変化はなく、Ｃｔ値もほぼ一定の値をとる。
なお、検体あるいは標的細胞・細菌によっては、培地の添加が不要な場合、又は加温や振蕩が不要な場合もある。また、本実施例では１８０分の時間差が有用であったが、これも対象により一定ではない。
以上説明したように、第３の実験においては、検体を適当な条件下におき、時間差をおいて検体を複数回採取し、検体中のＤＮＡ若しくはＲＮＡを定量してその変化を比較することによって、細胞・細菌の生死判定を正確かつ迅速に行うことができる。
ところで、上述した第１の実験乃至第３の実験では、検体となる細胞及び／又は細菌の核酸を増幅させることが不可欠であり、この核酸増幅を効率よく迅速に行うことによって、検体の生死をより正確且つ迅速に判別することが可能となる。
そこで、以下の第４の実験では、細胞及び／又は細菌の核酸を直接且つ迅速に効率よく増幅させる核酸増幅方法について説明する。
第４の実験
第４の実験では、採取した細胞・細菌の核酸が露出されるように検体を破壊し、該破壊産物を濾過して核酸増幅酵素反応阻害物質及び物理光学的反応阻害物質を除去若しくは制御し、得られた核酸増幅反応液を用いて核酸増幅することによって検体の細菌遺伝子を検出する。
ここで、検体から細胞・細菌の核酸を露出させるための破壊方法としては、熱処理、浸透圧処理、超音波処理若しくは電気的処理等の物理的処理方法や、界面活性剤処理、酵素処理若しくはウイルス感染溶菌処理等の化学的処理方法があり、検査する細胞・細菌に有効且つ強力な方法を用いることができる。
また、破壊産物から核酸増幅酵素反応阻害物質及び物理光学的反応阻害物質を濾過して取り除く方法としては、カラム若しくはフイルタを用いる方法や磁気吸着する方法などがあり、何れの方法を用いてもよい。
破壊産物が通過する濾過層には、イオン性不純物を吸着する性質のあるポリアミンを添加することにより、核酸増幅反応液の純度を向上させ、ＰＣＲ法等の核酸増幅酵素反応を円滑にすることができる。
ここで、ポリアミンとは、分子の主鎖に−ＮＨ−基を持つオリゴマ又はポリマ、多価アミンのことであり、濾過層に添加されて使用されるポリアミンは、検体の種類によって最適のものを利用することができる。
破壊され、反応阻害物質を取り除いて濾取された検体試料を増幅する方法としては、ＰＣＲ法及びこれを応用したリアルタイム定量ＰＣＲ法が利用できるが、これらに限定されるものではない。
以下、第４の実験の具体的な実施例について説明するが、この実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例９
実施例９では、図２に示す核酸増幅装置を用いて、細菌の遺伝子検出を行った。図２に示すように、核酸増幅装置は、破壊チャンバ１と、濾過チャンバ２と、濾過層３と、ＰＣＲ反応チャンバ４と、ＰＣＲ反応液溜５とにより構成される。なお、図２は、核酸増幅装置の概念構成を示したものであり、各チャンバの形状、構成がこの例に限定されるものでないことは、勿論である。
先ず、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）と３％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０とをＴｒｉｓＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液に溶解した後、ｐＨを８．０に調整して細胞溶解液を作製した。
この細胞溶解液５０μｌと検体１０μｌ（大腸菌１０５個／１０μｌ Ｍｉｌｋ）とを混合して破壊チャンバ１に入れ、室温で２分間静置後、７０００Ｇで１０分間遠心分離して沈殿を除去し、上清をｐＨ８．０に調整した。
そして、上清は、濾過チャンバ２を通過してＰＣＲ反応チャンバ４に落とされた。ここで、濾過チャンバ２は、濾過層３を有し、この濾過層３は、デキストランを担体とする粉体のイオン交換体であるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）が含浸された孔径０．２２μｍのニトロセルロース製の膜が３重に重ねられた濾材からなる。
ＰＣＲ反応チャンバ４には、以下の表１２に示す処方のＰＣＲ反応液が充填されており、濾過された濾液と混和されてＰＣＲ反応が行われた。ＰＣＲサイクルは、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで３０サイクル行った。ここで、プライマとしては、上述の第１のプライマ及び第２のプライマを使用した。
なお、高感度、高速ＰＣＲを行うためのＤＮＡポリメラーゼとしては、ＴＡＫＡＲＡ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）が、また細菌からＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを可能とするＰＣＲ緩衝液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（株式会社島津製作所製）が適しているが、それらに限定されるものではない。
通常の方法でＰＣＲ反応を実施した場合と本実施例の方法でＰＣＲ反応を実施した場合について、ＰＣＲ終了後のＰＣＲ産物１０μｌを定法に従い１％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分電気泳動して、エチジウムブロマイドでＰＣＲ産物を染色後、紫外線照射によって細菌遺伝子を確認した。
コントロールとして大腸菌を含まない例（サンプルＡ）、通常のＰＣＲ法による例（サンプルＢ，Ｃ）、及び本発明のＰＣＲ法による例（サンプルＤ，Ｅ）の電気泳動写真を図３に示す。また、サンプル処方と図３の電気泳動写真で確認された結果を以下の表１３に示す。
図３及び表１３に示すように、通常の方法でＰＣＲ反応を実施したサンプルＢ、サンプルＣの場合には、３０サイクルという条件下ではＰＣＲの効率が悪く、細菌遺伝子が検出されなかった。
また、上述した細胞溶解液を添加して破壊チャンバ１にて細胞・細菌の細胞壁、細胞膜及び核膜等を破壊して核酸を露出させた後、ＰＣＲ反応を行ったサンプルＥの場合には、細菌遺伝子の検出が確認されたが、細胞溶解液を添加していないサンプルＤでは細菌遺伝子は検出されなかった。
このように、細胞溶解とフィルタ濾過を組み合わせることによって、効率よく細菌遺伝子を検出することができた。
以上説明したように、第４の実験においては、破壊チャンバにて検体の核酸を露出させ、濾過チャンバにて反応阻害物質を除去することによって、効率よく検体の核酸を増幅させ、遺伝子を検出することができる。
さらに、この第４の実験では、検体由来の物理光学的反応阻害物が濾過チャンバで除去されているため、ＰＣＲ反応液にサイバーグリーンなどの蛍光インターカレータを含有させ、リアルタイム定量ＰＣＲ法と組み合わせて細菌の検出を行う場合にも、正確且つ確実に検出することができる。
例えばＰＣＲ法によって核酸を増幅させる場合、薬剤耐性遺伝子プライマを設計することにより、その検体に最適な抗生物質の推定が可能となり、また、毒素産生遺伝子検出用プライマを設計することにより、Ｏ１５７のような毒素産生菌についても、検出した菌を培地で培養することなく、迅速に検出することができる。また、目的に応じたプライマを用いることにより、ペストなど、診察した経験が無く病院外来で診断がつかない疾病についても的確に診断を下すことができる。
また、ＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基配列を、塩基配列決定法又はＤＮＡチップを用いて検査することによって、検出された細菌の詳細な種類を正確且つ迅速に同定することができる。
なお、本発明は、上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、種々の変更が可能であることはいうまでもない。
産業上の利用可能性
上述したような本発明を用いることにより、細胞及び／又は細菌の生死を正確に且つ迅速に判別することが可能となり、例えば、食品に含まれる細菌の生死を始め、抗生物質等で治療中の効果判定に用いることができる。また、ヒト等の多細胞生物の生細胞、死細胞の判定を容易に行うこともできる。
また、上述したような本発明を用いることにより、細胞及び／又は細菌の核酸を直接且つ迅速に効率よく増幅させ、遺伝子を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、生菌、死菌の混合割合の異なる検体Ａ乃至検体Ｈについて、ＤＮＡ安定部分及びＤＮＡ不安定部分の増幅後における電気泳動パターンを説明する図である。
図２は、破壊チャンバ、濾過チャンバ、ＰＣＲ反応チャンバ、ＰＣＲ反応液溜からなる本発明の説明に供する核酸増幅装置の概念構成を説明する図である。
図３は、ＰＣＲ反応後のＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動した電気泳動パターンを説明する図である。
本発明は、核酸定量を応用して細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法、並びに細胞及び／又は核酸の遺伝子を効率よく直接的に増幅させる核酸増幅方法に関する。
背景技術
従来、最小の生物である単細胞、或いは細菌類や真菌類等の菌類の生死判別方法としては、検体から適当な手段によって採取した菌類を所定の菌数に調整し、寒天培地等を用いて１日乃至２日培養してコロニーの増殖を目視判定する方法や、発色酵素を混合した発色培地に採取した菌類を植菌した後、所定温度に保持されたインキュベータ等の培養器内で１日乃至２日培養し、β−ガラクトシターゼ酵素で発色酵素を分解発色させて判読する方法等がある。
また、菌類の生死を即時に判定する方法として、特開平９−２７５９９８号公報には、フルオレセイン若しくはその誘導体からなる蛍光染料とプロピデュームイオダイトとからなる蛍光染料を生理食塩水に混合し、さらに塩、キチネス若しくはセルラーゼからなる染色促進剤を混合した染色溶液中に、採取した菌類を混合し、加温して菌類細胞を染色し、目視で即時に判別する方法が開示されている。
また、特開平１０−２４８５９７号公報には、蛍光染料で染色された菌液を透明セルに注入し、一方向から所定波長で且つパルス間隔が少なくとも７５０μ秒以上のパルス光線を照射させ、このパルス光線の軸光と直交する一方側では生菌からの蛍光発光光線を透過するバンドパスフィルターを介してフォトダイオード検知管で検知し、他方側では死菌細胞からの蛍光発色光線を透過させるバンドパスフィルターを介してフォトダイオード検知管で検知した後、無菌の染色菌液の検知電圧と菌類の存在する染色菌液の検知電圧との差をコンピュータ処理して菌類の生菌・死菌を判別する方法及び装置が開示されている。
また、これらの方法を改良した方法として、蛍光染色菌液を化学的に安定した状態で生菌細胞及び死菌細胞内に浸透染色させた蛍光染料から、蛍光発光強度が強く、且つ鮮明な蛍光画像をフォトダイオードで検知させた後、電気的処理を行って菌種、菌数、生菌数及び死菌数を即座に高い精度で判別する方法が特開平１１−１７８５６８号公報に開示されている。
さらに、人をはじめとする多細胞生物の生死の判定は、死後硬直や直腸温度の測定や外観変化の観察などによって行われている。
しかしながら、検体から採取した菌類を所定の菌数に調整後、寒天培地で培養してコロニーの増殖を観察することによって菌類の生菌と死菌を判別する方法や発色酵素による発色法では、判定に１日乃至２日程度の日数が必要とされ、迅速な判定が必要となる食物等の細菌を検査する方法としては不適当であるという問題があった。
また、蛍光染料で菌細胞を染色して生菌細胞と死菌細胞とを判別する方法は、迅速に判別できる利点はあるものの、判定には専門的知識及び技術が必要とされ、簡便な判別法とは言えない。
さらに、人をはじめとする多細胞生物の死を死後硬直や直腸温度の測定や外観変化の観察で行う検死確認の方法を、細胞中の核酸の定量検査で確実に行う方法の確立が待たれている。
一方、細菌、例えば薬剤耐性菌若しくは毒素産生菌を同定するために細菌遺伝子を検査する場合には、採取した検体の細菌培養を行った後、細菌を検出し、該細菌から核酸の抽出と定量工程を経て核酸増幅法としてのＰＣＲを実施した後、電気泳動を行い、得られたゲルを試薬にて染色して遺伝子のバンドを観察するという方法が一般的に採用されている。この方法は、通常、検査に１乃至２週間の時間と労力を要し、また、熟練した高度専門技術を要するものであった。
このため、細菌培養を行うことなく細菌同定を可能とする手段として、ＰＣＲ法を応用して細菌遺伝子の検査を迅速且つ簡易に行う検査方法やキットが種々開示されている。
例えば、細菌同定を迅速に行う１つの方法として、特開平９−９４１００号公報には、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子に存在する特異な塩基配列を有するＤＮＡをプライマとし、被同定細菌から得た染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を適用し、用いたプライマの塩基配列を含む特定のＤＮＡが増幅されるか否かで細菌種の決定を行う方法が開示されている。
また、特開平６−１１３８９９号公報には、酪酸菌からゲノムＤＮＡを抽出し、ｒＲＮＡ遺伝子を特異なプライマを用いてＰＣＲ法により増幅させ、増幅したｒＤＮＡ断片の長さを電気泳動により解析、比較することによって酪酸菌の同定を行う方法が開示されている。
また、極めて少数の細胞・細菌でのｍＲＮＡの定量を行う方法として、特開平７−２３１９７号公報には、遺伝子のイントロンを含まない部分由来の検出対象のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、該ｃＤＮＡに対応する部分のゲノムＤＮＡと共に増幅させる方法が開示されている。
さらに、採取した検体から核酸を抽出することなく核酸増幅を行う際に増幅を困難にするＰＣＲ阻害物質の作用を抑制する方法として、ＰＣＲ反応液にポリアミンを添加する方法が特開平８−９９９７号公報に、界面活性剤を添加する方法が特開平１０−８０２７９号公報にそれぞれ開示されている。
しかしながら、上述した特開平９−９４１００号公報に開示された方法は、全ての細菌を検出できるプライマを設計したことに特徴があり、ＰＣＲ法を用いれば迅速に細菌の同定が可能であるため、取り立てて迅速な検査方法とは言えない。
また、上述した特開平６−１１３８９９号公報や特開平７−２３１９７号公報にに記載されている方法は、高度の熟練技術を必要とせず、また、少数の試料から同定する方法であるが、それらは特定の菌に関するものであり、種々の検体からＤＮＡ検出を利用して細菌同定や薬剤耐性菌同定を極めて短時間に行う方法を示したものではない。
また、検体から核酸抽出を行うことなくＰＣＲ法を応用して核酸増幅を行う際に、核酸増幅酵素反応を阻害する物質の作用を抑制する目的でＰＣＲ反応液にポリアミンや界面活性剤を添加する方法は、細胞・細菌の遺伝子を直接且つ迅速に検出する方法としては優れた方法ではあるが、ＰＣＲ終了後にリアルタイム定量ＰＣＲ法を用いる場合に、蛍光を物理光学的に阻害する物質が除去されていないため、測定に誤差が生じるという問題があった。
発明の開示
本発明は、上述の実情に鑑みて提案されるものであって、核酸定量を応用することにより菌類をはじめとする細胞の生死判別を行う生死判別方法並びに細胞及び／又は細菌の遺伝子を直接且つ迅速に効率よく増幅する核酸増幅方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出してその少なくとも一部を定量し、上記検体内における上記ＤＮＡ及びＲＮＡの量比を比較することによって生死を判別することを特徴とするものである。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出して増幅させ、増幅産物を定量して上記検体内における上記ＤＮＡ及びＲＮＡの量比を比較することによって生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記ＤＮＡ及びＲＮＡの増幅は、それぞれ定量ＰＣＲ法及び定量逆転写ＰＣＲ法によって行うことができる。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、
上記検体からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、上記ＤＮＡ及びＲＮＡをそれぞれリアルタイムＰＣＲ法、リアルタイム逆転写ＰＣＲ法で増幅し、得られた相対的ＤＮＡ量及び相対的ＲＮＡ量の比に基づいて生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記相対的ＤＮＡ量及び相対的ＲＮＡ量は、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量若しくは増幅ｃＤＮＡ量との関係から得られるサイクルスレッショード値に基づいて求めることができる。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体からＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡの不安定部分を増幅させ、増幅産物を定量することによって生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記増幅産物のゲル電気泳動によって、若しくはサイクルスレッショード値を比較することによって、又は２本鎖ＤＮＡの温度解離曲線の解離温度点或いは２本鎖ＤＮＡの高次構造に由来する温度解離曲線のパターンに基づいて生死を判別することができる。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体から時間差をおいて等量の複数のサンプルを抽出し、上記複数のサンプルからＤＮＡを抽出してリアルタイムＰＣＲ法で増幅させ、増幅されたＤＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記ＤＮＡ量は、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量との関係から得られるサイクルスレッショード値に基づいて求められる。また、上記複数のサンプルは、上記検体から異なる培養時間で抽出されたものであってもよい。また、この際、上記複数のサンプルからＤＮＡを抽出することなく、直接ＰＣＲバッファを用いてリアルタイムＰＣＲで上記ＤＮＡ若しくはＲＮＡを増幅させ、増幅されたＤＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別するようにしてもよい。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る生死判別方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、上記検体から時間差をおいて等量の複数のサンプルを抽出し、上記複数のサンプルからＲＮＡを抽出してリアルタイム逆転写ＰＣＲ法で増幅させ、増幅されたＲＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別することを特徴とするものである。
ここで、上記ＲＮＡ量は、ＰＣＲサイクル数と増幅ＲＮＡ量との関係から得られるサイクルスレッショード値に基づいて求められる。また、この際、上記複数のサンプルからＲＮＡを抽出することなく、直接ＰＣＲバッファを用いてリアルタイム逆転写ＰＣＲ法で上記ＲＮＡを増幅させ、増幅されたＲＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別するようにしてもよい。
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る核酸増幅方法は、検体となる細胞及び／又は細菌の核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、上記検体を破壊して核酸を露出させ、破壊産物を濾過して反応阻害物質を除去若しくは抑制し、核酸を増幅させることを特徴とするものである。
ここで、上記核酸の増幅は、ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法によって行うことができる。
本発明の更に他の目的、本発明によって得られる具体的な利点は、以下に説明される実施例の説明から一層明らかにされるであろう。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
第１の実験
第１の実験は、細胞が生きている限り一定量の特定のＤＮＡから一定量の特定のＲＮＡが合成される仕組みを利用して、検体から採取したＤＮＡ及びＲＮＡを増幅させ、増幅産物中のＤＮＡ及びＲＮＡを定量して該ＲＮＡと該ＤＮＡのモル数の比率（ＲＮＡ／ＤＮＡ）を測定することによって細胞の生死を判別するものである。
細胞内でタンパク質を合成する必要が生じると、ＤＮＡ上の必要な塩基配列がＲＮＡに写し取られる転写が生じ、その結果として伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成される。そして、該ｍＲＮＡは細胞核の外に出てリボソームへと移動し、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の助けを借りてタンパク質が作られる翻訳が生じる。
ここで、検体を採取して核酸の定量を行うと、ＤＮＡは比較的安定で壊れにくく、生細胞ではＲＮＡの分解及び生成が常に継続しているのに対して、死細胞ではＲＮＡが生成されず早期に分解されてしまうため、生細胞に対してＲＮＡ／ＤＮＡモル比が相対的に低下する。そこで、このＲＮＡ／ＤＮＡモル比を測定することによって、細胞の生死を判別することが可能となる。
なお、第１の実験で用いる核酸の増幅方法としては、ＤＮＡ断片を利用したＤＮＡクローニング法やＰＣＲ法など、あらゆる核酸増幅法が利用できる。しかし、ＤＮＡクローニング法は、増幅操作に手間がかかると言う欠点があり、また、ＰＣＲ法は、短時間に目的ＤＮＡを増幅できる利点があるが、該目的ＤＮＡが指数級数的に増幅されるため、わずかな増幅効率の違いによって増幅産物量が大きく影響され、定量的解析には問題がある。
そこで、以下では、核酸増幅法の一例として検体から抽出したＲＮＡの定量逆転写ＰＣＲ（定量ＲＴ−ＰＣＲ）とＤＮＡの定量ＰＣＲとを用いるものとするが、この定量ＰＣＲ法及び定量ＲＴ−ＰＣＲ法に限定されないことは勿論である。さらには、核酸増幅有無の制限を受けるものでもない。すなわち、細胞・細菌から抽出されたＤＮＡ量及びＲＮＡ量が多ければ、増幅することなく直接ＤＮＡ／ＲＮＡの量比から細胞・細菌の生死判別を行うことができる。
以下、第１の実験の具体的な実施例について説明するが、この実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例１
実施例１では、先ず定量ＲＴ−ＰＣＲ用のコンペティタを作製する。具体的には、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を操作手順に従って使用し、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡの一部をコードする第１の塩基配列（５‘−ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ−３’）及び第２の塩基配列（５‘−ＡＣＧＡＣＡＣＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＣ−３’）を利用してコンペティタ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を作製した。作製された該コンペティタは、定量して既知濃度コンペティタとした。
また、採取した検体にＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン株式会社製）を添加し、常法通りの操作手順に従って細菌由来のゲノムＤＮＡ及びｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
そして、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡについては、定量後、その２μｇに逆転写プライマとしてｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒを添加して逆転写反応を行った。反応終了後、逆転写産物の５μｌを使用し、第１のプライマ（５’−ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ−３’）及び第２のプライマ（５’−ＡＣＧＡＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣ−３’）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
この定量ＲＴ−ＰＣＲ反応は、６反応を行い、各反応に夫々０、１（＝１０−９）、２（＝１０−８）、３（＝１０−７）、４（＝１０−６）、５（＝１０−５）Ｍの既知濃度コンペティタを加えた。なお、該反応には、ＰＣＲ ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を操作手順に従って使用した。
反応の終了したＰＣＲ産物は、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、バンドの濃度差を濃度測定器等によって測定した。
そして、コンペティタ濃度をＸ軸、エチジウムブロマイド染色濃度をＹ軸とした検量曲線を作成し、該検量曲線にコンペティタ濃度０のサンプルのエチジウムブロマイド染色濃度を当てはめ、ｍＲＮＡのモル濃度を求めた。
一方、検体から抽出したゲノムＤＮＡについては、定量後、その２μｇを用いてＰＣＲ反応を行い、反応の終了したＰＣＲ産物の５μｌに上記第１のプライマ及び第２のプライマを用いて定量ＰＣＲ反応を実施した。
このようにＰＣＲを２段階で行うことによって、特異性を高めることが可能となるが、１段階目のＰＣＲについては、省略しても構わない。なお、１段階目のＰＣＲに用いられるプライマは、２段階目の定量ＰＣＲで用いられる第１のプライマ及び第２のプライマの外側に位置する。
定量ＰＣＲ反応は、６反応を行い、各反応に夫々０、１（＝１０−９）、２（＝１０−８）、３（＝１０−７）、４（＝１０−６）、５（＝１０−５）Ｍの濃度既知コンペティタを加えた。なお、該反応には、ＰＣＲ ｂｅａｄｓを操作手順に従って使用した。
反応の終了した定量ＰＣＲ産物は、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、バンドの濃度差を濃度測定器等によって測定した。
そして、コンペティタ濃度をＸ軸、エチジウムブロマイド染色濃度をＹ軸とした検量曲線を作成し、該検量曲線にコンペティタ濃度０のサンプルのエチジウムブロマイド染色濃度を当てはめ、ＤＮＡのモル濃度を求めた。
この定量ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＰＣＲにより、検体中の細菌由来１６ＳリボソームＲＮＡのｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡの各モル濃度が得られる。生菌では、ＲＮＡ／ＤＮＡ比が高値になり、死菌では逆に低値となるために、その結果から検体に生菌又は死菌が含まれているか否かの判定を行った。
実施例２
実施例２では、死亡したラットの肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺等の内蔵部位、筋肉、皮膚及び眼球を取り出し、実施例１と同様の条件で定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、経時的なＲＮＡの減少が観察された。
以上説明したように、第１の実験においては、検体から抽出したＤＮＡ及びＲＮＡを増幅させ、そのモル比を求めることによって、検体中の細胞の生死を正確且つ迅速に判別することが可能とされる。
ところで、この第１の実験は、細菌ゲノムＤＮＡの検出を基本原理とするものであるため、細菌が死菌であっても菌体にゲノムＤＮＡを保持している限り陽性、すなわち生菌と判定してしまう危険性を内在している。
そこで、以下に示す第２の実験及び第３の実験では、より正確に検体中の細胞・細菌の生死を判別する方法について説明する。
第２の実験
第２の実験では、検体から抽出されたＤＮＡ及びＲＮＡを、それぞれリアルタイムＰＣＲ法及びリアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて増幅させ、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量若しくは増幅ＲＮＡ量との関係から得られるＣｔ（サイクルスレッショード）値を比較することによって細胞・細菌の生死を判別する。
また、この第２の実験では、細胞・細菌から抽出されたゲノムＤＮＡが部位により不安定である性質を利用し、ＰＣＲ法などによって核酸増幅することによっても、細菌の生死を判別する。
すなわち、ＰＣＲ法は、ＤＮＡの特定の標的部位を増幅する技術であるが、ＰＣＲ標的部位に連続性のあることが必須条件となっている。したがって、この部位に不連続性がある場合や、ＤＮＡの不安定性から極端な立体構造の変化を呈した場合には、ＰＣＲは完遂されず標的部位も増幅されない。特に、細胞死という劇的な生体変化が菌体内に起こった際には、標的部位に変化が起きる確率が非常に高くなる。つまり、安定性の高い標的部位は、生菌、死菌共に増幅されるのに対して、不安定性の高い標的部位は、生菌では増幅されるが死菌では増幅されないことを利用して、細菌・細胞の生死を判定することもできる。
なお、ＤＮＡ不安定部位を利用した方法では、ＰＣＲ法を用いることが有用であるが、ＰＣＲ法に限定されるものでなく、あらゆる核酸増幅法が利用できる。さらには、核酸増幅有無の制限を受けるものでもない。細胞・細菌から抽出されたＤＮＡ量及びＲＮＡ量が多ければ、増幅することなく直接ＤＮＡ／ＲＮＡの量比から細胞・細菌の生死判別を行うことができる。
以下、第２の実験の具体的な実施例について説明するが、この実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例３
実施例３では、リアルタイムＰＣＲ法及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を利用して求めた相対的ＤＮＡ量と相対的ＲＮＡ量とを比較することによって細胞の生死を判別した。
ここで、リアルタイムＰＣＲ法は、２本鎖ＤＮＡに取り込まれ蛍光を発する蛍光発色物質を反応液中に存在させることにより、ＰＣＲのサイクル経過と共に増幅する２本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）を蛍光強度の増強として捉えてＰＣＲ産物の増加を知る方法である。
ＰＣＲ産物は、元の鋳型ＤＮＡが多ければ早期のＰＣＲサイクルで増加し、蛍光強度も増強される。したがって、一定の蛍光強度を予め定めておき、この強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数をＣｔ値とすると、鋳型ＤＮＡが多いか又はＰＣＲ効率の高い場合は、早期のＰＣＲサイクル数でこの蛍光強度に到達するためにＣｔ値が低くなり、鋳型ＤＮＡが少ないか又はＰＣＲ効率の低い場合は、相当のＰＣＲサイクル数でこの蛍光強度に到達するためにＣｔ値が高くなる。
そして、このＣｔ値を予め既知量ＤＮＡを用いて求めたＣｔ値と比較し、そのＣｔ値に対応するＤＮＡ量を相対的ＤＮＡ量とする。ＲＮＡについても同様である。
実施例３において、検体からの細菌由来のゲノムＤＮＡ及びｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、採取した検体にＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン株式会社製）を添加し、常法通りの操作で採取することによって行った。
また、リアルタイムＰＣＲ法による相対的ＤＮＡモル数の推定は、以下の表１に示すＰＣＲ反応液を準備して行った。
次に、上述した第１のプライマ（１０ｐモル／μｌ）及び第２のプライマ（１０ｐモル／μｌ）を各３μｌと、蛍光インターカレータである１×ＳｙＧｒｅｅｎ（サイバーグリーン）５μｌとを加え、合計５０μｌのＰＣＲ反応試薬とした後、ポルテックスで攪拌してＰＣＲ反応試薬とした。
上記ＰＣＲ反応試薬中に、抽出した細菌ＤＮＡ２μｇを添加し、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールでＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を使用してＰＣＲを４０サイクル行った。そして、ＰＣＲ増幅曲線のプラトー値とベースライン値との中点、或いはＰＣＲ増殖曲線の直線部分の中点における蛍光強度を定め、この蛍光強度に達するサイクル数をＣｔ値とした。このＣｔ値を予め作製した既知量ＤＮＡ−Ｃｔ値の検量曲線に当てはめ、相対的ＤＮＡ量を算定した。
一方、抽出したＲＮＡについては、定量後、その２μｇを逆転写反応に使用した。なお、反応は、Ｙｏｕ−ｐｒｉｍｅ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用して行った。また、逆転写プライマは、ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒを使用した。
そして、このＰＣＲ反応試薬中に、反応の終了した逆転写産物５μｌを添加し、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールでＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を使用してＰＣＲを４０サイクル行った。そして、上述と同様に、Ｃｔを求め、これを予め作製した検量曲線に当てはめて相対的ＲＮＡ量を算定した。
ここで、大腸菌を使用してリアルタイムＰＣＲ及びリアルタイム逆転写ＰＣＲを行い、そのＣｔ値から算定した相対的ＤＮＡ量及び相対的ＲＮＡ量の結果を以下の表２に示す。
実施例４
実施例４では、細菌ＤＮＡの安定部分及び不安定部分をＰＣＲで増幅させ、増幅産物をゲル電気泳動することによって細菌の生死を判別した。先ず、以下の表３に示す処方のＰＣＲ反応液を用意した。
ＤＮＡ安定部分検出用プライマとしては、上述の第１のプライマ及び第２のプライマを使用し、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマとしては、第３のプライマ（５’−ＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＹ−３’）及び第４のプライマ（５’−ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ−３’）を使用した。
ＰＣＲは、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで３０サイクル行った。そして、ＰＣＲ終了後のＰＣＲ産物は、その１０μｌを定法に従い１％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分間電気泳動し、エチジウムブロマイドでＰＣＲ産物を染色後、紫外線照射によってバンドを確認した。
ここで、ＤＮＡ安定部分検出用プライマでは、生菌、死菌共にＰＣＲで増幅されるためにＰＣＲ産物が確認されるが、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマでは、生菌のＰＣＲ産物のみ確認され、死菌のＰＣＲ産物は確認されないか極端に低い増幅が確認される。
生菌、死菌の混合割合の異なる８群について検討した結果を図１に示す。なお、各群における生菌と死菌との比率は、以下の表４の通りであり、図１中、アルファベットは、表４の検体群に対応する。死菌は、１２１℃のオートクレーブで２０分間熱処理することによって作製した。
実施例５
実施例５では、実施例４と同様にＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン株式会社製）を用いて検体から細菌由来のＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法によって生菌と死菌の判別を行った。
ここで、実施例５において、リアルタイムＰＣＲは、以下の表５に示す処方のＰＣＲ反応液を用いて行った。
ＤＮＡ安定部分検出用プライマとしては、実施例３で使用した第１のプライマ及び第２のプライマを使用し、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマとしては、実施例４で使用した第３のプライマ及び第４のプライマを使用した。
ＰＣＲは、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで４０サイクル行った。また、リアルタイムＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を使用して行った。
ここで、ＤＮＡ安定部分検出用プライマでは、生菌、死菌共にＰＣＲで増幅されるためにＰＣＲ産物を確認することができるのに対して、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマでは、生菌のＰＣＲ産物のみ確認され、死菌のＰＣＲ産物は確認されないか極端に低い増幅が確認される。
つまり、ＤＮＡ安定部分検出用プライマでのＰＣＲ産物では、生菌、死菌共にほぼ一定のＣｔ値を示すが、ＤＮＡ不安定部分検出用プライマでのそれは、死菌のＣｔ値が生菌に比べて高い値となるか又はＰＣＲ反応が起こらないので、生菌と死菌とを判別することが可能となる。
実施例４と同様の８群からなる試料を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた結果を以下の表６に示す。
実施例６
実施例６では、紫外線照射、次亜塩素酸ソーダ、強酸、強アルカリで処理してＤＮＡがランダムに破壊される環境下に置いた試料について実施例５と同様の試験を行った。この結果、Ｃｔ値は全て高い値を示した。これは、このような環境下ではＤＮＡ安定部分も破壊されて死菌となるためと推測された。
実施例７
実施例７では、２本鎖ＤＮＡの温度解離変化を検出するＴｍ値或いはＴｍパターンを利用して、細胞・細菌の生死判別を行った。
先ず、ＡＧＰＣ法（酸性グアニジン・フェノール・クロロフォルム法）などの定法に従い、検体から細菌・細菌由来のＤＮＡを抽出して、以下の表７に示す処方の反応液にてリアルタイムＰＣＲを行った。
プライマは、実施例４で使用した第３のプライマ及び第４のプライマを使用し、リアルタイム定量ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を使用して９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで４０サイクル行った
ＰＣＲ終了後、６５℃から９５℃までの温度における２本鎖ＤＮＡのＴｍ値或いはＴｍパターンを測定して変化を調べた。
大腸菌死菌１００％と大腸菌生菌１００％との場合について、各１０回測定したＴｍ値を以下の表８に示す。なお、死菌は、１２１℃のオートクレーブで２０分間処理して作製した。
また、このＴｍ値やＤＮＡの高次構造に由来するＴｍパターンは、各菌種に特異なものであり、菌種毎に生菌、死菌の解析を行っておくことによって、容易に菌種毎の生死判別が可能となる。
以上説明したように、第２の実験においては、検体から抽出したＤＮＡ及びＲＮＡを増幅後、定量して両者の量比、Ｃｔ値又はＴｍ値或いはＴｍパターンに基づいて、検体中の細胞の生死を正確且つ迅速に判別することが可能とされる。
第３の実験
第３の実験では、時間差をおいて検体からＤＮＡ及びＲＮＡを複数回抽出し、夫々リアルタイムＰＣＲ法及びリアルタイム逆転写ＰＣＲ法で増幅させ、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量若しくは増幅ＲＮＡ量との関係から得られるＣｔ値を比較することによって細胞の生死を判別する。
つまり、時間経過後にＤＮＡ量若しくはＲＮＡ量の増加を認めれば生細胞・生菌であり、ＤＮＡ量若しくはＲＮＡ量に変化を認めなければ死細胞・死菌であると推定される。
また、この判定にリアルタイムＰＣＲ法等を用いた場合、Ｃｔ値が時間経過後に小さくなる場合（ＤＮＡ量若しくはＲＮＡ量の増加を意味する。）は、生細胞・生菌であり、ＣＴ値が時間経過後に変化しない場合は、死細胞・死菌であると推定することができる。特に、リアルタイムＰＣＲ法等を用いた核酸定量法では、プラトーに達する前のＣｔ値を判定基準として用いることができるため、微少なＤＮＡ量若しくはＲＮＡ量の変化をも捉えることができ、検体採取間の時間差が短時間であっても生菌・死菌の判別が可能である。
なお、検体採取間の時間差をさらに短時間とするため、細胞・細菌に最適条件、例えば温度・湿度・酸素濃度・培地供給などを供することが有効である。
また、短時間での微少なＤＮＡ若しくはＲＮＡの変化を捉えるためには、検体から核酸抽出を行わず、検体を直接リアルタイムＰＣＲ法に供することがより有効である。例えば、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（島津製作所製）に代表される直接ＰＣＲバッファなどの併用が可能である。これにより、迅速性、効率性が改善され、条件によっては６０分前後で細胞・細菌の生死判別が可能となる。
以下、第３の実験の具体的な実施例について説明するが、この実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例８
実施例８では、リアルタイムＰＣＲ法を利用し、時間差をおいて検体を複数回採取し、ＤＮＡ量を比較することによって細胞の生死を判別した。
ここで、検体は、生理食塩水中に１０８／ｍｌの濃度で大腸菌を混入させたものを用いた。また、比較のため生菌、死菌（オートクレーブ滅菌）の両者について、同時に同条件で操作を行った。
リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡ量の比較は、以下の表９に示すＰＣＲ反応液を準備して行った。
また、リアルタイムＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオ社製）を用いて測定を行った。プライマは、上述の第１のプライマ及び第２のプライマを使用した。
ＰＣＲは、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで４０サイクル行い、Ｃｔ値を予め作製した検量曲線に当てはめて、評価ＤＮＡ量を算定した。
そして、以下の表１０に示す検体を用いて生菌・死菌の判別を行った。菌の濃度は、何れも１０８／ｍｌであり、菌種は大腸菌を用いた。また、培地はＬＢ培地を用い、培養条件は３７℃加温、１００ｒｐｍ／ｍｉｎ振蕩で行った。
なお、検体あるいは標的細胞・細菌によっては、培地の添加が不要な場合、又は加温や振蕩が不要な場合もある。また、本実施例では１８０分の時間差が有用であったが、これも対象により一定ではない。
以上説明したように、第３の実験においては、検体を適当な条件下におき、時間差をおいて検体を複数回採取し、検体中のＤＮＡ若しくはＲＮＡを定量してその変化を比較することによって、細胞・細菌の生死判定を正確かつ迅速に行うことができる。
ところで、上述した第１の実験乃至第３の実験では、検体となる細胞及び／又は細菌の核酸を増幅させることが不可欠であり、この核酸増幅を効率よく迅速に行うことによって、検体の生死をより正確且つ迅速に判別することが可能となる。
そこで、以下の第４の実験では、細胞及び／又は細菌の核酸を直接且つ迅速に効率よく増幅させる核酸増幅方法について説明する。
第４の実験
第４の実験では、採取した細胞・細菌の核酸が露出されるように検体を破壊し、該破壊産物を濾過して核酸増幅酵素反応阻害物質及び物理光学的反応阻害物質を除去若しくは制御し、得られた核酸増幅反応液を用いて核酸増幅することによって検体の細菌遺伝子を検出する。
ここで、検体から細胞・細菌の核酸を露出させるための破壊方法としては、熱処理、浸透圧処理、超音波処理若しくは電気的処理等の物理的処理方法や、界面活性剤処理、酵素処理若しくはウイルス感染溶菌処理等の化学的処理方法があり、検査する細胞・細菌に有効且つ強力な方法を用いることができる。
また、破壊産物から核酸増幅酵素反応阻害物質及び物理光学的反応阻害物質を濾過して取り除く方法としては、カラム若しくはフイルタを用いる方法や磁気吸着する方法などがあり、何れの方法を用いてもよい。
破壊産物が通過する濾過層には、イオン性不純物を吸着する性質のあるポリアミンを添加することにより、核酸増幅反応液の純度を向上させ、ＰＣＲ法等の核酸増幅酵素反応を円滑にすることができる。
ここで、ポリアミンとは、分子の主鎖に−ＮＨ−基を持つオリゴマ又はポリマ、多価アミンのことであり、濾過層に添加されて使用されるポリアミンは、検体の種類によって最適のものを利用することができる。
破壊され、反応阻害物質を取り除いて濾取された検体試料を増幅する方法としては、ＰＣＲ法及びこれを応用したリアルタイム定量ＰＣＲ法が利用できるが、これらに限定されるものではない。
以下、第４の実験の具体的な実施例について説明するが、この実施例に限定されるものではないことは勿論である。
実施例９
実施例９では、図２に示す核酸増幅装置を用いて、細菌の遺伝子検出を行った。図２に示すように、核酸増幅装置は、破壊チャンバ１と、濾過チャンバ２と、濾過層３と、ＰＣＲ反応チャンバ４と、ＰＣＲ反応液溜５とにより構成される。なお、図２は、核酸増幅装置の概念構成を示したものであり、各チャンバの形状、構成がこの例に限定されるものでないことは、勿論である。
先ず、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）と３％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０とをＴｒｉｓＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液に溶解した後、ｐＨを８．０に調整して細胞溶解液を作製した。
この細胞溶解液５０μｌと検体１０μｌ（大腸菌１０５個／１０μｌ Ｍｉｌｋ）とを混合して破壊チャンバ１に入れ、室温で２分間静置後、７０００Ｇで１０分間遠心分離して沈殿を除去し、上清をｐＨ８．０に調整した。
そして、上清は、濾過チャンバ２を通過してＰＣＲ反応チャンバ４に落とされた。ここで、濾過チャンバ２は、濾過層３を有し、この濾過層３は、デキストランを担体とする粉体のイオン交換体であるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）が含浸された孔径０．２２μｍのニトロセルロース製の膜が３重に重ねられた濾材からなる。
ＰＣＲ反応チャンバ４には、以下の表１２に示す処方のＰＣＲ反応液が充填されており、濾過された濾液と混和されてＰＣＲ反応が行われた。ＰＣＲサイクルは、９８℃／１秒、５５℃／１０秒、７２℃／１０秒のプロトコールで３０サイクル行った。ここで、プライマとしては、上述の第１のプライマ及び第２のプライマを使用した。
なお、高感度、高速ＰＣＲを行うためのＤＮＡポリメラーゼとしては、ＴＡＫＡＲＡ ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）が、また細菌からＤＮＡを抽出することなくＰＣＲを可能とするＰＣＲ緩衝液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（株式会社島津製作所製）が適しているが、それらに限定されるものではない。
コントロールとして大腸菌を含まない例（サンプルＡ）、通常のＰＣＲ法による例（サンプルＢ，Ｃ）、及び本発明のＰＣＲ法による例（サンプルＤ，Ｅ）の電気泳動写真を図３に示す。また、サンプル処方と図３の電気泳動写真で確認された結果を以下の表１３に示す。
また、上述した細胞溶解液を添加して破壊チャンバ１にて細胞・細菌の細胞壁、細胞膜及び核膜等を破壊して核酸を露出させた後、ＰＣＲ反応を行ったサンプルＥの場合には、細菌遺伝子の検出が確認されたが、細胞溶解液を添加していないサンプルＤでは細菌遺伝子は検出されなかった。
このように、細胞溶解とフィルタ濾過を組み合わせることによって、効率よく細菌遺伝子を検出することができた。
以上説明したように、第４の実験においては、破壊チャンバにて検体の核酸を露出させ、濾過チャンバにて反応阻害物質を除去することによって、効率よく検体の核酸を増幅させ、遺伝子を検出することができる。
さらに、この第４の実験では、検体由来の物理光学的反応阻害物が濾過チャンバで除去されているため、ＰＣＲ反応液にサイバーグリーンなどの蛍光インターカレータを含有させ、リアルタイム定量ＰＣＲ法と組み合わせて細菌の検出を行う場合にも、正確且つ確実に検出することができる。
例えばＰＣＲ法によって核酸を増幅させる場合、薬剤耐性遺伝子プライマを設計することにより、その検体に最適な抗生物質の推定が可能となり、また、毒素産生遺伝子検出用プライマを設計することにより、Ｏ１５７のような毒素産生菌についても、検出した菌を培地で培養することなく、迅速に検出することができる。また、目的に応じたプライマを用いることにより、ペストなど、診察した経験が無く病院外来で診断がつかない疾病についても的確に診断を下すことができる。
また、ＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基配列を、塩基配列決定法又はＤＮＡチップを用いて検査することによって、検出された細菌の詳細な種類を正確且つ迅速に同定することができる。
なお、本発明は、上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、種々の変更が可能であることはいうまでもない。
産業上の利用可能性
上述したような本発明を用いることにより、細胞及び／又は細菌の生死を正確に且つ迅速に判別することが可能となり、例えば、食品に含まれる細菌の生死を始め、抗生物質等で治療中の効果判定に用いることができる。また、ヒト等の多細胞生物の生細胞、死細胞の判定を容易に行うこともできる。
また、上述したような本発明を用いることにより、細胞及び／又は細菌の核酸を直接且つ迅速に効率よく増幅させ、遺伝子を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、生菌、死菌の混合割合の異なる検体Ａ乃至検体Ｈについて、ＤＮＡ安定部分及びＤＮＡ不安定部分の増幅後における電気泳動パターンを説明する図である。
図２は、破壊チャンバ、濾過チャンバ、ＰＣＲ反応チャンバ、ＰＣＲ反応液溜からなる本発明の説明に供する核酸増幅装置の概念構成を説明する図である。
図３は、ＰＣＲ反応後のＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動した電気泳動パターンを説明する図である。
Claims (15)
- 検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、
上記検体からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出してその少なくとも一部を定量し、上記検体内における上記ＤＮＡ及びＲＮＡの量比を比較することによって生死を判別すること
を特徴とする生死判別方法。 - 検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、
上記検体からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出して増幅させ、増幅産物を定量して上記検体内における上記ＤＮＡ及びＲＮＡの量比を比較することによって生死を判別すること
を特徴とする生死判別方法。 - 上記ＤＮＡ及びＲＮＡの増幅は、それぞれ定量ＰＣＲ法及び定量逆転写ＰＣＲ法によって行うことを特徴とする請求の範囲第２項記載の生死判別方法。
- 検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、
上記検体からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、上記ＤＮＡ及びＲＮＡをそれぞれリアルタイムＰＣＲ法、リアルタイム逆転写ＰＣＲ法で増幅し、得られた相対的ＤＮＡ量及び相対的ＲＮＡ量の比に基づいて生死を判別すること
を特徴とする生死判別方法。 - 上記相対的ＤＮＡ量及び相対的ＲＮＡ量は、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量若しくは増幅ＲＮＡ量との関係から得られるサイクルスレッショード値に基づいて求められることを特徴とする請求の範囲第４項記載の生死判別方法。
- 検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、
上記検体からＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡの不安定部分を増幅させ、増幅産物を定量することによって生死を判別すること
を特徴とする生死判別方法。 - 上記増幅産物のゲル電気泳動によって、若しくはサイクルスレッショード値を比較することによって、又は２本鎖ＤＮＡの温度解離曲線の解離温度点或いは２本鎖ＤＮＡの高次構造に由来する温度解離曲線のパターンに基づいて生死を判別することを特徴とする請求の範囲第６項記載の生死判別方法。
- 検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、
上記検体から時間差をおいて等量の複数のサンプルを抽出し、
上記複数のサンプルからＤＮＡを抽出してリアルタイムＰＣＲ法で増幅させ、
増幅されたＤＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別すること
を特徴とする生死判別方法。 - 上記ＤＮＡ量は、ＰＣＲサイクル数と増幅ＤＮＡ量との関係から得られるサイクルスレッショード値に基づいて求められることを特徴とする請求の範囲第８項記載の生死判別方法。
- 上記複数のサンプルは、上記検体から異なる培養時間で抽出されたものであることを特徴とする請求の範囲第８項記載の生死判別方法。
- 検体となる細胞及び／又は細菌の生死を判別する生死判別方法であって、
上記検体から時間差をおいて等量の複数のサンプルを抽出し、
上記複数のサンプルからＲＮＡを抽出してリアルタイム逆転写ＰＣＲ法で増幅させ、
増幅されたＲＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別すること
を特徴とする生死判別方法。 - 上記ＲＮＡ量は、ＰＣＲサイクル数と増幅ＲＮＡ量との関係から得られるサイクルスレッショード値に基づいて求められることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の生死判別方法。
- 上記検体から時間差をおいて等量の複数のサンプルを抽出し、
上記複数のサンプルからＤＮＡ若しくはＲＮＡを抽出することなく、直接ＰＣＲバッファを用いてリアルタイムＰＣＲ法若しくはリアルタイム逆転写ＰＣＲ法で上記ＤＮＡ若しくはＲＮＡを増幅させ、
増幅されたＤＮＡ量若しくはＲＮＡ量を上記複数のサンプル間で比較することによって生死を判別すること
を特徴とする請求の範囲第８項乃至第１３項のいずれか１項記載の生死判別方法。 - 検体となる細胞及び／又は細菌の核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、
上記検体を破壊して核酸を露出させ、破壊産物を濾過して反応阻害物質を除去若しくは抑制し、核酸を増幅させることを特徴とする核酸増幅方法。 - 上記核酸の増幅は、ＰＣＲ法又はリアルタイムＰＣＲ法によって行うことを特徴とする請求の範囲第１４項記載の核酸増幅方法。
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