ES2893198T3 - Un método de cuantificación de la capacidad de cultivo celular bacteriano individuales usando parámetros independientes del cultivo - Google Patents
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Abstract
Un método de cuantificación de la capacidad de cultivo de células microbianas individuales usando parámetros independientes del cultivo, que comprende las siguientes etapas de (i) poner en contacto una muestra que comprende células microbianas con un colorante fluorescente que se una al ácido nucleico para teñir los ácidos nucleicos celulares en dichas células microbianas; (ii) someter las células marcadas a un método de formación de imágenes por microscopía de fluorescencia y determinar, en base a la tinción del ácido nucleico, para una pluralidad de células individuales al menos un primer parámetro que refleja el contenido de ácido nucleico de dicha célula y un segundo parámetro que refleja el grado de estiramiento de dicha célula; en el que la determinación de dicho al menos primer y segundo parámetro comprende el análisis de una imagen por microscopía de fluorescencia en bruto usando un algoritmo para establecer el umbral para obtener una imagen de filtro binaria, y hacer una superposición de la imagen de filtro binaria y en bruto para determinar el valor de gris promedio, la desviación estándar y el área de la superficie de células individuales, y en el que el contenido de ácido nucleico se calcula sobre la base de la siguiente ecuación: **(Ver fórmula)** (iii) clasificar en base a dicho al menos primer y segundo parámetro dicha célula en una de las siguientes categorías: (A) Células viables cultivables con un valor de contenido de ácido nucleico entre >=0.1 y 1.0 y un grado de estiramiento del valor de las células entre >=1.0 y 10 mm2, (B) Células viables no cultivables con un valor de contenido de ácido nucleico de >=-0.2 y un grado de estiramiento del valor de las células de >=0.5 mm2 menos las células viables cultivables (A), (C) Lo más probable células muertas con un contenido de ácido nucleico de <1.0 y un grado de estiramiento del valor de las células de <0.5 mm2; y (iv) calcular la proporción de la cantidad de (A) células viables cultivables, (B) células viables no cultivables y (C) lo más probable células muertas en una muestra microbiana.
Description
DESCRIPCIÓN
Un método de cuantificación de la capacidad de cultivo celular bacteriano individuales usando parámetros independientes del cultivo
La invención se refiere al campo de la microbiología y la detección de microorganismos. Más en particular, se refiere a un método para el análisis cuantitativo del estado metabólico de células microbianas individuales en una muestra líquida.
En la actualidad, los laboratorios de microbiología estándar necesitan métodos de recuento de células bacterianas viables, fiables, rápidos y de bajo coste. La contaminación bacteriana, en cualquier forma y en cualquier matriz, se controla por diversas razones. Con frecuencia, los laboratorios de microbiología hacen uso de análisis bacterianos clásicos de cuantificación por el método clásico de cultivo microbiológico ("el estándar de oro"). Este método tiene actualmente más de 100 años y es capaz de detectar solo la fracción cultivable de microorganismos. Este método está probado en el tiempo y tiene un bajo coste. Sin embargo, los principales inconvenientes de este método incluyen el tiempo hasta el resultado (mínimo 2 días) y el hecho de que no se detectan ni las células muertas ni las células viables no cultivables.
El recuento de células bacterianas suena trivial, pero no todas las células bacterianas pueden formar colonias visibles en placas de medio sólido. Incluso dentro de cultivos puros, se sabe que la tasa de formación de colonias no es uniforme y que varias células pueden formar solo micro colonias (comportamiento de crecimiento "autolimitado") y, por lo tanto, los recuentos de células bacterianas no se pueden detectar convenientemente a simple vista (Breeuwer and Abee, 2000; Zengler, 2009).
Las células bacterianas, que no crecen en placas de medio sólido estándar, a menudo se designan como viables pero no cultivables (VBNC) (Oliver, 2005). La variación de los componentes (por ejemplo, 22 componentes, 2 concentraciones diferentes) usados para crear un medio sólido con el fin de proporcionar una base de crecimiento apropiada para todas las células requeriría aproximadamente 1015 composiciones de medio; lo cual simplemente no es factible (Williams et al., 1998; Zengler, 2009).
Por lo tanto, se inventaron diferentes técnicas de tinción para diferenciar las células bacterianas vivas de las células bacterianas muertas. Un ejemplo es el kit de tinción LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen) (Boulos et al., 1999). El kit consta de dos tinciones, yoduro de propidio (PI) y SYTO9, que son agentes intercalantes que permiten diferenciar entre bacterias con membranas citoplasmáticas dañadas y membranas intactas. El PI solo puede ingresar a las células bacterianas con membranas citoplásmicas dañadas (bacterias teñidas de rojo) y SYTO9 ingresa a todas las células bacterianas (bacterias teñidas de verde). Es muy probable que las células bacterianas teñidas de rojo ya no sean cultivables (no viables/muertas), mientras que las células verdes son probablemente células bacterianas cultivables (viables). En la práctica, puede existir un estado fisiológico intermedio. Esto conduce a dificultades en la interpretación de los datos (por ejemplo, eficacia de la desinfección o antibióticos) (Berney et al., 2007).
Los parámetros bien conocidos de la viabilidad bacteriana son la integridad de la pared celular, elongación celular, la formación de ARN ribosómico, la intensidad de fluorescencia de la tinción específica de ADN, la actividad enzimática y los lípidos de la membrana polar intactos (Breeuwer and Abee, 2000; Flemming, 2013; Hammes et al., 2011). El kit de tinción LIVE/DEAD BacLight se basa únicamente en la integridad de la pared celular.
En resumen, las pruebas de enumeración microbiana actuales están dominadas por el cultivo microbiano. El cultivo microbiano tiene las importantes ventajas de ser simple, ultrasensible, económico y cuantitativo, pero tiene el inconveniente significativo de ser lento (por ejemplo, tiempo de incubación de más de 24 horas). El largo tiempo necesario para obtener resultados tiene importantes costes en la asistencia sanitaria (por ejemplo, tratamiento innecesario con antibióticos) y en la fabricación (por ejemplo, devolución de bebidas o alimentos). Se han desarrollado métodos más rápidos que pueden dar resultados en 4 u 8 horas (por ejemplo, Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), antígeno-anticuerpo y otros biomarcadores), pero mientras mejoran el tiempo de obtención de resultados, han sacrificado dos de las ventajas más críticas de los cultivos microbianos. El primer sacrificio fue la posibilidad de seleccionar las células bacterianas cultivables y el segundo sacrificio es la sensibilidad.
Reconociendo la necesidad de una prueba que sea más rápida que el cultivo microbiano tradicional pero que conserve los beneficios clave del método tradicional, por lo tanto los presentes inventores se propusieron desarrollar un método verdaderamente rápido (por ejemplo, tiempo para obtener el resultado de menos de 4 horas) para detectar microorganismos, método que también proporciona información fiable, en particular sobre el estado metabólico de las células bacterianas de la muestra.
Estos objetivos se cumplieron mediante la provisión de un método que se basa en un nuevo principio que comprende una combinación única de diferentes etapas. El método se caracteriza, entre otros, por el uso de dos parámetros independientes del cultivo (contenido de ácido nucleico por célula y un grado de estiramiento de la célula) como medio para estimar el número de células viables cultivables, células viables no cultivables y lo más probable células muertas en una población microbiana.
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
En una realización, la invención proporciona un método para el análisis cuantitativo de células microbianas (viables) en una muestra líquida, que comprende las etapas de
(i) poner en contacto la muestra con un colorante fluorescente que se una al ácido nucleico para teñir los ácidos nucleicos celulares en dichas células microbianas;
(ii) someter las células marcadas a un método de formación de imágenes por microscopía de fluorescencia y determinar, en base a la tinción del ácido nucleico, para una pluralidad de células individuales al menos un primer parámetro que refleja el contenido de ácido nucleico de dicha célula y un segundo parámetro que refleja el grado de estiramiento de dicha célula;
(iii) clasificar en base a dicho al menos primer y segundo parámetro dicha célula en una de las siguientes categorías: (A) Células viables cultivables con un valor de contenido de ácido nucleico entre >0.1 y <1.0 y un grado de estiramiento del valor de las células entre >1.0 y 10 |im2,
(B) Células viables no cultivables con un valor de contenido de ácido nucleico de >-0.2 y un grado de estiramiento del valor de las células de >0.5 |im2, menos las células viables cultivables en (A), y
(C) Lo más probable células muertas con un contenido de ácido nucleico de <1.0 y un grado de estiramiento del valor de las células de <0.5 |im2.
(iv) calcular la proporción de la cantidad de (A) células viables cultivables, (B) células viables no cultivables y (C) lo más probable células muertas en una muestra microbiana.
De esta manera, la invención proporciona un método para la cuantificación (autónoma) de la capacidad de cultivo celular bacteriano individuales usando parámetros independientes del cultivo. Un método proporcionado en este documento es aplicable a cualquier muestra que pueda contener células microbianas. Por ejemplo, la muestra se selecciona del grupo que consta de muestras de agua, muestras clínicas, bebidas, productos lácteos y medios de cultivo líquidos. En una realización preferida, la muestra se selecciona del grupo que consiste en: muestra respiratoria, urogenital, del tracto reproductivo, sistema nervioso central, orina, sangre, dérmica, plasma, suero, saliva, tejido de la herida, exudado de la herida, biopsia, heces, tracto reproductivo y muestras de tejido sólido y derivados de las mismas. La muestra se aísla por lo general de un sujeto mamífero, preferiblemente un sujeto humano. Sin embargo, también se abarca la aplicación veterinaria del método proporcionado en este documento. De hecho, como apreciará un experto en la técnica, el principio descrito en la presente invención es aplicable para medir la vitalidad de todas las especies microbianas conocidas en las siguientes matrices: todos los tipos de agua de proceso, agua potable, agua superficial, agua subterránea, agua de lastre, líquidos veterinarios y médicos, medios microbiológicos líquidos, todas las bebidas y todos los productos lácteos.
Las células microbianas pueden comprender células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, células parasitarias o cualquier combinación de las mismas.
En la etapa (i) del método, la muestra se pone en contacto con un colorante fluorescente que se una al ácido nucleico para teñir los ácidos nucleicos celulares (ADN, ARN, ARNm) y determinar el contenido de ácido nucleico de dichas células microbianas. Esta etapa comprende la fijación y deshidratación de las células microbianas. Los colorantes fluorescentes y los protocolos asociados para teñir el ácido nucleico celular son conocidos en la técnica. Por ejemplo, comprende teñir células con un agente intercalante tal como yoduro de propidio (PI), SYBR Green I, YO-PRO-1, TOTO-3, o TO-PRO-3, preferiblemente PI.
En un aspecto específico, un método de la invención comprende un protocolo que difiere ligeramente de la aplicación normal de usar un agente intercalante, como yoduro de propidio, a saber, fijación de células microbianas usando formaldehído o paraformaldehído; deshidratación de células con alcohol al 96 %; adición de un agente intercalante (por ejemplo, disuelto en miliQ) y lavado del agente intercalante libre para aumentar la proporción señal/ruido.
La etapa (ii) comprende someter las células marcadas a un método de formación de imágenes por microscopía de fluorescencia y determinar, en base a la tinción del ácido nucleico, para una pluralidad de células individuales al menos un primer parámetro que refleja los contenidos de ácido nucleico de dicha célula y un segundo parámetro que refleja el grado de estiramiento de dicha célula. En una realización específica, la etapa (ii) comprende someter las células a un procedimiento de citometría de filtro (por ejemplo, citometría de fase sólida (SPC)) para teñir, escanear, detectar y contar células microbianas marcadas con fluorescencia en el área de la superficie de un filtro de membrana. Un sistema óptico preferido usa lentes, cámara y una fuente de luz (ultravioleta) para visualizar células microbianas, tales como un microscopio de fluorescencia, o una plataforma de bioanálisis operativa autónoma como AquaScope® (BioTrack BV, Sneek, Países Bajos). El AquaScope® se puede aplicar en el monitoreo biológico rápido de microorganismos específicos tanto en el laboratorio como en un sitio de prueba remoto de su elección. Combina el principio de fiabilidad y prueba de tiempo de la citometría de filtro con la velocidad del análisis. El AquaScope® es capaz de medir números de (a) microorganismos específicos en muestras líquidas que van desde 1 ml hasta 500 ml,
con una etapa adicional de preconcentración, cuando sea apropiado. Se pueden alcanzar volúmenes de muestra de 2 litros. Puede funcionar de forma autónoma mientras está en línea, en procedimiento o en el laboratorio.
Se prefiere que, antes de someter las células marcadas a un método de formación de imágenes por microscopía de fluorescencia, se calibre la parte óptica de una unidad de microscopía de fluorescencia. La calibración se debe realizar mediante los dos siguientes procedimientos.
El primer procedimiento de calibración es el revestimiento óptico de la unidad óptica fluorescente usando una vara de medición a microescala, el área de superficie de una célula microbiana se puede cuantificar (|im2). Este parámetro se puede usar como indicador del grado de estiramiento de la célula.
En una realización específica, determinar dicho al menos primer y segundo parámetro comprende el análisis de una imagen por microscopía de fluorescencia en bruto usando un algoritmo para establecer el umbral para obtener una imagen de filtro binaria, y hacer una superposición de la imagen de filtro binaria y en bruto para determinar el valor de gris promedio, desviación estándar y área de superficie de células microbianas individuales.
Por lo general, comprende adquirir imágenes bajo iluminación ultravioleta, usando una unidad microscópica de fluorescencia montada con un dispositivo de carga acoplada (es decir, una cámara "digital"). Luego, las fotos resultantes se analizan mediante un software que filtra automáticamente el ruido, binariza la imagen en escala de grises y cuantifica la intensidad de la luz por objeto. La adquisición de datos selectiva asegura que los datos cumplan con ciertos criterios. En particular, asegurándose de que el valor de gris promedio no debe exceder de 254 y no debe ser menor que el fondo promedio de la imagen sin procesar. Además, se hace una estimación de la superficie de la imagen real, ya que este valor depende del aumento óptico. Por ejemplo, con el aumento del AquaScope (200 x), todos los objetos de “ 0.7 ± 0.2 |im2 se consideran "ruido".
En una realización preferida, un método de la invención usa un algoritmo para establecer el umbral según el documento WO2010/040371, que describe cómo se puede crear e interpretar una imagen binaria. Además de estos algoritmos, cabe mencionar que, en base a la imagen binaria, se proyecta preferentemente una superposición sobre la imagen en escala de grises. Esta superposición se usa para medir i) el valor de gris promedio, ii) la desviación estándar de la intensidad y iii) el área por célula microbiana seleccionada.
Preferiblemente, una vez que se mide el valor de gris promedio, la desviación estándar y el área de superficie por célula microbiana, el contenido de ácido nucleico se puede calcular sobre la base de la siguiente ecuación 1;
log (desviación estándar por célula microbiana)
contenido de ácido nucleico = -------------------------------------------------------------------------------------------------------log (valor de gris promedio por célula microbiana)
El segundo procedimiento de calibración consiste en establecer el tiempo de exposición óptimo mediante la denominada "titulación de luz". Se tiñeron seis cultivos diferentes, se tomaron imágenes (una titulación de luz que consistía en la adquisición de imágenes digitales en tiempos de exposición varió desde 10 -100 ms con etapas de 10 ms, desde 100 - 1000 ms con etapas de 100 y desde 1000 - 5000 ms con etapas de 1000 ms.) y procesamiento (establecer el umbral y medir la imagen superpuesta) usando el parámetro del contenido de ácido nucleico (cada célula microbiana se calcula con la ecuación 1). Se comparó cada tiempo de exposición (prueba de chi-cuadrado con alfa 0.05) con otros tiempos de exposición dentro del mismo cultivo.
Para evaluar el tiempo de exposición óptimo, cada tiempo de exposición de cada cultivo bacteriano diferente obtiene un número según la similitud. Cuanto mayor sea el número, más cultivos se muestrearon en este tiempo de exposición (por ejemplo, 10 ms en comparación con 10 ms da un 6 porque cada muestra tiene un conjunto de datos similar de 10 ms frente a 10 ms). Cinco o más cultivos dentro de un conjunto de tiempo de exposición indican que estos tiempos de exposición son similares para al menos el 80 % de los datos (véase la figura 1). Cuanto mayor sea el área con los números 5 o 6, más probable es que se alcance el tiempo de exposición óptimo.
La etapa (iii) de un método de la invención comprende clasificar, en base a al menos el primer y segundo parámetro, una célula en una de las siguientes categorías: (A) células viables cultivables, (B) células viables no cultivables y (C) probablemente células muertas en una población microbiana.
Preferiblemente, una vez que se mide el valor de gris promedio, la desviación estándar y el área de superficie por célula microbiana, el contenido de ácido nucleico se puede calcular sobre la base de la ecuación 1, en combinación con los valores para el grado de estiramiento de la célula en base al área de la superficie, los límites de punto de corte que se determinan después de repetidos experimentos. Estos se correlacionan posteriormente con los resultados del cultivo para determinar en qué categoría se debe clasificar la célula.
Lím ites de punto de corte:
(A) Células viables cultivables con un valor de contenido de ácido nucleico entre >=0.1 y <1.0 y un grado de estiramiento del valor de las células entre >=1.0 y 10 |im2.
(B) Células viables no cultivables con un valor de contenido de ácido nucleico de >-0.2 y un grado de estiramiento del valor de las células de >=0.5 |im2 menos células viables cultivables (A).
(C) Lo más probable células muertas con un contenido de ácido nucleico de <1.0 y un grado de estiramiento del valor de las células de <0.5 |im2.
(D) El número total de células microbianas es la suma de (A), (B) y (C).
En una realización preferida, la etapa (iii) comprende representar para cada célula dicho primer parámetro frente a dicho segundo parámetro para obtener distintas poblaciones de células. Véase, por ejemplo, la figura 2. La figura 3 apoya los límites de punto de corte de las células microbianas viables cultivables.
En base a la clasificación del contenido de ácido nucleico en la etapa (iii), en la etapa (iv) calcular la proporción de la cantidad de (A) células viables cultivables, (B) células viables no cultivables y (C) lo más probable células muertas en una muestra microbiana.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Se tiñeron seis cultivos diferentes, se tomaron imágenes (una titulación de luz que consistía en la adquisición de imágenes digitales en tiempos de exposición varió desde 10 - 100 ms con etapas de 10 ms, desde 100 -1000 ms con etapas de 100 y desde 1000 - 5000 ms con etapas de 1000 ms.) y procesamiento (establecer el umbral y medir la imagen superpuesta) usando el parámetro del contenido de ácido nucleico (cada célula microbiana se calcula con la ecuación 1). Se comparó cada tiempo de exposición (prueba de chi-cuadrado con alfa 0.05) con otros tiempos de exposición dentro del mismo cultivo. Los números aparecen entre 1 y 6. Cuanto mayor es el número, más cultivos se muestrearon en este tiempo de exposición (por ejemplo, 10 ms en comparación con 10 ms da un 6 porque cada muestra tiene un conjunto de datos similar de 10 ms contra 10 ms). Cinco o más cultivos dentro de un conjunto de tiempo de exposición indican que estos tiempos de exposición son similares para al menos el 80 % de los datos. El intervalo de tiempo de exposición óptimo para este sistema óptico y el factor de aumento está entre 800 y 1000 ms.
Figura 2: Diferencias entre cultivos de células bacterianas jóvenes y viejos. El gráfico A muestra un cultivo joven y el gráfico B un cultivo viejo, ambos fueron procesados por los protocolos detectando células bacterianas dañadas (cuadrados) y detectando células bacterianas totales (rombos). La línea horizontal en los gráficos ofrece el umbral para el grado de estiramiento de la célula. La línea vertical en los gráficos ofrece el umbral para el valor del contenido de ácido nucleico. Las imágenes (Fig. 2A' y Fig. 2B') son ejemplos de las intensidades capturadas por la cámara (factor de aumento de 200 veces y un tiempo de exposición de 510 ms). A' es un cultivo joven y B' es un cultivo viejo.
Figura 3: Comparación de la fracción cultivable por la proporción de "estándar de oro"/cámara de recuento de Bürker Turk (BT) y el método propuesto por el número total de células (TCN) con un agente intercalante y las células microbianas viables cultivables (células viables cultivables con un valor de contenido de ácido nucleico entre >=0.1 y <1.0 y un grado de estiramiento del valor de célula entre >=1.0 y 10 |im2. El eje Y muestra la población total de bacterias en porcentajes.
Sección experimental
Materiales y métodos
Cultivos
Para todos los experimentos se usó Escherichia coli (DSMZ 301). Para evaluar las diferencias entre cultivos de células bacterianas viejas y frescas, se inició el cultivo de bacterias a partir de un cultivo almacenado en Cryo-bank en 5 mL de TSB (Oxoid, CM0129) durante 30 min a temperatura ambiente (20 °C). Posteriormente, se subcultivaron 50 |iL en 5 mL de TSB y se incubaron durante 7-9 horas a 37 °C. Para las mediciones de cultivos de células bacterianas frescas, se usaron inmediatamente los cultivos. Para crear un cultivo celular bacteriano antiguas, el cultivo se almacenó a 5 °C, durante al menos 1 año.
Para comparar la fracción cultivable usando las técnicas de cultivo estándar y el método propuesto, se realizó el cultivo de bacterias a partir del cultivo de Cryo-bank en 5 mL de TSB (Oxoid, CM0129) durante 20 horas a 37 °C. Se subcultivaron 100 |iL de este cultivo en 5 mL de TSB durante 20 horas a 37 °C.
Técnicas de cultivo estándar
Comparación de las fracciones cultivables de E. coli
Para adquirir una fracción cultivable, las muestras se incubaron en Plate Count Agar (PCA) (Oxoid, CM0325). Se preparó una serie de diluciones de 10 veces y se vertió 1 ml de cada dilución (por duplicado) en una placa de Petri y
se agregaron 20 mL de PCA (enfriado a 42-45 °C) y se agitó bien. Las placas se incubaron durante 2 días a 37 °C. Después de la incubación, las placas se contaron manualmente. Solo se contaron las placas que contenían más de 30 y menos de 300 bacterias.
Detección de células bacterianas dañadas
Para detectar bacterias con paredes celulares dañadas, se mezclaron bien cultivo celular bacteriano al 10 %, solución de cloruro de sodio al 70 % (NaCl al 0.9 % (p/v) (v/v) y solución de tinción al 20 % (yoduro de propidio 0.03 mg/mL (Fluka, Sigma-Aldrich ecno.2470810) disuelto en agua Milli-Q) y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Posteriormente, la mezcla se centrifugó en una centrífuga de mesa durante 5 min a 6000 rpm. Después de la centrifugación, la suspensión se reemplazó por una solución de cloruro de sodio (NaCl al 0.9 % (p/v)) (v/v) y se mezcló suavemente. Se colocaron 10 |iL de la solución bacteriana teñida en vidrio (portaobjetos de diagnóstico, 8 pocillos/6 mm) y se secaron al aire durante 30 min. Cada mancha se cubrió con 5 |iL de medio de montaje (Invitrogen, I7224 componente H) para evitar la degradación del fluorocromo durante el período de almacenamiento (una semana a varias semanas, en la oscuridad a temperatura ambiente).
Detección del número total de células bacterianas:
Para el recuento total de células, se mezclaron bien cultivo celular bacteriano al 10 %, formaldehído al 10 % (37 % v/v) y solución de cloruro de sodio al 80 % (NaCl al 0.9 % (p/v)) (v/v) y se incubaron, durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla se centrifugó en una centrífuga de mesa durante 5 min a 6000 rpm. Después de la centrifugación, se reemplazó el sobrenadante usando una solución de cloruro de sodio y el vial se mezcló bien. Se colocaron 10 |iL de la solución bacteriana en portaobjetos de diagnóstico y se secaron al aire durante 30 min. Se realizó la deshidratación (etanol al 96 % (v/v)) para asegurar la eliminación total del agua y permitir el transporte fácil del colorante de tinción a las células bacterianas. Se agregó la solución de tinción de yoduro de propidio (0.03 mg/mL) y las muestras se incubaron durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con agua Milli-Q durante 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Los portaobjetos se secaron al aire en la oscuridad y cada mancha se cubrió con 5 |iL de medio de montaje para evitar la descomposición del fluorocromo durante el período de almacenamiento (una semana a varias semanas, en la oscuridad a temperatura ambiente).
Figura 1 diseño experimental:
Procesamiento de datos:
Se usó un enfoque de integración de variables biológicas significativas para obtener una imagen binarizada (Tamminga et al., 2016). Este enfoque usa el cambio de umbral y el recuento de ruido y objetos de interés (OOI) para determinar un valor de punto de corte cuando el recuento de OOI fue mayor que el recuento del ruido. En este punto se determinó el umbral. El software usado fue ImageJ versión 1.47m (Abramoff et al., 2004). Antes de obtener una imagen binaria, el valor mínimo se estableció en 0 (por ejemplo, si el valor mínimo en la imagen era 20, entonces se restaron 20 de todos los valores de gris de la imagen). Después de eso, se aplicó un método de resta de fondo (Sternberg, 1983) (este método puede manejar valores cero). Los objetos que eran demasiado pequeños para representar una bacteria (varilla más pequeña calculada (Palumbo et al., 1984) en píxeles menos 1 píxel, los cálculos se basaron en calibraciones por sistema óptico usando un bastón de medición a microescala) o tenían una intensidad menor que la media del fondo de la imagen no se contaron. Luego de obtener una imagen binarizada se realizó una retroalimentación a la imagen original para medir diferentes parámetros tales como el valor de gris promedio, la desviación estándar y la superficie de la célula bacteriana así como el fondo promedio de la imagen correspondiente.
Clarificación de los parámetros:
Se usaron los tres parámetros "valor de gris promedio", "desviación estándar" y "superficie de la célula bacteriana" para la determinación de la capacidad de cultivo de cada célula individual. El contenido de ácido nucleico se define como el coeficiente de variación modificado (CV), que es la proporción entre el logaritmo de la desviación estándar y el logaritmo del valor de gris promedio de la célula bacteriana (ecuación 1). Los parámetros "valor de gris promedio" y "desviación estándar" son independientes según el análisis del componente principal (el coeficiente de determinación de PCA1 y PCA2 es 0.75). El área de una célula bacteriana proporciona información sobre el grado de estiramiento de la célula. Los parámetros "grado de estiramiento de la célula" y "contenido de ácido nucleico" son también independientes según el análisis de componentes principales (el coeficiente de determinación de PCA1 y PCA2 es 0.98). Por lo tanto, estos parámetros se pueden graficar entre sí.
Evaluación de los tiempos de exposición:
Para evaluar el efecto del tiempo de exposición sobre el parámetro del contenido de ácido nucleico, se usaron 6 cultivos bacterianos diferentes y se recogió 1 muestra de cada cultivo individual. Las muestras se procesaron de acuerdo con la detección del número total de células bacterianas. Después de la tinción, cada muestra se fotografió en 4 ubicaciones diferentes en los portaobjetos microscópicos en diferentes tiempos de exposición y un factor de aumento de 200x. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio Olympus (BH2) con una lámpara de mercurio
Olympus (BH2-RFL-T3) y una cámara Lumineria LM135. Luego, el tiempo de exposición se varió desde 10 -100 ms con etapas de 10 ms, desde 100 - 1000 ms con etapas de 100 y desde 1000 - 5000 ms con etapas de 1000.
Interpretación de datos:
Se probó un parámetro: contenido de ácido nucleico, este es la proporción entre el logaritmo de la desviación estándar y el logaritmo del valor de gris promedio de la célula bacteriana (ecuación 1).
En este experimento, el parámetro del contenido de ácido nucleico se segmentó como sigue: -0.4 -1.1 con etapas de 0.15. Después de la segmentación, los valores por segmentación se expresaron como porcentajes. Para evaluar los datos se aplicó una prueba de chi-cuadrado con alfa 0.05 ya que los datos no tenían una distribución normal según la prueba de Kolmogorov-Smirnov (a = 0.05).
Cálculo del efecto del tiempo de exposición
Cada muestra individual produce 23 conjuntos de datos diferentes. Estos 23 conjuntos de datos tuvieron un mayor tiempo de exposición (véase arriba) entre 10 ms y 5000 ms. Para evaluar un conjunto de datos con los otros 22 conjuntos de datos de la muestra idéntica para encontrar similitudes, se aplicó una prueba de chi-cuadrado con alfa 0.05 ya que los datos no tenían una distribución normal (según la prueba de Kolmogorov-Smirnov (a = 0.05)).
Figura 2 diseño experimental:
El procesamiento de datos y la clarificación de los parámetros se describen anteriormente.
Diferencias entre cultivos de células bacterianas viejos y frescos
Se procesaron ambos cultivos de E. coli (viejos (almacenados a 5 °C, durante al menos 1 año) y frescos (incubación de 7-9 horas)) usando el protocolo de tinción para detectar células bacterianas dañadas y células bacterianas totales. Se representó gráficamente el grado de estiramiento de la célula de cada célula bacteriana individual frente al contenido de ácido nucleico de dicha célula bacteriana. Los conjuntos de datos que detectan células bacterianas dañadas y células bacterianas totales se representaron en un gráfico. Esto se hizo para investigar dónde se muestran las células bacterianas dañadas en comparación con la población total de bacterias teñidas. Se hizo el mismo gráfico para un cultivo viejo.
Interpretación de datos:
La figura 2 presenta una distinción entre cultivos de células bacterianas jóvenes (Figura 2A y A') y viejos (Figura 2B y B'). Además, la figura 2 ilustra la distinción entre dos protocolos de tinción diferentes, a saber, las células bacterianas dañadas (cuadrados) y el número total de células bacterianas (rombos). Estos dos protocolos de tinción se probaron en los mismos cultivos de células bacterianas jóvenes y viejos.
El protocolo usado para la tinción del número total de células bacterianas (cuadrados) está diseñado de tal forma que todas las bacterias estén permeabilizadas (tratamiento con formaldehído al 3.7 % y alcohol al 96 %). Por lo tanto, no se puede hacer ninguna discriminación entre células dañadas o muertas y células viables. El protocolo que se usa para detectar células dañadas/muertas es solo para teñir las células dañadas/muertas (rombos) (sin tratamiento con ningún producto químico).
En la figura 2A es notable una diferencia entre el número total de células bacterianas y células bacterianas dañadas/muertas. Con estos dos resultados podemos identificar dónde se presentan las células bacterianas dañadas/muertas y las células bacterianas viables dentro de un cultivo bacteriano joven.
En la figura 2B (cultivo bacteriano viejo) es notable una diferencia menor entre el número total de células bacterianas y células bacterianas dañadas/muertas. Dentro de un cultivo celular bacteriano viejo hay más células bacterianas dañadas/muertas y, por lo tanto, se tiñe una fracción mayor según el protocolo de tinción de células bacterianas dañadas. Para el protocolo de tinción, el número total de células bacterianas se tiñe y se coloca la misma fracción dentro de la figura 2B. Lo más probable es que estas células bacterianas en comparación con los resultados de la figura 2A sean células bacterianas dañadas/muertas.
Las diferencias entre el cultivo celular bacteriano viejos y jóvenes no solo son visibles en los diagramas (Figura 2A y 2B), sino también en las imágenes del protocolo para teñir el número total de células bacterianas. (Figura 2A' cultivo joven, Figura 2B' cultivo viejo). El brillo de fluorescencia de las células bacterianas es más oscuro dentro del cultivo celular bacteriano viejo en comparación con las células bacterianas del cultivo joven.
Además, se puede aplicar un valor umbral para distinguir la fracción viable y cultivable de la fracción no viable (dañada/muerta). El cultivo fresco (Figura 2A) que se tiñe con el protocolo de detección de células bacterianas totales (Figura 2A, rombos) tiene un gran grupo de bacterias proyectadas entre un contenido de ácido nucleico de 0.1 y 1.0 con un grado de estiramiento de la célula entre 1.0 y 10 |im2. En comparación, el protocolo que detecta células
bacterianas dañadas (Figura 2A, cuadrados) muestra un grupo de bacterias proyectadas con un bajo contenido de ácido nucleico de <0.1 con un grado de estiramiento del valor de las células de <1.0 |im2
La confirmación de este grupo de bajo contenido de ácido nucleico es visible en la figura 2B - el cultivo viejo. Al centrarse solo en las células bacterianas totales teñidas (Figura 2B, rombos), es visible un gran grupo de células bacterianas con un bajo contenido de ácido nucleico (<0.1). El protocolo que detecta células bacterianas dañadas (Figura 2B, cuadrados) muestra una superposición considerable con el grupo de bajo contenido de ácido nucleico (<0.1).
A continuación de estos resultados, se sugiere que es aplicable un valor umbral para distinguir la fracción viable y cultivable de la fracción no viable/muerta. En este caso específico, las células microbianas viables cultivables tienen un contenido de ácido nucleico entre 0.1 y 1.0 con una extensión de estiramiento de la célula entre 1.0 y 10 |im2.
Figura 3 diseño experimental:
El procesamiento de datos y la clarificación de los parámetros se describen anteriormente.
Comparación de la fracción cultivable usando la técnica de cultivo estándar y el método propuesto
Se recogieron nueve muestras de un cultivo de E. coli. Estos se procesaron usando una cámara de recuento Bürker Turk y el método de agar de recuento en placa. La fracción cultivable se calculó como sigue: recuentos de células generados por el método de agar de recuento en placa dividido por recuentos de la cámara de recuento de Bürker Turk. Se contaron las mismas nueve muestras usando el protocolo de tinción para células bacterianas totales y los datos se procesaron como se describe anteriormente. El punto de corte se estableció para células microbianas viables cultivables con un contenido de ácido nucleico entre 0.1 y 1.0 con una extensión de estiramiento de la célula entre 1.0 y 10 |im2. La fracción cultivable se calculó de la siguiente manera: el recuento cultivable se dividió por el recuento total.
La figura 3 presenta dos diagramas de caja que ilustran el porcentaje de la fracción cultivable. El diagrama de caja de la izquierda se calcula a partir de los análisis de la técnica de cultivo estándar (Bürker Türk y agar de recuento en placa). El diagrama de caja de la derecha se calcula a partir del método propuesto. Ambos conjuntos de datos (n = 9) tenían una distribución normal según la prueba de Kolmogorov-Smirnov (a = 0.05). Por lo tanto, se realizó una prueba T de dos muestras pareadas de dos colas (a = 0.05). La fracción cultivable calculada a partir de las técnicas de cultivo estándar es estadísticamente igual al método propuesto (p > 0.05).
Referencias
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Claims (11)
1. Un método de cuantificación de la capacidad de cultivo de células microbianas individuales usando parámetros independientes del cultivo, que comprende las siguientes etapas de
(i) poner en contacto una muestra que comprende células microbianas con un colorante fluorescente que se una al ácido nucleico para teñir los ácidos nucleicos celulares en dichas células microbianas;
(ii) someter las células marcadas a un método de formación de imágenes por microscopía de fluorescencia y determinar, en base a la tinción del ácido nucleico, para una pluralidad de células individuales al menos un primer parámetro que refleja el contenido de ácido nucleico de dicha célula y un segundo parámetro que refleja el grado de estiramiento de dicha célula; en el que la determinación de dicho al menos primer y segundo parámetro comprende el análisis de una imagen por microscopía de fluorescencia en bruto usando un algoritmo para establecer el umbral para obtener una imagen de filtro binaria, y hacer una superposición de la imagen de filtro binaria y en bruto para determinar el valor de gris promedio, la desviación estándar y el área de la superficie de células individuales, y en el que el contenido de ácido nucleico se calcula sobre la base de la siguiente ecuación:
log (desviación estándar por célula microbiana) contenido de ácido nucleico - -------------------------------------------------------------------------------------------------------log (valor de gris promedio por célula microbiana) (iii) clasificar en base a dicho al menos primer y segundo parámetro dicha célula en una de las siguientes categorías: (A) Células viables cultivables con un valor de contenido de ácido nucleico entre >0.1 y 1.0 y un grado de estiramiento del valor de las células entre >1.0 y 10 |im2,
(B) Células viables no cultivables con un valor de contenido de ácido nucleico de >-0.2 y un grado de estiramiento del valor de las células de >0.5 |im2 menos las células viables cultivables (A),
(C) Lo más probable células muertas con un contenido de ácido nucleico de <1.0 y un grado de estiramiento del valor de las células de <0.5 |im2; y
(iv) calcular la proporción de la cantidad de (A) células viables cultivables, (B) células viables no cultivables y (C) lo más probable células muertas en una muestra microbiana.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en muestras de agua, muestras clínicas, bebidas, productos lácteos, medios de cultivo líquidos.
3. Método según la reivindicación 2, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en muestra respiratoria, muestra urogenital, muestra del tracto reproductivo, muestra del sistema nervioso central, orina, sangre, dérmica, plasma, suero, saliva, tejido de la herida, exudado de la herida, biopsia, heces, cultivos microbianos líquidos y muestras de tejido sólido.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que las células microbianas comprenden células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, células parasitarias o cualquier combinación de las mismas.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (i) comprende la fijación y deshidratación de células microbianas.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (i) comprende teñir las células con un agente intercalante tal como yoduro de propidio (PI), naranja de acridina, SYBR Green I, YO-PRO-1, TOTO-3, o TO-PRO-3.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (ii) comprende someter las células a un procedimiento de citometría de filtro (por ejemplo, citometría en fase sólida (SPC)) para teñir, escanear, detectar, y contar células microbianas marcadas con fluorescencia en el área de la superficie de un filtro de membrana.
8. Método según la reivindicación 7, en el que dicho procedimiento de citometría de filtro comprende las etapas de: a) aplicar un volumen predeterminado de la muestra en un filtro;
b) formar imágenes de las etiquetas unidas en la superficie del filtro, y;
c) analizar la imagen del filtro para la cuantificación de las células microbianas en el filtro, en el que la etapa de análisis comprende determinar el umbral óptimo para separar las células del fondo en la imagen del filtro.
9. Método según la reivindicación 8, en el que la determinación del umbral óptimo en la etapa c) comprende:
i. establecer el umbral de la imagen de filtro usando un intervalo de umbrales;
ii. determinar las proporciones de objetos seleccionados y no seleccionados para el intervalo de imágenes de umbral, en el que se selecciona un objeto con un tamaño mayor que un umbral inferior predeterminado, y;
iii. designar un umbral del intervalo de umbrales que resulta en la proporción más alta como el umbral óptimo.
10. Método según la reivindicación 7 u 8, en el que al menos las etapas (a) y (b) se ejecutan en ubicaciones separadas en un dispositivo para citometría de filtro automático, en el que el filtro se mueve automáticamente entre dichas ubicaciones y en el que dichas etapas se pueden ejecutar simultáneamente en al menos dos filtros separados.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (iii) comprende representar para cada célula dicho primer parámetro frente a dicho segundo parámetro para obtener distintas poblaciones de células.
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