JP2000500011A

JP2000500011A - 微生物培養物の生育能力の評価方法

Info

Publication number: JP2000500011A
Application number: JP9518244A
Authority: JP
Inventors: ケイ．ハーマン，エリザベス; エム．ラザーフォード，ウィリアム
Original assignee: パイオニアハイ−ブレッドインターナショナル，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-11-08
Filing date: 1996-11-05
Publication date: 2000-01-11
Also published as: HUP9902028A2; EP0876505A1; CA2236687A1; AU7603096A; WO1997017463A1; US5939282A

Abstract

(57)【要約】本発明は、所定の微生物培養物における、生細胞、死細胞およびストレスのかかった細胞の割合を迅速に決定する方法を提供する。ストレスのかかった細胞の測定値は、集団の相対的健康状態および集団の長期ストレスに耐える能力の定量的指標として使用される。本発明は、（ｉ）培養物を膜透過性および膜不透過性染料の組み合わせを用いて染色する工程；および（ｉｉ）このようにして得られた測定値を集団の相対的健康状態の指標として使用して、ストレスのかかった細胞の集団を定量する工程とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】微生物培養物の生育能力の評価方法発明の分野本発明は微生物培養物の生育能力および生存力を予測する方法に関する。具体的には、本発明は代表的なストレスに曝される集団における細菌細胞の生育能力を予測する方法に関する。発明の背景細菌培養物は、飼草接種物（forage inoculants）、共生物質（probiotics）、および発酵食品のような製品における包含用に広く製造される。培養物は、代表的には発酵によって調製される；培養物は大容積の富化ブロスにおいて、振盪フラスコ、固体または連続発酵によって増殖される。一旦所望の細胞集団が達成されると、細胞は生成発酵槽から収集され、そして低温保存および／または凍結乾燥によって保存される。例えば、Manual of Industrial Microbiology and Bi otechnology，ASM，Washington，D.C.，Demain，A.L.，Solomon，N.A．（編）(1 986)を参照のこと。保存後、培養物は販売用の製品に混合され、保管され得る。発酵から販売用の製品の調製に至る各工程において、細胞は絶えず変化する環境に曝され、これは様々なタイプのストレスおよび損傷を導く。代表的なストレスは、pH変動、必須栄養素の涸渇、および代謝副産物の蓄積を含む。増殖後の細胞の濃縮および凍結はさらなるストレスとなり得る。凍結はしばしばコールドショック（cold shock）を引き起こし、細胞内の氷の形成をもたらす。凍結乾燥は、代表的には水の昇華によって行われる。凍結乾燥された培養物は、販売用の製品に包含されるまで、乾燥した防湿パッケージング中で冷蔵保管されるかまたは凍結される。培養物が販売用の処方物において使用される場合、細胞は機械的な損傷および長期保管によってさらに傷つけられる。発酵から販売用の製品への包含に至るまでに細菌培養物にかかるストレスは、細胞の死および損傷をもたらす。生育可能な細胞の上述のストレスによる損失は、最終消費者に対する活性製品（active product）の損失を生じる。生育能力の低下により、製品は所望の効力を有し得ないか、または保証された仕様を満たし得ない；従って、代表的には、適切な能力を保証するためにさらなる培養物が販売用の製品に包含される。製品を調製するために使用される培養物がストレスのかかった細胞および損傷した細胞を含む場合、製品は長期保管のさらなるストレスに耐える安定性を欠き得る。従って、製品の効力は経時的に低下し得る。培養物の生育能力の低下は、製品の回収、またはラベルの仕様を満たすための強化のために、製造業者にさらなる費用を生じる。ストレスのかかった培養物を有する細菌製品の製造を防止するために、販売用の完成品への包含の前に、生育能力および生命力について培養物をスクリーニングする必要がある。微生物を検出する通常の方法は、FDA Bacteriologlcal Anal ytical Method，Washington，D.C.：AOAC，(1984)に記載されるような従来のプレート菌数方法（plate count method）による。この方法によると、生育可能な微生物細胞は、増殖に必須のすべての栄養素を含む固体の培地上にプレートされ、そして接種された培地は増殖に有利な条件の下でインキュベートされる。細胞は培地上で増殖し、元の細胞のクローン化された世代を含む可視コロニーを形成する。Microbial Ecology: Principles，Methods and Applications，Levin，M. A.，Seidler，R.J.，Rogul，M．(編)，McGraw Hill，Inc.，New York，(1992)を参照のこと。生きている細胞、無損傷の細胞、あるいは標準的な微生物培地上での回復が可能な細胞のみの評価に限定されるこの方法は、代表的には数日間のインキュベーションを要する。製品包含についての培養物の適性を決定する現行の慣習は、長期貯蔵寿命安定性調査によって実行される。この方法は、１２ヶ月までの期間、異なる環境条件の下で培養物を保管することを必要とする。培養物の生育能力計数（culture vi ability count）は、前述した従来のプレート菌数方法により、保管期間中に確認される。この標準手順は、安定性テストのために長時間の期間を要し、この間、死ぬ可能性の最も高い細胞の集団の予測は可能ではない。損傷した細胞は、標準寒天培地上で回復可能でない場合、生育可能な集団には含まれない。前述に基づき、培養物中の生細胞、死細胞、および／またはストレスのかかった細胞の迅速な決定を可能にする、細菌細胞の生育能力を予測するアッセイ方法を提供する必要性が存在する。細胞の集団の相対的健康状態を迅速に評価するさらなる必要性が存在する。従って、本発明の目的は、培養物中の生細胞、死細胞、またはストレスのかかった細胞の割合を迅速に決定する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、細胞の所定の集団の相対的健康状態の迅速な定量的指標を提供することである。本発明のさらなる目的は、所定の培養物の長期安定性を予測する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、所定の培養物の仕様を最小限の費用で満たす手段を提供することである。本発明のこれらおよびその他の目的は、以下の説明から容易に明らかになる。発明の要旨本発明は、蛍光染色および蛍光測定の組み合わせを使用することによって、培養物中の生細胞、死細胞、およびストレスのかかった細胞の割合を迅速に決定する方法を提供する。集団におけるストレスのかかった細胞の測定は、その集団の相対的健康状態の定量的指標である。ストレスのかかった細胞の割合はまた、生育可能な数の減少率に関連する。なぜなら、これらの細胞がときとして、生きているまたは生育可能なプレート菌数として記録されるが、製品への包含または保管のさらなるストレスに耐え得ないからである。本方法の使用は、この集団を検出し、そして培養物の長期安定性の相対的な測定を与える。発明の詳細な説明本明細書中で使用される「生細胞」は、広い範囲の栄養素組成物および環境条件によって増殖および分裂する可能性を有する細胞を意味する。本明細書中で使用される「ストレスのかかった細胞」は、狭い範囲の栄養素組成物および環境条件下で増殖および分裂する能力を有し得る細胞を意味する。本明細書中で使用される「死細胞」とは、増殖および分裂し得ない細胞を意味する。本明細書中で使用される「ストレス」は、細胞の生命力を損なう任意の状況を意味する。ストレスは、ph変化、栄養素の排除、化学的損傷、凍結乾燥、機械的損傷、長期保管、温度変動および相対湿度変化を含むが、これらに限定されない。本明細書中で使用される「膜透過性」は、選択膜の反対側への非特異的移動が可能であることを意味する。本明細書中で使用される「膜不透過性」は、選択膜の反対側への移動が不可能であることを意味する。本発明によると、異なる細胞の集団（生細胞、死細胞、またはストレスのかかった集団）のレベルが決定するために培養物は自然な状態で評価され、さらなるストレスに耐えるそれらの能力が見積もられる。細胞にさらなる制御されたストレスをかけ、製品の形成および長期保管中の悪条件に対するそれらの耐性を評価することもまた望ましくあり得る。蛍光測定器に結合された蛍光プローブの組み合わせを使用は、販売用の製品への包含の前の発酵、保存、および保管中の培養物の生育能力評価を可能にする。これにより、最適な長期安定性および効力が提供するための最も少ない数のストレスのかかった細胞を有する細胞培養物の選択が可能になる。本発明において有用な染料は、第１の色の生細胞染色用の膜透過性染料、および第２の色の死細胞染色用の膜不透過性染料を含む。細胞にストレスがかかっている場合は、数多くの中間色を生じる。この数多くの色は第１の色および第２の色の両方を区別可能である。好ましい実施形態において、細菌培養物を標識するために使用される市販の染料は、生細胞染色用の緑色蛍光膜透過性核酸染料、および死細胞染色用の赤色蛍光膜不透過性染料からなる。有用な染料は、フルオレセインジアセテート、カルボキシフルオレセインジアセテート（「CFDA」）、フルオレセインイソチオシアネート、ケムクロムＹ（ch エステル、ヘキスト33342、ローダミン123、3,3’ジヘキシルオキサカルボシアニンイオダイド、Calcofluorホワイト、プロピジウムイオダイド、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（「DAPI」）、エチジウムブロミド、3,6-ビス［ジメチルアミノ］アクリジニウムクロライド（アクリジンオレンジ）、およびシアジ、エチジウムブロミド、カルボキシフルオレセインジアセテート、フルオレセインジアセテート、プロピジウムイオダイド、およびシアニン色素を含む。より膜透過性染料はすべての細胞を染色することができる一方、膜不透過性染料は膜を損なった細胞にのみ侵入し得ない。好ましい実施形態においては、生細胞は緑色として、死細胞は赤色として観察される。損傷した細胞は、損傷の程度に依存して、変化する割合で両方の染料の取り込みを可能にし、従って黄色から橙色に変化する光を発する。正確な色は、細胞膜を透過する赤色および緑色の染料の相対的な量に依存する。この相対比は、細胞の生理条件に対応する。多くの染料および色素が、新鮮な培養物または凍結乾燥された培養物のいずれかにおけるストレスのかかった細胞を検出するという用途にとって有用である。色素の特定のセットの使用の唯一の要件は、色素が細胞の生理状態に依存して、細胞に対して差別的に透過性であるということである。染色混合物の正確な組成および使用される色素の比は、化合物に大きく依存する。当業者は、適切な色素の組み合わせおよび割合を容易に決定し得る。本明細書中で使用される「蛍光」は、より短い波長の光によって励起されたとき、化合物によって発する光を意味する。本明細書中で使用される「蛍光測定」は、フローサイトメトリ、蛍光顕微鏡検査、蛍光分光学、蛍光ダイオードアレイ検出、およびマルチウェル蛍光プレート読み取りを含むが、これらに限定されない。フローサイトメトリは特に好ましい蛍光測定である。フローサイトメトリは、個別の細胞の、光または電子センサを通過して流体の流れの中に移動する際の物理的あるいは化学的特性の測定のために、顕微鏡検査および生化学的分析の長所を組み合わせる。Muirhead，K.A.，Horan，P.K.およびPoste，G．“Flow Cytome try: Present and Future”；Biotechnol.,第３巻，337-356(1985)を参照のこと。細胞は、細胞の機能または特性に特異な蛍光プローブで染色される。これらの細胞がレーザビームを通過すると、蛍光がレーザビームに垂直な角度で検出される。４５度ダイクロイックミラー（dichroic mirror）は、散乱されたレーザ光を検出器に反射させ、一方より長い波長の蛍光は通過する。それぞれの色の検出器に特異なさらなるフィルタを用いて、４色（例えば、緑色、橙色、赤色、および長波長の赤色(long red)）までの蛍光分離が達成される。以下の指針および標準が、販売用の製品への包含に適した培養物を選択するために好ましい。当業者は、所定の仕様に従って以下の手順を容易に変更し得る。凍結乾燥された培養物のバッチを受け取ると、ランダムにサンプリングし、そして選択された蛍光プローブを用いて、生細胞、死細胞、およびストレスのかかった細胞の集団について、蛍光測定によって分析する。10％未満の最初の中間集団、および70％を上回る生集団を有する各ロットを、熱および湿度を高めた標準ストレスモデルに供し、そして再分析する。ストレスのかかっていない試料およびストレスのかかった試料を比較し、どの培養物のロットが最も高いストレス耐性を示すかを決定する。ストレス耐性は、以下の実施例に記載する標準ストレス条件下において、生集団の減少が50％を下回らず、かつ中間集団の増加が35％を上回らないこととして定義される。すべての場合において、特定の範疇に分類される粒子の割合は、全蛍光粒子の割合であり、そしてほとんどまたは全く蛍光を有さない残骸（debris）を含まない。フローサイトメータの使用は、数分間に何千という細胞を測定する能力を提供するが、選択された蛍光プローブに特異な反射光蛍光装置およびフィルタを備える顕微鏡の使用によっても、集団の差を得ることが可能である。このような技術における使用に適した染料は、生細胞にはCFDA（膜透過性染料）および死細胞にはPI（膜不透過性核酸染料）を含む。任意の標準フルオレセイン長通過（long-pass）フィルターを備える蛍光顕微鏡は、生細胞（緑色）、死細胞（赤色）、およびストレスのかかった細胞（橙色）からの蛍光を見ることができる。細胞の型に依存して、0.5-10μg/mlのPI濃度および10-200μg/mlのCFDA濃度が、細胞を染色するのに十分である。一旦細胞が染色されると、室温で１５分間、暗所で保持される。染色された細胞の懸濁液は、Petroff-Hausser Counting Cha mber内に、適切な希釈で接種される。細胞は、緑色、橙色、および赤色の細胞を識別する蛍光顕微鏡の下で計数される。これらの染料および顕微鏡を用いて、ストレスのかかっていないおよびストレスのかかった培養物は、製品への包含についてのそれらの適性に関して評価される。本発明は、以下の詳細な実施例を参照することによってより良く理解され得る。実施例は様々な用途を例示するが、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実施例１４℃で水分蒸気バリアパッケージングにおいて保管される、凍結乾燥された、安定化培養物の２つのロットを、生細胞、死細胞、およびストレスのかかった細胞の集団の相対的割合について評価する。培養物を通常の生理食塩水において再懸濁し、そして百万細胞／mlの濃度まで連続的に希釈する。希釈された細胞の試料を市販の細菌生育能力キット（LIVE/DEAD Baclight Viability Kit，(Molecul 色された試料をフローサイトメトリによって分析し、赤色、緑色、および様々な色合いの黄色および橙色の蛍光を発する細胞を測定する。すべての試料において、合計50,000の粒子を、前方角度光散乱（forward angle light scatter）によって分析する。細胞培養物を、緑色（生）染料でのみ染色し、次いで赤色のみの（死）染料で染色する。この個別の染色手順から、グラフ表示（例えば、ヒストグラム）のどこに赤色または緑色のみを有する細胞が位置するかを決定し得る。ユーザは、特定の領域の細胞の集団をマークまたは「ゲート付与（gate）」し得、そしてこれらのゲートを比較のために、その他のヒストグラム表示上にかぶせ得る。このゲート付与手順は分析プロトコルとして知られている。異なる集団を示す分析プロトコルを作製する。生集団は非常に濃い緑色の蛍光を有する一方、ストレスのかかった集団は赤色および緑色の染料の両方の組み合わせを有する。死集団は、緑色蛍光の全くない赤色細胞を含む。離れた領域は、赤色領域にも緑色領域にも蛍光がほとんどあるいは全くない残骸を表す。それぞれ異なる長期安定性を有する、異なる発酵バッチから調製された、異なる年齢の、Enterococcus faeciumの２つの細菌培養物の間で比較を行う。第１の培養物は、78.8％の生細胞および赤色および緑色の両方に染色する12.5％のストレスのかかった細胞を表す細胞の集団を示す。第２の培養物はわずか37.8％の生細胞および57.8％のストレスのかかった細胞を有し、よりストレスがかかっている。損傷した細胞は、蛍光染色およびフローサイトメトリによって、生細胞および死細胞から容易に識別可能である。実施例２ Enterococcus faeciumの２つの凍結乾燥培養物（培養物１および２）を、37℃ 、相対湿度67％で10日間保管し、温度および相対湿度（「RH」）の悪条件に対する耐性を評価する。培養物は、異なる発酵バッチから調製し、異なる年齢であり、それぞれ異なる長期安定性を有する。ストレスのかかった試料を、相対湿度10％および４℃で水分蒸気バリアパッケージングにおいて維持された同一の培養物と比較する。ストレスのかかった、およびストレスのかからないすべての試料を、滅菌生理食塩水中に、百万細胞／ml の濃度まで連続的に希釈する。希釈された細胞の試料を、市販の細菌生育能力核 regon）で、製造業者のプロトコルに従って染色する。染色された試料をフローサイトメトリによって分析し、赤色、緑色、および様々な色合いの黄色および橙色の蛍光を発する細胞を測定する。この実施例から、蛍光染色およびフローサイトメトリによって生細胞から損傷を被った細胞への移行を測定することにより、細菌培養物におけるストレスの増加が検出されることが理解され得る。実施例３ Enterococcus faeciumの一晩増殖した培養物を収集し、洗浄し、そして滅菌生理食塩水において再懸濁する。洗浄した一晩増殖した細胞を、様々な時間、高温に供する。洗浄した一晩増殖した細胞の生理食塩水における懸濁液を３、５、７、10、15、および30分間、加熱ブロック上で75℃でインキュベートし、次いで氷上に配置する。ストレスのかかった、およびストレスのかからない試料を、滅菌生理食塩水中に、百万細胞／mlの濃度まで連続的に希釈する。希釈された細胞の試料を、市販の細菌生育能力核酸キット（LIVE/DEAD Baclight Viability Kit，Mo る。染色された試料をフローサイトメトリによって分析し、赤色、緑色、および様々な色合いの黄色および橙色の細胞の蛍光を測定する。生細胞から中間のストレスのかかった細胞への移行をインキュベーションの時間に対して注目する。細菌の異なる集団の分布は、それらの強度および発色蛍光に基づく。すべての試料において、合計50,000の粒子を、前方角度光散乱によって分析する。分析は異なる集団を示すように確立する。生集団は非常に濃い緑色の蛍光を示す。ストレスのかかった集団は、赤色および緑色の染料の両方の組み合わせを示す。このプロトコルに記載された領域を、細胞培養物を緑色（生）および赤色（死）染料を用いて別々にに染色することによって決定する。このストレスモデルは、実施例２に記載のモデルと類似する生細胞から中間細胞への集団における移行を示し、このモデルはより短い時間およびより高い温度を使用して同じ最終結果を達成するという点が異なる。このストレスモデルでは、発酵後および凍結乾燥前の培養物の生存力についての評価をより迅速に行い得る。代表的には、10％未満から30％を超えない中間集団の増加、および70％以上から50％を下回らない生集団の減少は、販売用の製品において高い生存力を示す。実施例４ Enterococcus faeciumの２つの凍結乾燥培養物（培養物１および２）を、それぞれ37℃で相対湿度67％、および45℃で相対湿度96％の環境で１０日間保管し、温度および相対湿度の悪条件に対する耐性を評価する。培養物は、異なる発酵バッチから調製し、そして異なる年齢であり、それぞれ異なる長期安定性を有する。ストレスのかかった試料を、相対湿度10％および４℃で水分蒸気バリアパッケージングにおいて維持された同一の培養物と比較する。ストレスのかかった、およびストレスのかからないすべての試料を、滅菌生理食塩水中に、百万細胞／ml の濃度まで連続的に希釈する。全ての試料において、希釈された細胞の全てを、市販の細菌生育能力核酸キット（LIVE/DEAD Baclight Viability Kit，Molecula色された試料をフローサイトメトリによって分析し、赤色、緑色、および様々な色合いの黄色および橙色の蛍光を発する細胞を測定する。最初の培養物試料を分析したところ、両方の試料は販売用の製品への包含に適しているようである。しかし、培養物試料をストレスに供すると、培養物１は、 50％未満の生細胞が残存し、そしてストレスのかかった細胞の割合が30％を上回るので、使用に関して拒否される。対照的に、培養物２は、先の実施例で前述した基準を満たす。本明細書で言及するすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルの指標である。すべての刊行物および特許出願を、個々の刊行物または特許出願のそれぞれを具体的かつ個別に参考のために援用することを示す場合と同じ程度に、本明細書中で参考のために援用する。前述の実施形態の変更は当業者の能力の範囲内にあり、そしてこのような変更は以下の請求の範囲に記載する本発明の範囲から逸脱しない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．培養物の商業的適用についての適性を予測する方法であって、以下の工程：（ｉ）該培養物を膜透過性および膜不透過性蛍光染料の組み合わせで染色する工程；および（ｉｉ）蛍光測定によって、生細胞、死細胞、およびストレスのかかった細胞の集団の差を検出する工程、を包含する、方法。２．前記培養物が染色前に選択されたストレスにさらに供される、請求項１に記載の方法。３．前記蛍光染料が、フルオレセインジアセテート、フルオレセインイソチオシアネート、ケムクロムＹ、ケムクロムＢ、ローズベンガル、カルセインアセトキシメチルエステル、ヘキスト33342、ローダミン123、3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンイオダイド、Calcofluorホワイト、プロピジウムイオダイド、4',6 -ジアミジノ-2-フェニルインドール、エチジウムブロミド、3,6-ビス［ジメチルアミノ］アクリジニウムクロライド、カルボキシフルオレセインジアセテート、およびLIVE/DEAD Baclight Viability Kitからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。４．前記染料が、ローダミン123、4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、3,6- ビス［ジメチルアミノ］アクリジニウムクロライド、エチジウムブロミド、フルオレセインジアセテート、カルボキシフルオレセインジアセテート、プロピジウ択される、請求項３に記載の方法。５．前記集団の差がフローサイトメトリ、蛍光顕微鏡検査、蛍光分光測光、マルチウェル蛍光マイクロプレートリーダー、およびダイオードアレイ蛍光検出器によって検出される、請求項４に記載の方法。６．前記ストレスが、pH変化、栄養素の排除、化学的損傷、凍結乾燥、機械的損傷、長期保管、温度変動、および相対湿度変化からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。７．前記集団の差が、フローサイトメトリによって検出される、請求項６に記載の方法。項７に記載の方法。９．前記ストレスが、凍結乾燥、化学的損傷、長期保管、温度および相対湿度変化からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。１０．前記ストレスが温度および相対湿度変化である、請求項９に記載の方法。１１．微生物培養物の生存力を予測する方法であって、該培養物におけるストレスのかかった細胞の集団を測定する工程、および測定値を該集団の相対的健康状態の指標として使用する工程を包含する、方法。１２．請求項１１に記載の方法であって、以下の工程：（ｉ）前記培養物を膜透過性および膜不透過性蛍光染料の組み合わせを用いて染色する工程；（ｉｉ）蛍光測定によって、前記ストレスのかかった細胞の集団を定量する工程、を包含する、方法。１３．前記培養物が染色前に選択されたストレスにさらに供される、請求項１２に記載の方法。１４．前記染料が、フルオレセインジアセテート、フルオレセインイソチオシアネート、ケムクロムＹ、ケムクロムＢ、ローズベンガル、カルセインアセトキシメチルエステル、ヘキスト33342、ローダミン123、3,3'-ジヘキシルオキサカルボシアニンイオダイド、Calcofluorホワイト、プロピジウムイオダイド、4',6- ジアミジノ-2-フェニルインドール、エチジウムブロミド、3,6-ビス［ジメチルアミノ］アクリジニウムクロライド、カルボキシフルオレセインジアセテート、およびLIVE/DEAD Baclight Viability Kitからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。１５．前記蛍光測定がフローサイトメトリによって行われる、請求項１４に記載の方法。１６．前記ストレスが、凍結乾燥、栄養素の排除、化学的損傷、pH変動、機械的損傷、長期保管、および温度ならびに相対湿度の変化からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。１７．所定の微生物培養物がストレスに耐え、長期安定性および効力の必要条件を満たすことを確実にする方法であって、該培養物におけるストレスのかかった細胞の集団を測定する工程、および測定値を該集団の相対的健康状態の指標として使用する工程を包含する、方法。１８．請求項１７に記載の方法であって、以下の工程：（ｉ）前記培養物を膜透過性および膜不透過性蛍光染料の組み合わせを用いて染色する工程；（ｉｉ）蛍光測定によって、前記ストレスのかかった細胞の集団を定量する工程、を包含する、方法。１９．前記培養物が染色前に選択されたストレスにさらに供される、請求項１８に記載の方法。２０．30％を超えるストレスのかかった細胞の集団を有するすべての培養物が廃棄される、請求項１９に記載の方法。