JP2003506029A

JP2003506029A - 内部検定試験法

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Publication number: JP2003506029A
Application number: JP2001514075A
Authority: JP
Inventors: ベシィー・グラハム
Original assignee: ビーティーエフピーティワイリミテッド
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2003-02-18
Anticipated expiration: 2020-07-27
Also published as: ATE343628T1; EP1204737A4; CA2400715A1; WO2001009281A1; AUPQ196199A0; EP1204737A1; JP4683604B2; EP1204737B1; CA2400715C

Abstract

(57)【要約】バイオ粒子の個体群を用意し、これらのバイオ粒子のそれぞれに恒久的かつ検出可能なタグを付けてタグ付きバイオ粒子に変化させ、規定数量のタグ付きバイオ粒子を規定容量のキャリヤに入れた内部対照（内標準）サンプルを作り、バイオ粒子を検出するために対照サンプルを試験サンプルに添加して、試験を実施し、その後に試験サンプル中に検出されたタグ付きバイオ粒子の正確な数を測定し、添加したタグ付きバイオ粒子の数と比較して分析精度の指標を得る方法、可搬性液体中のバイオ粒子の分析における内部検定試験法、ならびに内部検定標準を提供する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、診断分析における内部検定(internal quality control)に関する。
特に、本発明は、水またはその他の可搬性の液体、食品、血液、尿、糞、脳脊髄
液などの中のバクテリア、プロトゾア、酵母、菌類、ウイルス、プリオンなどの
微生物またはその他の微粒子の解析に関する。注：参考文献は本明細書の末尾にまとめて収録した。

【０００２】

【従来技術】

水は、日常的に試験を行ってクリプトスポリジウム(Cryptosporidium)やギア
リダ(Giardia）の存在を確認する。これらの検出は、シストやオーシストを緑色
蛍光染料で染色する免疫蛍光手法に基づいて行われる。染色されたサンプルはエ
ピ蛍光顕微鏡を用いて検査し、緑色蛍光のシストやオーシストの数が記録される
。

【０００３】この方法には多くのプロセスが含まれ、そのプロセス中でシストやオーシスト
が失われることがある。したがって、厳格な検定試験を実施してこの方法の成績
をモニターすることが重要である。現在は、検定試験は既知数のシストやオーシ
ストを含む標準を分析する外部プロセスとなっている。そうした検定試験は、典
型的には１０〜２０個のサンプルを分析した後に行われる。こうした外部検定試
験は理想からはほど遠い。シストやオーシストの損失はサンプルによって大きく
変わることがありうる。ある種のサンプルはこの分析には不適当なことがある。
さらに、もし検定試験の結果が悪い場合、１０〜２０個のサンプルのすべての結
果を破棄しなければならなくなる。同じ状況は、外部検定試験が関連診断分析の性能／精度の１つの指標として適
用されるさまざまな分野の診断分析にも当てはまる。したがって、診断分析における正確、簡便、費用効果の高い、かつ再現可能な
検定試験法の必要性があるが、これらは現在のところ先行技術では達成されてい
ない。

【０００４】 [発明の要旨] 本発明の第１の視点では、バイオ粒子の個体群を用意し、これらのバイオ粒子
のそれぞれに恒久的かつ検出可能なタグを付けてタグ付きバイオ粒子に変化させ
、規定数量の該タグ付きバイオ粒子を規定容量のキャリヤに入れた内部対照サン
プルを作り、前記バイオ粒子を検出するために前記対照サンプルを試験サンプル
に添加し、分析を実施して試験サンプル中に検出されたタグ付きバイオ粒子の正
確な数を測定し、添加したタグ付きバイオ粒子の数と比較して分析精度を確定す
ることを含むことを特徴とする診断用内部検定試験法を提供する。

【０００５】本発明のさらなる視点では、可搬性液体中のバイオ粒子の分析における内部検定
を行うための方法を提供する。この方法は、バイオ粒子のサンプルを用意し、前
記サンプルに検出可能なタグを付け、規定数量のタグ付きバイオ粒子を規定容量
のサンプル中に入れた内部対照のサンプルを作り、前記内部対照サンプルを試験
サンプルに添加して前記サンプルを分析し、サンプル中のタグ付きバイオ粒子の
割合を測定することを含み、試験サンプル中に検出されたタグ付きバイオ粒子の
数をサンプルに添加した既知量のタグ付きバイオ粒子と比較することによって、
分析精度の１つの指標と実際のバイオ粒子数を得、分析実施中にバイオ粒子が失
われることを容認する方法である。

【０００６】本発明のさらなる視点として、所定数量のバイオ粒子を含み、前記バイオ粒子
が日常分析にかけられるタイプのものであり、前記所定数量のバイオ粒子が検出
可能なタグが付けられたタグ付きバイオ粒子であって、規定容量のキャリヤ中に
入れられたものであることを特徴とする内部検定試験用標準を提供する。

【０００７】診断分析の精度は、近代的な分析のツールとしてのそれらの性能にとって極め
て重要なものである。簡明にいえば、正確な結果が得られない試験法は、測定す
る特定の個体の存在を過小または過大に表すことになり、現実的な価値を持たな
いことになる。不正確な分析は不適切な結論を導くことがあり、重大な間違った
影響をもたらすこともありうる。

【０００８】本発明は内部検定試験法に関わるものであり、タグ付きバイオ粒子の内部標準
を用意し、これらをサンプルに添加し、日常分析を行い、その後サンプル中のタ
グ付きバイオ粒子の数を、サンプルに添加した既知数のバイオ粒子と比較して試
験精度の直接的な指標とするものである。

【０００９】本発明の第１の視点では、バイオ粒子の個体群を用意し、これらのバイオ粒子
のそれぞれに恒久的かつ検出可能なタグを付けてタグ付きバイオ粒子に変化させ
、規定数量の該タグ付きバイオ粒子を規定容量のキャリヤに入れた内部対照（内
標準）用サンプルを作り、該バイオ粒子を検出するために該対照サンプルを試験
サンプルに添加し、分析を実施し、その後に試験サンプル中に検出されたタグ付
きバイオ粒子の絶対数を測定し、添加したタグ付きバイオ粒子の数と比較するこ
とで試験精度が確定されるという手順を含む診断用内部検定試験法を提供する。

【００１０】これらのバイオ粒子は、微生物、たとえばバクテリア、菌類、酵母またはウイ
ルス、あるいは単細胞または複細胞のプトロゾア、プリオンまたはその他のバイ
オ粒子から選択することができる。そうしたバイオ粒子の例としては、クリプト
スポリジウム(Cryptosporidium)、ギアリダ(Giardia)、シクロスポーラ(Cyclosp ora )、トキソプラズマ(Toxoplasma)、アイメリア(Eimeria)、レジオネラ(Legion ella )、サルモネラ(Samonella)、レプトスピラ(Leptospirosis)、エシェリヒア(Escherichia )、酵母菌(Saccharomyces)、クロストリジウム(Clostridium)、ビブ
リオ(Vibrio)、シュードモナス(Pseudomonas)、炭疽菌(Anthrax)、血液細胞、Ｈ
ＩＶ、ノーウォークウイルス(Norwalk virus）、単純性疱疹ウイルス(herpes si mplex virus)などがある。

【００１１】バイオ粒子検出用の試験サンプルは、水またはフルーツジュース、ワイン、ビ
ール、ミルク、サイダーなどの可搬性液体である。また、サンプルは鶏肉、牛肉
、卵、チーズ、サラミやハムなどの保存用肉類などでもよい。サンプルは、血液
、脳脊髄液、尿、組織抽出物、糞便などの形でもよい。

【００１２】対照（検定用）バイオ粒子を含むバイオ粒子は、バイオ粒子の化学的および／
または物理的特性を、容易に検出できるような形に変えるタグによって検出可能
な形にタグ付けされる。容易に検出可能なものの１つの例は、顕微鏡分析により
検出できる発蛍光団のようなタグを使用するものである。適当な波長の光を照射
したときに、発蛍光団が蛍光を発し、これによって発蛍光団でタグ付けされたバ
イオ粒子を同定することができる。タグ付けされていないバイオ粒子は、そうし
た条件下では蛍光を発しない。標識バイオ粒子の密度、形状、外観などの物理的
および／または化学的特性に効果をもたらして容易に検出できるその他のタグと
しては、コロイド金などのコロイド状化合物、フェリチンやその他の鉄または重
金属化合物／錯体などの電子稠密剤による標識などがある。その他使用できるタ
グとしては放射線アイソトープを用いる放射標識、たとえば細胞表面のタンパク
質、脂質または炭水化物あるいはそれらの内部物質による標識、ならびにバイオ
粒子の化学的および／または物理的特性を変化させるためにＤＮＡまたはＲＮＡ
を修飾するものなどがある。後者の方法は、発光を起こす遺伝子の組み込み（Ca trinら、1999）、蛍光を起こす遺伝子の組み込み（Nobuhide Doi and Hiroshi Y anagawa、1999）、または抗生物質耐生、ケミカル・トレランス、抗原発現、酵
素発現または代謝活性の変更などの確立された遺伝子発現システムなどである。

【００１３】検出可能タグは、細胞表面のタンパク質、脂質、糖脂質、および／または炭水化
物、あるいはバイオ粒子中のそれらの内部物質に標識をつけることができる。タ
グが細胞表面または細胞内タンパク質、脂質および／または炭水化物に恒久的に
結合する場合、さまざまな利点が出てくる。たとえば、そうした細胞は標識を付
けるために過度に可動化したり物理的に変化させる必要がなく、タグ付けは恒久
的なものとなって、細胞の損傷または破壊が検出可能タグから信号を消失させる
ようなことがない。

【００１４】バイオ粒子中のＤＮＡまたはＲＮＡは、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡと永久
結合する核酸反応性フルオロクロムを用いたり、ＤＮＡまたはＲＮＡと恒久的結
合を作らないＤＮＡ／ＲＮＡ内部校合フロオロクロムを用いて、恒久的または非
恒久的にタグ付けすることができる。ＤＮＡ／ＲＮＡタグ付けは、タグの検出可
能信号の消失または衰弱を引き起こすＤＮＡ／ＲＮＡの代謝回転(turnover)／劣
化により、前述の他のタグ付け方法ほど利点がないかもしれない。

【００１５】微生物、酵母細胞、ウイルスなどのバイオ粒子に検出可能なタグ付けまたは標識
する方法は、たとえば［Grondahalら、1997］および［Chakaら、1995］にあるよ
うに、十分に確立されている。蛍光染色酵母やバクテリアは、Molecular Probes Inc．（米国ユージーン）などさまざまな会社から販売されている一般市販商品
である。一例として、蛍光マーカーで標識を付ける細胞は、発蛍光団の溶液に、
細胞表面または細胞内のタンパク質またはその他の物質が蛍光標識されるように
、単純に添加するだけでよい。フルオロクロムは通常１以上の官能基を備えてお
り、これがリシンのε−アミノ基などのタンパク質官能基へのカップリングを可
能にする。

【００１６】同様に、コロイド剤、電子稠密剤なども、一般的に１以上の反応基を含むか、
または１以上の反応基を含むように誘導され、たとえばリシンのε−アミノ基や
グルタミン酸のカルボン酸官能基などのタンパク質官能基で標識を可能とする。微生物のＤＮＡまたはＲＮＡは、当分野で公知の確立された分子生物学手法（
たとえば、Cartinら、1999；Nobuhide DoiとHiroshi Yamagawa、1999参照）を
用いて、たとえば形状、密度、形態学的状態などで検出できるように、微生物中
に物理的または化学的変化を起こすＤＮＡ配列を含むように変化させる。

【００１７】異なる種類のバイオ粒子を分析する日常分析においては、対照サンプルは各タ
イプのバイオ粒子を所定数含み、バイオ粒子のそれぞれのタイプは、タグ付けさ
れたバイオ粒子の各タイプが簡単に同定できるような方法でタグ付けされる。一
例としては、バイオ粒子の各タイプに異なる蛍光活性剤を用いてタグ付けする。
たとえば、フルオレセインまたはローダミンなど、緑色、赤色、黄色、橙色また
は青色の蛍光を発するさまざまな種類の染料が市販されている（たとえば、Haug land、1998参照）。

【００１８】生物的性質はタグ付けする前または後で、Ｘ線不活性化、急速凍結、化学的不活
性化などの確立された方法により不活性化して安定化する。この不活性化は、バ
イオ粒子の化学的または物理的特性には影響を与えず、試験においてバイオ粒子
は試験条件でテストされるバイオ粒子と同様に挙動する。

【００１９】タグ付けされたバイオ粒子は、対照が内部対照になっているから、分析プロセ
スの中で検出される。日常分析のタイプは、実施する特定の診断分析に用いる分
析システムにより決まる。一例として、水質は水サンプルの微生物やプロトゾア
などの異なるタイプのバイオ粒子を同定することができる高倍率の顕微鏡分析に
より測定される。

【００２０】その他の診断分析では、細胞をそれぞれの物理特性に応じて容易に分類するこ
とができるフローサイトメトリーを用いることもできる（Shapiro、1995）。食
品分析、および血液、痰、脳脊髄液、糞便などの生物学的液体の分析における水
またはその他の可搬性液体中の微生物などのバイオ粒子の分析は、顕微鏡分析、
フローサイトメトリー、サイトメトリー、レーザー走査サイトメトリー、共焦点
顕微鏡、あるいは水および食品分析、医療診断テスト、細胞培養、組織培養伝染
性および動物伝染性分析などで通常用いられている確立された分析技法などの方
法を用いて行われる。また、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）、比色検出お
よび免疫蛍光法などの免疫検出法、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡプローブハイブ
リダイゼーション、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）またはポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸検出法も用いることができる。

【００２１】バイオ粒子の検出をどのような種類の分析法で行なうとしても、サンプルに所
定容量のバイオ粒子の対照サンプルを加え、分析を実施し、分析サンプル中に検
出されるタグ付きバイオ粒子の割合を確定し、それを添加したタグ付きバイオ粒
子の所定数と比較し、試験精度の指標とする。これを本発明の特徴である数値化
（enumeration）と呼ぶ。この方法では、対照サンプル中のタグ付きバイオ粒子
の正確な数は既知／所定のものであり、試験で対照サンプルを添加した後、正確
な数、または絶対数を測定して分析効率の指標とする。分析効率の指標は、次に
サンプル中に存在するテスト微生物の数を計算するために利用される。具体的に
は、検出されたタグ付きバイオ粒子の数を試験用に添加した数量と比較すること
によって、回収率が得られる。たとえば、もし１０個のタグ付きバイオ粒子を添
加し、該粒子の分析に供した場合に、８個のタグ付きバイオ粒子が分析で検出さ
れれば、回収率は８０％となる。これはこの試験におけるタグ付けされていない
粒子の回収率／検出率の直接的な指標となる。

【００２２】本発明のさらなる視点では、可搬性液体中のバイオ粒子の分析における内部検
定を行うための方法を提供するが、この方法は、バイオ粒子のサンプルを用意し
、該サンプルに検出可能なタグを付け、規定数量のタグ付きバイオ粒子を規定容
量のサンプル中に含む内部対照のサンプルを作り、前記内部対照サンプルを試験
サンプルに添加し、該サンプルを分析し、サンプル中のタグ付きバイオ粒子の割
合を確定する手順を包含し、テストサンプル中に検出されたタグ付きバイオ粒子
の数をサンプルに添加した既知量のタグ付きバイオ粒子と比較することによって
分析精度の１つの指標が得られるものである。好ましくは、可搬性液体は水であり、検出されるバイオ粒子はクリプトスポリ
ジウム(Cryptosporidium)やギアリダ(Giardia)などである。

【００２３】本発明のさらなる視点として、所定数量のバイオ粒子を包含し、該バイオ粒子
が日常分析にかけられるタイプのものであり、該所定数量のバイオ粒子が検出可
能なタグが付けられたタグ付きバイオ粒子であって、規定容量のキャリヤ中に入
れられたものであることを含む内部検定用標準を提供する。前述のようにタグ付けされたバイオ粒子は、たとえばフローサイトメトリーに
より細胞をそれらの物理的特性に基づいて分離する方法（Shapiro、1995；Vesey ら、1994）、または当分野の標準的なその他の技法により、所定容量のキャリヤ
中に所定数を入れた形にする。規定数量のタグ付きバイオ粒子は容器中に入れられ、これにより当該タグ付き
バイオ粒子を試験サンプル中に容易に添加できるようにする。

【００２４】本発明は、たとえば微生物などのバイオ粒子のサンプル中の存在をテストする
のに広い応用範囲を持っている。具体的な重要な１つの分野は、水質テストに関
わる検定試(quality control)である。可搬性の水は通常、微生物の存在、特に
クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)やギアリダ(Giardia)の存在をテストす
る。検出は、緑色蛍光染料を用いてシストやオーシストを染色する免疫蛍光技法
による。染色されたサンプルはエピ蛍光顕微鏡を用いて測定され、緑色蛍光シス
トとオーシストの数を記録する。前述のように、この方法の性能をモニターする
ためには厳格な検定試験手順で行うことが重要である。本発明は分析されたあら
ゆるサンプルの分析の質をモニターすることができる。水サンプルには、たとえ
ば青色蛍光染料でタグ付けされた既知数のタグ付きシストとオーシストを加える
。サンプルは緑色蛍光を発するシストとオーシストについて検査し、さらにこれ
らのシストまたはオーシストが内部標準であるかどうか確認するための試験が行
われる。これらのシストとオーシストは、単純にそれらが青色の蛍光を発してい
るかおよび緑色の蛍光を発しているかを調べる。青色ではなくて緑色蛍光が検出
されたシストまたはオーシストは内部標準のものではない。この方法においては
、標識を付した微生物を識別するさまざまな蛍光染料を使用することができる。
前述のようにその他の標識技法ももちろん利用することができる。

【００２５】水質の分野では、蛍光染料またはその他の標識化剤と結合させる前に、シスト
およびオーシストをガンマ線照射で不活性化するのが便利である。タグ付けされ
た微生物は、前述のように通常不活性化される。既知数の標識されたシストとオ
ーシストを試験管に正確に入れるために、フローサイトメトリーが通常用いられ
る。試験管は密封され、かつサンプルを滅菌し、保存寿命を延ばすために、たと
えばガンマ線を照射する。サンプルは、水質の標準試験で使用するまで低温、た
とえば４℃、で保存される。

【００２６】本明細書に記述した発明により、内部対照バイオ粒子、たとえば対照細胞の正
確な数値化が可能となる。先行技術とは明らかに一線を画すものであるこの数値
化は、分析精度の検定を可能とするためにはサンプル中のテスト微生物の正確な
数または絶対数を測定することが極めて重要なことであり、必要不可欠のもので
ある。前述のように、本発明は、たとえば、食品、水またはその他の可搬性液体、血
液、尿、糞便、食品などに含まれるバクテリア、プロトゾア、酵母、菌類または
ウイルスなどの微生物またはその他のバイオ粒子の検出に広い応用範囲を持って
いる。

【００２７】

【実施例】

次に本発明を以下の実施例を参照して説明する。実施例１ Cryptosporidium及び Giardia Cryptosporidium parvumオーシストを、自然汚染されたシドニーの新生子牛
の集合糞便から精製する。糞便サンプルを遠心分離（２０００ｇ、１０分間）し
、水の中に２回再懸濁させ、次に５倍量の１％（ｗ／ｗ）ＮａＨＣＯ₃中に再懸
濁させる。次に脂肪性物質を１容量のエーテルで２回抽出し、次いで遠心分離（
２０００ｇ、１０分間）する。ペレットを水に再懸濁させ、予め湿潤した非吸着
性脱脂綿の層を通して濾過する。濾過液を次に１０容量の５５％（ｗ／ｖ）蔗糖
溶液の上に入れ、遠心分離（２０００ｇ、２０分間）する。オーシストを蔗糖の
界面から回収し、目に見える汚染物質が検出されなくなるまで蔗糖浮選工程を繰
り返す。精製されたオーシストを氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで３０分間表
面滅菌し、リン酸緩衝生理食塩水（150mmol/l ＮａＣｌ、15mmol/l ＫＨ₂ＰＯ
₄、20 mmol/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄、27mmol/l ＫＣｌ、ｐＨ7.4：ＰＢＳ）中で１回
洗浄し、約１ｘ１０⁷オーシスト／ｍｌの濃度にＰＢＳで希釈し、４℃で保存し
た。 Giardia lambliaシストはWaterborne Inc.（米国ニューオリンズ）から購入し
た。

【００２８】シストおよびオーシストへのフルオロクロムの結合結合させる前に、シストおよびオーシストのサンプルを冷凍（−８０℃）して
シストとオーシストの壁を破壊した。約１ｘ１０⁷のシストとオーシストを含むアリコート（２００μｌ）を、１２
０００ｇで２分間遠心分離し、上澄み液を取り除いて廃棄した。シストとオーシ
ストを０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．３）の中に再懸濁させた。この洗浄
手順を２回繰り返した。

【００２９】青色フルオロクロムＡｌｅｘａ３５０カルボン酸、サクシニミジルエステル（
Alexa 350-Molecular Probes、米国ユージーン）を、ジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＮＳＯ）に濃度１ｍｇ／ｍｌで溶解させた。フルオロクロム／ＤＭＳＯ混合液のアリコート（１０μｌ）を、２００μｌの
シストとオーシストの懸濁液に加えた。サンプルを完全に混合し、室温で３０分
間インキュベートした。次にサンプルを１２０００ｇで２分間遠心し、上澄み液
を取り除いて廃棄した。シストとオーシストを０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中に再
懸濁させた。この洗浄手順を２回繰り返した。

【００３０】アリコートの調製標識されたシストとオーシストをフローサイトメトリーを用いて６ｍｌプラス
チック試験管に正確に取り分けた。標識シストとオーシストを分析するためにBe cton Dickinson FACScaliburフローサイトメーターを用いた。シストまたはオー
シストの蛍光および／または光散乱特性を定義し、これらの性質を用いて、標識
シストおよびオーシストのサンプルから１００個の標識シストとオーシストを分
別した。分別したシストとオーシストを試験管中に取り分けた。分別されたシストとオーシストはすべて標識されていることが重要である。も
し無標識シストまたはオーシストがサンプル中に残っていると、間違った陽性の
結果が出ることになる。正確な数のシストとオーシストが確実に取り分けられているように検定試験を
実施した。ここで、シストとオーシストを数値化するためにマイクロ顕微鏡また
はフローサイトメトリーを用いて試験管の比率を分析した。試験管を秤量し、範
囲外の重量のものは処分した。

【００３１】水サンプルへの対照物質の接種水サンプルを容器に集め、濃縮するために研究所に送るか、サンプル採集場所
でサンプルを濃縮した。濃縮のために研究所に送られるサンプルは通常１０ない
し１００リットルの範囲である。これらのサンプルに以下の接種方法を用いて対
照サンプルを接種した：１）２ｍｌの０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン８０を対照物質の試験管に添加し
、２）キャップを戻して、激しく攪拌する。３）キャップを取り、対照物質をサンプル中に注入する。４）３ｍｌの０．０５％（ｖ／ｖ）トゥイーン８０を対照物質の試験管に添加す
る。５）キャップを戻して、激しく攪拌する。６）キャップを取り、対照物質をサンプル中に注入する。工程４、５および６を繰り返す。サンプルを、通常の方法、例えば膜濾過、カートリッジ濾過、プリーツ膜カー
トリッジ濾過、凝集または渦流濾過などを用いて濃縮した（Ａｖｏｎ、１９９９
；Ｖｅｓｅｙら、１９９４）。もしサンプルを採集場所で濃縮する場合は、カートリッジ濾過装置など可搬式
の濃縮方法を用いる。フィルタカートリッジにはサンプルの濃縮前に対照物質を
接種しておかなければならない。フィルタカートリッジの接種には前述の接種方
法が適当である。カートリッジフィルタのメーカーは、製造プロセス中にフィルタに接種するこ
とができる。水サンプルを濃縮するために使用したフィルタを分析研究所に送り
返し、フィルタに集められた粒子状物質を溶出させ、さらに濃縮する。

【００３２】分析濃縮サンプルから、藻類および鉱物粒子などの夾雑物粒子を除去する処理をす
る。濃縮水からシストおよびオーシストを精製するためには、浮遊分離、免疫磁
気分離（ＩＭＳ）およびフローサイトメトリーなどの方法が通常用いられる（Ve seyら、1994；著者不明、1999）。精製したサンプルは、次に顕微鏡グラス・スライドまたは小さな膜フィルタ（
１３ｍｍ）に移す。このスライドまたは膜をイソチオシアン酸フルオレセイン（
ＦＩＴＣ）で染色したモノクローナル抗体で染色し、インキュベートおよび洗浄
し、エピ蛍光顕微鏡を用いて測定する（Veseyら、1993；著者不明、1999）。た
とえば、１２倍接眼レンズおよび２０倍対物レンズ（Ｆｌｕｏｒ２０）を備えた
ニコンＯｐｔｉｐｈｏｔ２エピ蛍光顕微鏡でサンプルを試験する（Veseyら、199 3；著者不明、1999）。フルオロクロムイソチオシアン酸フルオレセインＦＩＴ
Ｃ標識サンプルの試験にはＤＭ５１０フィルタブロックを用いる。膜またはスラ
イドを注意深く走査して、シストとオーシストを検出する。

【００３３】緑色蛍光シストまたはオーシストが検出された場合、異なる光学フィルタを用
いて青色に蛍光発色するかどうかを確認することにより、対照シストとオーシス
トであることを同定する。Ａｌｅｘｓ３５０標識対照シストおよびオーシストか
らの青色蛍光を検出するためにＤＭ４５０フィルタブロックを用いる。膜全体を走査した後、サンプル中に検出されたシストとオーシストの合計数を
、青色蛍光が検出されたシストとオーシストの数と比較する。次に、これらの数
字を回収効率ならびに水サンプル中に存在するシストとオーシストの実際の数を
計算するために用いる。ある実施例では、サンプルに１００個の青色対照シスト
と１００個の青色対照オーシストを接種した。このサンプルの分析の結果、５０
個の青色シストと３０個の非青色シストならびに５０個の青色オーシストと１０
個の非青色オーシストが検出された。この分析の回収効率は、シストおよびオー
シストの両方とも５０％である（１００個接種し、５０個だけが検出された）。
したがって、このサンプルは６０個のシストと２０個のオーシストを含んでいた
。

【００３４】本明細書およびそれに続く請求項においては、文脈上他の解釈を必要としない
限り、“含む（comprise）”という用語ならびに“含む（comprises）”または
“含んでいる（comprising）”などの変形語は、表示した数字または工程あるい
は数字群または工程群を含むが、その他の数字または工程あるいは数字群や工程
群を除外するものではないと理解するものとする。

【００３５】参考文献著者不明. 試験法１６２３：濾過／ＩＭＳ／ＦＡ法による水中のクリプトスポリ
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA28 CA25 CA26 CB03 CB08 CB21 CB30 FA16 FB07 FB12 GC15 JA02 2G054 AA06 CA20 CD04 CE02 EA03 JA08 4B063 QA19 QQ03 QQ05 QQ16 QQ18 QQ20 QQ79 QR48 QR56 QR58 QR74 QS03 QS40 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バイオ粒子の個体群を用意し、これらのバイオ粒子のそれぞ
れに恒久的かつ検出可能なタグを付けてタグ付きバイオ粒子に変化させ、規定数
量の前記タグ付きバイオ粒子を規定容量のキャリヤに入れた内部対照サンプルを
作り、前記バイオ粒子を検出するために前記対照サンプルを試験サンプルに添加
し、分析を実施して試験サンプル中に検出されたタグ付きバイオ粒子の正確な数
を測定し、添加したタグ付きバイオ粒子の数と比較して分析精度を確定する手順
を含むことを特徴とする、診断用内部検定試験法。
【請求項２】前記バイオ粒子が、バクテリア、プロトゾア、酵母、菌類、
ウイルスまたはプリオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記バイオ粒子が、検出可能なマーカーでタグ付けされた外
表面を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記バイオ粒子が、各細胞の表面または内部のタンパク質を
通してタグ付けされたバクテリアまたはプロトゾアである、請求項２に記載の方
法。
【請求項５】前記タグが、バイオ粒子の化学的および／または物理的特性
を検出可能な形に変化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】タグが蛍光タグである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】試験サンプル中に２種類以上のバイオ粒子が使用される場合
、それらが異なる蛍光タグでタグ付けされ、バイオ粒子に対するそれぞれのタイ
プのタグの数が容易に測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】バイオ粒子の検出のための試験が、水またはその他の可搬性
液体、食品、血液、痰、粘膜、尿または脳脊髄液中のバイオ粒子の検出のための
試験である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】バイオ粒子の検出のための試験が顕微鏡分析であり、バイオ
粒子が蛍光タグ付けされ、それらの特異的蛍光によりバイオ粒子が同定される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】可搬性液体中のバイオ粒子の分析における内部検定を行な
うための方法であって、バイオ粒子のサンプルを用意し、前記サンプルに検出可
能なタグを付け、規定数量のタグ付きバイオ粒子を規定容量のサンプル中に含む
内部対照のサンプルを作り、前記内部対照サンプルを試験サンプルに添加し、前
記サンプルを分析してサンプル中のタグ付きバイオ粒子の割合を確定することを
含み、試験サンプル中に検出されたタグ付きバイオ粒子の数をサンプルに添加し
た既知量のタグ付きバイオ粒子と比較することで、分析精度の１つの指標が得ら
れることを特徴とする方法。
【請求項１１】前記バイオ粒子が、バクテリア、プロトゾア、酵母、菌類
、ウイルスまたはプリオンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記バイオ粒子が、検出可能なマーカーでタグ付けされた
外表面を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】前記バイオ粒子が、各細胞の表面または内部のタンパク質
を通してタグ付けされたバクテリアまたはプロトゾアである、請求項１１に記載
の方法。
【請求項１４】前記タグが、バイオ粒子の化学的および／または物理的特
性を検出可能な形に変化させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】前記タグが蛍光タグである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】試験サンプル中に２種類以上のバイオ粒子が使用される場
合、それらが異なる蛍光タグでタグ付けされ、バイオ粒子に対するそれぞれのタ
イプのタグの数が容易に測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】バイオ粒子の検出のための試験が、水またはその他の可搬
性液体、食品、血液、痰、粘膜、尿または脳脊髄液中のバイオ粒子の検出のため
の試験である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】バイオ粒子の検出のための試験が顕微鏡分析であり、バイ
オ粒子が蛍光タグ付けされ、それらの特異的蛍光により、バイオ粒子が同定され
る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】所定数量のバイオ粒子を含み、前記バイオ粒子が日常分析
にかけられるタイプのものであり、前記所定数量のバイオ粒子が、規定容量のキ
ャリヤ中に入れられた検出可能なタグが付けられたタグ付きバイオ粒子であるこ
とを特徴とする内部検定用標準。
【請求項２０】前記タグ付けされたバイオ粒子が試験のために容易に添加
できる容器に入れて提供される、請求項１９に記載の標準。
【請求項２１】前記バイオ粒子が、バクテリア、プロトゾア、酵母、菌類
およびプリオンから選ばれる、請求項１９または２０に記載の標準。
【請求項２２】前記バイオ粒子が、検出可能なマーカーでタグ付けされた
外表面を含む、請求項２０に記載の標準。
【請求項２３】前記バイオ粒子が、各細胞の表面または内部のタンパク質
を通してタグ付けされたバクテリアまたはプロトゾアである、請求項１９に記載
の標準。
【請求項２４】前記タグが、バイオ粒子の化学的および／または物理的特
性を検出可能な形に変化させる、請求項１９に記載の標準。
【請求項２５】前記タグが蛍光タグである、請求項１９に記載の標準。