JP2001521172A

JP2001521172A - Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍのオーシストを検出するための方法

Info

Publication number: JP2001521172A
Application number: JP2000518281A
Authority: JP
Inventors: ビクターシー．ダブリュー．ツァン，; リュク−ムイリー，; パトリックダブリュー．ジョンソン，; マイケルジェイ．アローウッド，; ジェフリーエル．コール，
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1997-10-28
Filing date: 1998-10-27
Publication date: 2001-11-06
Also published as: DE69833218D1; AU750326B2; ATE315786T1; US20010049116A1; EP1027605A1; EP1027605B1; WO1999022239A1; US6475747B2; AU1201999A; CA2309087A1

Abstract

(57)【要約】濁りのある、または濁りのない試料に存在するＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍＰａｒｖｕｍなどの寄生生物を、可溶化分子マーカーまたは寄生生物の抗原によって検出するための方法。寄生生物を含有する試料と可溶化緩衝液とをインキュベートすることにより分子マーカーを可溶化し、そして、電気化学発光によって、可溶化抗原を検出する。可溶化緩衝液は、１つ以上の界面活性剤を単独で、または１つ以上の変性剤との組み合わせで、緩衝化溶液中に含有している。この方法は、Ｃ．ｐａｒｖｕｍについての既存の免疫蛍光アッセイに対する改良である。なぜなら、本明細書に記載されている方法は、定量的で、再現性があり、高感度を有し、非労働集約的であり、最小限の試料処理を必要とし、かつ試料の混濁度による悪影響を回避するからである。加えて、電気化学発光アッセイを使用するため、顕微鏡を必要としない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、疫病管理センターにおいてなされた。従って、合衆国政府は、本発
明に特定の権利を有する。

【０００２】（発明の分野）本発明は、検出アッセイの分野、およびより詳細には、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒ
ｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍオーシストを検出するための改良した方法の分野に関
する。

【０００３】（発明の背景）胃腸管への寄生生物の感染は世界中で蔓延している。多くの胃腸管系の寄生生
物は、汚染された食物または水の消費によって感染される。胃腸管系の寄生生物
の感染は、一般大衆においてはごく短時間腹腔の疾患を引き起こすが、免疫無防
備状態にある個体においては、寄生生物感染は致命的であり得る。

【０００４】Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）は、食
物まは水媒介の寄生生物で、ヒトおよび動物に感染し、激しい腸の苦痛を引き起
こす。１９７０年代以来、Ｃ．ｐａｒｖｕｍは、増大する世界的な注目を受けて
いる。１９８０年代初頭に、全部で５１６件の症例をもたらしたイギリスでのＣ
．ｐａｒｖｕｍ感染の２回の大発生の後、イギリス政府は、水中のＣ．ｐａｒｖ
ｕｍを検出するための方法を発明することを余儀なくされた（Ｋ．Ｍ．Ｓｈｅｐ
ｈｅｒｄら、ＡＰＰＬＤ．ＡＮＤＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯ．，Ｖｏｌ．６
２，Ｎｏ．４１３１７−１３２２頁（１９９６））。アメリカにおいては、Ｃ
．ｐａｒｖｕｍの水媒介での大発生が報告される頻度が増している。最近の大発
生の１つは、ミルウォーキー、ウィスコンシンで１９９３年４月に起こり、およ
そ４００，０００人がＣ．ｐａｒｖｕｍに感染している（Ｃ．Ｄｏｒｚｄら、Ａ
ＰＰＬＤ．ＡＮＤＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯ．，Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．４
１２２７−１２３２頁（１９９６））。Ｃ．ｐａｒｖｕｍが引き起こす感染は、
免疫無防備状態にある個体にとって潜在的に命に関わり得る長期の下痢性の疾病
を引き起こし得るため、特に危険である。

【０００５】Ｃ．ｐａｒｖｕｍは、腸管系および尿生殖器系への侵入によってその宿主に感
染する寄生生物である。Ｃ．ｐａｒｖｕｍ生物は、汚染された食物または水経由
、動物対動物の接触経由、ヒツジおよび子ウシのような家畜経由、あるいは糞便
に存在するオーシストによる様式を含む、種々の様式で感染し得る。一般的に、
人への感染は、人畜共通伝染性の伝播、人対人の接触、糞−口の接触（ｆｅｃａ
ｌ−ｏｒａｌｃｏｎｔａｃｔ）、口−肛門の接触（ｏｒａｌ−ａｎａｌｃｏ
ｎｔａｃｔ）、あるいは水媒介の伝染に起因する。クリプトスポリジウム症は世
界中で発生しているが、子供、外国への旅行者、男性同性愛者、そしてその疾患
を有する患者を介護する医療職員は特別な危険にさらされている。先進諸国にお
いては、胃腸炎を患っている子供の１〜４％がＣ．ｐａｒｖｕｍを保有しており
；そして開発途上国においては、そのような子供の４〜１１％がクリプトスポリ
ジウム症を患っている。人間以外では、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ感染は
、哺乳動物、爬虫類、および魚類などいくつかの他の脊椎動物において広まって
いる。従って、クリプトスポリジウム症の発症頻度は、動物飼育係および獣医師
職員に対して比較的高いことが報告されている。

【０００６】他の球虫類亜綱と異なり、Ｃ．ｐａｒｖｕｍは、腸管上皮の刷子縁上に見出さ
れるが、深部細胞内領域には見出されない。代表的には、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ生物
は微細（２〜６μｍ）な小球で、空腸の刷子縁に沿って配列されている腸管上皮
の刷子縁の微繊毛辺縁に存在する。腸管への移入後、Ｃ．ｐａｒｖｕｍスポロゾ
イトは微繊毛表面に付着し、増員生殖（無性生殖的に）により繁殖する。生じる
感染性のオーシストは腸管の内腔を通過し、糞便中に移入する。別の脊椎動物に
よりそのオーシストが摂取されると、そのオーシストはスポロゾイトを放出する
。そのスポロゾイトは上皮表面に付着し、感染の新しい周期を開始する。

【０００７】Ｃ．ｐａｒｖｕｍ生物が腸管細胞の表面に侵入すると、宿主は、食欲の減退、
激しい下痢、そして慢性的な脱水症状などの症状を経験する。通常の宿主におい
て、その疾患の発症は爆発的であり、大量の水様の下痢、ならびに激しい腹痛が
曝露から４〜１４日間続く。症状は一般的に５〜１１日間続き、次いで、寄生生
物の緩解（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）が約１０〜１５日で生じるので急激に症状が和
らぐ。しかし、免疫無防備状態の個体（すなわち、消耗症および栄養失調症の子
供、先天的な低ガンマグロブリン症を有する個体、ガン治療または臓器移植のた
めの免疫抑制剤を受けている個体、およびＡＩＤＳを有する患者）では、病気の
発症はより緩やかであり、下痢はより重篤であり、１日に失われる水分は最高１
５〜２０リットルに達する。もし根本的な免疫学的欠損が補正されなければ、生
涯にわたって、下痢は永続的または弛張的に続き得る（ＭｅｒｃｋＭａｎｕａ
ｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ１５２３７頁第１６版．（１９９２））。

【０００８】現在、有効かつ特異な利用可能な、抗Ｃ．ｐａｒｖｕｍ治療が存在しない。一
部の患者は、スピラマイシンおよびパラモマイシンのような従来の抗生物質によ
る治療に陽性に応答してきたが、感染の結果は、免疫無防備状態の個体にとって
は、しばしば致死的である。事実、クリプトスポリジウム症は、免疫無防備状態
の患者における死因の主な原因の１つである。

【０００９】Ｃ．ｐａｒｖｕｍ感染が悲惨な成り行きになり得ることを考慮して、Ｃ．ｐａ
ｒｖｕｍ汚染を検出するための感度の高い、効率的な方法が必要である。ヒトに
おいて、クリプトスポリジウム症の代表的な出所は、汚染された水であるため、
上水道を保護することが第一の目標である。合衆国環境保護庁は、水におけるＣ
．ｐａｒｖｕｍレベルに対する必須のガイドラインの確立を創始することによっ
て、改良された検出方法の必要性を認知してきた。

【００１０】現在、利用可能な検出システムは、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ生物が、「スパイク（ｓ
ｐｉｋｅｓ）」において観察されることを示す；これは、汚染の同じ供給源由来
の、上流および下流から収集された試料に存在するＣ．ｐａｒｖｕｍレベルが、
同時に読み込みがなさた場合、同一でないかもしれないことを意味する。従って
、１つの区域から記録されるＣ．ｐａｒｖｕｍレベルは、同じ区域から得られた
数分後の読み込み（ｒｅａｄｉｎｇ）と顕著に異なることがあり得る。水に存在
するＣ．ｐａｒｖｕｍの検出は、感染の最初の供給源を特定することが困難であ
るため、さらに複雑である。異常に高いＣ．ｐａｒｖｕｍ濃度は、汚染された飼
育場あるいは牧草地から流出した水、もしくは小川に不注意に捨てられた幼児の
汚れたオムツに起因する事があり得る。

【００１１】理想的には、その後の分析のためのＣ．ｐａｒｖｕｍ生物を捕獲し、そして保
持する能力を有する、持続的なろ過システムを、全ての上水道貯水槽に、継続的
なモニターを可能にするために導入する。不運にも、現在使用されているろ過シ
ステムは、生物の保持ができないか、泥あるいは沈降物を頻繁に詰まらせるか、
またはそのカートリッジを非実用的にするほど頻繁に取り替えあるいは洗浄しな
ければならないか、のいずれかであるカートリッジを備える。

【００１２】現在使用されているＣ．ｐａｒｖｕｍ検出アッセイは、煩わしく、そしてしば
しば不正確である。例えば、ほとんどのアッセイ試験試料は、フィルターによっ
て回収された泥の沈着物から分離されたＣ．ｐａｒｖｕｍオーシストの粗混合物
として始まる。そのオーシストは、遠心分離および限外濾過を含む処理によって
単離される。このようにしてオーシストを分離することは、しばしば、単調で退
屈であり、そして非効率的である。なぜなら、その試験試料が遠心分離されそし
て濾過されるたびに、オーシストがその処理において損失し、感度の欠如および
それに関連する不正確さを生じることが避けられないからである。このようなア
ッセイの別の有意な欠点は、試験試料を処理するために必要とされる大量の時間
である。例えば、検出のための試験試料の光学的な特性を改善するために、オー
シストは染色されなければならない。代表的には、染色および引き続く検出手順
は、４日までかかり得る。さらに、試料は、小増分（すなわち、５０μｌ）での
み試験され得、そして最近の入手可能なアッセイの感度は、非常に低い。一般に
、１ミリリットルあたり少なくとも５０，０００Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシストが
、明確な（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）検出結果を得るためには存在しなければならない
。したがって、現在使用されているＣ．ｐａｒｖｕｍアッセイは、一般に、非効
率的であり、不正確であり、かつ一貫性がない。

【００１３】効率的なＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍスクリーニングに対する別の障壁は
、試料の濁度に関する。用語「濁度」は、詳細には、水の透明さ（ｃｌａｒｉｔ
ｙ）または透明度（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ）をいい、そして水中の任意の懸
濁した粒子が有し得るこの透明度に対する効果をいう。濁度は、試料を通過する
ことを許容される光の量を定量することによって決定され、そしてＮＴＵ（比濁
分析濁度単位）で測定される。公用水の貯水槽の多くの水源水地（例えば、川お
よび湖）は、しばしば、１００ＮＴＵまでの濁度を有する一方、処理水（例えば
、公共の消費のための貯水槽）は、０〜５ＮＴＵの範囲の濁度を有する傾向があ
る。

【００１４】Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ汚染は、水源水地で生じると一般に推測され
ているので、貯水槽の取り入れ口で試料をアッセイすることに努力が集中されて
きた。数ガロンの水源水がオーサイトのサイズまたはそれより大きいサイズの粒
子を捕捉すると規格されたフィルターを通して汲み上げられる。水源水をこのよ
うにして汲み上げることにより、フィルターを通じた水の流れが大量の沈降物に
よって妨害され、それゆえフィルターを通過する水の容量を制限する。次いで、
そのフィルター保持物は溶出され、そして微生物の存在についてアッセイされる
。これらの保持物は、３００，０００ＮＴＵまでの濁度を有し得、そして多段階
試料処理において生じるオーシストの損失のために、免疫蛍光アッセイによる高
度に可変性のＣ．ｐａｒｖｕｍオーシスト計数を生じ得る。

【００１５】フィルター溶出物中に存在するオーシストは、処理の間にしばしは洗浄除去さ
れる傾向にあり、そしてそれゆえ検出アッセイの最終段階で検出されない。結果
として、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）および酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）のよう
な現在利用可能な方法は、主に「きれいな」試料（すなわち、低い濁度を有する
試料）においてオーシストを検出するために有用である。このようなアッセイは
、「汚い」と考えられる試料（すなわち、高い濁度を有する試料）よりもきれい
な試料で、再現可能な結果を与えるようである。

【００１６】クリプトスポリジウム症の臨床的診断は、抗酸菌オーシストを糞便試料から回
収することによってなされる。抗酸菌オーシストの排泄は、病気の最初の４日の
間に最も強力であるが、下痢の持続する間持続する。診断目的のために現在使用
されている他のアッセイは、わずかなオーシストを含有する標本中のオーシスト
の産生を増強するために、ホルマリン−エチルアセテート沈降またはＳｈｅａｔ
ｈｅｒ’ｓ糖浮遊糞便（ｓｕｇａｒｆｌｏｔａｔｉｏｎｓｔｏｏｌ）濃縮手
順を使用することを含む。市販の蛍光標識モノクローナル抗体キットはまた、臨
床標本におけるオーシストの検出を提供する（ＭｅｒｃｋＭａｎｕａｌ，Ｃｈ
ａｐｔｅｒ１５、２３７頁、第１６版（１９９２））。このような臨床試験の
欠点は、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ感染の段階に依存して、そのアッセイがオーシストを
検出するために適切に感度が良くも悪くもあり得る点である。さらに、このよう
な臨床試験は、一般に、多数の工程を包含し、それゆえ不正確さが導入される可
能性がより大きくなる。さらに、Ｃ．ｐａｒｖｕｍについての糞便標本を試験す
るための「標準」が確立されておらず、そのため現在使用されている方法の絶対
感度は、評価されていない（ＣｈｒｉｓｔｉｎｅＬ．Ｒｏｂｅｒｔｓら、ＪＯ
ＵＲＮ．ＯＦＣＬＩＮ．ＭＩＣＲＯ．，Ｖｏｌ．３４Ｎｏ．９、２２９２−
２２９３頁（１９９６））。Ｃ．ｐａｒｖｕｍ試験に付随する他の問題には、大
量の処理時間および試験が正確である割合の低さが含まれる。

【００１７】要約すると、Ｃ．ｐａｒｖｕｍのような寄生生物のための既存のアッセイは、
再現性がなく、感度が低く、労働集約的であり、試料の濁度による妨害を受けや
すく、そして時間がかかるものである。さらに、既存のアッセイは定量的ではな
く、そして水中の寄生生物レベルを健常な個人と免疫無防備の個人における疾患
の発生率および重篤度と相関させる科学的データは、入手可能ではない。疾患−
寄生生物レベルの相関付けを可能にする有用なアッセイは、Ｃ．ｐａｒｖｕｍお
よび他の寄生生物感染に対して水源を保護するための環境ガイドラインの開発の
ために必要である。したがって、必要とされるものは、多数の工程および主観的
な決定を必要とせずに、多数の試料を効率的に処理し得る、食物または水媒介の
寄生生物についての、感度の高い、定量的な、そして再現性のあるアッセイであ
る。

【００１８】（発明の要旨）食物または水媒介の寄生生物（例えば、Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシスト）の検出
のための効率的かつ感度の高い方法が提供される。この方法にしたがって、寄生
生物の分子量マーカーが可溶化され、それにより濁りのある試料における寄生生
物の認識および検出が可能になる。先行技術のアッセイとは異なり、本明細書に
記載されるアッセイの結果は、再現性があり、かつ定量的である。さらに、この
アッセイは、娯楽用水および天然の水のような水源水、公用水貯水槽のような処
理水、生物学的流体試料、または排泄物試料に存在するＣ．ｐａｒｖｕｍオーシ
ストを、試料の濁度に妨害されずに検出するために本質的に有用である。このア
ッセイは、高感度であり、１ミリリットルあたり５０，０００オーシスト未満の
検出を可能にし、そして迅速な試料試験を可能にする。

【００１９】本明細書に記載されるアッセイは、寄生生物の分子マーカーすなわち抗原を可
溶化する工程、および免疫学的手段によってその抗原を検出する工程を包含する
。好ましくは、そのアッセイは、試験試料中のＣ．ｐａｒｖｕｍを、オーシスト
抗原を可溶化し、そしてその可溶化抗原を、好ましくは磁気マトリックス捕捉お
よび電気化学発光によって検出することによって検出するために有用である。こ
のアッセイは、環境水、生物学的流体試料、および糞便試料中の寄生生物の検出
のために特に適切である。なぜなら、それは濁度の低い試料および高い試料の両
方において操作可能であり、そして高い再現性を有し、そしてほとんど試料を操
作または処理せずに行われ得るからである。

【００２０】したがって、本発明の目的は、食物または水媒介性の寄生生物（例えば、Ｃ．
ｐａｒｖｕｍオーシスト）の検出のための定性的または定量的なアッセイを提供
することである。

【００２１】本発明の別の目的は、水源水または処理水のいずれかにおける、Ｃ．ｐａｒｖ
ｕｍオーシストのような寄生生物のための検出アッセイを提供することである。

【００２２】本発明のなお別の目的は、濁りのある試料（特に、濁りのある水試料）におい
て、Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシストのような寄生生物のための検出アッセイを提供
することである。

【００２３】本発明の別の目的は、生物学的流体試料および糞便、または糞便試料のような
、生物学的試料中の、食物または水媒介性の寄生生物（例えば、Ｃ．ｐａｒｖｕ
ｍオーシスト）のための検出アッセイを提供することである。

【００２４】本発明の別の目的は、食物または水源における寄生生物レベル（例えば、水中
のＣ．ｐａｒｖｕｍオーシストレベル）と、正常で健常な個体、または免疫無防
備の個体における疾患の発症率との相関付けを可能にする定量的な検出アッセイ
を提供することである。

【００２５】本発明のなお別の目的は、Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシストのような寄生生物の分
子量マーカーを可溶化するための方法を提供することである。

【００２６】本発明の別の目的は、水、生物学的流体、または糞便試料におけるＣ．ｐａｒ
ｖｕｍのような寄生生物の検出のための自動化された使用地点（ｐｏｉｎｔ−ｏ
ｆ−ｕｓｅ）分析のための最適化したアッセイ構成についてのキットを提供する
ことである。

【００２７】本発明の別の目的は、電気化学発光技術を利用する、Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシ
ストのような寄生生物の免疫学的検出のための方法を提供することである。

【００２８】本発明のこれらのおよび他の目的、特徴、ならびに利点は、以下の開示される
実施態様の詳細な説明および添付の請求の範囲を検討した後に、明らかになる。

【００２９】（詳細な説明）食物または水媒介性の寄生生物の検出のための方法またはアッセイが提供され
る。この方法は、水源水（例えば、娯楽用水および天然の水）、処理水（例えば
、公用水の貯水槽）、生物学的流体試料、糞便試料、および他の濁りのある試料
を含むがこれらに限定されない種々の試料において、試料の濁度からの妨害なし
に、寄生生物を検出するために有用である。そのアッセイにより、迅速な試料試
験が可能になり、そしてそのアッセイは高感度であり、１ミリリットルあたり５
０，０００オーシスト未満の寄生生物の検出が可能になる。好ましくは、そのア
ッセイは、１ミリリットルあたり１０，０００オーシストほど低い濃度でのオー
シストの検出が可能であり、最も好ましくは、１ミリリットルあたり１，０００
オーシストほど低い濃度で検出可能である。

【００３０】本明細書に提供される方法に従って、寄生生物の分子量マーカーが可溶化され
、そしてその可溶化された分子量マーカーは、免疫学的アッセイで、好ましくは
電気化学発光を利用して、検出される。その方法は、顕微鏡が必要とされず、そ
してその結果が濁度による影響に対する感受性を欠くので、特に有利である。さ
らに、その結果は、定量的でありかつ再現性がある。

【００３１】用語「分子量マーカー」は、本明細書中で寄生生物の抗原として定義される。
好ましくは、その抗原は、膜結合タンパク質または糖タンパク質である。最も好
ましくは、その抗原は、そのアッセイによって検出される寄生生物に対して独特
であり、そして寄生生物のオーシストの表面において見出される。

【００３２】好ましくは、そのアッセイは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（特に、Ｐｌａｓｍｏｄ
ｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｔｒｙｐａｎｓｏｍａ（特に、Ｔｒｙｐａｎ
ｓｏｍａｃｒｕｚｉ）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ、Ｇｉａｒｄｉａ、およびＣｒ
ｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍのような寄生生物を検出する。より好ましくは、そ
のアッセイは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ（Ｃ．ｐａｒｖ
ｕｍ）を検出する。最も好ましくは、そのアッセイは、Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシ
ストの可溶化抗原または分子量マーカーを検出する。

【００３３】（分子量マーカー可溶化）試料中の検出されるべき寄生生物の１つ以上の分子量マーカー（例えば、Ｃ．
ｐａｒｖｕｍ生物のオーシスト期の膜結合タンパク質または糖タンパク質）は、
可溶化された分子量マーカーと分子量マーカーに対して特異性を有する抗体との
間の抗体−抗原複合体の形成を損失しない程度までタンパク質変性を生じずにタ
ンパク質の可溶化を容易にするのに十分な時間および条件下で、寄生生物を含有
する試料を可溶化緩衝液と合わせることによって可溶化される。

【００３４】可溶化緩衝液は、１つ以上の界面活性剤を単独で、または１つ以上の変性剤と
の組み合わせで含有する緩衝化溶液である。好ましくは、Ｃ．ｐａｒｖｕｍオー
シスト抗原についての可溶化緩衝液は、弱アルカリ性の緩衝溶液中に界面活性剤
を含有する。

【００３５】一般に、寄生生物（好ましくは、オーシスト期の寄生生物）の表面または外壁
上に存在する膜結合タンパク質または糖タンパク質は、緩衝化溶液中にて、広範
な界面活性剤、変性剤、または界面活性剤および変性剤の組み合わせを使用して
可溶化される。例示的な界面活性剤および変性剤には、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ^TM 界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ−２０^TM界面活性剤、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００^TM界面
活性剤、ＮＰ４０^TM界面活性剤、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、塩酸グアニジ
ンが含まれるが、これらに限定されない。好ましいｐＨは、弱酸性または弱アル
カリ性である。用語、弱酸性は、本明細書中で、ｐＨ４より大きくｐＨ７未満と
して定義される。用語、弱アルカリ性は、本明細書中で、ｐＨ７より大きくｐＨ
１０より小さいとして定義される。可溶化緩衝液の最適な処方物は、可溶化され
、そして検出アッセイによって検出される分子量マーカーの物理化学的特性に依
存する。

【００３６】例えば、好ましいアッセイにおいて、検出されるべき抗原は、ＯＷ３の標的エ
ピトープであり、これはＣ．ｐａｒｖｕｍオーシスト細胞壁上で見出され、そし
て現在では、いくつかの利用可能な免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）におけるＣ．ｐ
ａｒｖｕｍ検出のために所望の分子量マーカーである。本明細書に記載される検
出方法の好ましい実施態様において、ＯＷ３抗原は、室温を超える温度、アルカ
リｐＨで、少なくとも３０分間Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ^TM界面活性剤およびＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌを含有する可溶化緩衝液で可溶化される。より好ましくは、Ｃ．ｐ
ａｒｖｕｍＯＷ３抗原は、１％未満のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ^TM３−１０界面
活性剤および０．１Ｍ未満のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８〜１０）を含有する可溶
化緩衝液で、７５℃よりも高い温度で、３０〜９０分間、可溶化される。最も好
ましくは、Ｃ．ｐａｒｖｕｍＯＷ３抗原またはエピトープは、約０．６５％の
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ^TM３−１０および約０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌを含
有する可溶化緩衝液で、約ｐＨ８．０、約９５℃で、約１時間可溶化される。

【００３７】他の寄生生物または寄生生物のオーシストの分子量マーカー、すなわち表面抗
原の可溶化は、検出されるべき既知量の寄生生物で試料をスパイクし；界面活性
剤および変性剤、ｐＨ、温度、インキュベーションの長さ、および攪拌の程度の
選択および濃度を調整し；そして可溶化されたかまたはイムノアッセイで検出可
能な抗原の最高濃度を生じる条件を最大化することによって当業者により決定さ
れ得る。

【００３８】（抗原の捕捉および検出）可溶化に続いて、可溶化されたマーカー（単数または複数）は、抗体−抗原複
合体の形成を容易にする条件下で、可溶化された抗原に結合する１つ以上の抗体
と反応される。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得
る。最も好ましくは、その抗体は、可溶化抗原に対して特異的なモノクローナル
抗体である。その抗体は、当業者に公知の方法に従って調製される。分子量マー
カーは、そのアッセイによって検出される生物の代表として機能する。

【００３９】例えば、ＯＷ３のエピトープは、Ｃ．ｐａｒｖｕｍの代表である。ＯＷ３が特
に選択される。なぜなら、ＯＷ３のエピトープは、Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシスト
壁上に豊富に存在するが、他のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種または他の寄
生生物上には存在しないからである。

【００４０】好ましくは、その分子量マーカーを捕捉するために使用される抗体は、モノク
ローナル抗体または固相に結合した抗体である。例示的な固相基質には、マイク
ロタイタープレート、試験管、磁気ビーズおよびスライド、プラスチックビーズ
およびスライド、またはガラスビーズおよびスライドが含まれるが、これらに限
定されない。好ましくは、膜結合タンパク質抗原のエピトープに特異的なモノク
ローナル抗体（ＭＡｂ）でコートされた磁気ビーズは、可溶性抗原を捕捉するた
めに使用される。

【００４１】この抗体−抗原複合体は次いで、当業者に公知であるイムノアッセイ方法（サ
ンドウィッチイムノアッセイおよび競合的イムノアッセイを含む）を使用して検
出される。この抗体−抗原複合体は、この抗原を捕捉するため使用されるモノク
ローナル抗体と同一のモノクローナル抗体に曝露されるが、これは検出可能な標
識で標識されている。適切な標識は、以下を含む：化学発光標識（例えば、ホー
スラディッシュペルオキシダーゼ）；電気化学発光標識（例えば、ルテニウムお
よびエクオリン）；生物発光標識（例えば、ルシフェラーゼ）；蛍光標識（例え
ば、ＦＩＴＣ）；ならびに酵素標識（例えば、アルカリホスファターゼ、β‐ガ
ラクトシダーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼ）。好ましくはこの標識は
、電気化学発光により検出される。最も好ましくは、この検出モノクローナル抗
体は、ルテニウム（Ｒｕ²⁺）標識の添加により修飾される。

【００４２】この標識複合体は次いで、用いられた標識の検出に特異的な検出技術または検
出装置を使用して検出される。好ましくはこの複合体は、電気化学発光装置（例
えば，ＯＲＩＧＥＮ^TM ＡＮＡＬＹＺＥＲ（Ｉｇｅｎ、Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），により、Ｒｕ²⁺光子放出について分析される。可溶性の
抗原はまた、同一のアッセイ形式で、非特異的な抗体でコートした磁気ビーズと
インキュベートされ、本アッセイで分析される試料のバックグランド値を決定し
得る。

【００４３】本方法の好ましい実施態様において、可溶化抗原をモノクローナル抗体コート
磁気ビーズと複合化し、そしてＯＲＩＧＥＮ^TM ＡＮＡＬＹＺＥＲの流動細胞に
存在する電磁石により、このビーズを捕捉する。捕捉後、免疫複合体中に存在す
るＲｕ²⁺は、電子供与体であるトリプロピルアミンの添加、続く電場の適用によ
り、光子の放出をするように誘発される。光電子増倍管によって測定される光は
次いで、電気化学発光（ＥＣＬ）カウントで表される。寄生生物（例えば、Ｃ．
ｐａｒｖｕｍ）に陽性の試料は、所定のバックグランド値シグナルを超えるＥＣ
Ｌカウントを生じる。。

【００４４】（アッセイの特徴）本明細書中に記載される検出アッセイは、速い速度で試料をスクリーニングし
、処理し、そして分析し得るために効率的である。代表的には、約１ｍｌの試料
を、１つの試料当たり約６０秒の速度で分析し得る。さらに、本発明のアッセイ
は、限られた試料の処理の結果として、寄生生物のより高い回収率のために効率
性を改良した。この検出方法は、試験試料の濁度によって混乱されない迅速およ
び定量的なアッセイである。処理前水または処理後水中、ならびに糞便試料中の
Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシストを検出するための本発明のアッセイ時間は、約６時
間であるが、水試料中のこの生物についての既存の顕微鏡的アッセイは、完了す
るのに最長４日間要し得る。

【００４５】本明細書中に記載される方法は、５０，０００未満のオーシストを含む１ミリ
リットルの試料中のＣ．ｐａｒｖｕｍオーシストを首尾よく検出し得、そして好
ましくは１０，０００オーシスト／ｍｌ程度を検出し得る。最も好ましくは、こ
の方法は、１，０００オーシスト／ｍｌ以下を首尾よく検出し得る。これは、５
０，０００未満のオーシストを含む１ミリリットルの試料中のＣ．ｐａｒｖｕｍ
を検出し得ない、現在利用可能な方法の感度に対する、有意な改良である。

【００４６】図１および２に示すように、本発明の検出アッセイは、試料の濁度による妨害
に供されず、そして最大３３０，０００ＮＴＵを有する試料を適切に処理し得る
。比較において、現在の方法論（例えば、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）および酵
素イムノアッセイ（ＥＩＡ））は、時間がかかり、そして試料の濁度により厳し
く制限される。試料の濁度は、本明細書中に記載された方法による首尾よい検出
に対する主要な障害ではなく、このアッセイは、フィルターカートリッジの溶出
液（通常、約３００，０００ＮＴＵ程度の高い濁度を示す）から得られた処理前
水または処理後濾過水の試料中のオーシストを検出することに適している。さら
に、図３または４に示されるように、本発明の検出アッセイは、Ｃ．ｐａｒｖｕ
ｍに特異的である：このアッセイは、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの他の種
と交叉反応しない。

【００４７】このアッセイはまた、疫学上の理由のために価値がある。なぜなら、患者にお
ける低レベルの感染を同定するために使用し得るからである。これは、特に重要
である。なぜなら、Ｃ．ｐａｒｖｕｍに対する現存するアッセイは低感度であり
、無症候性のクリプトスポリジウム症の検出を困難な仕事にするからである。本
明細書中に記載されるアッセイとは異なり、現在利用可能なアッセイは、個々の
試料間の整合性の変動、使用される標本の量の変動、および困難な試料調製の間
に被るオーシストの損失のために、一般に不正確および非効率とみなされる。

【００４８】当該分野で現在のところ使用されるアッセイとは異なり、現在記載された方法
は、生物の分子マーカの認識により生物を検出する。この型の認識の利点は、こ
のアッセイは微粒子形態の寄生生物を認識すること、インタクトであるオーシス
トの存在を検出することのどちらにも依存しない。その代わりにこのアッセイは
、オーシスト細胞壁に多量に存在する可溶化抗原の存在を検出することに指向さ
れる。可溶化した細胞壁分子マーカーの存在に基づく検出は、本願検出方法の感
度を増加し、そして試料の濁度から生じる妨害を減少することもある。

【００４９】本発明はさらに、以下の実施例により例証される。これは、その範囲に制限を
賦課するとしてどのようにも解釈されるべきではない。対照的に、手段は種々の
他の実施態様、改変、およびそれの等価物まで請求され得ると明らかに理解され
るべきである。これは、本明細書中の説明を読んだ後に、本発明の精神から逸脱
することなく当業者にそれらを想起させ得る。

【００５０】（実施例１）可溶化したＣ．Ｐａｒｖｕｍオーシスト抗原の調製オーシスト細胞壁上に存在するＣ．ｐａｒｖｕｍオーシスト膜結合抗原（さら
に詳細にはＯＷ３抗原のエピトープ）は、以下の手順に従って可溶化された。

【００５１】５００μｌの試験試料を含むアリコート（Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシスト（Ｄｒ
．Ｍ．Ｊ．Ａｒｒｏｗｏｏｄ，ＣＤＣ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡより提供）の既知
の量を含む陰性および陽性コントロール）を、１．７ｍｌのシリコン処理された
マイクロチューブに配置し、そして４℃で５分間、２１，０００×ｇで微小遠心
した。この上清を廃棄し、そしてこのペレットを５００μｌの可溶化緩衝液中で
再懸濁し、そして６０分間インキュベートした。

【００５２】Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシストを検出するためのＯＷ３モノクローナル抗体を利
用する場合、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ^TM３〜１０界面活性剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、０．０５ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０を０．６５％（重量）含む可溶化緩衝液を使用し、オ
ーシスト細胞壁からのＯＷ３のエピトープを９５℃で６０分間可溶化した。処理
の後、試料を４℃にて１５分間、２１，０００×ｇで微小遠心した。電気化学発
光（ＥＣＬ）を使用する検出までに、可溶化した抗原の上清の４５０μｌアリコ
ートを取り除いた。

【００５３】実施例２磁性捕捉マトリクスの調製Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシスト壁の抗原に特異的な抗ＯＷ３抗体および他の抗体
を含むモノクローナル抗体は、他に特定されない限りはＤｒ．Ｍ．Ｊ．Ａｒｒｏ
ｗｏｏｄ（ＣＤＣ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）より提供された。マウス骨髄腫から
精製されたＩｇＭおよびＩｇＧモノクローナル抗体は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−
Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から購入された。Ｄｙｎａ
ｌ，Ｉｎｃ．（ＬａｋｅＳｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）からの４．５μｍＭ４５０
ラット抗マウスＩｇＭおよびＭ４５０ラット抗マウスＩｇＧコート磁気ビーズも
また、抗原検出のために使用された。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ‐６^TM培地、ＭＯＮＯ‐
Ｑ^TM、およびＦＡＳＴ‐Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ^TMカラムを含むクロマトグラフィー
カラムは、、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｈｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ，ＮＪ）から購入された。

【００５４】Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシスト特異的アッセイに関しては、Ｍ４５０ラット抗マ
ウスＩｇＭまたはＭ４５０ラット抗マウスＩｇＧ磁気ビーズを、０．００１ｍｇ
／ｍｌ４５％硫酸アンモニウムで沈澱し、クロマトグラフィーで精製したオ
ーシスト壁の抗原の特定のエピトープに特異的なモノクローナル抗体とともに、
１０⁷ビーズ／ｍｌ（０．０７５ｍｇ／ｍｌ）の濃度でインキュベートした。ＯＷ３モノクローナル抗体に関しては、抗マウスＩｇＭ磁気ビーズを、その調製に
おいて使用した。使い捨ての１２×７５ｍｍホウケイ酸塩グラス培養チューブ中
で、インキュベーションを実施し、そしてオービタルシェーカー（約８００ｒｐ
ｍ）に室温で６０分間置いた。この溶液を磁気ラック（ＭＰＣ‐６磁気ラック、
Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．，ＬａｋｅＳｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）に２分間置くことに
より、このビーズを濃縮した後、非結合モノクローナル抗体を含む溶液を、この
ビーズから除去した。この磁石からチューブを取り出し、そしてビーズを、２ｍ
ｌの電気化学発光希釈液（ＥＣＬＤｉｌｕｅｎｔ：０．０５ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、０．５ＭＮａＣｌ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．７％
Ｔｗｅｅｎ‐２０、ｐＨ８．０）中で穏やかに再懸濁した。チューブを磁気ラッ
クの上に戻し、そしてこの溶液を、前のように除去した。この洗浄手順を一回以
上繰り返した。次いで、洗浄したビーズをＥＣＬ希釈液中に再懸濁し、ＥＣＬア
ッセイ１回当たり２．５×１０⁵ビーズ（０．０１８７ｍｇ／１００μｌ／ＥＣＬアッセイ）を産生するために、２．５×１０⁶ビーズ／ｍｌ（０．１８７ｍｇ／ｍｌ）の最終濃度にした。

【００５５】（実施例３）（ルテニウム標識した抗体の調製）実施例２に記載されるように、クロマトグラフィー精製したモノクローナル抗
体を、ルテニウム金属キレートＴＡＧ−ＮＨＳ（電気化学発光検出に使用される
活性化ルテニウム標識）エステル（活性化ルテニウム標識として本明細書中に記
載）と結合させた。検出抗体を標識するために使用されるＴＡＧ−ＮＨＳエステ
ルは、Ｉｇｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から入手された
。

【００５６】１．４２×１０^-4ｍＭの濃度で１５分間、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
にＴＡＧ−ＮＨＳを溶解させた。０．０１ＭＮａＰＯ₄中の精製モノクローナル抗体を、１５〜３０モルのＴＡＧ対１モルのモノクローナル抗体という目標の
比率で、溶解したＴＡＧと結合させた（反応中、アミノ基は存在しなかった）。
このＯＷ３モノクロ−ナル抗体へのルテニウムの結合に関しては、この反応で３
０対１の目標の比率を使用し、約１８対１の最終取り込み比を達成した。この混
合物を、暗所中、オービタルシェーカーで６０分間、室温にてインキュベートし
た。結合後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを、この反応を停止するために０．２Ｍの最終濃
度まで添加した。非結合ＴＡＧを、０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中のＦＡＳＴ−Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ^TMカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用し
て脱塩することにより取り除いた。各々のモノクローナル抗体について、ルテニ
ウム対イムノグロビンの最終的なモル取り込み比率を、この結合体のタンパク質
濃度および４５５ｍｍでのその吸光度を測定することにより決定した。Ｉｇｅｎ
，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）より供給された試薬プロトコル
に従って、この比率を算定した。ＥＣＬ希釈液中で、３倍濃度のＭＡｂ−Ｒｕ²⁺ 結合体を３×１０^-4ｍｇ／ｍｌタンパク質で調製し、そしてこのアッセイ中では
１０^-4ｍｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。

【００５７】（実施例４）（電気化学発光イムノアッセイ）Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシスト特異的試験および非特異的試験の両方について、
各々の試料の二重の試験を実施した。可溶化抗原上清の１００μｌアリコート（
上記の実施例１に記載されているように調製される）を、１００μｌのＭ４５０
ラット抗マウスモノクローナル抗体磁気ビーズ（上記の実施例２に記載されてい
るように調製される）、および１００μｌのＲｕ²⁺標識化モノクローナル抗体（
上記の実施例３に記載されているように調製される）とともに、オービタルシェ
ーカー上（約８００ｒｐｍ）で室温にて６０分間インキュベートした。インキュ
ベーション後、試料をＯＲＩＧＥＮ^TM ＡＮＡＬＹＺＥＲ（Ｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のカルーセル上に配置し、そして機器の説
明書に従ってアッセイした。

【００５８】（実施例５）（試験試料中のオーシスト数の測定）試験試料（上記の実施例４に記載されている）中に検出されるＣ．ｐａｒｖｕ
ｍオーシスト数の測定は、初めに試験試料および陽性コントロールから陰性試料
のＥＣＬカウントの差し引きを必要とする。非特異的アッセイから得られる陽性
コントロールおよび試験試料のＥＣＬカウントを、特異的アッセイから得られる
対応試料のＥＣＬカウントから差し引く。この陽性試料から得られた生味のＥＣ
Ｌカウントを使用して標準曲線を作成し、試験試料中のオーシスト数の算定に使
用する。１ｍｌの試料容積に対し、１０倍の算定量のオーシストが、この試料に
存在する。

【００５９】以下の式を使用し、１００リットルの水試料中の全オーシスト数を算定した。Ｔ＝［（１０Ｎ×Ｅ）／（Ｑ／１００）］×（１００％／Ｒ）Ｔ＝１００Ｌの水試料中の全オーシスト数Ｎ＝試験試料中のオーシスト数／０．１ｍｌ（標準曲線から得られる）Ｅ＝濾過試料の全容積（ｍＬ）Ｑ＝カートリッジフィルターを介して収集した水試料の全容積（Ｌ）Ｒ＝使用されたフィルターカートリッジの理論的なオーシスト回収率。

【００６０】（Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシストを含む試験試料に対する電気化学発光アッセイ
の結果）異なる数のオーシスト（１０¹〜１０⁶）を、種々の比濁計の濁度単位（ＮＴＵ
）値（５０７７ＮＴＵ，４１２５ＮＴＵおよび、３３０，０００ＮＴＵ）を有す
る緩衝液または沈澱試料にスパイクし、次いで上記のように、電気化学発光によ
って可溶性ＯＷ３抗原の存在についてアッセイした。図１および２に示されるよ
うに、濁度の上昇は、このアッセイの感度または精度に悪影響を及ぼさなかった
。また、図１および２に示されるように、このアッセイは、１ミリリットル試料
当たり１０００オーシスト程度を検出し得る。

【００６１】図３および４では、種々のＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種から１０³〜１０⁵オーシストを、糞便懸濁試料にスパイクし、そして可溶化ＯＷ３抗原の存在についてアッセイした。図３におけるグラフは、Ｃ．ｐａｒｖｕｍに対するこの
現方法の特異性を示す。図４は、Ｃ．ｐａｒｖｕｍおよびＣ．ｂａｉｌｅｙｉに
関する試験結果を比較し、そしてＣ．ｐａｒｖｕｍに特異的なモノクローナル抗
体を利用しているこのアッセイが、Ｃ．ｂａｉｌｅｙｉと交叉反応し得ないこと
を示す。

【００６２】本方法の改変および変更は、先の詳細な記載から当業者に明らかである。この
ような改変および変更は、添付の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、種々の比濁分析濁度ユニット（ＮＴＵ）値を有する緩衝液または沈降
試料中のＣ．ｐａｒｖｕｍオーシストの電気化学発光（ＥＣＬ）の計数値によっ
て測定された、滴定曲線を示すグラフである。

【図２】図２は、緩衝溶液対沈降試料において、試料あたりの電気化学発光値として測
定したオーシスト検出の比較を示す棒グラフである。グラフは、本明細書記載の
方法を使用して、最高３３０，０００ＮＴＵまでの沈降試料が、スパイクされた
試料中のＯＷ３抗原の存在についてアッセイされ得ることを示す。

【図３】図３は、本明細書記載の検出アッセイを使用して、Ｃ．ｐａｒｖｕｍに特異的
なモノクローナル抗体で測定した、９の異なる寄生生物に対する電気化学発光値
を示す棒グラフである。

【図４】図４は、Ｃ．ｐａｒｖｕｍおよび関連種のＣ．ｂａｉｌｅｙｉに対する示差的
電気化学発光値を示す棒グラフであり、本明細書記載の検出アッセイが、Ｃ．ｐ
ａｒｖｕｍに対して特異的であって、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｂａｉ
ｌｅｙｉと交差反応しないことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ツァン，ビクターシー．ダブリュー．アメリカ合衆国ジョージア 30033，デカター，オーククロッシングドライブ 2595 (72)発明者リー，リュク−ムイアメリカ合衆国ジョージア 30360，ドラビル，ウィンターズチャペルロード 4920，アパートメントイー−３ (72)発明者ジョンソン，パトリックダブリュー．アメリカ合衆国ジョージア 30033，デカター，ウィルビープレイス 2190 (72)発明者アローウッド，マイケルジェイ．アメリカ合衆国ジョージア 30136，ダルス，ワゴンウィールトレイス 2466 (72)発明者コール，ジェフリーエル．アメリカ合衆国ジョージア 30084，タッカー，リヘイブンドライブ 2471

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の寄生生物を検出するための方法であって、該方法は
、該試料を、可溶化緩衝液と共に、寄生生物の分子マーカーを可溶化するために
十分な時間、インキュベートする工程と、１ｍｌの試料あたり５０，０００未満
のオーシストの濃度で可溶化分子マーカーを検出する工程とを包含する、方法。
【請求項２】前記可溶化緩衝液が、緩衝化された溶液中に、界面活性剤、
変性剤またはその両方を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記分子マーカーが、寄生生物のオーシスト壁の膜結合性の
タンパク質あるいは糖タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記寄生生物が、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍである、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記寄生生物が、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒ
ｖｕｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記分子マーカーが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐ
ａｒｖｕｍオーシストの抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記分子マーカーが、イムノアッセイにより検出される、請
求項１に記載の方法。
【請求項８】前記可溶化分子マーカーが抗原であり、かつ、以下の工程：ａ）該可溶化された抗原に対して特異的な第１の抗体を、該可溶化された抗原
とインキュベートする工程であって、該抗体が該可溶化された抗原と結合して、
抗体−抗原複合体を形成する、工程；およびｂ）該抗体−抗原複合体を検出する工程であって、該複合体の検出が該試料中
の寄生生物の存在を示す、工程、によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記抗体が固相に結合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記可溶化分子マーカーが電気化学発光によって検出され
る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】請求項１に記載の方法であって、前記抗体−抗原複合体と
、可溶化された抗原に対して特異的な第２の次抗体とを共にインキュベートする
工程をさらに包含し、該第２の抗体は、検出可能な標識で標識され、かつ該抗体
−抗原複合体に結合する、方法。
【請求項１２】前記標識が、電気化学発光標識、化学発光標識、酵素標識
、生物発光標識、および蛍光標識からなる群から選択される、請求項１１に記載
の方法。
【請求項１３】前記電気化学発光標識が、ルテニウムおよびエクオリンか
らなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記可溶化分子マーカーが、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉ
ｕｍｐａｒｖｕｍオーシストのＯＷ３抗原のエピトープである、請求項１に記
載の方法。
【請求項１５】前記試料が、可溶化された緩衝液と共に、室温より高い温
度下で、少なくとも３０分間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記試料が水試料（ｗａｔｅｒｓａｍｐｌｅ）である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】前記水試料が、娯楽用の水（ｒｅｃｒｅａｔｉｏｎａｌ
ｗａｔｅｒ）、天然の水、および公用の貯水槽の水からなる群から選択される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】前記試料が生物学的試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】前記試料が糞便試料である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】試料中に存在する寄生生物を検出するためのアッセイキッ
トであって、ａ）可溶化された寄生生物オーシストの分子マーカーに対して特異的である抗
体、および、ｂ）該試料中に存在する寄生生物オーシストの該分子マーカーを可溶化する、
可溶化緩衝液を包含する、アッセイキット。
【請求項２１】前記抗体が固相上で固定されている、請求項２０に記載の
アッセイキット。
【請求項２２】請求項２０に記載のアッセイキットであって、可溶化され
た分子マーカーに対して特異的な標識された抗体をさらに包含する、アッセイキ
ット。
【請求項２３】前記可溶化緩衝液が、緩衝化された溶液中に、界面活性剤
、変性剤またはその両方を含有する、請求項２０に記載のアッセイキット。
【請求項２４】前記抗体が、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖ
ｕｍの可溶化された分子マーカーに対して特異的である、請求項２０に記載のア
ッセイキット。