ES2201490T3

ES2201490T3 - Anticuerpos igg1 reactivos con la superficie de oocistos de cryptosporidium.

Info

Publication number: ES2201490T3
Application number: ES98922500T
Authority: ES
Inventors: Graham Vesey; Christopher Weir; Keith Leslie Williams; Martin Basil Slade; Duncan Veal
Original assignee: Australian Water Technologies Pty Ltd; Macquarie Research Ltd
Current assignee: Australian Water Technologies Pty Ltd; Access Macquarie Ltd
Priority date: 1997-05-19
Filing date: 1998-05-19
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2018-05-19
Also published as: WO1998052974A1; ATE237639T1; EP0991667A1; DE69813555T2; DE69813555D1; EP0991667A4; US6777222B1; EP0991667B1

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para producir anticuerpos de la subclase IgG1 reactivos con la superficie del Crystosporidiun oocysts, el procedimiento comprende: (a) separar al menos una parte de la pared del Crystosporidiun oocysts de las esporozoitas internas para formar una preparación oocysts-pared; (b) tratar la preparación oocysts-pared separada para obtener una preparación oocysts antígena capaz de producir una respuesta inmune del IgG1 detectable en un animal, sobre la superficie del Crystosporidiun oocysts; (c) inmunizar a un animal con la preparación del antígeno de oocysts para que manifieste una respuesta inmune IgG1 en el animal; y (d) obtener del animal anticuerpos IgG1 que reaccionen con la superficie del Crystosporidiun oocysts. Los anticuerpos IgG1 reaccionan sobre la superficie del Crystosporidiun oocysts.

Description

Anticuerpos IgG1 reactivos con la superficie de oocistos de Cryptosporidium.

Campo técnico

La presente invención se refiere a anticuerpos contra Cryptosporidium y a métodos para inducir anticuerpos específicos contra Cryptosporidium adecuados en animales.

Técnica antecedente

El parásito protozoario Cryptosporidium se encuentra entre los patógenos más comunes responsables de las diarreas en los seres humanos. La infección se produce cuando nuevos hospedadores ingieren oocistos de Cryptosporidium difundidos en las heces de individuos infectados. Recientemente, se han producido varios brotes grandes de criptosporidiosis en los que se ha identificado el agua que se bebe como fuente de infección. Ciertos estudios han demostrado que muchos suministros de agua superficial están contaminados con oocistos de Cryptosporidium.

Los métodos de laboratorio usados para detectar Cryptosporidium a menudo implican el uso de anticuerpos contra este organismo. Los métodos típicos usados para analizar muestras de agua con respecto a la presencia de este organismo incluyen microscopía y citometría o una combinación de estas técnicas. Los métodos de citometría de flujo implican la tinción de muestras con un anticuerpo monoclonal marcado con fluorescencia específico para la superficie de los oocistos de Cryptosporidium y después el análisis con un citómetro de flujo clasificador. Las partículas con las características de fluorescencia y dispersión de luz de los oocistos de Cryptosporidium se clasifican sobre un portaobjetos de microscopio y se examinan manualmente usando microscopía de epifluorescencia para confirmar su identidad como oocistos. Esta etapa de confirmación es necesaria porque, con un solo anticuerpo, el citómetro no puede distinguir los oocistos de las demás partículas presentes en las muestras de agua. Las partículas que el citómetro puede identificar de forma errónea como oocistos son partículas autofluorescentes tales como algas o partículas que no se unen específicamente al anticuerpo específico para los oocistos.

Se dispone de citómetros de flujo solo para análisis que son fáciles de utilizar y relativamente baratos. Estos citómetros no pueden realizar la clasificación. Para permitir la detección de oocistos de Cryptosporidium usando un citómetro sólo de análisis, la discriminación conseguida por el citómetro debe mejorarse de forma que no se identifiquen erróneamente como oocistos las partículas que no son oocistos. Los presentes inventores han demostrado previamente que es posible detectar un solo microorganismo específico en muestras de agua turbia con un citómetro de análisis si el microorganismo se marca con dos anticuerpos diferentes.

Desafortunadamente, los anticuerpos para Cryptosporidium disponibles actualmente no son ideales debido a su adherencia y existe la necesidad de anticuerpos más específicos y reactivos para la superficie de oocistos de Cryptosporidium. Se usan anticuerpos monoclonales (mAb) que son específicos para la superficie de oocistos de Cryptosporidium para detectar Cryptosporidium en muestras clínicas y ambientales. Todos los mAb disponibles que se unen a la superficie de los oocistos de Cryptosporidium son de las subclases de inmunoglobulina M (IgM) o IgG3. Serían preferibles anticuerpos monoclonales de la subclase IgG1 porque normalmente muestran menos unión no específica. Tales mAb serían más adecuados en los métodos usados actualmente para la detección e identificación de Cryptosporidium. Desafortunadamente, los intentos previos de los trabajadores en el campo de producir anticuerpos monoclonales IgG1 contra la superficie de oocistos de Cryptosporidium no han sido satisfactorios o no se han comprobado (Smith, 1994; MacDonald et al., 1991). En general, se considera que debido a las características antigénicas de este organismo, esta clase de anticuerpo no se produce por animales infectados o inmunizados (Smith, 1994).

En el documento WO 97/08204 presentado por los presentes inventores, se crearon anticuerpos monoclonales contra una serie de antígenos de oocistos de Cryptosporidium. Como antígenos, se usaron oocistos enteros o exquistados que se expusieron a diversos tratamientos. A partir de un total de ocho fusiones que incluían la selección de varios miles de hibridomas, sólo se identificó un hibridoma que era específico para la superficie de los oocistos de Cryptosporidium. Este anticuerpo monoclonal era de la subclase inmunológica IgM.

Los presentes inventores ahora han creado un nuevo método que permite la producción de anticuerpos IgG1 contra la superficie de oocistos de Cryptosporidium.

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención consta de un método para producir anticuerpos de la subclase IgG1 reactivos con la superficie de oocistos de Cryptosporidium, que comprende:

(a): pretratar oocistos de Cryptosporidium con un reactivo para retirar la capa superficial de los oocistos para formar una preparación de antígenos de oocisto;

(b): separar los oocistos de la preparación de antígenos para obtener una preparación de antígenos de oocistos separada capaz de inducir una respuesta inmune IgG1 detectable en un animal contra la superficie del oocisto;

(c): inmunizar a un animal con la preparación de antígenos de oocisto separada para inducir una respuesta inmune IgG1 en el animal;

(d): obtener a partir del animal anticuerpos IgG1 reactivos con la superficie de oocistos de Cryptosporidium.

Se apreciará que una vez que se ha estimulado una respuesta inmune adecuada en un animal, por ejemplo en un ratón de laboratorio, pueden generarse anticuerpos monoclonales de la subclase IgG1 por medio de técnicas convencionales a partir de ese animal.

En una realización preferida del primer aspecto de la presente invención, el reactivo usado para preparar la preparación de antígenos es un detergente, preferiblemente el detergente dodecil sulfato sódico (SDS). Un pretratamiento adecuado implica hervir los oocistos en presencia de SDS durante un período de tiempo suficiente como para generar una preparación de antígenos adecuada. Se ha descubierto que cuando se usa una concentración de SDS del 0,5% (p/v), es particularmente adecuada la ebullición durante 1 hora.

Otros reactivos adecuados incluyen urea, detergentes tales como octoxinol, conocido como Triton X-100 o nonident, enzimas tales como quitinasa, agentes oxidantes tales como hipoclorito sódico, peryodato sódico u ozono, y agentes reductores tales como mercaptoetanol y 1,1,1-tricloro- 2,2-bis[4-clorofenil]etano (DDT).

El pretratamiento retira los antígenos de la superficie del oocisto de una forma que permite la generación de anticuerpos IgG1 cuando se inyectan en un animal.

El animal puede inmunizarse por cualquier técnica adecuada para inducir una respuesta inmune en un animal. Con la preparación de antígenos también pueden incluirse adyuvantes antes de la inmunización del animal para promover una respuesta inmune fuerte en el animal.

En una realización preferida adicional, la preparación de antígenos también aumenta la producción de anticuerpos IgM cuando se pone en un animal.

En un segundo aspecto, la presente invención consta de un método para producir anticuerpos de la subclase IgG1 reactivos con la superficie de oocistos de Cryptosporidium, comprendiendo el método:

(a): separar al menos una porción de la pared de los oocistos de Cryptosporidium de los esporozoítos internos para formar una preparación de pared de oocistos;

(b): tratar la preparación de pared de oocistos separada para obtener una preparación de antígenos de oocistos capaz de inducir una respuesta inmune IgG1 detectable en un animal contra la superficie del oocisto;

(c): inmunizar a un animal con la preparación de antígenos de oocisto separada para inducir una respuesta inmune IgG1 en el animal; y

Los presentes inventores han descubierto que para obtener una preparación de antígenos de pared de oocisto adecuada, la pared del oocisto debe separarse de los esporozoítos internos. Parece ser que los antígenos de los esporozoítos internos son más inmunodominantes que los antígenos de la pared del oocisto, y su presencia en una preparación de antígenos puede enmascarar a los antígenos de la pared del oocisto. Una preparación de antígenos mezclados normalmente inducirá anticuerpos contra los antígenos del esporozoíto.

La separación de la pared del oocisto del esporozoíto interno (etapa (a)) puede conseguirse por cualquier medio. Los presentes inventores han descubierto que es particularmente adecuada la inducción de la exquistación del oocisto seguida de una inmuno-separación de los componentes de la pared. La separación también puede conseguirse por medio del marcaje de la superficie de los oocistos enteros con un ligando, tal como biotina, permitiendo la separación de los fragmentos de la pared celular de los componentes internos por reacción con un reactivo que reaccione con el ligando, tal como avidina, sobre una matriz insoluble o sobre perlas. Sin embargo, se apreciará que también serían adecuados otros métodos de separación conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen centrifugación, citometría de flujo, separación por gradiente de densidad, precipitación, inmuno-marcaje, unión a ligandos, marcaje con biotina y separación por avidina, y separación cromatográfica.

No es necesario provocar la exquistación del oocisto por procedimientos normales. Los oocistos pueden someterse a ciclos de congelación-descongelación, por ejemplo, para promover la separación inicial de la pared de los esporozoítos internos. Además, el oocisto puede romperse físicamente por aplastamiento, sonicación o trituración seguidas de separación.

La etapa de tratamiento (b) puede realizarse por cualquier medio adecuado. En particular, los presentes inventores han descubierto que la ruptura física de la pared celular puede producir una buena preparación de antígenos. Esto puede realizarse por cualquier medio, pero es bastante adecuado el uso de una batidora de perlas.

El tratamiento retira los antígenos de la superficie de la pared de oocisto de una forma que permita la generación de anticuerpos IgG1 cuando se inyectan en un animal.

Se apreciará que una vez que se ha estimulado una respuesta inmune adecuada en un animal, por ejemplo, en un ratón de laboratorio, pueden generarse anticuerpos monoclonales de la subclase IgG1 por técnicas convencionales a partir de ese animal.

El animal puede inmunizarse por cualquier técnica adecuada para inducir una respuesta inmune en un animal. También pueden incluirse adyuvantes con la preparación de antígenos antes de inmunizar al animal para promover una respuesta inmune fuerte en el animal.

En otra realización preferida, la preparación de antígenos también aumenta la producción de anticuerpos IgM cuando se pone en un animal.

Como los presentes inventores han determinado métodos que permiten la producción de anticuerpos IgG1 útiles reactivos con la superficie de oocistos de Cryptosporidium, se apreciará que ahora pueden producirse anticuerpos similares a los producidos por los presentes inventores a partir de la información y las enseñanzas proporcionadas en este documento.

En un tercer aspecto, la presente invención consta de anticuerpos IgG1 aislados sustancialmente, reactivos con la superficie de oocistos de Cryptosporidium, producidos por el método de acuerdo con el primer o segundo aspectos de la presente invención.

Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que el término "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Para que la presente invención pueda entenderse más claramente, las formas preferidas se describirán haciendo referencia a los siguientes ejemplos y a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los Dibujos

La figura 1 muestra la comparación de anticuerpos monoclonales para teñir oocistos en muestras de agua.

La figura 2 muestra el análisis citométrico de flujo de oocistos de Cryptosporidium sembrados en un concentrado de agua compuesta. La población de oocistos fluorescentes se separa claramente de las partículas autofluorescentes y extrañas unidas de forma no específica al anticuerpo. Como se observa en esta figura, la concentración óptima de mAb a usar para el análisis del agua tiene que definir una separación clara de la fluorescencia de fondo.

La figura 3 muestra el análisis citométrico de flujo de una muestra de control de oocistos de Cryptosporidium teñidos de forma fluorescente. En la población principal de oocistos fluorescentes puros se centra una región elíptica de tamaño por defecto para cada anticuerpo (R1). Alrededor de la población patrón en perlas se define una región poligonal (R2).

La figura 4 muestra el análisis citométrico de flujo de un concentrado de agua que no contiene oocistos ni quistes. Las regiones son las de la figura 2 para cada mAb examinado. El número de partículas dentro de los oocistos o de la región de quistes (R1) incluye tanto partículas autofluorescentes como partículas unidas de forma no específica. El número de partículas en R1 se divide por el número de perlas analizadas (R2). El resultado es una relación de unión no específica comparable entre anticuerpos.

Modos para realizar la invención Materiales y métodos Oocistos de Cryptosporidium

Se purificaron oocistos de Cryptosporidium parvum a partir de heces recogidas de terneros recién nacidos infectados de forma natural en Sydney. Las muestras fecales se centrifugaron (2000 g, 10 min.), se resuspendieron en agua dos veces y después se resuspendieron en 5 volúmenes de NaHCO_{3} al 1% (p/v). Después se extrajeron las sustancias grasas dos veces con 1 volumen de éter, seguido de centrifugación (2000 g durante 10 min.). Los sedimentos se resuspendieron en agua y se filtraron a través de una capa de algodón en rama no adsorbente prehumedecido. El eluato después se aplicó sobre 10 volúmenes de solución de sacarosa al 55% (p/v) y se centrifugó (2000 g durante 20 min.). Se recogieron oocistos de la interfase de sacarosa y la etapa de flotación en sacarosa se repitió hasta que ya no podía detectarse material contaminante visible. Los oocistos purificados se esterilizaron superficialmente con etanol al 70% (v/v) enfriado con hielo durante 30 min., se lavaron una vez en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Oxoid, Sydney) y se almacenaron en PBS a 4ºC durante un periodo de hasta 2 semanas.

Preparación de antígenos Extracción de la superficie

Se centrifugó una muestra de 2 ml de oocistos que contenía aproximadamente 2x10^{9} oocistos a 13000 g durante 1 minuto y el sobrenadante se retiró y se desechó. Los oocistos se resuspendieron en 2 ml de SDS al 0,5% (p/v) enfriado con hielo y se pusieron en un baño de agua hirviendo durante una hora. La muestra después se centrifugó a 13000 g durante 20 minutos para retirar los oocistos. El sobrenadante se retiró cuidadosamente, se mezcló con 10 ml de acetona y se puso a -20ºC durante 8 horas. La muestra después se centrifugó a 13000 g durante 10 minutos y el sobrenadante se desechó. Después se resuspendió un pequeño precipitado blanco en PBS estéril.

La concentración de proteínas se midió usando el ensayo de proteínas Biorad DC disponible en el mercado, usando el protocolo convencional y albúmina de suero bovino (BSA) como patrón.

Paredes de oocistos

Se exquistaron oocistos de Cryptosporidium como se describe por Robertson et al. (1993). Se centrifugó una muestra de 1 ml de oocistos que contenía aproximadamente 1 x 10^{9} oocistos a 13000 g durante 1 minuto y el sobrenadante se retiró y se desechó. Los oocistos se resuspendieron en 1 ml de solución salina equilibrada de Hank acidificada (HBSS), pH 2,7, y se incubaron a 37ºC durante 30 min. Las muestras después se lavaron y se resuspendieron en 1 ml de HBSS con 100 \mul de desoxicolato sódico al 1% (p/v) en medio esencial mínimo de Hank (HMEM) y 100 \mul de NaHCO_{3} al 2,2% (p/v) en HBSS, y se incubaron a 37ºC durante 4 h. La muestra después se analizó usando el citómetro de flujo Coulter Elite como se ha descrito previamente (Vesey et al., 1997). La población con la menor señal de dispersión de luz de ángulo hacia adelante se clasificó en tubos de ensayo y se concentró por centrifugación a 3000 g durante 20 minutos. Se almacenaron muestras concentradas a -20ºC en PBS.

Exquistación de oocistos

La exquistación se realizó como se ha descrito anteriormente para las paredes de oocistos.

Purificación de Paredes de oocistos:

Las paredes de los oocistos se purificaron a partir de la muestra exquistada usando separación inmuno-magnética. Un alícuota de 0,5 ml de perlas magnéticas (aproximadamente 5 x 10^{7} perlas) recubiertas con un anticuerpo IgM de cabra anti-ratón (Dynal Pty Ltd, Australia) se mezcló con 10 ml de sobrenadante de cultivo de tejidos de un anticuerpo monoclonal específico para oocistos de Cryptosporidium, CRY26. Las perlas se incubaron a 4ºC durante 4 horas y después se pusieron cerca de un imán de forma que las perlas fueran atraídas hacia el fondo del tubo. El sobrenadante se retiró y se desechó y las perlas se resuspendieron en 10 ml de PBS más albúmina de suero bovino al 2% (p/v) (BSA; fracción V de Sigma) (PBS-BSA). Este procedimiento de lavado se repitió dos veces y las perlas se resuspendieron en un volumen final de 1 ml de PBS-BSA. Las perlas después se mezclaron con la muestra de oocistos exquistados y se incubaron en un agitador rotatorio a temperatura ambiente durante 30 minutos. El tubo se puso cerca del imán de forma que las perlas y los oocistos unidos fueran atraídos hacia el fondo del tubo. El sobrenadante se retiró y se puso a 4ºC. Para retirar todos los esporozoítos contaminantes, las perlas se resuspendieron suavemente en 1 ml de PBS-BSA y después se concentraron una vez más usando el imán. El sobrenadante se retiró y se desechó. Las perlas se resuspendieron en 1 ml de PBS y se agitaron vorticialmente de forma vigorosa para separar las perlas de las paredes de los oocistos. Las perlas se concentraron usando el imán y el sobrenadante que contenía las paredes de los oocistos se retiró y se mantuvo en hielo. Después, las perlas se añadieron a la muestra original de oocistos exquistados y se repitió el procedimiento entero 10 veces. Después, las 10 muestras de paredes de oocistos purificadas se reunieron y se concentraron por centrifugación a 3000 g durante 10 minutos. Una fracción de la muestra de paredes de oocistos se analizó usando citometría de flujo como se ha descrito previamente (Vesey et al., 1997). La muestra se analizó en un tubo que contenía un número exacto de perlas (TrueCount, Becton Dickinson, San Hose, USA) para determinar el número de paredes de oocistos.

Ruptura de las paredes de los oocistos

La mitad de la muestra de paredes de oocistos se trató para romper las paredes en pequeñas piezas, usando una batidora de perlas FastPrep (Bio101, CA, USA) quince veces a la velocidad máxima durante 40 segundos. La muestra se enfrió en hielo durante 1 minuto entre cada tratamiento de 40 segundos. Las piezas de pared de oocisto se resuspendieron en 3 ml de PBS, se extrajeron alícuotas en cantidades de 200 \mul y se almacenaron congeladas hasta el uso.

Inmunización de ratones Método 1

Se inmunizaron cinco ratones hembra Balb/C por inyección IP con 200 \mug del extracto de la superficie de oocistos (ratones del grupo E) o 4 x 10^{4} paredes de oocistos (ratones del grupo W). Las preparaciones de antígenos se emulsionaron en adyuvante completo de Freund. Se extrajo sangre de los ratones antes de recibir la inyección primaria para proporcionar un control negativo. Se administraron dos inyecciones IP adicionales con la misma cantidad de antígeno pero emulsionado en adyuvante incompleto de Freund a intervalos de 3 semanas. Se extrajo sangre de los ratones después de la segunda de estas inyecciones para comprobar la respuesta inmune. Los ratones del grupo E recibieron dos refuerzos intravenosos finales de 200 \mug de antígeno 3 días y 1 día antes de la fusión.

Método 2

Cinco ratones Balb/C hembra (grupo WP) se inmunizaron por inyección IP con 200 \mul de preparación de paredes de oocisto fragmentadas emulsionada en adyuvante completo de Freund. La preparación contenía aproximadamente 1 x 10^{6} paredes de oocistos.

Un segundo grupo de ratones (grupo WI) se inmunizó con aproximadamente 1 x 10^{6} paredes de oocisto purificadas intactas emulsionadas en adyuvante completo de Freund. Se extrajo sangre de los ratones a partir de la vena de la cola antes de recibir la inyección primaria para proporcionar un control negativo. Se administraron dos inyecciones IP adicionales con la misma cantidad de antígeno pero emulsionadas en adyuvante incompleto de Freund a intervalos de 3 semanas. Se extrajo sangre de los ratones después de la segunda de estas inyecciones para comprobar la respuesta inmune.

Los ratones pueden recibir inyecciones de refuerzo IP o IV hasta 7 días antes del sacrificio y la fusión de las células de bazo para ayudar al desarrollo de los anticuerpos apropiados.

Análisis de suero de ratón

Se recogieron muestras (aproximadamente 50 \mul) de sangre de la vena de la cola y después se centrifugaron a 13000 g durante 30 segundos. La capa superior de suero se retiró cuidadosamente y se almacenó a -20ºC hasta que se analizó. El suero se diluyó a 1 en 100, 1 en 1000 y 1 en 10.000 en albúmina de suero bovino al 1% (p/v) en PBS (BSA-PBS). Se mezclaron alícuotas (50 \mul) de suero diluido con 10 \mul de suspensión de oocistos en PBS (que contenía aproximadamente 1 x 10^{6} oocistos) y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las muestras se mezclaron con 50 \mul de anticuerpo específico IgM de cabra anti-ratón conjugado con FITC (diluido 1 en 50 con BSA- PBS) (número de producto de Sigma) o con 50 \mul de anticuerpo específico IgG de cabra anti-ratón conjugado con PE (diluido 1 en 200 con BSA-PBS) (Sigma). Después de 20 minutos más de incubación a temperatura ambiente, las muestras se analizaron usando un citómetro de flujo FACScan. Se analizó un control negativo de PBS y un control positivo de IgM del sobrenadante de cultivo de tejidos de un anticuerpo monoclonal IgM específico para la superficie de oocistos de Cryptosporidium con cada lote de muestras. Se registraron las intensidades de fluorescencia medias de las muestras teñidas con FITC y PE.

Las muestras de suero de ratón diluido 1 en 500 en BSA-PBS se analizaron usando transferencia de western.

Producción de hibridomas

Se sacrificaron ratones, se diseccionaron células de bazo y se fusionaron con células de mieloma de ratón NS1, y los hibridomas resultantes se clonaron. Un volumen de 50 \mul de sobrenadante de cultivo de tejidos de cada hibridoma se mezcló con 10 \mul de suspensión de oocistos en PBS (que contenía aproximadamente 1 x 10^{6} oocistos). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos y después se mezclaron con 50 \mul de anticuerpo de cabra anti-ratón específico tanto para anticuerpos IgM como para anticuerpos IgG y se conjugaron con FTTC (diluido 1 en 100 con BSA- PBS) (Silenus, Melbourne). Después de 20 minutos más de incubación a temperatura ambiente, las muestras se analizaron usando un citómetro de flujo FACScan. Con cada lote de muestras se analizó un control negativo de sobrenadante de cultivo de tejidos de un anticuerpo específico para Dictyostelium (MUD62) y un control positivo de sobrenadante de cultivo de tejidos de un anticuerpo monoclonal IgM específico para la superficie de oocistos de Cryptosporidium (CRY26). Los hibridomas que produjeron una mayor fluorescencia media (FL1) que el control negativo se clonaron y se ensayaron una vez más.

Las subclases inmunológicas de anticuerpo monoclonal producidas por los clones se identificaron usando el Kit Sigma Immuno Type.

Selección de hibridomas

Aproximadamente 7-14 días después de la fusión, se controlaron las placas de microtitulación para comprobar el crecimiento de hibridomas. Se marcaron los hibridomas visibles a 40 aumentos, se tiñeron y se retiraron asépticamente 100 \mul de sobrenadante de cultivo de tejidos sin alterar los hibridomas que estaban en el fondo. Todos los hibridomas después se volvieron a alimentar con 100 \mul de medio reciente para permitir el cultivo continuado.

Selección Inicial:

A cada 100 \mul de sobrenadante de hibridoma recogido, se les añadieron 10 \mul de 1 x 10^{8} oocistos y las mezclas se dejaron incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después se añadió un segundo anticuerpo anti-ratón conjugado con FITC (Amrad) (100 \mul a una dilución de 1:50) y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las muestras después se analizaron por citometría de flujo. Se midió la intensidad de fluorescencia de la población de oocistos. La alta fluorescencia observada en el histograma indicó un resultado positivo con respecto a los anticuerpos anti-Cryptosporidium. Todos los positivos se marcaron y se desarrollaron para el cultivo adicional.

Selección secundaria:

Una vez cultivados los hibridomas positivos en placas de microtitulación de 12 pocillos, se ensayaron para determinar la clase de anticuerpos IgM o IgG. Una muestra de 100 \mul de cada positivo se puso en dos tubos separados. A cada tubo se le añadieron 10 \mul de 1 x 10^{8} oocistos y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. A cada tubo duplicado, se le añadieron 100 \mul de anti-IgG marcado con FITC prediluido (Zymed 61-6011), o anti-IgM marcado con FITC (Sigma F-9259) y los tubos se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Cada muestra después se analizó por citometría de flujo. La alta fluorescencia de la población de oocistos observada en un histograma indicó un resultado positivo para la subclase de anticuerpo, que podría confirmarse posteriormente.

Confirmación de subclases:

En todos los hibridomas positivos se confirmó el isotipo por un ensayo de hemaglutinación disponible en el mercado (Serotec), que emplea eritrocitos de oveja conjugados con un anticuerpo que reconoce específicamente un isotipo de Ig de ratón.

Análisis de anticuerpos para la tinción de oocistos en muestras de agua

La eficacia de mAb para uso en muestras de agua se evaluó por citometría de flujo. Se añadió un volumen de 100 \mul de sobrenadante a muestras sembradas. Las muestras sembradas constaban de 50 \mul de concentrado de agua y 100 \mul de una siembra de alta concentración de oocistos. Se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de esta incubación, se añadió un volumen de 100 \mul de anticuerpo anti-ratón conjugado con FTTC (Silenus, 1:50) y las muestras se incubaron durante 20 minutos más. Después, las muestras se analizaron usando citometría de flujo. Los datos se analizaron para determinar el anticuerpo que producía la mayor separación entre la población de control inmunofluorescente (oocistos) y las partículas fluorescentes de fondo detectadas dentro de los concentrados de agua.

Medición funcional de la avidez

La avidez de la unión (constante de afinidad del anticuerpo entero) de los anticuerpos anti-Cryptosporidium marcados con FITC CRy104, CRY26 y un anticuerpo anti-Cryptosporidium marcado con FITC comercial (Immunocel) se midió como se indica a continuación. Se diluyeron en serie anticuerpos de una concentración conocida a partir de una concentración de 20 \mug hasta diluciones de 20 veces. Cada concentración de mAb después se incubó con 1 x 10^{7} oocistos durante 20 minutos a temperatura ambiente. También se preparó un control negativo de oocistos en PBS para proporcionar un punto final para la unión. Los valores de fluorescencia (FL-1) para cada dilución se registraron y representaron. Se obtuvo el valor para la unión máxima del 50% a los oocistos para cada mAb analizado. Se supuso que el anticuerpo de entrada total es casi igual que el que el anticuerpo libre, por lo tanto, la constante de disociación (Kd) es igual a esta concentración (50%). Después se calcula la constante de afinidad (Ka) como el valor inverso.

Citometría de flujo

Para el análisis del suero de ratón y de los hibridomas se usó un citómetro de flujo FACScan. Se usaron señales logarítmicas para todos los detectores. El umbral se fijó sobre la dispersión lateral a un valor de 500. Los detectores se fijaron a los siguientes niveles de sensibilidad: 200 para la dispersión lateral (SSC); E00 para la dispersión hacia adelante (FALS); 600 para el detector de fluorescencia verde (FL-1) y 600 para el detector de fluorescencia roja (FL-2). Se definió una región (R1) en un gráfico de puntos de FALS frente a SSC que encerraba oocistos individuales, pero no grupos de oocistos. Los histogramas de FL1 y FL2 se desconectaron cíclicamente para que las únicas partículas que aparecían en la región R1 aparecieran en los histogramas. Se registró el valor medio de FL1 y/o FL2 de los histogramas para 2000 oocistos de cada muestra analizada.

Electroforesis en dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (PAGE)

Se añadieron doscientos \mul de oocistos a 5 x 10^{7} - 10^{8} células/ml a un volumen igual de tampón reductor (compuesto de 975 \mul de Tris HCl 0,125 M/SDS al 0,5% (p/v), 150 \mul de glicerol, 225 \mul de SDS al 10% (p/v), 150 \mul de 2-mercaptoetanol y 20 \mul de azul de bromofenol (0,25% p/v) y la mezcla se hirvió durante 3 minutos a 100ºC.

Esta muestra reducida después se procesó en un gel de separación de poliacrilamida al 12% con un gel de adherencia al 5% en un aparato de células Biorad Miniprotean II. Se procesaron proteínas para marcadores de alto y bajo peso molecular (Novex) al lado de la muestra durante aproximadamente 45-60 minutos a 200 voltios.

Transferencia de Western

Se mezclaron alícuotas (100 \mul) de una suspensión de oocistos en PBS que contenía aproximadamente 5 x 10^{7} oocistos con 100 \mul de tampón de reducción y se hirvieron durante 2 minutos. La muestra entera se introdujo en un gel plano con un 10% de SBS y se procesó a 150 V durante 1 hora. Se incluyó una muestra de marcadores de peso molecular preteñida (Novex). Después de la SBS-PAGE, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa usando un sistema de electrotransferencia semiseco y un sistema tampón discontinuo. La nitrocelulosa después se cortó en tiras de 2 mm de anchura y se sumergió en leche desnatada al 2% (p/v) en PBS. Las tiras después se incubaron con sobrenadante de cultivo de hibridoma o suero de ratón. Como control positivo se incluyó sobrenadante de cultivo de tejidos de un anticuerpo monoclonal IgM específico para Cryptosporidium. Las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las tiras de nitrocelulosa después se aclararon durante 3 x 5 minutos en leche desnatada en polvo al 3% (p/v) en PBS; y después se incubaron durante 1 h en anticuerpo de cabra anti-ratón (específico tanto para anticuerpos IgM como para anticuerpos IgG) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP, Tago, Inc. Burlingame, California, USA), diluido a 1:1500 con leche desnatada en polvo al 3% (p/v) en PBS. Las tiras después se lavaron 3 veces durante 5 min en PBS y se revelaron usando una solución nueva de substrato 4CN y finalmente se lavaron extensamente con agua corriente durante al menos 20 minutos.

Muestras de agua

Se recogieron muestras (10 l) de agua superficial no tratada de diversas localizaciones de Australia y se concentraron usando una técnica de floculación (Vesey et al. 1993a). Se preparó una muestra compuesta de agua superficial no tratada mezclando alícuotas de muestras de 15 sitios diferentes. La muestra se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos y el sedimento se resuspendió en PBS. Se sembraron alícuotas (50 \mul) de concentrado de muestra de agua con 10 \mul de suspensión de oocistos (que contenía aproximadamente 1000 oocistos) y se mezclaron minuciosamente. Las muestras después se mezclaron con 50 \mul de sobrenadante de cultivo de tejidos de un anticuerpo monoclonal específico para Cryptosporidium y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después se añadió una alícuota (50 \mul) de un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con FTTC (específico tanto para anticuerpos IgG como para anticuerpos IgM) (Silenus) diluido 1 en 300 en PBS-BSA a cada muestra y las muestras se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras después se analizaron usando citometría de flujo.

Métodos alternativos

Para separar las paredes de oocistos de los esporozoítos, los oocistos pueden someterse a ciclos de congelación-descongelación en lugar de exquistarse. Se requiere una etapa de puficación, tal como separación inmuno-magnética, citometría de flujo o separación por gradiente de densidad, para purificar las paredes de los oocistos de los esporozoítos. Los presente inventores han preparado muestras de pared celular por medio de la tinción de la superficie de oocistos enteros con biotina y, después de la exquistación, la unión de las paredes celulares a perlas magnéticas marcadas con avidina.

Una estrategia alternativa implicaría la fragmentación de los oocistos enteros (con los esporozoítos aún dentro) en pequeñas piezas y después el uso de un método de purificación inmunológica, tal como cromatografía de separación inmuno-magnética o de afinidad.

Podrían usarse otros métodos alternativos tales como sonicación para romper los oocistos o las paredes de oocistos purificadas.

Ensayos de comparación de anticuerpos Oocistos de Cryptosporidium y quistes de Giardia

Se aislaron oocistos de Cryptosporidium parvum a partir de terneros infectados de forma natural como se ha descrito previamente. Los oocistos se inactivaron térmicamente a 65ºC durante 15 minutos. Se obtuvieron quistes de Giardia lamblia fijados con formalina en Waterborne, Inc. (New Orleans, USA). Los quistes y los oocistos se almacenaron en solución salina tamponada con fosfato (fosfato 0,01 M, pH 7,3 \pm 0,2) (Oxoid) a 4ºC.

Anticuerpos específicos de Cryptosporidium y específicos de Giardia

En este estudio se evaluaron siete mAb específicos de Cryptosporidium y cuatro mAb específicos de Giardia, su proveedor, el marcador fluorescente y la clase de anticuerpo se describen en las tablas 3 y 4.

Muestras de agua concentradas

Se recogieron muestras (10 l) de agua superficial no tratada de diversos sitios de Australia y se concentraron por floculación o filtración. Se preparó una muestra de agua no tratada compuesta mezclando alícuotas de muestras de una serie de sitios diferentes. La muestra se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 min. y el sedimento se resuspendió en PBS. El volumen de la muestra se ajustó de forma que 100 \mul de concentrado fueran equivalentes a 5 litros de agua no tratada original. También se prepararon muestras a partir de diferentes tipos de agua que incluyen agua natural de río, aguas residuales, agua filtrada y agua contracorriente. Todas las muestras se prefiltraron a través de una malla de acero inoxidable de 38 micrómetros antes del uso.

Preparación de la muestra

Para estandarizar el ensayo se usaron perlas Fluorebrite™ (Polysciences, Inc. Warrington, PA, USA). Las perlas se añadieron a una alta concentración a albúmina de suero bovino (BSA, Sigma Chemical Co, St Louis USA) (4% p/v) en PBS y azida (0,05% v/v). Después se añadió el mismo volumen de perlas a cada muestra, haciendo posible controlar el volumen de concentrado analizado, por el número de perlas detectadas. Después se estandarizó el volumen de concentrado de agua analizado para cada muestra, produciendo un resultado por perla analizada. El tampón de muestra para la tinción de las muestras constaba de BSA (1% p/v) y Tween 20 (0,05% v/v) en PBS.

Concentraciones de anticuerpo

Primero se determinó la concentración o dilución óptima de cada anticuerpo a evaluar (tablas 3 y 4) por citometría de flujo. Se prepararon diluciones en serie para mAb de concentración proteica desconocida entre 1:20 y 1:1280 en tampón de muestra apropiado como se describe por el fabricante. Estos mAb de concentraciones proteicas conocidas se prepararon como diluciones en serie entre 8 \mug/ml y 0,5 \mug/ml. Se añadió una alícuota de 100 \mul de cada dilución a muestras sembradas. Las muestras sembradas constaban de 50 \mul de concentrado de agua y 50 \mul de una siembra con alto contenido de oocistos o de quistes. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se analizaron usando citometría de flujo. Los datos se analizaron para determinar la concentración de anticuerpo que producía la mayor separación entre la población de control inmunofluorescente (oocistos/quistes) y las partículas fluorescentes de fondo detectadas dentro de los concentrados de agua (figura 2).

Tinción de muestras de agua

Después de la optimización de las concentraciones de anticuerpo, cada mAb se diluyó a la concentración apropiada en tampón de muestra. Todas las muestras se prepararon en tubos Falcon de 5 ml. Se prepararon controles positivos que constaban de 50 \mul de la siembra de alta concentración respectiva. Se prepararon por triplicado muestras de agua a ensayar y constaban de 50 \mul de concentrado de agua. Cada mAb se añadió a los controles y a las muestras de agua hasta un volumen total de 150 \mul en tampón de muestra y se mezcló. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, las muestras se sembraron con alícuotas de 20 \mul del patrón de perlas Fluorbrite™. Las muestras después se mezclaron por agitación vorticial durante 5 segundos y se analizaron.

El Kit de mAb Hydrofluor contiene anticuerpos específicos para Cryptosporidium y específicos para Giardia no conjugados así como anticuerpo anti-ratón conjugado con FITC. Los reactivos se usaron como se recomienda en las instrucciones de los fabricantes.

Citometría de flujo

La comparación de mAb contra Cryptosporidium y contra Giardia se realizó usando un citómetro de flujo FACScan de Becton-Dickinson (Becton-Dickinson, Lane Cove, NSW Australia). El fluido de la cubierta constaba de Isoton II (Coulter Electronics, Brook Vale, NSW Australia) no diluido. Los detectores usados fueron detectores de dispersión de luz de ángulo lateral (SSC) frente a FL1 (fluorescencia verde). Los voltajes de los detectores se fijaron a 300 mV para SSC y 450 mV para todos los demás detectores. El umbral se fijó en el detector de fluorescencia 1 (FL1). La compensación se fijó a FL1- FL2 45%. Primero se analizaron muestras positivas para cada mAb. Se recogieron aproximadamente 1.000 sucesos, y se definió una región elíptica (R1) de tamaño por defecto se definió alrededor del centro de la población de oocistos o de quistes (figura 2). Se definió una región de clase rectangular (R2) alrededor del patrón de perlas respectivo usado. Una vez definidas las regiones de clase, se analizó una muestra de concentrado de agua para permitir que el operario aumentara o redujera el discriminador hasta que las partículas extrañas recogidas emitieran fluorescencia justo por debajo de R1 (figura 3). Una vez definidas todas las regiones, se recogieron 5000 sucesos para cada muestra. Fue importante mover R1 al centro de la población de oocistos o de quistes para cada anticuerpo evaluado, ya que la fluorescencia varía entre mAb.

Análisis de datos

Los análisis de datos se realizaron usando un software LYSIS II obtenido en Becton-Dickinson, (Lane Cove, NSW Australia). Para los análisis se usaron gráficos de puntos que definían SSC frente a FL1 (figuras 3 y 4). Las regiones se definieron como se ha indicado anteriormente. Para enumerar el número de perlas detectadas, se definió un rectángulo de clase (R2) alrededor de la población de perlas. Esta región se determinó por análisis de una muestra de control que constaba de perlas y oocistos/quistes (figura 3). La especificidad de cada mAb se calculó en términos de una relación de unión no específica dividiendo el número de sucesos recogidos en R1 por R2.

Análisis estadístico

La interpretación de los datos se realizó usando Microsoft Excell™4.0 y el Análisis Toolpack™ Add-in. La hipótesis de que las medias de diferentes muestras eran iguales se ensayó usando un análisis de varianza (ANOVA). Usando un nivel de significado del 5% (p<0,05), se calcularon los valores críticos para el parámetro estadístico F y se compararon con los obtenidos a partir del ANOVA.

Resultados Análisis de suero de ratón

El análisis citométrico de flujo de suero de ratón reveló una gran respuesta inmunológica contra la superficie de oocistos de Cryptosporidium en ratones del grupo E (tabla 1). Veintiún días después de la segunda inmunización, se detectaron anticuerpos tanto IgM como IgG específicos para Cryptosporidium en el suero de los ratones del grupo E. Los oocistos teñidos con suero de ratones del grupo E emitían una fluorescencia muy brillante aunque el suero se hubiera diluido a 1 en 10.000 (tabla 1). Las fluorescencias de los oocistos teñidos con el suero de los ratones del grupo W antes y 21 días después de la segunda inmunización no fueron significativamente diferentes (p>0,05), lo que indica que la inmunización no originaba la producción de anticuerpos específicos contra la superficie de oocistos de Cryptosporidium. No se detectó ningún anticuerpo específico contra la superficie de oocistos de Cryptosporidium en el suero de ratones del grupo W. Lo más probable es que la ligera diferencia entre los resultados de los ratones del grupo W y del grupo E antes de la inmunización se debiera a la variación en la sensibilidad del instrumento en diferentes días.

TABLA 1

Comparación de la intensidad de fluorescencia de oocistos de Cryptosporidium teñidos con suero
(diluido 1 en 1000) de ratones del grupo E y W y después teñidos con un anticuerpo anti- IgG o anti-IgM
marcado con fluorescencia. El suero se ensayó antes de la inmunización y 21 después de la
segunda inmunización.
ratón número	anticuerpo específico de IgG	anticuerpo específico de IgM
	Antes de la	Después de la	Antes de la	Después de la
	inmunización	inmunización	inmunización	inmunización
E1	12	1117	12	111
E2	9	460	11	121
E3	10	195	11	74
E4	10	1762	13	258
E5	12	550	12	33
W1	36	39	16	17
W2	45	32	27	14
W3	36	37	27	13
W4	42	30	25	27
W5	47	40	16	15
Control positivo*	42		978
(IgM)
Control negativo	27		17
ND - no determinado
* como control positivo se usó un anticuerpo monoclonal IgM específico para Cryptosporidium.
No se disponía de un control positivo de IgG.

Hibridomas

Se sacrificó el ratón número 4 del grupo E y las células de bazo se fusionaron con células de mieloma de ratón. La selección de los 230 clones resultantes identificó seis clones que producían anticuerpo específico de Cryptosporidium. Se descubrió que cinco de los clones (clones P9F1, P6G7, P6B11, P11D5 y P7D5) producían anticuerpo IgM específico contra la superficie de oocistos de Cryptosporidium. Un clon (CRy104) producía anticuerpos IgG1 específico contra la superficie de oocistos de Cryptosporidium.

Otras fusiones de células de bazo de ratones del grupo E han producido un gran número de hibridomas específicos para la superficie de oocistos de Cryptosporidium. Se han caracterizado otros anticuerpos IgG1 producidos por estos hibridomas. Esto demostró adicionalmente que los métodos de acuerdo con la presente invención son particularmente adecuados para producir anticuerpos IgG1 específicos para la superficie de oocistos de Cryptosporidium.

No se intentaron fusiones con ratones del grupo W debido a la deficiente respuesta inmunológica contra Cryptosporidium que se observó.

Evaluación de anticuerpos monoclonales

En la figura 1 se presentan los resultados del análisis citométrico de flujo de muestras de agua sembradas con oocistos y teñidas con algunos de los anticuerpos monoclonales específicos para Cryptosporidium. Deben tenerse en cuenta las diferencias en la posición de la población de oocistos a lo largo del eje Y. La población de oocistos está más cerca de la parte superior del gráfico de puntos para la muestra teñida con 8C12 (CRy104) que para cualquiera de las otras muestras. Esto se debe a que los oocistos emiten fluorescencia más brillante en esta muestra que en cualquier otra muestra. La fluorescencia de las partículas residuales (debajo de los oocistos) no es más brillante en la muestra 8C12 (CRY104) que en el control no teñido. La separación entre los oocistos y las partículas residuales es mayor en la muestra teñida con 8C12 (CRY104). Esto sugiere que este anticuerpo es el más útil para teñir oocistos de Cryptosporidium en muestras de agua. Por el contrario, la muestra teñida con 6G7 muestra un aumento en la fluorescencia de algunas de las partículas residuales (a la derecha de los oocistos) en comparación con el control no teñido. Esto se debe a que este anticuerpo se une a algunas de las partículas residuales y sugiere que este anticuerpo no puede ser útil para la tinción de oocistos de Cryptosporidium en muestras de agua.

El análisis citométrico de flujo de suero de ratones inmunizados con paredes de oocistos purificadas intactas (ratones del grupo WI) no reveló ninguna referencia en el brillo de los oocistos de Cryptosporidium teñidos con suero recogido antes o después de la inmunización (tabla 2). Se observaron resultados similares cuando se usaron segundos anticuerpos específicos de IgM y específicos de IgG. Por el contrario, cuando los oocistos se tiñeron con el suero de los ratones del grupo WP, hubo una diferencia en la intensidad de fluorescencia de los oocistos teñidos con el suero después de la inmunización y los teñidos con el suero previo a la inmunización. Los resultados fueron similares para los oocistos teñidos con anticuerpos secundarios específicos tanto de IgG como de IgM.

TABLA 2

Comparación de la intensidad de fluorescencia de oocistos de Cryptosporidium teñidos con suero
(diluido 1 en 100 o 1 en 1000) en ratones del grupo WI y WP y después teñidos con un anticuerpo
marcado con fluorescencia anti-IgG o anti-IgM. El suero se ensayó antes de la inmunización y 21 días
después de la segunda inmunización.
	anticuerpo específico de IgG	anticuerpo específico de IgM
ratón número	Antes de la	Después de la	Antes de la	Después de la
	inmunización	inmunización	inmunización	inmunización
^{1}WI1	36	39	16	17
WI2	45	32	27	14
WI3	36	37	27	13
WI4	42	30	25	27
WI5	47	40	16	15
^{2}WP1	^{3}230	248	404	420
WP2	231	518	405	514
WP3	229	306	403	475
WP4	233	290	410	417
WP5	232	350	407	603
^{1}WI - ratones inmunizados con paredes de oocistos purificadas intactas. El suero se diluyó 1 en 1000.
^{2}WP - ratones inmunizados con pequeñas piezas de paredes de oocistos purificadas. El suero se diluyó 1 en 100.
^{3} Los resultados de los dos grupo de ratones no son comparables directamente. El suero no se ensayó
a la misma dilución para los dos grupos de ratones. Se usaron diferentes segundos anticuerpos para ensayar
los ratones del grupo W y los ratones del grupo WP.

Ensayos de comparación de anticuerpos

Cuando se tiñeron muestras de agua concentrada con mAb dirigidos contra Cryptosporidium o Giardia, se observó un aumento significativo (p<0,05) en el número de partículas fluorescentes observadas con las muestras teñidas, en comparación con las no teñidas (tablas 5 y 6). Se observaron diferencias entre diferentes anticuerpos con respecto a la tinción inmunofluorescente, detectándose aumentos en las partículas fluorescentes entre los mAb. El anticuerpo IgG1 CRY104 produjo niveles significativamente menores (p<0,05) de unión no específica por el mAb fluorescente a partículas extrañas presentes en el agua, en comparación a cuando se tiñó con anticuerpos de las subclases IgM o IgG3 (tabla 5). El anticuerpo IgG1 G203 producido específicamente para el análisis de Giardia en el agua, produjo partículas de fondo significativamente menos fluorescentes que cuando se tiñó con anticuerpos producidos para el análisis fecal que incluían una IgG1 (tabla 6).

Se seleccionaron anticuerpos específicos (tanto para Giardia como para Cryptosporidium) para la evaluación del efecto de los mAb sobre la tinción de diferentes tipos de agua. Se observaron niveles estadísticamente diferentes (P<0,05%) de unión no específica de partículas a anticuerpos entre diferentes tipos de agua tanto para el análisis de Giardia como para el análisis de Cryptosporidium (tablas 7 y 8). La variación observada después de la tinción con una IgG3 fue mayor entre las aguas que la variación observada por el mAb IgG1 (tabla 7). Se observó una mayor variación en la unión no específica con el mAb Hydrofluor™ en comparación con G203 (tabla 8), de manera que se observaron diferencias significativas en el nivel de unión entre los mAb para cada tipo de agua.

TABLA 3

Anticuerpos monoclonales específicos para Cryptosporidium evaluados.
Anticuerpo	Tipo de anticuerpo	Proveedor
CRy104	conjugado de IgG1- FITC	MUCAB*
CRY26™	conjugado de IgM - FITC	MUCAB*
CRY212	conjugado de IgM - FITC	MUCAB*
Crypto-Cell	conjugado de IgM - FITC	CelLab, Australia
Crypto-a-glo™	conjugado de IgM - FITC	Waterborne. Inc. USA
Immucell™	conjugado de IgG3 - FITC	Immucell, Portland. USA
Hydrofluor™	IgM No conjugada	Meridian, ENSYS Inc. USA
*Macquarie University Centre for Analytical Biotechnology

TABLA 4

Anticuerpo monoclonales específicos para Giardia evaluados.
Anticuerpo	Tipo de anticuerpo	Proveedor
G203	conjugado de IgG1- FITC	MUCAB*
Giardia-Cell	conjugado de IgM - FITC	CelLab, Australia
Giardia-a-glo™	conjugado de IgG1- FITC	Waterborne. Inc. USA
Hydrofluor™	Giardia IgM No	Meridian, ENSYS Inc.
Combo	conjugada + Crypto IgG	USA
*Macquarie University Centre for Analytical Biotechnology

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5

Comparación del nivel de unión no específica a mAb específicos de Cryptosporidium.
Anticuerpo	Relación de unión no específica*
CRY104	0,045\pm0,013
CRY26	0,623\pm0,023
CRY212	0,112\pm0,034
Crypto-Cell	0,177\pm0,034
Crypto-a-glo™	0,980\pm0,125
Immucell™	0,155\pm0,013
Hydrofluor™	0,159\pm0,058
No teñido	0,033\pm0,010
Los resultados son las medias de 3 análisis separados.
Escala arbitraria desarrollada para el análisis de Cryptosporidium* (véase M \textamp M). Diferencia
estadística (p<0,05) por ANOVA

TABLA 6

Comparación del nivel de unión no específica a mAb específicos de Giardia
Anticuerpo	Relación de unión no específica*
G203	0,029\pm0,002
Células Giardia	0,163\pm0,024
Giardia-a-glo™	0,201\pm0,032
Hydrofluor™	0,044\pm0,005
No teñido	0,020\pm0,002
Los resultados son las medias de 3 análisis separados.
* Escala arbitraria desarrollada para el análisis de Giardia (véase M \textamp M). Diferencia
estadística (p<0,05) por ANOVA

TABLA 7

Evaluación del nivel de unión no específica de mAb específicos de Cryptosporidium en
diferentes concentrados de agua.
Tipo de Agua	Media de tratamiento \pm SD
	Control no teñido	CRY104	Immucell™
Natural	0,023\pm0,002	0,023\pm0,001	3,294\pm0,327
Contracorriente	0,023\pm0,003	0,020\pm0,006	0,440\pm0,049
Natural	0,021\pm0,003	0,020\pm0,004	0,385\pm0,016
Contracorriente	0,022\pm0,002	0,087\pm0,038	0,233\pm0,052
Residual	0,035\pm0,006	0,085\pm0,01	1,801\pm0,093
Contracorriente	0,023\pm0,004	0,277\pm0,031	0,869\pm0,154
Natural	0,022\pm0,006	0,025\pm0,005	1,391\pm0,036
Natural	0,036\pm0,006	0,099\pm0,013	0,651\pm0,047
Contracorriente	0,023\pm0,004	0,031\pm0,002	0,156\pm0,027
Filtrada	0,026\pm0,007	0,027\pm0,002	0,166\pm0,015
Diferencia estadística (p<0,05) por ANOVA, N = 3

TABLA 8

Evaluación del nivel de unión no específica de mAb específicos de Giardia en diferentes
concentrados de agua.
Tipo de agua	Media de tratamiento \pm SD
	Control no teñido	CRY104	Hydrofluor™
Natural	0,022\pm0,002	0,048\pm0,007	0,645\pm0,01
Contracorriente	0,022\pm0,003	0,034\pm0,005	0,669\pm0,008
Natural	0,020\pm0,003	0,025\pm0,002	0,696\pm0,022
Contracorriente	0,021\pm0,003	0,214\pm0,094	14,63\pm4,58
Residual	0,032\pm0,007	0,007\pm0,001	1,021\pm0,075
Contracorriente	0,021\pm0,003	0,081\pm0,014	10,36\pm1,547
Natural	0,021\pm0,006	0,023\pm0,003	0,062\pm0,005
Natural	0,031\pm0,006	0,070\pm0,022	1,637\pm0,096
Contracorriente	0,022\pm0,004	0,036\pm0,009	0,111\pm0,016
Filtrada	0,024\pm0,006	0,024\pm0,003	0,043\pm0,004
Diferencia estadística (p<0,05) por ANOVA, N = 3

La evaluación del número de partículas fluorescentes dentro de un concentrado de agua antes y después de la tinción inmunofluorescente reveló que con todos los mAb ensayados había números significativamente mayores (p<0,05) de partículas fluorescentes después de la tinción. Sin embargo, hubo una gran variación en el número de partículas fluorescentes después de la tinción con diferentes mAb. El análisis de diferentes clases de mAb reveló que la tinción con los mAb IgG1 generalmente producía menor partículas fluorescentes que la tinción con los mAb IgM e IgG3.

La variación en la fluorescencia de fondo observada se debe en gran medida al tipo de anticuerpo usado para el ensayo. La respuesta inmune primaria a un antígeno induce la producción de IgM. Existen anticuerpos de inmunoglobulina M como mAb grandes que contienen diez sitios de unión, con una mayor probabilidad de unirse de forma no específica a las partículas en comparación con la IgG. La superficie de los oocistos y quistes contiene carbohidratos que inducen la producción de IgM e IgG3 de baja afinidad. Tras la exposición repetida a un antígeno, generalmente se producen mAb de inmunoglobulina G1. Se produce un cambio de isotipo de IgM a IgG, obteniéndose mAb de mayor afinidad que contienen dos sitios de unión idénticos más específicos para el antígeno contra el que se producen. La especificidad de la IgM CRY212 que se creó para el análisis del agua fue mayor que la de mAb comerciales que se produjeron para aplicaciones clínicas tales como análisis fecales. Esta tendencia se observó después del análisis en Giardia de mAb IgG1, teniendo G203 mayor afinidad que Giardia-a-glo™.

La comparación de diferentes tipos de agua reveló una diferencia significativa en la relación de unión no específica entre aguas. Se observó variación después de la tinción con varios mAb IgG1 (CRY104 y G203), sin embargo, el intervalo de unión no específica a diferentes tipos de agua se redujo significativamente con respecto a los otros mAb examinados. El grado de variación en la unión no específica fue significativo con muestras contracorriente que presentaban un intervalo variado en la fluorescencia de fondo entre una relación de 0,111 y 14,63 para la unión no específica del mAb Hydroflor. De esta manera, algunos concentrados de agua contienen partículas que tienen una probabilidad mucho mayor de unirse a ciertos mAb, sin embargo, para todos los tipos de agua, los mAb IgG1 produjeron el mínimo aumento en el número de partículas fluorescentes detectadas.

Los mAb producidos específicamente para el análisis de agua tienen una alta afinidad por quistes y oocistos con respecto a partículas extrañas presentes dentro de los concentrados de agua. Las inmunoglobulinas G1 son mAb más pequeños que se unen específicamente a sitios antigénicos contra los que se producen con poca interferencia de fondo. La producción de nuevos mAb IgG1 contra diferentes sitios antigénicos en quistes u oocistos puede permitir el desarrollo de ensayos muy específicos para la detección de Cryptosporidium y Giardia dentro de muestras ambientales.

TABLA 9

Comparación de la intensidad de fluorescencia de oocistos de Cryptosporidium teñidos con suero de 3
diluciones (1:1000, 1:10.000, 1:100.000) procedentes de los grupos de ratones E (Extracto), W
(Paredes), control de oocistos (OC - ratones inyectados con oocistos enteros) o control negativo (C), y
después teñidos con un anticuerpo anti-IgG o anti-IgM marcado con fluorescencia. Los datos se
calcularon restando el valor fluorescente (arb) obtenido a partir de segundas muestras de suero después
de dos inmunizaciones de las muestras de suero negativas antes de la inmunización.
	Anticuerpo Específico de IgM	Anticuerpo Específico de IgG
	1:1000	1:10.000	1:100.000	1:1000	1:10.000	1:100.000
Ratón de Extracto 1	280	129	64	353	370	229
Ratón de Extracto 2	283	115	96	220	259	172
Ratón de Extracto 3	278	129	90	67	84	73
Ratón de Extracto 4	319	151	108	354	425	279
Ratón de Extracto 5	45	92	99	103	324	44
Ratones de Pared 1	3	30	19	-68	-13	28
Ratones de Pared 2	-3	36	2	29	-31	10
Ratones de Pared 3	18	0	4	41	52	16
Ratones de Pared 4	38	38	-3	24	-3	-4
Ratones de Pared 5	22	16	15	3	-11	27
Control de Oocisto 1	432	240	115	2	-18	13
Control de Oocisto 2	339	189	26	-53	-5	42
Control de Oocisto 3	438	228	69	48	45	2
Control de Oocisto 4	581	457	235	124	46	57
Control de Oocisto 5	210	75	37	21	43	43
Control	0	0	0	0	0	0

Examen por transferencia de Western de muestras de suero y mAb

Se observó una gran cantidad de bandas inmunoteñidas en transferencias de western realizadas en suero de ratón de cada uno de los tres grupos de inmunización (E, W y OC). El grupo de ratones de control de oocistos (OC) y el grupo de ratones de extracto (E) mostraron bandas de >200 kD a 40 kD sin una diferencia visible en los modelos de bandas. El grupo de ratones de pared (W) mostró una banda única sólo en el intervalo medio entre 100 kD y 160 kD. Los mAb analizados por transferencia de western mostraron algunos modelos de bandas únicos, aunque todos reconocieron dos bandas distintas, una a 200 kD y la otra a 40 kD.

Medición funcional de la Avidez TABLA 10:

Muestra la medición funcional de la Avidez.
Anticuerpo Monoclonal	Subclase	ka (constante de afinidad del
		anticuerpo entero)
CRY104	IgG1	7x10^{8} mol^{-1}
CRY26	IgM	3x10^{8} mol^{-1}
Immucell™	IgG3	6x10^{7} mol^{-1}

Durante el transcurso del programa de inmunización, los ratones se controlaron con respecto a los niveles de IgM e IgG en suero. El grupo de control de oocistos demostró una alta respuesta IgM con una respuesta IgG pequeña o nula. Esto sugeriría que no hay memoria en la respuesta inmune (es decir, cambio a la respuesta de IgG) y que cada inmunización se ve como un nuevo antígeno.

Esto puede deberse a las estructuras de polisacáridos complejas que contienen los oocistos de C. parvum, que no requieren la ayuda de linfocitos T para estimular la producción de anticuerpos por las células B. De esta manera, se obtienen menos cambios de isotipo y se reduce la maduración de afinidad en los mAb producidos. Por lo tanto, los anticuerpos IgM menos específicos dominan la respuesta inmune.

El grupo de pared de oocisto (W) no mostró ninguna respuesta inmune. Probablemente, esto se debe al gran tamaño y estructura de la pared entera del oocisto, que puede tener un efecto de desensibilización sobre la respuesta inmune. El hecho de que no se observara ninguna respuesta inmune en el grupo de pared de oocisto sugeriría que sin que estén presentes esporozoítos, se obtiene una reducción de la inmunogenicidad.

El grupo de extracto de oocisto indujo respuestas de IgM e IgG fuertes. Sin embargo, las respuestas de IgM no fueron tan fuertes como en el grupo de control de oocistos, sugiriendo de nuevo que los esporozoítos son más antigénicos que la pared de los oocistos y son característicos de la naturaleza autolimitante de la criptosporidiosis. Parece ser que la digestión con SDS rompe la pared de los oocistos y expone más epítopos para una respuesta inmune. Después de retirar los esporozoítos y de romper la estructura de la pared de los oocistos en complejos más pequeños, la pared o el extracto de oocisto se convierte en un antígeno extremadamente inmunogénico, como se demuestra por la fuerte respuesta inmune observada en los ratones de extracto. Después de inmunizaciones adicionales en ratones de extracto, la respuesta de IgG aumentó adicionalmente con respecto a un programa de inmunización típico. Esto no se observó en el grupo de control o de pared, que mostró una respuesta de IgM dominante o no mostró ninguna respuesta respectivamente.

A partir de los análisis de transferencia de western, los grupos de extracto y de control de oocisto comparten un modelo de bandas similar, mostrando los ratones de extracto un modelo de bandas más definitivo con una banda distinta inferior no compartida (40 kD).

Se midió la avidez del anticuerpo y se comparó con otros anticuerpos anti- Crypto. Se calculó una constante de afinidad para el anticuerpo IgG1 entero de 7 x 10^{8} mol^{-1}, que es al menos el doble de la de los otros anticuerpos ensayados (tabla 10). Esto indica que CRY104 es al menos dos veces más eficaz en la unión a Cryptosporidium a una concentración constante que los otros anticuerpos ensayados, y forma un enlace más fuerte con el epítopo. Se descubrió que la eficacia de unión de CRY104 facilita la tinción más eficaz de Cryptosporidium a concentraciones inferiores que otros anticuerpos usados comúnmente.

Conclusiones

Se produjo una respuesta inmunológica fuerte contra la superficie de oocistos de Cryptosporidium por inmunización de ratones con una muestra parcialmente purificada de la capa externa de la pared de oocistos. La inmunización de ratones con paredes de oocistos purificadas no produjo una respuesta inmunológica fuerte. Esto sugeriría que existe supresión inmune por un componente de la pared de los oocistos o que la presentación natural de los antígenos superficiales en las paredes de los oocistos no produce una respuesta inmunológica. Los presentes inventores han solucionado esta falta de respuesta inmunológica contra la superficie de oocistos de Cryptosporidium por medio de la purificación parcial del antígeno de la superficie.

La fusión de células de bazo de un ratón inmunizado con la muestra purificada de la capa externa de la pared del oocisto produjo seis (6) hibridomas que producen anticuerpos específicos con-tra la superficie de la pared del oocisto. Uno de estos seis anticuerpos es de la subclase inmunológica IgG1, y los cinco anticuerpos restantes son de la subclase IgM. El anticuerpo IgG1 parece ser superior a los anticuerpos IgM para la tinción de oocistos de Cryptosporidium en muestras de agua. Los ratones inmunizados con paredes de oocistos de Cryptosporidium purificadas no producen una respuesta inmunológica fuerte contra la superficie de los oocistos de Cryptosporidium. Sin embargo, si las paredes de los oocistos purificadas se rompen en pequeñas piezas, se produce una respuesta fuerte tanto de la subclase inmunológica IgG como de la subclase inmunológica IgM. Los ratones inmunizados con tal procedimiento también serían adecuados para producir anticuerpos monoclonales de las subclases IgG1.

Referencias

Roberston L.J., Campbell A.T. & Smith H. V. 1993. in vitro excystation of Cryptosporidium parvum. Parasitology 106: 13-19. Vesey G. 1996. Application of flow cytometry to the detection of Cryptosporidium in water. PhD thesis, Macquarie University, Sydney, Australia.

Vesey, G, Griffiths, K, Gauci, M, Deere, D, Williams, K and Veal, D. 1997. Simple and rapid measurement of Cryptosporidium excystation using flow cytometry. International Journal of Parasitology, in press.

McDonald, V; Deer, RM; Nina, JM; Wright, S; Chiodini, PL; McAdam, KP. (1991). Characteristics and specificity of hybridoma antibodies against oocyst antigens of Cryptospondium parvum from man. Parasite Immunology 13, 251-259.

Smith, H (1994). Use of antibodies for detecting environmental contamination with protozoan parasites. In Laboratory Notes for Water Microbiology for the 21st Century, University of Nottingham, U.K., 21-23 September.

Vesey, G, Slade, JS, Byrne, M, Shepherd, K, Dennis, PJL, and Fricker, CR. (1993). A new method for the concentration of Cryptosporidium oocysts from water. Journal of Applied Bacteriology, 75, 87-90.

Claims

1. Un método para producir anticuerpos de la subclase IgG1 aislados reactivos con la superficie de oocistos de Cryptosporidium, comprendiendo el método:

(b): separar los oocistos de la preparación de antígenos de oocisto para obtener una preparación de antígenos de oocistos separada capaz de inducir una respuesta inmune IgG1 detectable en un animal contra la superficie del oocisto;

(c): inmunizar a un animal no humano con la preparación de antígenos de oocisto separada para inducir una respuesta inmune IgG1 en el animal; y

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el reactivo es un detergente.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde el detergente es dodecil sulfato sódico (SDS).

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde el pretratamiento consiste en hervir los oocistos en presencia de SDS durante un periodo de tiempo suficiente para generar la preparación de antígenos de oocistos.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde (a) consiste en hervir los oocistos durante 1 hora en presencia de un 0,5% (p/v) de SDS.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el reactivo se selecciona entre el grupo compuesto por urea, detergentes incluyendo octoxinol, conocido como Triton X-100 y nonident, enzimas incluyendo quitinasa, agentes oxidantes incluyendo hipoclorito sódico, peryodato sódico, y ozono; y agentes reductores incluyendo mercaptoetanol y 1,1,1-tricloro-2,2-bis[4- clorofenil]etano.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde (c) incluye además uno o más adyuvantes.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el animal es un ratón.

9. Un método para producir anticuerpos de la subclase IgG1 aislados reactivos con la superficie de oocistos de Cryptosporidium, comprendiendo el método:

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, donde la separación de la pared de los oocistos de los esporozoítos internos se realiza induciendo la exquistación de los oocistos seguida de una inmuno-separación de los componentes de la pared del oocisto.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 9, donde la separación de la pared de los oocistos de los esporozoítos internos se realiza induciendo la exquistación de los oocistos seguida de la separación de los componentes de la pared por el grupo de métodos de separación que consta de centrifugación, citometría de flujo, separación por gradiente de densidad, precipitación, marcaje inmune, unión de ligandos, marcaje con biotina y separación por avidina, y separación cromatográfica.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 o 11, donde la inducción de la exquistación de los oocistos se realiza por congelación-descongelación o por ruptura física por medio de aplastamiento, sonicación o trituración.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde la etapa de tratamiento (b) se realiza por ruptura física de la pared celular.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde (c) incluye además uno o más adyuvantes.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, donde el animal es un ratón.

16. Un anticuerpo IgG1 aislado reactivo con la superficie de oocistos de Cryptosporidium que se puede obtener por el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

17. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16, que es un anticuerpo monoclonal.

18. Un anticuerpo IgG aislado reactivo con la superficie de oocistos de Cryptosporidium, que se puede obtener por el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15.

19. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 18, que es un anticuerpo monoclonal.