DE69813555T2

DE69813555T2 - Gegen die fläche von cryptosporidium-oozysten gerichteten igg1-klasse antikörper

Info

Publication number: DE69813555T2
Application number: DE69813555T
Authority: DE
Inventors: Graham Vesey; Christopher Weir; Leslie Keith WILLIAMS; Basil Martin SLADE; Duncan Veal
Original assignee: Australian Water Technologies Pty Ltd; Macquarie Research Ltd
Current assignee: Australian Water Technologies Pty Ltd; Access Macquarie Ltd
Priority date: 1997-05-19
Filing date: 1998-05-19
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2018-05-20
Also published as: US6777222B1; EP0991667A1; ATE237639T1; WO1998052974A1; EP0991667A4; DE69813555D1; ES2201490T3; EP0991667B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen Cryptosporidium und Verfahren, um geeignete Cryptosporidium-spezifische Antikörper in Tieren zu erhöhen.
Stand der Technik
Der Protozoonparasit Cryptosporidium ist unter den geläufigsten Pathogenen verantwortlich für eine Durchfallerkrankung beim Menschen. Eine Infektion tritt auf, wenn Cryptosporidium-Oozysten, die im Kot von infizierten Individuen abgelegt werden, von neuen Wirten aufgenommen werden. Kürzlich sind mehrere große Ausbrüche von Cryptosporidiosis aufgetreten, bei denen Trinkwasser als die Infektionsquelle identifiziert worden ist. Untersuchungen haben gezeigt, dass viele Oberflächenwasservorräte mit Oozysten von Cryptosporidium kontaminiert sind.
Laborverfahren, die verwendet werden, um Cryptosporidium nachzuweisen, schließen oft die Verwendung von Antikörpern gegen diesen Organismus ein. Typische Verfahren, die zur Untersuchung von Wasserproben auf die Anwesenheit dieses Organismus verwendet werden, schließen Mikroskopie und Zytometrie oder eine Kombination dieser Verfahren ein. Durchflusszytometrische Verfahren betreffen die Färbung von Proben mit einem fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper, der spezifisch ist für die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten, und dann die Analyse mit einem Durchflusszytometer mit Sortierung. Teilchen mit den Fluoreszenz- und Lichtstreuungscharakteristika von Cryptosporidium-Oozysten werden auf einen Mikroskop-Objektträger sortiert und manuell unter Verwendung von Epifluoreszenzmikroskopie untersucht, um ihre Identität als Oozysten zu bestätigen. Dieser Bestätigungsschritt ist notwendig, da das Zytometer mit einem einzelnen Antikörper nicht zwischen Oozysten von allen anderen Teilchen, die in Wasserproben vorliegen, unterscheiden kann. Die Teilchen, welche das Zytometer mit Oozysten verwechselt, sind autofluoreszierende Teilchen, wie etwa Algen oder Teilchen, die den Oozysten-spezifischen Antikörper unspezifisch binden.
Es sind ausschließlich zur Analyse geeignete Durchflusszytometer erhältlich, welche leicht zu bedienen und relativ kostengünstig sind. Diese Zytometer können keine Sortierung durchführen. Um den Nachweis von Cryptosporidium-Oozysten unter Verwendung eines Zytometers, das ausschließlich zur Analyse geeignet ist, zu ermöglichen, muss die durch das Zytometer erreichte Auflösung so verbessert sein, damit Teilchen, die keine Oozysten sind, nicht mit Oozysten verwechselt werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben zuvor gezeigt, dass es möglich ist, einen einzelnen spezifischen Mikroorganismen in trüben Wasserproben mit einem Analyse-Zytometer nachzuweisen, wenn der Mikroorganismus mit zwei verschiedenen Antikörpern markiert ist.
Unglücklicherweise sind die gegenwärtig verfügbaren Antikörper gegen Cryptosporidium aufgrund ihrer Klebrigkeit nicht ideal, und es gibt einen Bedarf für spezifischere und reaktivere Antikörper gegen die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten. Zum Nachweis von Cryptosporidium in klinischen und Umweltproben werden monoklonale Antikörper (mAbs) verwendet, welche spezifisch sind für die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten. Alle verfügbaren mAbs, die an die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten binden, gehören zur Unterklasse Immunglobulin M (IgM) oder IgG3. Bevorzugt sind monoklonale Antikörper der Unterklasse IgG1, weil sie normalerweise eine geringe nicht spezifische Bindung aufweisen. Solche mAbs wären geeigneter für gegenwärtig verwendete Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Cryptosporidium. Unglücklicherweise sind die früheren Versuche von Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Herstellung von monoklonalen IgG1-Antikörpern gegen die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten nicht erfolgreich gewesen oder nicht bestätigt worden (Smith, 1994; MacDonald et al., 1991). Es wird im Allgemeinen angenommen, dass aufgrund der antigenen Charakteristika dieses Organismus diese Antikörperklasse von infizierten oder immunisierten Tieren nicht erzeugt wird (Smith, 1994).
In WO 97/08204, eingereicht von den Erfindern der vorliegenden Erfindung, wurden monoklonale Antikörper gegen eine Reihe von Antigenen von Cryptosporidium-Oozysten entwickelt. Ganze oder exzysierte Oozysten, welche verschiedenen Behandlungen ausgesetzt worden waren, sind als Antigene verwendet worden. Von insgesamt acht Fusionen, welche das Screening von mehreren tausend Hybridomen einbezogen, wurde nur ein Hybridom identifiziert, welches für die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten spezifisch war. Dieser monoklonale Antikörper gehörte zur immunologischen Unterklasse IgM.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun ein neues Verfahren entwickelt, welches die Herstellung von IgG1-Antikörpern gegen die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten ermöglicht.
Offenbarung der Erfindung
In einem ersten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung von Antikörpern der IgG1-Unterklasse, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind, umfassend:

(a) Vorbehandeln von Cryptosporidium-Oozysten mit einem Reagenz, um die Oberflächenschicht der Oozysten zu entfernen und ein Oozysten-Antigenpräparat zu bilden;
(b) Abtrennen der Oozysten vom Antigenpräparat, um ein abgetrenntes Oozysten-Antigenpräparat zu erhalten, das dazu befähigt ist, eine nachweis bare IgG1-Immunreaktion in einem Tier gegenüber der Oberfläche der Oczyste hevorzurufen;
(c) Immunisieren eines Tieres mit dem abgetrennten Oozysten-Antigenpräparat, um in dem Tier eine IgG1-Immunreaktion hervorzurufen; und
(d) Gewinnen von IgG1-Antikörpern aus dem Tier, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind.

Es ist verständlich, dass monoklonale Antikörper der Unterklasse IgG1 durch Standardverfahren aus einem Tier erzeugt werden können, wenn einmal eine geeignete Immunreaktion in diesem Tier, beispielsweise in einer Labormaus stimuliert worden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist das Reagenz, das zur Herstellung des Antigenpräparats verwendet wird, ein Detergenz, bevorzugt ist das Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS). Eine geeignete Vorbehandlung betrifft eine Siedebehandlung der Oozysten in Gegenwart von SDS, für einen ausreichenden Zeitraum, um ein geeignetes Antigenpräparat zu erzeugen. Wenn eine Konzentration von 0,5% (w/v) SDS verwendet wird, hat sich eine Siedebehandlung für 1 Stunde als besonders geeignet erwiesen.
Andere geeignete Reagenzien schließen Harnstoff, Detergenzien wie etwa Octoxynol, das als als Triton X-100 oder Nonident bekannt ist, Enzyme wie etwa Chitinase, oxidierende Agenzien wie etwa Natriumhypochlorit, Natriumperjodat, Ozon und reduzierende Agenzien wie etwa Mercaptolethanol und 1,1,1-Trichlor-2,2-bis[4-chlorphenyl]-ethan (DDT) ein.
Die Vorbehandlung entfernt Antigene von der Oberfläche der Oozyste in einer Form, welche bei einer Injektion in ein Tier die Erzeugung von IgG1-Antikörpern ermöglicht.
Das Tier kann durch jedes Verfahren immunisiert werden, welches zum Auslösen einer Immunreaktion in einem Tier geeignet ist. Es können auch Adjuvantien mit dem Antigenpräparat vor der Immunisierung des Tiers enthalten sein, um eine starke Immunreaktion in dem Tier zu fördern.
In einer weiteren Ausführungsform verstärkt das Antigenpräparat auch die Herstellung von IgM-Antikörpern, wenn sie in ein Tier eingebracht wird.
In einem zweiten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren zur Herstellung von Antikörpern der IgG1-Unterklasse, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Abtrennen zumindest eines Teil der Cryptosporidium-Oozystenwand aus den internen Sporozoiten unter Bildung eines Oozystenwand-Präparates;
(b) Behandeln des abgetrennten Oozystenwand-Präparates, um ein Oozystenantigen-Präparat zu erhalten, das dazu befähigt ist, in einem Tier eine nachweisbare IgG1-Immunreaktion gegenüber der Oberfläche der Oozyste hervorzurufen;
(c) Immunisieren eines Tiers mit dem Oozysten-Antigenpräparat, um in dem Tier eine IgG1-Immunreaktion hervorzurufen und
(d) Gewinnen von IgG1-Antikörpern aus dem Tier, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass die Oozystenwand von internen Sporozoitbestandteilen abgetrennt werden sollte, um ein geeignetes Oozystenwand-Antigenpräparat zu erhalten. Es scheint, dass die internen Sporozoitantigene immundominanter sind als Oozystenwandantigene und dass deren Vorliegen in einem Antigenpräparat die Oozystenwandantigene maskieren kann. Ein gemischtes Antigenpräparat wird normalerweise in einer Erhöhung von Antikörpern gegen die Sporozoitantigene resultieren.
Die Trennung der Oozystenwand von dem internen Sporozoiten (Schritt (a)) kann durch jegliches Mittel erreicht werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass das Veranlassen der Oozyste zur Exzystierung, gefolgt von einer Immunabtrennung der Wandbestandteile besonders geeignet ist. Eine Abtrennung kann auch erreicht werden durch eine Oberflächenmarkierung der ganzen Oozyste mit einem Liganden, wie etwa Biotin, was eine Abtrennung von Zellwandfragmenten von den inneren Bestandteilen durch eine Reaktion mit einem Reagenz an einer unlöslichen Matrix oder an Beads ermöglicht, das gegenüber den Liganden reaktiv ist, wie etwa Avidin. Es ist aber verständlich, dass andere Abtrennungsverfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, auch geeignet sind. Beispiele schließen Zentrifugation, Fließzytometrie, Dichtegradiententrennung, Fällung, Immunmarkierung, Ligandenbindung, Biotinmarkierung und Trennung durch Avidin und eine chromatographische Trennung ein.
Es ist nicht notwendig, die Exzystierung der Oozyste durch normale Verfahren zu verursachen. Die Oozysten können eingefroren/aufgetaut werden, beispielsweise um eine anfängliche Abtrennung der Wand von den internen Sporozoiten zu fördern. Weiterhin kann die Oozyste physikalisch aufgebrochen werden durch Zerkleinerung, Ultraschallbehandlung oder Mahlen, gefolgt von einer Trennung.
Der Behandlungsschritt (b) kann durch alle geeigneten Mittel durchgeführt werden. Insbesondere haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass ein pyhsikalisches Aufbrechen der Zellwand eine gute Antigenpräparation erzeugen kann. Dies kann durch jedes Mittel erfolgen, aber die Verwendung eines Bead-Beaters ist ziemlich geeignet.
Die Behandlung entfernt Antigene von der Oberfläche der Oozystenwand in einer Form, welche bei Injektion in ein Tier die Erzeugung von IgG1-Antikörpern ermöglicht.
Es ist verständlich, dass monoklonale Antikörper der IgG1-Unterklasse durch Standardverfahren aus einem Tier erzeugt werden können, wenn einmal eine geeignete Immunreaktion in diesem Tier, z. B. in einer Labormaus ausgelöst worden ist.
Das Tier kann immunisiert werden durch jedes geeignete Verfahren zum Auslösen einer Immunreaktion in einem Tier. Mit dem Antigenpräparat können vor der Immunisierung des Tiers auch Adjuvantien enthalten sein, um eine starke Immunreaktion in dem Tier zu fördern.
In einer weiteren Ausführungsform verstärkt das Antigenpräparat auch die Herstellung von IgM-Antikörpern, wenn sie in ein Tier eingebracht wird.
Da die Erfinder der vorliegenden Erfindung Verfahren ermittelt haben, welche die Herstellung von nützlichen IgG1-Antikörpern ermöglichen, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind, ist es verständlich, dass nun anhand der hierin bereitgestellten Information und Lehre ähnliche Antikörper wie diejenigen erzeugt werden können, welche von den Erfindern der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden.
In einem dritten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung aus im Wesentlichen isolierten IgG1-Antikörpern, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind, die durch das Verfahren gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden.
Bevorzugt sind die Antikörper monoklonale Antikörper.
Solange es der Zusammenhang nichts anderes besagt, wird überall in dieser Beschreibung das Wort "umfassen" oder Variationen wie etwa "umfasst" oder "umfassend" so verstanden, dass die Einbeziehung eines genannten Elements, einer ganzen Zahl oder eines Schrittes oder einer Gruppe von Elementen, ganzen Zahlen oder Schritten vorausgesetzt wird, aber nicht der Ausschluss von irgendeinem anderen Element, einer ganzen Zahl oder einem Schritt oder einer Gruppe von Elementen, ganzen Zahlen oder Schritten.
Damit die vorliegende Erfindung deutlicher verstanden werden kann, werden bevorzugte Formen mit Verweis auf die folgenden Beispiele und die begleitende Zeichnung beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den Vergleich monoklonaler Antikörper zur Färbung von Oozysten in Wasserproben.
2 zeigt eine durchflusszytometrische Analyse von Cryptosporidium-Oozysten, ausgesät in einem gemischten Wasserkonzentrat. Die fluoreszierende Oozystenpopulation ist deutlich von autofluoreszierenden und fremden Teilchen getrennt, die nicht spezifisch an einen Antikörper gebunden sind. Die optimale Konzentration an mAb zur Verwendung bei einer Wasseranalyse muss eine klare Trennung von der Hintergrundfluoreszenz festlegen, wie es in dieser Figur zu sehen ist.
3 zeigt eine durchflusszytometrische Analyse einer Kontrollprobe mit fluoreszenzgefärbten Cryptosporidium-Oozysten. Eine elliptische Region der Standardgröße ist auf die Hauptpopulation von reinen fluoreszierenden Oozysten für jeden Antikörper (R1) zentriert. Eine Polygonregion ist um die Bead-Standardpopulation (R2) definiert.
4 zeigt eine durchflusszytometrische Analyse eines Wasserkonzentrats, das keine Oozysten oder Zysten enthält. Die Regionen sind diejenigen aus 2 für jeden untersuchten mAb. Die Anzahl der Teilchen innerhalb der Oozysten- oder Zystenregion (R1) enthält sowohl autofluoreszierende als auch nicht spezifisch gebundene Teilchen. Die Anzahl der Teilchen in R1 wird durch die Anzahl der untersuchten Beads (R2) geteilt. Das Ergebnis ist ein Verhältnis von nicht spezifischer Bindung, das zwischen den Antikörpern vergleichbar ist.
Verfahren zur Durchführung der Erfindung
MATERIAL UND METHODEN
Cryptosporidium-Oozysten
Cryptosporidium parvum-Oozysten wurden aus vereinigtem Kot von natürlich infizierten neonatalen Kälbern in Sydney gereinigt. Die Kotproben wurden zentrifugiert (2000 g, 10 min) und zweimal in Wasser resuspendiert, und dann in 5 Volumina 1%-iger (w/v) NaHCO₃ resuspendiert. Dann wurden Fettsubstanzen zweimal mit 1 Volumen Ether extrahiert, gefolgt von einer Zentrifugation (2000 g für 10 min). Die Pellets wurden in Wasser resuspendiert und durch eine Schicht von zuvor angefeuchteter, nicht adsorbierender Baumwolle filtriert. Das Eluat wurde dann auf 10 Volumina einer 55%-igen (w/v) Saccharoselösung überschichtet und zentrifugiert (2000 g für 10 min). Die Oozysten wurden aus der Saccharose-Interphase gesammelt und der Saccharose-Flotationsschritt wiederholt, bis kein sichtbares kontaminierendes Material nachgewiesen werden konnte. Gereinigte Oozysten wurden mit eiskaltem 70%-igem (v/v) Ethanol für 30 min oberflächensterilisiert, einmal in phosphatgepufferter Saline (PBS; Oxoid, Sydney) gewaschen und in PBS bei 4°C für bis zu 2 Wochen gelagert.
Antigenpräparation
Oberflächenextraktion:
Eine Oozystenprobe von 2 ml, die ungefähr 2 × 10⁹ Oozysten enthielt, wurde bei 13000 g für 1 Minute zentrifugiert und der Überstand entfernt und verworfen. Die Oozysten wurden in 2 ml eiskaltem 0,5%-igem (w/v) SDS resuspendiert und in einem kochenden Wasserbad für 1 Stunde platziert. Die Probe wurde dann bei 13000 g für 20 Minuten zentrifugiert, um die Oozysten zu entfernen. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt, mit 10 ml Aceton gemischt und für 8 Stunden bei –20°C platziert. Die Probe wurde dann bei 13000 g für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Ein kleines weißes Präzipitat wurde dann in sterilem PBS resuspendiert.
Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Biorad DC-Proteinassays gemessen, unter Verwendung des Standardprotokolls und Rinderserumalbumin (BSA) als einem Standard.
Oozystenwände:
Cryptosporidium-Oozysten wurden exzystiert, wie es von Robertson et al. (1993) beschrieben wird. Eine Oozysten-Probe von 1 ml, die ungefähr 1 × 10⁹ Oozysten, enthielt, wurde für 1 Minute bei 13000 g zentrifugiert und der Überstand entfernt und verworfen. Die Oozysten wurden in 1 ml angesäuerter, ausgeglichener Salzlösung nach Hank (HBSS, „Hank's balanced salt solution"), mit pH 2,7 resuspendiert und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann gewaschen und in 1 ml HBSS mit 100 ul 1% (w/v) Natriumdeoxycholat in Minimalnährmedium nach Hank (HMEM, "Hank's minimal essential medium") und 100 ul 2,2% (w/v) NaHCO₃ in HBSS resuspendiert und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Die Probe wurde dann unter Verwendung des Coulter-Elite-Durchflusszytometers wie zuvor beschrieben untersucht (Vesey et al., 1997). Die Population mit dem geringsten Signal des entlang der Achse gestreuten Lichts („forward angle light scatter") wurde in Teströhrchen sortiert und durch Zentrifugation bei 3000 g für 20 Minuten aufkonzentriert. Die aufkonzentrierten Proben wurden bei –20°C in PBS gelagert.
Exzystierung der Oozysten:
Die Exzystierung wurde erreicht, wie es oben für die Zellwände beschrieben ist.
Reinigung der Oozystenwände:
Die Oozystenwände wurden aus der exzystierten Probe unter Verwendung einer magnetischen Immunauftrennung gereinigt. Ein 0,5 ml Aliquot von Magnet-Beads (ungefähr 5 × 10⁷ Beads), beschichtet mit einem Ziege-Anti-Maus-IgM-Antikörper (Dynal Pty Ltd, Australien) wurde mit 10 ml Gewebekulturüberstand eines Cryptosporidium-Oozysten-spezifischen monoklonalen Antikörpers CRY26 gemischt. Die Beads wurden bei 4°C für 4 Stunden inkubiert und dann neben einen Magneten platziert, sodass die Beads auf den Boden des Röhrchens gezogen wurden. Der Überstand wurde entfernt und verworfen und die Beads in 10 ml PBS plus 2% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA; Sigma Fraktion V) (PBS-BSA) resuspendiert. Dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt und die Beads wurden in einem Endvolumen von 1 ml PBS-BSA resuspendiert. Die Beads wurden dann mit der Probe der exzystierten Oozysten gemischt und auf einem Rotationsschüttler bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Das Röhrchen wurde neben einem Magneten platziert, sodass die Beads und die angehefteten Oozysten auf den Boden des Röhrchens angezogen wurden. Der Überstand wurde entfernt und bei 4°C platziert. Um alle verunreinigenden Sporozoiten zu entfernen wurden die Beads vorsichtig in 1 ml PBS-BSA resuspendiert und dann noch einmal unter Verwendung des Magnets aufkonzentriert. Der Überstand wurde entfernt und verworfen. Die Beads wurden in 1 ml PBS resuspendiert und heftig geschüttelt, um die Beads von den Oozystenwänden loszulösen. Die Beads wurden aufkonzentriert unter Verwendung des Magnets und der Überstand, der die Oozystenwände enthielt, entfernt und auf Eis aufbewahrt. Die Beads wurden dann zu der Originalprobe der exzystierten Oozysten zugegeben und das gesamte Verfahren wurde zehnmal wiederholt. Die 10 Proben mit gereinigten Oozystenwänden wurden dann vereinigt und durch Zentrifugation bei 3000 g für 10 Minuten aufkonzentriert. Eine Fraktion der Probe der Oozystenwände wurde unter Verwendung von Durchflusszytometrie untersucht, wie es zuvor beschrieben wird (Vessey et al., 1997). Die Probe wurde in einem Röhrchen untersucht, das eine genaue Anzahl an Beads enthielt (TrueCount, Becton Dickinson, San Hose, USA), um die Anzahl der Oozystenwände zu bestimmen.
Aufbrechen der Oozystenwände:
Die Hälfte der Probe der Oozystenwände wurde behandelt, um die Wände in kleine Stücke zu zerbrechen, unter Verwendung eines FastPrep-Bead-Beaters (Bio 101, CA, USA) fünfzehnmal bei Maximalgeschwindigkeit für 40 Sekunden Dauer. Die Probe wurde zwischen jeder 40 Sekunden-Behandlung für 1 Minute auf Eis gekühlt. Die Oozystenwandstücke wurden in 3 ml PBS resuspendiert und in 200 μl-Mengen aliquotiert und bis zur Verwendung eingefroren gelagert.
Immunisierung von Mäusen
Verfahren 1:
Fünf weibliche Balb/C-Mäuse wurden mittels IP-Injektion entweder mit 200 μm Oozysten-Oberflächenextrakt (Mäuse der Gruppe E) oder mit 4 × 10⁴ Oozystenwänden (Mäuse der Gruppe W) immunisiert. Antigenpräparate wurden in Freunds-Komplettadjuvants emulgiert. Den Mäusen wurde vor dem Erhalten der ersten Injektion Blut entnommen, um eine Negativkontrolle bereitzustellen. Zwei weitere IP-Injektionen mit der gleichen Menge des Antigens, die aber in unvollständigem Freunds-Adjuvans emulgiert war, wurden in 3-wöchigen Intervallen gegeben. Den Mäusen wurde nach der zweiten dieser Injektionen Blut entnommen, um die Immunreaktion zu kontrollieren. Mäusen der Gruppe E wurden zwei finale intravenöse Verstärkungen von 200 μg Antigen gegeben, 3 Tage und 1 Tag vor der Fusion gegeben.
Verfahren 2:
Fünf weibliche Balb/C-Mäuse (Gruppe WP) wurden mittels IP-Injektion mit 200 μl einer Präparation von zertrümmerten Oozystenwänden immunisiert, die in Freunds-Komplettadjuvans emulgiert waren. Das Präparat enthielt ungefähr 1 × 10⁶ Oozystenwände. Eine zweite Gruppe von Mäusen (Gruppe WI) wurde mit ungefähr 1 × 10⁶ intakten gereinigten Oozystenwänden immunisiert, die in unvollständigem Freunds-Adjuvans emulgiert waren. Den Mäusen wurde vor der Gabe der ersten Injektion Blut durch eine Schwanzentnahme entnommen, um eine Negativkontrolle bereitzustellen. In 3-wöchigen Intervallen wurden zwei weitere IP-Injektionen mit der gleichen Menge Antigen gegeben, die aber in Freunds unvollständigem Adjuvans emulgiert war. Den Mäusen wurde nach der zweiten dieser Injektionen Blut entnommen, um die Immunreaktion zu kontrollieren.
Der Maus können 7 Tage vor dem Töten und der Fusion von Milzzellen entweder IP- oder IV-Verstärkungsinjektionen gegeben werden, um die Entwicklung geeigneter Antikörper zu unterstützen.
Analyse von Mäuseserum
Blutproben (ungefähr 50 μl/) wurden durch Blutentnahme am Schwanz gesammelt und dann bei 13000 g für 30 Sekunden zentrifugiert. Die obere Schicht des Serums wurde vorsichtig entfernt und bis zur Analyse bei –20°C gelagert. Das Serum wurde 1 in 100, 1 in 1000 und 1 in 10000 in 1%-igem (w/v) Rinderserumalbumin in PBS (BSA-PBS) verdünnt. Aliquots (50 μl) von verdünntem Serum wurden mit 10 μl der Oozystensuspension in PBS (enthaltend ungefähr 1 × 10⁶ Oozysten) gemischt und bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Die Proben wurden entweder mit 50 μl eines spezifischen Ziege-Anti-Maus-IgM Antikörpers, der mit FITC konjugiert war (verdünnt in 1 in 50 mit BSA-PBS) (Sigma Produktnummer) oder mit 50 μl eines spezifischen Ziege-Anti-Maus-IgG Antikörpers, der mit PE konjugiert war (verdünnt 1 in 200 mit BSA-PBS) (Sigma), gemischt. Nach weiteren 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben unter Verwendung eines FACScan-Durchflusszytometers untersucht. Mit jeder Probencharge wurde eine Negativkontrolle mit PBS und eine IgM-Positivkontrolle von Gewebekulturüberstand von einem monoklonalen IgM-Antikörper, der gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten spezifisch ist, untersucht. Die mittleren Fluoreszenzintensitäten der mit FITC und PE gefärbten Proben wurden aufgezeichnet.
Proben von Mäuseserum, verdünnt 1 in 500 in BSA-PBS wurden unter Verwendung von Western-Blotting untersucht.
Herstellung von Hybridomen
Mäuse wurden getötet, Milzzellen präpariert und mit NS1-Mausmyelomzellen fusioniert und die resultierenden Hybridome wurden kloniert. Ein Volumen von 50 μl Gewebekulturüberstand von jedem Hybridom wurde mit 10 μl Oozystensuspension in PBS (enthaltend ungefähr 1 × 10⁶ Oozysten) gemischt. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert und dann mit 50 μl eines Ziege-Anti-Maus-Antikörpers, der sowohl für IgM als auch IgG-Antikörper spezifisch war und mit FITC konjugiert war (verdünnt 1 in 100 mit BSA-PBS) (Silenus, Melbourne), gemischt. Nach weiteren 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben unter Verwendung eines FACScan-Durchflusszytometers untersucht. Mit jeder Probencharge wurde eine Negativkontrolle von Gewebekulturüberstand von einem Dictyosteüum-spezifischen Antikörper (MUD62) und eine Positivkontrolle von Gewebekulturüberstand von einem monoklonalen IgM-Antikörper, der gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten (CRY26) spezifisch war, untersucht. Hybridome, welche eine höhere mittlere Fluoreszenz (FL1) als die Negativkontrolle erzeugten, wurden kloniert und noch einmal untersucht.
Die immunologische Unterklasse der von den Klonen erzeugten monoklonalen Antikörper wurde unter Verwendung des Sigma Immuno Typ-Kits identifiziert.
Hybridom-Screening
Ungefähr 7–14 Tage nach der Fusion wurden Mikrowellplatten im Hinblick auf das Hybridom-Wachstum überprüft. Hybridome, welche mit einem 40x Objektiv sichtbar waren, wurden gekennzeichnet, markiert und 100 μl des Gewebekulturüberstands wurde steril entfernt, ohne die Hybridome auf dem Boden zu stören. Alle Hybridome wurden dann mit 100 μl frischem Medium für das weitere Wachstum erneut gefüttert.
Anfangs-Screening:
Zu jeden gesammelten 100 μl Hybridomüberstand wurden 10 μl mit 1 × 10⁸ Oozysten zugegeben und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde ein zweiter Antikörper Anti-Maus-FITC (Amrad) zugegeben (100 μl mit einer 1 : 50 Verdünnung) und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann mittels Durchflusszytometrie untersucht. Es wurde die Fluoreszenzintensität der Oozystenpopulation gemessen. Eine im Histogramm beobachtete hohe Fluoreszenz zeigte eine für Anti-Cryptosporidium-Antikörper positive Probe an. Alle positiven Proben wurden dann markiert und für eine weitere Kultur aufgezogen.
Zweites Screening:
Einmal positive Hybridome sind in 12-Well Mikrotiterplatten kultiviert worden, sie wurden dann im Hinblick auf die IgM oder IgG-Antikörperklasse untersucht. Eine Probe von 100 μl von jedem positiven Hybridom wurde in zwei getrennten Röhrchen platziert. Jedem Röhrchen wurden 10 μl mit 1 × 10⁸ Oozysten zugegeben und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zu jedem doppelten Röhrchen wurden 100 μl eines vorverdünnten, FITC-markierten Anti-IgG (Zymed 61-6011) oder FITC-markierten Anti-IgM (Sigma F-9259) zugegeben und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Jede Probe wurde dann mittels Durchflusszytometrie untersucht. Eine in einem Histogramm beobachtete hohe Fluoreszenz der Oozystenpopulation zeigte eine positive Population für die Antikörperunterklasse an, welche später bestätigt wurde.
Bestätigung der Unterklasse:
Alle positiven Hybridome wurden im Hinblick auf den Isotyp mittels eines kommerziell erhältlichen (Serotec) Hämagglutinations-Assays bestätigt, der Schaferythrozyten verwendet, die mit einem Antikörper konjugiert sind, der spezifisch einen Maus-Ig-Isotyp erkennt.
Untersuchung von Antikörpern zur Oozystenfärbung in Wasserproben
Die Wirksamkeit von mAbs zur Verwendung in Wasserproben wurde mittels Durchflusszytometrie bewertet. Ein Volumen von 100 μl Überstand wurde zu ausgesäten Proben zugegeben. Die ausgesäten Proben bestanden aus 50 μl Wasserkonzentrat und 10 μl einer hohen Oozystenkultur. Dies wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde ein Volumen von 100 μl eines mit FITC konjugierten Anti-Maus-Antikörpers (Silenus, 1 : 50) zugegeben und für weitere 20 Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann unter Verwendung von Durchflusszytometrie untersucht. Die Daten wurden untersucht, um zu bestimmen, welcher Antikörper die größte Trennung zwischen der Immunfluoreszenzkontroll(Oozysten-) Population und den fluoreszierenden Hintergrundteilchen, die in den Wasserkonzentraten nachgewiesen wurden, erzeugte.
Funktionelle Messung der Avidität
Die Avidität der Bindung (Affinitätskonstante eines ganzen Antikörpers) der mit FITC markierten Anti-Cryptosporidium-Antikörper CRY104, CRY26 und eines kommerziellen, mit FITC markierten Anti-Cryptosporidium-Antikörpers (Immunocel) wurde wie folgt gemessen. Antikörper mit einer bekannten Konzentration wurden ausgehend von einer Konzentration von 20 μg verdünnt mit 20 zweifachen Verdünnungen. Jede mAb-Konzentration wurde dann mit 1 × 10⁷ Oozysten für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde auch eine Negativkontrolle mit Oozysten in PBS präpariert, um einen Endpunkt für die Bindung bereitzustellen. Fluoreszenz- (FL-1) Werte für jede Verdünnung wurden aufgezeichnet und aufgetragen. Der Wert für 50% der maximalen Bindung an die Oozysten für jeden untersuchten mAb wurde erhalten. Es wurden die Annahmen gemacht, dass der Gesamtinput-Antikörper nahezu der gleiche ist wie der freie Antikörper, weshalb die Dissoziationskonstante (kd) gleich ist mit dieser (50%) Konzentration. Die Affinitätskonstante (ka) wird dann als der reziproke Wert berechnet.
Durchflusszytometrie
Ein FACScan-Durchflusszytometer wurde zur Untersuchung von Mäuseserum und Hybridomen verwendet. Für alle Detektoren wurden logarithmische Signale verwendet. Der Schwellenwert wurde am Seitwärtsstreulicht („side scatter") auf einen Wert von 500 gesetzt. Die Detektoren wurden auf die folgenden Sensitivitätsniveaus gesetzt: 200 für Seitwärtsstreulicht (SSC, „side scatter"); EOO für Vorwärtssteulicht (FALS, „forward scatter"); 600 für den grünen Fluoreszenzdetektor (FL1) und 600 für den roten Fluoreszenzdetektor (FL2). Eine Region (R1) wurde auf einem Dot-Blot von FALS gegenüber SSC definiert, welche einzelne Oozysten einschloss, nicht aber Klumpen von Oozysten. Histogramme von FL1 und FL2 wurden so durchgelassen, dass die einzigen Teilchen, die in der Region R1 auftauchen, auf den Histogrammen auftauchen. Der Mittelwert von FL1 und/oder FL2 aus den Histogrammen wurde für 2000 Oozysten von jeder untersuchten Probe aufgezeichnet.
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophorese (PAGE)
200 Mikroliter Oozysten mit 5 × 10⁷ bis 10⁸ Zellen/ml wurden zu einem gleichen Volumen eines reduzierenden Puffers (zusammengesetzt aus 975 μl 0,125 M Tris Hcl/0,5% (w/v) SDS, 150 μl Glycerol, 225 μl 10% (w/v) SDS, 150 μl 2-Mercaptoethanol und 20 μl Bromphenolblau (0,25% w/v) zugegeben und für 3 Minuten bei 100°C gekocht.
Diese reduzierte Probe wurde dann auf einem 12%-igen Polyacrylamid-Trenngel mit einem 5%-igen Sammelgel in einem Biorad Minoprotean/II-Zellapparat gefahren. Proteine für Marker mit hohem und geringem Molekulargewicht (Novex) wurden entlang der Probe für ungefähr 45 bis 60 Minuten bei 200 Volt gefahren.
Western-Blotting
Aliquots (100 μl) einer Oozystensuspension in PBS, die ungefähr 5 × 10⁷ Oozysten enthielt, wurden mit 100 μl reduzierendem Puffer gemischt und für 2 Minuten gekocht. Die gesamte Probe wurde auf ein 10%-iges SDS-Slab-Gel geladen und bei 150 Volt für eine Stunde gefahren. Eine Probe von vorgefärbten Molekulargewichtsmarkern (Novex) war enthalten. Nach der SDS-PAGE wurden die Proteine unter Verwendung eines halbtrockenen Elektroblotting-Systems und eines diskontinuierlichen Puffersystems auf Nitrocellulose übertragen. Die Nitrocellulose wurde dann in 2 mm breite Streifen geschnitten und in 2% (w/v) Magermilch in PBS getränkt. Die Streifen wurden dann entweder mit Mäuseserum oder Hybridomkulturüberstand inkubiert. Gewebekulturüberstand von einem IgM-Cryptosporidiumspezifischen monoklonalen Antikörper wurde als eine Positivkontrolle eingeschlossen. Die Proben wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Nitrocellulosestreifen wurden dann 3 × 5 Minuten in 3% (w/v) Trockenmilchpulver in PBS gespült, dann für 1 Stunde in einem Ziege-Anti-Maus-Antikörper inkubiert (spezifisch sowohl für IgM als auch IgG-Antikörper), der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war (HRP, Tago, Inc. Burlingame, Kalifornien, USA), verdünnt auf 1 : 1500 mit 3% (w/v) Trockenmilchpulver in PBS. Die Streifen wurden dann 3 × 5 Minuten in PBS gewaschen und unter Verwendung einer frischen Lösung von 4CN-Substrat entwickelt und schließlich gründlich unter fließendem Leitungswasser für mindestens 20 Minuten gewaschen.
Wasserproben
Proben (10 l) von nicht behandeltem Oberflächenwasser wurden an Orten um Australien herum gesammelt, und unter Verwendung eines Ausflockungsverfahrens (Vesey et al., 1993a) aufkonzentriert. Eine nicht behandelte gemischte Oberflächenwasserprobe wurde durch Mischen von Aliquots von Proben von 15 verschiedenen Stellen hergestellt. Die Probe wurde bei 3000 g für 10 Minuten aufkonzentriert und das Pellet in PBS resuspendiert. Aliquots (50 μl) des Wasserprobenkonzentrats wurden mit 10 μl einer Oozystensuspension (die ungefähr 1000 Oozysten enthielt) ausgesät und sorgfältig gemischt. Die Proben wurden dann mit 50 μl Gewebekulturüberstand von einem Cryptosporidium-spezifischen monoklonalen Antikörper gemischt und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Aliquot (50 μl) eines mit FITC konjugierten Ziege-Anti-Maus-Antikörpers (spezifisch für sowohl für IgG als auch IgM-Antikörper) (Silenus), verdünnt 1 in 300 in PBS-BSA wurde dann zu jeder Probe zugegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden dann unter Verwendung von Durchflusszytometrie untersucht.
ALTERNATIVE VERFAHREN
Um die Oozystenwände von den Sporozoiten zu trennen, können die Oozysten anstelle einer Exzystierung eingefroren/aufgetaut werden. Ein Reinigungsschritt, wie etwa eine immunmagnetische Trennung, Durchflusszytometrie oder Dichtegradiententrennung ist erforderlich, um die Oozystenwände von den Sporozoiten wegzureinigen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Zellwandproben präpariert durch Oberflächenmarkierung ganzer Oozysten mit Biotin und nach einer Exzystierung durch Binden der Zellwände an magnetische Beads, die mit Avidin markiert waren.
Ein alternativer Ansatz betrifft das Zerstrümmern der ganzen Oozysten (Sporozoiten sind immer noch im Innern) in kleine Stücke und dann Verwendung eines immunologischen Reinigungsverfahrens, wie etwa eine immunmagnetische Trennung oder Affinitätschromatographie.
Andere alternative Verfahren wie etwa Ultraschall können verwendet werden, um die Oozysten oder die gereinigten Oozystenwände aufzubrechen.
ANTIKÖRPER-VERGLEICHSTESTS
Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten
Oozysten von Cryptoporidium parvum wurden wie zuvor beschrieben aus natürlich infizierten Kälbern isoliert. Die Oozysten wurden bei 65°C für 15 Minuten hitzeinaktiviert. Zysten von Giardia lamblia wurden in formalinfixierter Form von Waterborne, Inc. (New Orleans, USA) erhalten. Zysten und Oozysten wurden in Phosphat-gepufferter Salzlösung (0,1 M Phosphat, pH 7,3 ± 0,2) (Oxoid) bei 4°C gelagert.
Cryptosporidium-spezifische und Giardia-spezifische Antikörper In dieser Studie wurden sieben Cryptosporidium-spezifische und 4 Giardia-spezifische mAbs bewertet, deren Lieferant, Fluoreszenzmarkierung und Antikörperklasse sind in Tabelle 3 und 4 beschrieben.
Aufkonzentrierte Wasserproben
Proben (10 l) von nicht behandeltem Oberflächenwasser wurden von Stellen in Australien gesammelt und durch Flokkulation oder Filtration aufkonzentriert. Eine gemischte, nicht behandelte Wasserprobe wurde durch Mischen von Aliquots von Proben aus einer Auswahl von verschiedenen Stellen hergestellt. Die Probe wurde bei 13000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert und das Pellet wurde in PBS resuspendiert. Das Volumen der Probe wurde so eingestellt, dass 100 μl des Konzentrats äquivalent waren mit 5 l des originalen, unbehandelten Wassers. Die Proben wurden auch aus verschiedenen Wassertypen hergestellt, einschließlich rohem Flusswasser, ausfließendem Wasser, filtriertem Wasser und rückströmendem Wasser. Alle Proben wurden vor der Verwendung vorgefiltert durch einen Filter mit 38 Mikrometer rostfreiem Stahlgitter.
Probenvorbereitung
Fluorebrite^TM-Beads (Polysciences, Inc. Warrington, PA, USA) wurden verwendet, um den Assay zu standardisieren. Die Beads wurden mit einer hohen Konzentration zu Rinderserumalbumin (BSA, Sigma Chemical Co., St. Louis USA) (4% w/v) in PBS und Azid (0,05% v/v) gegeben. Das gleiche Volumen an Beads wurde dann zu jeder Probe zugegeben, was es ermöglicht, das Volumen des untersuchten Konzentrats durch die Anzahl der nachgewiesenen Beads zu kontrollieren. Das Volumen des für jede Probe untersuchten Wasserkonzentrats wurde dann standardisiert durch Herstellen eines Ergebnisses pro untersuchtem Bead. Der Probenpuffer zur Färbung der Proben bestand aus BSA (1% w/v) Tween 20 (0,5% v/v) in PBS.
Antikörperkonzentrationen
Die optimale Konzentration oder Verdünnung jedes zu bewertenden Antikörpers (Tabelle 3 und 4) wurde zuerst durch Durchflusszytometrie bestimmt. Verdünnungsreihen für mAbs mit einer unbekannten Proteinkonzentration wurden zwischen 1 : 20 und 1 : 1280 in geeigneten Probenpuffern angesetzt, wie vom Hersteller beschrieben. Diejenigen mAbs mit bekannten Proteinkonzentrationen wurden als Verdünnungsreihen zwischen 8 μg/ml bis zu 0,5 μg/ml angesetzt. Ein Aliquot von 100 μl jeder Verdünnung wurde zu ausgesäten Proben zugegeben. Ausgesäte Proben bestanden aus 50 μl Wasserkonzentrat und 50 μl einer hohen Oozysten- oder Zystenkultur. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und dann unter Verwendung von Durchflusszytometrie untersucht. Die Daten wurden untersucht, um zu bestimmen, welche Konzentration des Antikörpers die größte Trennung zwischen der immunfluoreszierenden Kontroll(Oozysten/Zysten-) Population und den fluoreszierenden Hintergrundpartikeln erzeugte, die in den Wasserkonzentraten nachgewiesen wurden (2).
Färbung der Wasserproben
Nach der Optimierung der Antikörperkonzentrationen wurde jeder mAb auf die geeignete Konzentration in Probenpuffer verdünnt. Alle Proben wurden in 5 ml Falcon-Röhrchen hergestellt. Es wurden Positivkontrollen hergestellt, bestehend aus 50 μl der jeweiligen hohen Aussaat. Zu untersuchende Wasserproben wurden in dreifachen Ansätzen hergestellt und bestanden aus 50 ml Wasserkonzentrat. Jeder mAb wurde zu den Kontrollen und Wasserproben auf ein Gesamtvolumen von 150 μl in Probenpuffer zugegeben und gemischt. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten wurden die Proben mit 20 μl Aliquots des Bead-Standards Fluorbrite^TM ausgesät. Die Proben wurden dann durch Vortexen für 5 Sekunden gemischt und untersucht.
Der Hydrofluor-mAb-Kit enthält nicht konjugierte Cryptosporidium-spezifische und Giardia-spezifische Antikörper ebenso wie einen mit FITC konjugierten Anti-Maus-Antikörpers. Die Reagenzien wurden so verwendet, wie es in den Anweisungen des Herstellers empfohlen wird.
Durchflusszytometrie
Der Vergleich von Cryptosporidium- und Giardia-mAbs wurde durchgeführt unter Verwendung eines FACScan-Durchflusszytometers von Becton-Dickinson (Becton-Dickinson, Lane Cove, NSW Australien). Das Umgebungsfluid bestand aus nicht verdünntem Isoton II (Coulter Electronics, Brook Vale, NSW Australien), die verwendeten Detektoren waren Seitenwinkel-Lichtstreuung (SSC) gegen FL1-Detektor (grüne Fluoreszenz). Die Spannungen der Detektoren wurden auf 300 mV für SSC und 450 mV für alle verbleibenden Detektoren festgelegt. Der Schwellenwert wurde auf dem Fluoreszenzdetektor 1 (FL1) festgelegt. Die Kompensation wurde bei FL1-FL2 auf 45% festgelegt. Positive Proben für jeden mAb wurden zuerst untersucht. Es wurden ungefähr 1000 Ereignisse gesammelt und eine elliptische Region (R1) der Standardgröße wurde um das Zentrum der Oozysten- oder Zystenpopulation (2) herum festgelegt. Eine rechteckige Sortierungsregion (R2) wurde um den jeweiligen verwendeten Bead-Standard herum festgelegt. Sobald die Sortierungsregionen definiert waren, wurde eine Probe; des Wasserkonzentrats untersucht, um dem Bediener eine Erhöhung oder Verringerung des Diskriminators zu ermöglichen, bis fremde, gesammelte; Teilchen gerade unterhalb R1 fluoreszierten (3). Sobald alle Regionen definiert warden, wurden 5000 Ereignisse für jede Probe gesammelt. Es war wichtig, dass R1 zum Zentrum der Oozysten oder Zystenpopulation bewegt wurde für jeden bewerteten Antikörper, da die Fluoreszenz zwischen der mAbs variiert.
Datenanalyse
Die Datenanalyse wurde durchgeführt unter Verwendung der LYSIS II Software, erhalten von Becton-Dickinson (Lane Cove, NSW Australien). Für die Analysen wurden bivariante Dot-Blots, die SSC gegen FL1 definierten, verwendet (3 und 4). Die Regionen wurden wie oben definiert. Um die Anzahl der nachgewiesenen Beads zu zählen, wurde um die Bead-Ppopulation herum ein Sortierrechteck definiert. Diese Region wurde bestimmt durch Analyse einer Kontrollprobe, die aus Beads und Oozysten/Zysten bestand (3). Die Spezifität jedes mAbs wurde berechnet als nicht spezifisches Bindungsverhältnis durch Dividieren der Anzahl der Ereignisse, die in R1 gesammelt wurden, durch R2.
Statistische Analyse
Die Dateninterpretation wurde durchgeführt unter Verwendung von Microsoft Excel^TM 4,0 und dem Analysis-Toolpack^TM Add-in. Die Hypothese, dass die Mittelwerte von verschiedenen Proben gleich waren, wurde unter Verwendung einer Varianzanalyse (ANOVA) untersucht. Unter Verwendung eines Signifikanzniveaus von 5% (p < 0,05), wurden die kritischen Werte für die F-Statistik berechnet und mit den von ANOVA erhaltenen Werten verglichen.
ERGEBNISSE
Analyse von Mäuseserum
Eine durchflusszytometrische Analyse von Mäuseserum ergab bei Mäusen der Gruppe E eine beträchtliche Immunreaktion gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten (Tabelle 1). 21 Tage nach der zweiten Immunisierung wurden sowohl Cryptosporidium-spezifische IgM- als auch IgG-Antikörper im Serum der Mäuse der Gruppe E nachgewiesen. Oozysten, die mit Serum von Mäusen der Gruppe E gefärbt waren, fluoreszierten sehr hell, sogar wenn das Serum auf 1 zu 10000 verdünnt war (Tabelle 1). Die Fluoreszenz von Oozysten, die mit Serum vor und 21 Tage nach der zweiten Immunisierung von Mäusen der Gruppe W gefärbt waren, waren nicht signifikant verschieden (p > 0,05), was anzeigt, dass die Immunisierung keine Produktion von Antikörpern verursachte, die spezifisch gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten sind. Im Serum der Mäuse der Gruppe W wurden keine Antikörper nachgewiesen, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten spezifisch sind. Der geringe Unterschied zwischen den Ergebnissen der Mäuse der Gruppe W und der Gruppe E vor der Immunisierung rührte höchstwahrscheinlich von der Variation bei der Sensitivität des Instruments an verschiedenen Tagen her.
Tabelle 1
Hybridome
Die Maus Nummer 4 aus Gruppe E wurde getötet und die Milzzellen wurden mit Mausmyelomzellen fusioniert. Ein Screening der resultierenden 230 Klone identifizierte sechs Klone, welche Cryptosporidium-spezifische Antikörper produzierten. Fünf der Klone (Klone P9F1, P6G7, P6B11, P11D5 und P7D5) produzierten IgM-Antikörper, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten spezifisch waren. Ein Klon (CRy104) produzierte IgG1-Antikörper, die gegenüber die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten spezifisch waren.
Zusätzliche Fusionen von Milzzellen von Mäusen in Gruppe E erzeugten eine große Anzahl von Hybridomen, spezifisch für die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten. Weiterhin sind IgG1-Antikörper charakterisiert worden, die von diesen Hybridomen erzeugt wurden. Dies zeigt weiter, dass die erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet sind, um nützliche IgG1-Antikörper zu erzeugen, die für die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten spezifisch sind.
Es wurden keine Fusionen mit Mäusen aus der Gruppe W versucht aufgrund der beobachteten schlechten Immunreaktion gegen Cryptosporidium.
Evaluation der monoklonalen Antikörper
Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse der Wasserproben, die mit Oozysten ausgesät wurden und mit einigen der Cryptosporidium-spezifischen monoklonalen Antikörpern gefärbt wurden, sind in 1 dargestellt. Die Unterschiede in der Position der Oozystenpopulationen entlang der Y-Achse sind zu beachten. Die Oozystenpopulation ist bei der Probe, die mit 8C12 (CRy104) gefärbt wurde, näher am oberen Ende des Dot-Blots als bei jeder der anderen Proben. Dies kommt daher, dass die Oozysten in dieser Probe heller fluoreszieren als in jeder anderen Probe. Die Fluoreszenz der Trümmerteilchen (unterhalb der Oozysten) ist in der 8C12 (CRy104) Probe nicht heller als in der ungefärbten Kontrolle. Die Trennung zwischen den Oozysten und den Trümmerpartikeln ist am größten in der mit BC12 (Cry104) gefärbten Probe. Dies deutet darauf hin, dass dieser Antikörper für eine Färbung von Cryptosporidium-Oozysten in Wasserproben am nützlichsten ist.
Im Vergleich zeigt die Probe, die mit 6G7 gefärbt ist, eine Steigerung in der Fluoreszenz von einigen der Trümmerteilchen (rechts von den Oozysten), wenn sie mit der nicht gefärbten Kontrolle verglichen werden. Dies kommt daher, dass dieser Antikörper an einige der Trümmerteilchen bindet und deutet darauf hin, dass dieser Antikörper bei der Färbung von Cryptosporidium-Oozysten in Wasserproben nicht nützlich sein könnte.
Eine durchflusszytometrische Analyse von Serum von Mäusen, die mit intakten gereinigten Oozystenwänden (Gruppe WI-Mäuse) immunisiert wurden, ergab keinen Unterschied in der Helligkeit der Cryptosporidium-Oozysten, gefärbt mit Serum, gesammelt vor oder nach der Immunisierung (Tabelle 2). Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn sowohl IgM-spezifische als auch IgG-spezifische zweite Antikörper verwendet wurden. Wenn Oozysten mit dem Serum der Mäuse der Gruppe WP gefärbt wurden, gab es im Vergleich dazu einen Unterschied in der Fluoreszenzintensität der Oozysten, die mit Post-Immunisierungsserum gefärbt waren und denjenigen, die mit mit Prä-Immunisierungsserum gefärbt waren. Die Ergebnisse waren ähnlich für Oozysten, die sowohl mit IgG-spezifischen als auch IgM-spezifischen sekundären Antikörpern gefärbt waren.
Tabelle 2
Antikörpervergleichstests
Wenn aufkonzentrierte Wasserproben mit mAbs gefärbt wurden, die entweder gegen Cryptosporidium oder Giardia gerichtet waren, gab es einen signifikanten (p < 0,05) Anstieg in der Anzahl der fluoreszierenden Teilchen, die mit den gefärbten im Vergleich zu den nicht gefärbten Proben beobachtet wurden (Tabellen 5 und 6). Unterschiede wurden zwischen verschiedenen Antikörpern beobachtet im Hinblick auf die Immunfluoreszenzfärbung, mit Anstiegen der nachgewiesenen fluoreszierenden Teilchen zwischen den mAbs. Der IgG1-Antikörper CRY104 ergab signifikant (p < 0,05) geringere Niveaus einer nicht spezifischen Bindung durch den fluoreszierenden mAb gegenüber fremden Teilchen im Wasser als bei einer Färbung mit Antikörpern der IgM- oder IgG3-Unterklasse (Tabelle 5). Der IgG1-Antikörper G203, der speziell für eine Wasseranalyse von Giardia hergestellt wurde, ergab signifikant weniger fluoreszierende Hintergrundteilchen als bei einer Färbung mit Antikörpern, die für eine Kotanalyse hergestellt wurden, einschließlich eines IgG1 (Tabelle 6).
Spezifische Antikörper (sowohl Giardia als auch Cryptosporidium) wurden zur Bewertung der Wirkung von mAbs auf die Färbung verschiedener Wasserarten ausgewählt. Es wurden statistisch unterschiedliche Niveaus (p < 0,05%) einer nicht spezifischer Bindung von Teilchen an Antikörper beobachtet zwischen den verschiedenen Wasserarten beobachtet, sowohl für die Giardia- als auch die Cryptosporidium-Analyse (Tabelle 7 und 8). Die beobachtete Variation nach der Färbung mit einem IgG3 war höher zwischen den Wasserarten als die Variation, die mit dem IgG1-mAb beobachtet wurde (Tabelle 7). Eine größere Variation der nicht spezifischen Bindung wurde mit Hydrofluor^TM-mAb im Vergleich mit G203 beobachtet (Tabelle 8), somit wurden signifikante Unterschiede im Ausmaß der Bindung zwischen mAbs für jede Wasserart beobachtet.
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6
Tabelle 7
Tabelle 8
Die Evaluation der Anzahl der fluoreszierenden Partikel innerhalb eines Wasserkonzentrats vor und nach der Immunfluoreszenzfärbung ergab, dass mit allen untersuchten mAbs eine signifikant (p < 0,05) höhere Anzahl fluoreszierender Partikel nach der Färbung vorlagen. Es gab aber eine große Variation in der Anzahl der fluoreszierenden Teilchen nach der Färbung mit verschiedenen mAbs. Eine Analyse der verschiedenen mAb-Klassen ergab, dass eine Färbung mit den IgG1-mAbs im Allgemeinen weniger fluoreszierenden Teilchen ergab als eine Färbung mit IgM- und IgG3 mAbs.
Die Variation in der beobachteten Hintergrundfluoreszenz ist größtenteils wegen der für den Assay verwendeten Antikörperart. Die primäre Immunreaktion auf ein Antigen induziert die Produktion von IgM. Immunglobulin M-Antikörper exisitieren als große mAbs, die zehn Bindungsstellen enthalten, mit einer größeren Wahrscheinlichkeit im Vergleich zu IgG, nicht spezifisch an Teilchen zu binden. Die Oberfläche von Oozysten und Zysten enthält Kohlenhydrate, welche die Herstellung von IgM und IgG3 mit geringer Affinität induzieren. Immunglobulin G 1-mAbs werden im Allgemeinen nach einer wiederholten Exposition gegenüber einem Antigen hergestellt. Es tritt ein Wechsel des Isotyps von IgM nach IgG auf, was mAbs mit einer höheren Affinität ergibt, die zwei identische Bindungsstellen enthalten, die für das Antigen, für das sie erzeugt sind, spezifischer sind. Die Spezifität des IgM CRY212, der für die Wasseranalyse entwickelt wurde, war größer als die Spezifität von kommerziellen mAbs, welche für klinische Anwendungen, wie etwa eine Kotanalyse hergestellt wurden. Dieser Trend wurde nach einer Giardia-Analyse von IgG1-mAbs beobachtet, wobei G203 eine höhere Affinität besaß als Giardia-a-glo^TM.
Ein Vergleich von verschiedenen Wasserarten ergab einen signifikanten Unterschied im Verhältnis der nicht spezifischen Bindung zwischen den Wasserarten. Es wurde eine Variation beobachtet nach der Färbung mit IgG1-mAbs (CRY104 und G203), aber der Bereich der nicht spezifischen Bindung von verschiedenen Wassertypen war gegenüber den anderen untersuchten mAbs signifikant verringert. Das Ausmaß der Variation einer nicht spezifischen Bindung war signifikant mit Rückströmungswasserproben, welche einen breiten Bereich an Hintergrundfluoreszenz zwischen einem Verhältnis von 0,111 und 14,63 für eine nicht spezifische Bindung des Hydrofluor-mAbs zeigte. Folglich enthalten einige Wasserkonzentrate Teilchen, welche eine viel höhere Wahrscheinlichkeit der Bindung an bestimmte mAbs besitzen, aber für alle Wasserarten verursachten die IgG1-mAbs den geringsten Anstieg in der Zahl der nachgewiesenen fluoreszierenden Teilchen.
mAbs, die speziell für eine Wasseranalyse hergestellt werden, besitzen eine hohe Affinität für Zysten und Oozysten gegenüber fremden Teilchen, die in den Wasserkonzentraten vorliegen. Immunglobulin G1 sind kleinere mAbs, welche spezifisch an antigene Stellen binden, für die sie hergestellt werden, mit einer geringen Hintergrundstörung. Die Herstellung von neuen IgG1-mAbs für verschiedene antigene Stellen an Zysten oder Oozysten kann die Entwicklung von hochspezifischen Assays für einen Cryptosporidium- und Giardia-Nachweis in Umweltproben ermöglichen.
Tabelle 9
Western Blotting-Untersuchung von Serumproben und mAbs Eine große Menge immungefärbter Banden wurde in Western Blots beobachtet, die mit Mäuseserum von jeder der drei Immunisierungsgruppen (E, W und OC) durchgeführt wurden. Die Oozystenkontroll-Mäusegruppe (OC) und die Extrakt-Mäusegruppe (E), zeigten Banden von > 200 kD bis hinunter zu 40 kD mit keinem deutlichen Unterschied in den Bandenmustern. Die Wand-Mäusegruppe (W) zeigte nur im mittleren Bereich zwischen 100 kD und 160 kD ein außergewöhnliches Bandenmuster. mAbs, die durch Western Blotting untersucht wurden, zeigten einige außergewöhnliche Bandenmuster, obwohl alle zwei deutliche Banden erkannten, eine bei 200 kD und die andere bei 40 kD.
Funktionelle Messung der Avidität Tabelle 10
Während des Verlaufs des Immunisierungsprogramms wurden die Mäuse sowohl im Hinblick auf IgM- als auch IgG-Spiegel im Serum überwacht. Die Oozystenkontroll-Gruppe zeigte eine hohe IgM-Antwort mit wenig oder keinen IgG. Dies würde bedeuteten, dass es kein Gedächtnis bei der Immunreaktion gibt (d. h. Eine Verschiebung hin zur IgG-Reaktion), und dass jede Immunisierung als ein neues Antigen gesehen wird.
Dies kann aufgrund dessen sein, dass C. parvum Oozysten komplexe Polysaccharidstrukturen enthalten, welche keine Hilfe von T-Lymphozyten benötigen, um B-Zellen zur Antikörperproduktion zu stimulieren. Somit ergibt sich ein geringerer Isotyp-Wechsel und eine verringerte Affinitätsreifung in den erzeugten mAbs. Daher dominieren weniger spezifische IgM-Antikörper die Immunreaktion.
Die Oozystenwand-Gruppe (W) zeigte keine Immunreaktion. Dies kommt wahrscheinlich von der großen Größe und Struktur der ganzen Oozystenwand, welche eine desensibilisierende Wirkung auf die Immunreaktion haben kann. Die Tatsache, dass bei der Oozystenwand-Gruppe keine Immunreaktion gesehen wurde, würde bedeuten, dass ohne vorhandene Sporozoiten eine Verringerung der Immunogenizität erhalten wird.
Die Oozystenextrakt-Gruppe rief starke IgM- und IgG-Reaktionen hervor. Aber die IgM-Reaktionen waren nicht so stark wie bei der Oozystenkontroll-Gruppe, was erneut bedeutet, dass Sporozoiten antigener sind als die Oozystenwand und charakteristisch sind für die selbstbeschränkende Natur der Cryptosporidiosis. Es scheint, dass der SDS-Verdau die Oozystenwand aufbricht und mehr Epitope für eine Immunreaktion exponiert. Nach der Entfernung der Sporozoiten und dem Aufbrechen der Oozystenwandstruktur in kleinere Komplexe wird die Oozystenwand oder der Extrakt ein extrem immunogenes Antigen, wie durch die starke Immunreaktion gezeigt wird, die in den Extrakt-Mäusen beobachtet wird. Nach weiteren Immunisierungen in Extrakt-Mäusen stieg die IgG-Antwort weiter an, wie bei einem typischen Immunisierungsprogramm. Dies wurde in der Kontroll- oder Wandgruppe nicht beobachtet, welche eine dominante IgM-Antwort bzw. keine Antwort zeigten.
Von der Western Blotting-Analyse teilen die Extrakt- und Oozystenkontroll-Gruppen ein ähnliches Bandenmuster, wobei die Extrakt-Mäuse ein eindeutigeres Bandmuster zeigen mit einem niedrigeren, deutlichen, nicht geteilten Band (40 kD).
Die Messung der Antikörperavidität wurde durchgeführt und mit anderen Anti-Crypto-Antikörpern verglichen. Die Affinitätskonstante für den ganzen IgG1-Antikörper wurde berechnet als 7 × 10E8 MoIE-1, was mindestens das Doppelte ist wie bei den anderen untersuchten Antikörper (Tabelle 10). Dies zeigt, dass CRY104 mindestens zweimal so wirksam bei der Bindung an Cryptosporidium bei einer konstanten Konzentration ist als die anderen untersuchten Antikörper und eine stärkere Bindung zu dem Epitop bildet. Es wurde gefunden, dass die Bindungseffizienz von CRY104 bei geringeren Konzentrationen eine wirksamere Färbung von Cryptosporidium als andere gewöhnlich verwendete Antikörper erleichtert.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Es wurde eine starke Immunreaktion gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten erzeugt durch Immunisierung von Mäusen mit einer teilweise gereinigten Probe der äußeren Schicht der Oozystenwand. Eine Immunisierung von Mäusen mit gereinigten Oozystenwänden erzeugte keine starke Immunreaktion. Dies würde bedeuten, dass es entweder eine Immunsuppression durch einen Bestandteil der Oozystenwand gibt, oder dass die natürliche Präsentation der Oberflächenantigene an den Oozystenwänden keine Immunreaktion erzeugt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben diesen Mangel einer Immunreaktion gegen die Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten durch teilweises Aufreinigen von Oberflächenantigen überwunden.
Die Fusion von Milzzellen aus einer Maus, die mit der gereinigten Probe der äußeren Schicht der Oozystenwand immunisiert wurde, ergab sechs (6) Hybridome, welche einen Antikörper erzeugten, der gegenüber der Oberfläche der Oozystenwand spezifisch war. Einer dieser sechs Antikörper gehört zur immunologischen IgG1-Unterklasse, die verbleibenden fünf Antikörper gehören zur IgM-Unterklasse. Der IgG1-Antikörper scheint den IgM-Antikörper für eine Färbung von Cryptosporidium-Oozysten in Wasserproben überlegen zu sein. Mäuse, die mit gereinigten Cryptosporidium-Oozystenwänden immunisiert wurden, entwickeln keine starke Immunreaktion gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten. Wenn aber die gereinigten Oozystenwände in kleine Stücke zerbrochen wurden, dann wurde eine starke Reaktion sowohl bei den immunologischen IgG- als auch IgM-Unterklassen erzeugt. Mäuse, die mit solch einem Verfahren immunisiert werden, wären auch zur Herstellung monoklonaler Antikörper der IgG1-Unterklassen geeignet.
REFERENZEN
Robertson L. J., Campbell A. T. & Smith H. V. 1993. In vitro excystation of Cryptosporidium parvum. Parasitology 106: 13–19. Vesey G. 1996. Application of flow cytometry to the detection of Cryptosporidium in water. PhD thesis, Macquarie University, Sydney, Australien.
Vesey, G, Griffiths, K, Gauci, M, Deere, D, Williams, K und Veal, D. 1997. Simple and rapid measurement of Cryptosporidium excxystation using flow cytometry. International Journal of Parasitology, in press.
McDonald, V; Deer, R. M; Nina, JM; Wright, S; Chiodini, PL; McAdam, KP (1991) Characteristics and specificity of hybridoma antibodies against oocyst antigens of Cryptospondium parvum from man. Parasite Immunology 13, 251-259.
Smith, H (1994). Use of antibodies for detecting environmental contamination with protozoan parasites. In: Laboratory Notes for Water Microbiology for the 21 st Century, University of Nottingham, U.K., 21–23 September.
Vesey, G, Slade, JS, Byrne, M, Shepherd, K, Dennis, PJL, und Fricker, CR. (1993). A new method for the concentration of Cryptosporidium oocysts from water. Journal of Applied Bacteriology, 75, 87–90.

Claims

Verfahren zur Herstellung von isolierten Antikörpern der IgG1-Unterklasse, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Vorbehandeln von Cryptosporidium-Oozysten mit einem Reagenz, um die Oberflächenschicht der Oozysten zu entfernen und ein Oozysten-Antigenpräparat zu bilden; (b) Abtrennen der Oozysten vom Oozysten-Antigenpräparat, um ein abgetrenntes Oozysten-Antigenpräparat zu erhalten, das dazu befähigt ist, eine nachweisbare IgGi-Immunreaktion in einem Tier gegenüber der Oberfläche der Oozyste hervorzurufen; (c) Immunisieren eines nicht-humanen Tiers mit dem abgetrennten Oozysten-Antigenpräparat, um in dem Tier eine IgG1-Immunreaktion hervorzurufen; und (d) Gewinnen von IgGi-Antikörpern aus dem Tier, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Reagenz um ein Detergens handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Detergens um Natriumdodecylsulfat (SDS) handelt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Vorbehandlung in einer Siedebehandlung der Oozysten in Gegenwart von SDS für eine ausreichende Zeitspanne, um das Oozysten-Antigenpräparat zu erzeugen, besteht.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei (a) in einer Siedebehandlung der Oozysten für 1 Stunde in Gegenwart von 0,5 (Gew.Nol.) SDS besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagenz aus der Gruppe Harnstoff, Detergentien, einschließlich Octoxynol, bekannt als Triton X-100 und Nonidet, Enzyme, einschließlich Chitinase, Oxidationsmittel, einschließlich Natriumhypochlorit, Natriumperiodat und Ozon, sowie Reduktionsmittel, einschließlich Mercaptoethanol und 1,1,1-Trichlor-2,2-bis-[4-chlorphenyl]-ethan, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei (c) feiner ein oder mehr Adjuvantien umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei dem Tier um eine Maus handelt.
Verfahren zur Herstellung von isolierten Antikörpern der IgGi-Unterklasse, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Abtrennen zumindest eines Teils der Cryptosporidium-Oozystenwand aus den internen Sporozoiten, wodurch ein Oozystenwand-Präparat gebildet wird; (b) Behandeln des abgetrennten Oozystenwand-Präparats, um ein Oozysten-Antigenpräparat zu erhalten, das dazu befähigt ist, eine nachweisbare IgG1-Immunreaktion in einem Tier gegenüber der Oberfläche der Oozyste hervorzurufen; (c) Immunisieren eines Tiers mit dem Oozysten-Antigenpräparat, um in dem Tier eine IgGi-Immunreaktion hervorzurufen; und (d) Gewinnen von IgGi-Antikörpern aus dem Tier, die gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Abtrennung der Oozystenwand von den internen Sporozoiten durchgeführt wird, indem man die Oozyste zur Exzystierung veranlasst, wonach sich die immunologische Abtrennung der Oozystenwand-Komponenten anschließt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Abtrennung der Oozystenwand von den internen Sporozoiten durchgeführt wird, indem man die Oozyste zur Exzystierung veranlasst, wonach sich die Abtrennung der Wandkomponenten durch eine Gruppe von Trennverfahren, die aus Zentrifugation, Fließzytometrie, Dichtegradiententrennung, Fällung, Immunmarkierung, Ligandenbindung, Biotinmarkierung und Trennung durch Avidin und chromatographische Trennung besteht, anschließt.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Oozyste zur Exzystierung veranlasst wird, indem man sie einfriert/ auftaut oder physikalisch durch Zerkleinerung, Ultraschallbehandlung oder Mahlen aufbricht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Behandlungsstufe (b) durch physikalisches Aufbrechen der Zellwand erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei (c) ferner ein oder mehr Adjuvantien umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei es sich bei dem Tier um eine Maus handelt.
Isolierter IgG1-Antikbrper, der gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv ist, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Antikörper nach Anspruch 16, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Isolierter IgG1-Antikörper der gegenüber der Oberfläche von Cryptosporidium-Oozysten reaktiv ist, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15.
Antikörper nach Anspruch 18, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt.