DE69717991T2

DE69717991T2 - Ein monoklonaler antikörper, welcher ein apoptotisches antigen nachweist

Info

Publication number: DE69717991T2
Application number: DE69717991T
Authority: DE
Inventors: Franklin Schlossman; Chonghui Zhang
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-28
Publication date: 2003-07-24
Anticipated expiration: 2017-03-29
Also published as: EP0904296B1; DE69717991D1; WO1997036928A1; EP0904296A1; CN1215406A; JP2000509252A; AU2596397A; CA2248615A1; US5935801A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper und insbesondere betrifft die Erfindung einen monoklonalen Antikörper, der an ein neues Epitop auf der Membran des Mitochondrienproteins (7A6) bindet, das auf Zellen, die einer Apoptose unterliegen, exponiert ist.

Hintergrund der Erfindung

Studien in Bezug auf das biologische und molekulare Verständnis des programmierten Zelltodes wurden kürzlich durch die Identifikation von Genen und ihren Produkten, die Apoptose regulieren, stimuliert. Apoptose stellt einen aktiven Prozess eines autonomen Zelltodes dar, der unter physiologischen und pathologischen Bedingungen auftritt (Clarke et al., 1990, Anal. Embryol. 181: 195-213; Boehmer, 1992, Immunology Today 13: 454-458, Gougeon und Matagnier et al. 1993,. Science 260: 1269-1270, Thompson, 1995, Science 267: 1456-1462). Die Stoffwechselwege, um einen programmierten Zelltod auszulösen, können in verschiedenen Zellen variieren, aber die Regulation der Apoptose wird im Allgemeinen durch Induktor- und Suppressorsignale geregelt, die von der molekularen Kaskade während der Apoptose initiiert wurden. Beispielsweise sind einige Mitglieder aus der Familie des Tumornekrosefaktors/Nervenwachstumsfaktorrezeptorgens in der Lage, apoptotischen Zelltod durch die Störung dieser Moleküle zu induzieren (Trauth et al. 1989, Science 245: 301-305, Itoh et al. 1991, Cell 66: 233-243, Boehm et al. 1992, J. Biol. Chem. 267: 10709-10715) und lassen vermuten, dass sie entweder über die Initiierung des den Tod auslösenden Signals wirken oder durch die Blockierung der Signale, die für das Zellüberleben notwendig sind. Im Gegensatz dazu, kann das Protein, das durch das Bc1-2-Gen kodiert wird, das Zellüberleben fördern, indem es mit den Stoffwechselwegen interferiert, die zu Apoptose führen, obgleich Bc1-2 anscheinend nicht das Fortschreiten des Zellzyklus beeinflusst (Vaux et al. 1988, Nature 335: 440-442, Hockenbery et al. 1990, Nature 248: 334-346, Nuñez et al. 1990, J. Immunol. 144: 3602-3610). Die kürzlich erfolgte Identifizierung dieser Gene und ihrer Produkte, die den programmierten Zelltod regulieren, hat in großem Ausmaß zu unserem Verständnis des molekularen Mechanismus von Apoptose beigetragen und stellt ebenso eine neue Herausforderung dar, neue Moleküle zu definieren, die beim programmierten Zelltod involviert sind.
Apoptose wird von charakteristischen morphologischen Wechseln sowie vom Abbau der internuklosomalen DNA (Kerr et al. 1972, B.r.J. cancer 26: 239-257, Wyllie, 1980, Nature 284: 555-556) begleitet. Der kürzlich erbrachte Nachweis weist darauf hin, dass vor dem Auftreten von morphologischen Änderungen und des Zelltodes während spontaner oder induzierter Apoptose, die Zellen wesentliche Änderungen sowohl im Hinblick auf ihre phänotypischen als auch funktionellen Eigenschaften durchlaufen. Diese umfassen die Aktivierung von Endonukleasen (Duke et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6361- 6365, Barry and Eastman, 1993, Arch., Biochem. Biophys. 300: 440-450, Peitsch et al. 1993, EMBO J. 12: 371-377, Zhang et al. 1995, Cell Immunol. 165: 161-167), die Expression von molekularen Markern (Estus et al. 1994, J. Cell. Biol. 127: 1717-1727, Fernandez et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 8641-8645) und einen Verlust oder eine Zunahme der Proteinexpression (Kishimoto et al. 1995, J. Exp. Med. 181: 649-655, Casciola-Rosen et al. 1994, J Exp. Med. 179: 1317-1330, Ajmani et al. 1995, J. Exp. Med. 181: 2049-2058). Obgleich gezeigt wurde, dass molekulare Veränderungen eng mit der Apoptose verbunden sind, ist wenig über ihre genaue Rolle während des Ablaufs des apoptoischen Zelltodes bekannt.
Die molekularen Veränderungen während der Apoptose wurden nicht nur bei Zellmembranen und dem Kern beobachtet, sondern ebenso bei Mitochondrien. Mitochondrien DNA kann nicht in der apoptotischen Zelle fragmentiert werden, während ihre Kern DNA in Fragmente von Endonukleasen gespalten wurde (Murgia eta 1, 1992, J. Biol. Chem. 267: 10939 -10941, Tepper und Stutzinsky, 1992, Cancer Res. 52: 3384-3390). Es wurde jedoch in Zellen, die einer Apoptose unterliegen, die abnormale Ultrastruktur von Mitochondrien und eine Reduktion des Mitochondrien-Membranpotentials gefunden (Vayssiere et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11752 -11756, Zamzami et al. 1995, J. Exp. Med. 181: 1661-1672, Steller, 1995, Science 267: 1445-1449). Die Lokalisierung von Bc1-2 auf Mitochondrien- Membranen hat einen gewisse funktionellen Einfluss auf Mitochondrien während der Apoptose hervorgerufen, obgleich das Bc1-2-Genprodukt ebenso in der Kernhülle und im endoplasmatischen Retikulum gefunden wurde (Hockenbery et al. 1990. Nature 248: 334- 346, Crajewsky et al. 1993, Cancer Res. 53: 4701-4714). Unter Verwendung einer menschlichen fibroplastischen Zelllinie, der die Mitochondrien DNA fehlt, berichteten Jacobson et al (1993, Nature, 361: 365-369) dass weder die Induktion von Apoptose durch das Entfernendes Wachstumsfaktors noch der anti-apoptotische Effekt von Bc1-2 von der Aktivität der Mitochondrien-Atmungslinie abzuhängen scheint. Die Überexpression von Bc1- 2 vergrößert jedoch das Mitochondrien-Membranpotential und rettet die Zellen vor dem apoptotischen Zelltod (Hennet et al. 1993, Cancer Res. 53: 1456-1460). Konsistent mit diesen Befunden haben Zamzani et al (1995; J. Exp. Med. 181: 1661-1672) kürzlich gezeigt, dass eine Reduktion des Mitochondrien-Membranpotentials ein frühes irreversibles Ereignis der in vivo Lymphozytenapoptose darstellt und dass einige pharmazeutische Wirkstoffe, die in der Lage sind, frühe Signalwege für die Apoptose zu blockieren, die Werte des Mitochondrien-Membranpotentials effizient stabilisieren. Diese Daten haben vermuten lassen, dass Mitochondrien-Komponenten beim apoptotischen Zelltod involviert sind.
Um die molekularen Marker für apoptotische Zellen zu identifizieren, wurden monoklonale Antikörper durch die Immunisierung von Mäusen mit sterbenden Jurkat-Zellen entwickelt. Es wurde gefunden, dass ein Antikörper, der als Anti-7A6 bezeichnet wird, bevorzugt mit Zellen reagiert, die einer Apoptose unterliegen, jedoch nicht mit normalen Zellen reagiert. Das Antikörper-definierte Molekül ist ein 38 kD-Protein, das auf der Mitochondrienmembran lokalisiert ist.
Der monoklonale Antikörper kann verwendet werden, um apoptotische Zellen von normalen Zellen zu unterscheiden, um die molekularen Mechanismen der Apoptose zu untersuchen und Diagnoseproben von Apoptose ähnlichen Krankheiten zu untersuchen, um die Wirksamkeit von therapeutischen Maßnahmen zu verfolgen und um neue Wirkstoffe zu identifizieren, die Apoptose induzieren oder inhibieren. Es wird dazu auf den Artikel von Thompson (1995, Science 267: 1456-1462) verwiesen, der im Detail die Rolle der Apoptose bei der Pathogenese und Behandlung von Krankheiten beschreibt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper oder deren immunreaktive Fragmente, die in einer menschlichen Zellpopulation zwischen normalen und apoptotischen Zellen unterscheiden. Die monoklonalen Antikörper binden spezifisch an ein Antigen auf der Membran von Mitochondrien in apoptotischen Zellen. Das Antigen, das ein Protein mit einem Molekulargewicht von 38 kD ist, ist in Zellen, die einer Apoptose unterliegen, nachweisbar, nicht jedoch in normalen Zellen.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind vorzugsweise murine Antikörper, sie können jedoch auch von jeder anderen Säugetierart abgeleitet werden, einschließlich jedoch nicht beschränkt auf Menschen oder Ratten oder Kombinationen davon. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper von einer Hybridzellinie produziert, die von Balb/c- Mäusen entwickelt ist, die mit apoptotischen Jurkat-Zellen immunisiert wurden. Die Hybridzellinie wurde bei der American Type Culture Collection Zugangsnummer A.T.C.C. HB 12065 hinterlegt.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erkennen ein neues Antigen (7A6) und binden spezifisch an ein Epitop dieses Antigens auf der Membran von Mitochondrien in apoptotischen Zellen. Diese Antikörper oder deren Fragmente können in Verfahren zur Unterscheidung zwischen normalen und apoptotischen Zellen in einer biologischen Probe verwendet werden, beispielsweise bei menschlichen hämopoetischen Zellpopulationen, einschließlich peripherer Blutlymphozyten, T-Zelllinien, B-Zelllinien, histiozytischen Zelllinien und promyeloiden Zelllinien. Aufgrund dieser Selektivität dieser Antikörper wird weiter ein Verfahren zur Nachweis und zur Messung von apoptotischen Zellen zur Verfügung gestellt.
Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden ersichtlich, wenn die detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Zeichnungen betrachtet werden, die nur in einem anschaulichen und nicht beschränkenden Sinn verstanden werden sollen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Die Fig. 1A und 1B zeigen Elektronenmikrographen von apoptotischen Jurkat-Zellen, die von Ara-C (1-β-D-Arabinofuranosylcytosin) induziert wurden. Die Jurkat-Zellen wurden in Gegenwart (Fig. 1A) oder in Abwesenheit von 10 uM Ara-C (Fig. 1B) in RPMI 1640 Medium, das mit 10%igem fötalen Rinderserum angereichert war, inkubiert. Beide Zellen wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei der gleichen Vergrößerung (· 18.000) untersucht. Pfeile zeigen die Struktur der apoptotischen Körper an. Die Balken in den Figuren stellen 1 u dar.
Die Fig. 2A und 2B sind graphische Darstellungen der Durchflusszytometrie-Analyse von anti-7-A6 auf normalen und apoptotischen Jurkat-Zellen. Die Jurkat-Zellen wurden durch y- Bestrahlung oder durch Behandlung mit ARA-C oder anti-CD 95 (Phas/Apo-1) induziert, um einer Apoptose zu unterliegen. Die apoptotischen oder normalen Jurkat-Zellen wurden nicht permeabilisiert (Fig. 2A) oder wurden durch Digitonin (Fig. 2B) permeabilisiert, bevor sie für die Durchflusszytometrie immunofluoreszenzmarkiert wurden. Der Prozentsatz an positiven Zellen ist in jedem Profil angegeben.
Fig. 3 ist eine graphische Illustration des ELISA-Tests von Zelllysaten, die aus normalen der aptotischen Jurkat-Zellen hergestellt wurden. Die Zellysate wurden aus normalen oder apoptotischen Jurkat-Zellen hergestellt, die durch γ-Bestrahlung oder durch ARA-C- Behandlung induziert wurden, und auf ELISA-Plättchen aufgeschwemmt. Die Plättchen wurden mit anti-7A6 oder einem entsprechenden Isotypen übereinstimmenden Kontrollantikörper inkubiert, gefolgt von enem Ziegen-Antimaus IgG-Peroxidase-Konjugat Die enzymatische Reaktion wurde mit Orthophenylendiaminsubstrat entwickelt und bei 492 nM unter Verwendung eines ELISA-Lesers gelesen.
Die Fig. 4A und 4 B veranschaulichen den DNA-Fragmentationsessay auf gereinigten 7A6+ und 7A6- Zellen. Normale und ARA-C behandelte Jurkat-Zellen wurden gemischt und mit anti -7A6 immunofluoreszenzmarkiert. Die 7A6 positiven (pc) und negativen Zellen (nc) wurden anschließend durch einen Zellsortierer aussortiert (Fig. 4A). Die DNA wurde aus beiden Zellpopulationen isoliert und auf 1,5%igem Elektrophorese-Agarosegel, wie vorher schon beschrieben, analysiert (Zhang et al. 1995, Cell. Immunol. 165: 161-167). Spur 1, ein 100bp DNA-Leiter als Molekulargewichtsmarkierer, Spur 2, DNA isoliert aus 7A6- Zellen und Spur 3, DNA aus 7A6+ Zellen (Fig. 4B). Es ist die relative Wanderung der DNA Molekulargewichtstandards (bp) angegeben.
Fig. 5 ist ein Immunoblot von Zellysaten durch anti-7A6. Die Zellysate wurden aus normalen, bestrahlten oder mit Ara-C behandelten Jurkat-Zellen hergestellt und SDS - PAGE, das 10% Acrylamidgel enthielt, unter reduzierenden Bedingungen unterworfen. Die Proteine wurden auf die Nitrozellulosemembran transferiert, die mit anti-7A6 inkubiert war, gefolgt von Protein G-Peroxydase. Der Blot wurde durch Verstärkungschemolumineszenztechniken sichtbar gemacht. Spur 1 zeigte Zelllysate aus bestrahlten Jurkat-Zellen, Spur 2 zeigt Zellysate aus ARA-C behandelten Jurkat-Zellen und Spur 3 zeigt Zellysate aus normalen Jurkat-Zellen. Es ist die relative Wanderung von Proteinmolekulargewichtsstandards angegeben.
Die Fig. 6A-F sind Eletronenmikrographen, die die Lokalisierung des 7A6 Antigens auf der Mitochondrienmembran zeigen. Kryoschnitte, die aus ARA-C behandelten (Fig. 6A) oder normalen Jurkat-Zellen (Fig. 6B) erhalten wurden, wurden mit anti-7A6 markiert, gefolgt von einem Immunogoldkonjugat, und mit einem Elektronenmikroskop untersucht. Bei normalen Jurkat-Zellen wurde keine Markierung beobachtet, während Cluster von Immunogoldteilchen in ARA-C behandelten Jurkat-Zellen (Pfeile) gefunden wurden. Die Reaktivität von anti-7A6 wurde ebenfalls auf isolierten Mitochondrien aus normalen und mit ARA-C behandelten Jurkat-Zellen unter Verwendung der Percoll Metrizamingradientenzentifugation getestet (Fig. 6C-F). Die Mitochondrien wurden durch Digitonin permeabilisiert bevor sie mit Immunogold für Elektronenmikroskopie markiert wurden. Die Fig. 6D zeigt Mitochondrien aus apoptotischen Zellen, die mit anti- 7A6 (· 35.000 fache ursprüngliche Vergrößerung) gefärbt wurden. Fig. 6D zeigt das gleiche Beispiel wie in Fig. 6C, aber mit einer höheren Vergrößerung untersucht (· 72.000). Die beobachteten Goldteilchen waren an der Oberfläche der inneren Membran (Pfeile) des Mitochondriums (m) lokalisiert. Fig. 6F zeigt Mitochondrien aus normalen Zellen, die mit anti-7A6 gefärbt wurden, und Fig. 6F zeigt Mitochondrien aus apoptotischen Zellen, die mit einem isotypenübereinstimmenden Kontrollantikörper gefärbt waren. Der Balken in den Figuren stellt 0,5 u dar.
Die Fig. 7A-D sind graphische Darstellungen der Durchflusszytometrie-Analyse von peripheren Blutlymphozyten aus einem mit HN-infizierten Spender. Fig. 7A zeigt eine zytometrische Analyse unter Verwendung eines Kontrollantikörpers von HIV-infizierten Zellen, die mit CD3 aktiviert wurden. Fig. 7B zeigt eine zytometrische Analyse unter Verwendung eines Kontrollantikörpers von HIV-infizierten Zellen, die mit PMA aktiviert wurden. Fig. 7C zeigt eine zytometrische Analyse unter Verwendung eines Anti-7A6 Antikörpers von HIV-infizierten Zellen, die mit CD3 aktiviert wurden. Fig. 7D zeigt eine zytometrische Analyse unter Verwendung eines anti-7A6 aus mit HIV-infizierten Zellen, die mit PMA aktiviert wurden.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfindung stellt einen mit anti-7A6 bezeichneten monoklonalen Antikörper, der ein einziges Epitop definiert, das apoptotischen Zellen ausgesetzt ist, zur Verfügung. Wie mit Durchflußzytometrie analysiert wurde, sind anti-7A6 Antikörper nicht in der Lage, normale, mit Digitonin permeabilisierte menschliche periphere Blutlymphozyten und eine Anzahl untersuchter menschlichen Zelllinien zu färben. Im Gegensatz dazu markiert der Antikörper Zellen, die einer Apoptose unterliegen, ohne Rücksicht darauf, ob die Zellen durch Digitonin permeabilisiert wurden oder nicht. ELISA und Immunoblot, die Zellysate verwenden, die in einem TritonX-100 Lysepuffer hergestellt wurden, haben ebenfalls gezeigt, dass anti-7A6 mit apoptotischen Jurkat-Zellen reagiert, jedoch nicht mit normalen Zellen. Das durch anti-7A6 definierte Antigen ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 38 kD, das an der Membran von Mitochondrien lokalisiert ist. Diese Befunde weisen darauf hin, dass 7A6 ein neues Hepitop ist, das auf Zellen, die einer Apoptose unterliegen, exponiert ist. Es wurde gezeigt, dass eine zunehmende Anzahl von molekularen Vorgängen Zelltod durch Apoptose reguliert. Es wird angenommen, dass die Induktion von Apoptose Endonukleasen aktiviert, die für den Abbau von DNA Fragmenten in Nukleosomen verantwortlich sind (Duke et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6361-6365, Barry and Eastman 1993, Arch. Biochem. Biophys. 300: 440-450, Peitsch et al. 1993, EMBO J. 12: 371-377).
Kürzlich wurde ein Triplett von Nukleaseproteinen (NP 42-SO) identifiziert, dass in Jurkat- Zellen aktiviert ist, die einer Apoptose unterliegen, und es scheint, dass dieses Triplett von DNaseI und DNasell durch seine molekularen Charakteristika und enzymatischen Anforderungen unterscheidbar ist (Zhang et al. 1995, Cell. Immunol. 165: 161-167). Neben dem während der Apoptose zerstörten Kern wurde auch gefunden, dass Mitochondrien das zelluläre Target sind, wobei Schäden im frühen Stadium der Apoptose beginnen, obwohl die Fragmentierung von Mitochondrien DNA für die Zellen, die einer Apoptose unterliegen, nicht erforderlich ist (Murgia et al. 1992, J. Biol. Chem. 267: 10939-10941, Tepper and Studzinsky 1992, Cancer Res. 52: 3384-3390, Yoneda et al. 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 723-729). Es wurde in der Tat gezeigt, dass einige Apoptose verursachende Wirkstoffe den Verlust der Mitochondrien-Integrität und ihrer funktionellen Defekte verursachen, was zum Zelltod führt (Vukmanovic et al. 1991, Eur. J. Immunol. 21: 419-424, Hennet et al. 1993, Biochem. J. 389: 587-592). Es wurde im Gegensatz dazu gezeigt, dass die Überexertion von Bc1-2, ein Protein, das das Überleben der Zelle durch die Blockierung von Stoffwechselwegen für die Apoptose blockiert, die Werte des Mitochondrien Membranpotentials in transfizierten Zellen vergrößert und den Mitochondrien Membranpotentialverlust durch Apoptose schützt (Hennet et al. 1993, Cancer, Res. 53: 1456 -1460, Smetz et al. 1994; Blatt 5: 1613-1619). Die spezifische Lokalisierung des 7A6 Antigens auf der Membran von Mitochondrien und seine beschränkte Expression in apoptotischen Zellen weist nach, dass das 7A6 Antigen in der molekularen Kaskade der Apoptose involviert ist.
Die Expression des 7A6 Antigens wird vorzugsweise auf apoptotischen Zellen nachgewiesen, jedoch nicht auf der normalen Zelloberfläche oder auf mit Digitonin permeabilisierten Zellen. Darüber hinaus hat die Aktivierung von Jurkat-Zellen durch Mitogene keine Auswirkungen auf die Expression des 7A6 Antigens. Durchflusszytomentrische Profile haben ebenfalls gezeigt, dass das 7A6 Antigen in einem frühen Stadium der Apoptose nachgewiesen wird, und zeigen weiterhin an, dass die Expression des 7A6 Antigens eher ein frühes Ereignis während der Apoptose als Endprodukt von toten Zellen ist. Unter Verwendung monoklonaler Antikörpertechniken haben Rotello et al (1994, Development 120: 1421-1431) berichtet, dass Zellen, die während der Embryo-Entwicklung bei Hühnern an Apoptose starben, spezifische Antigene exprimierten, die als Apogene bezeichnet wurden, obgleich einige dieser Antigene nachweislich ebenso auf nekrotischen Zellen exprimiert wurden (Fernandez et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8641-8645). Interessanterweise wurde gezeigt, dass einige intrazelluläre Moleküle innerhalb der normalen Zellen während der Apoptose an der Zelloberfläche exponiert sind (Casciola-Rosen et al. 1994, J. Exp. Med. 179: 1317-1330, Koopmann et al. 1994, Blatt 1984: 1415-1420). Im Gegensatz dazu ist es unwahrscheinlich, dass 7A6 ein herkömmliches intrazelluläres Protein ist, das auf der Oberfläche apoptotischer Zellen exprimiert wird, da es nicht in mit Digitonin permeabilisierten normalen Zellen über Durchflusszytometrie oder in Lysaten dieser Zellen über Immunoblots nachgewiesen werden kann.
Die Verfahren und Materialien, die verwendet werden um die monoklonalen Antikörper herzustellen und das erfindungsgemäße Antigen zu definieren, sind nachstehend im Detail beschrieben. Zusammengefasst gesagt, wurde eine Auswahl monoklonaler Antikörper gegen sterbende Zellen erhalten, indem Mäuse mit apoptotischen Jurkat-Zellen immunisiert wurden. Es wurde gefunden, dass einer dieser Antikörper, nämlich anti -7A6 mit apoptotischen Zellen reagiert. Wie mit Durchflusszytometrie und ELISA bestimmt werden konnte, wurde keine Reaktivität von anti -7A6 in normalen oder in mit Digitonin permeabilisierten menschlichen peripheren Blutlymphozyten und in allen untersuchten lymphoiden Zelllinien beobachtet. Jedoch reagierte der Antikörper in großem Ausmaß mit diesen Zellen, wenn sie, durch Bestrahlung oder durch Behandlung mit Apoptose induzierenden Wirkstoffen dazu angeregt wurden, einer Apoptose zu unterliegen. Zellsortierungs- und DNA Fragmentierungsexperimente zeigten, dass 7A6+ Zellen jedoch nicht 7A6- Zellen offensichtliche DNA Fragmente aufwiesen, die charakteristisch für Zellen sind, die einer Apoptose unterliegen. Unter Verwendung von Immunoblots unter reduzierenden Bedingungen wies anti -7A6 ein 38 kD Proteinband in den Zellysaten nach, die aus apoptotischen Zellen stammten. Immunoelektronenmikroskopie zeigte, daß das 7A6 Antigen auf der Membran von Mitochondrien in apoptotischen Jurkat-Zellen lokalisiert ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass anti -7A6 ein neues Epitop auf dem Protein der Membran von Mitochondrien definiert, das auf Zellen exponiert ist, die einer Apoptose unterliegen, und weist somit nach, dass das 7A6 Molekül in der molekualren Kaskade des apoptotischen Zelltods involviert ist.
Die vorliegend beschriebenen Verfahren können dazu verwendet werden, zusätzliche monoklonale Antikörper mit den Charakteristika des anti -7A6 Antikörpers der in den nachstehenden Beispielen beschrieben ist, oder durch Verfahren, die dem Fachmann an sich bekannt sind, zu erzeugen. Screeningverfahren, um Antikörper mit den gewünschten Charakteristika zu identifizieren sind vorliegend ebenfalls beschrieben. Darüber hinaus kann die Identifizierung von Antikörpern und deren immunoreaktive Fragmenten im Rahmen der Erfindung unter Verwendung von Standard-Konkurrenzbindungsassays, die dem Fachmann im wesentlichen bekannt sind, unter Verwendung des Anti -7A6 Antikörpers, der durch die Hybridzelllinie, die durch die ATCC Zugangsnummer HB1206 gekennzeichnet ist, erreicht werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Antikörperfragmente und Derivate umfaßt, die wenigstens den funktionellen Teil der Antigenbindungsdomäne eines anti -7A6 Antikörpermoleküls umfassen.
Antikörperfragmente, die die Bindungsdomäne des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken hergestellt werden. Beispielsweise umfassen derartige Fragmente das F(ab')2 Fragment, das durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann, die Fab' Fragmente, die durch die Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')2Fragments hergestellt werden, und die Fab Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papaim und einem reduzierenden Wirkstoff erzeugt werden können, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Siehe beispielsweise National Institutes of Health, 1 Current Protocols In Immunology, Coligan et al. ed. 2.8, 2.10 (Wiley Interscience 1991). Ebenso umfassen die Antikörperfragmente Fv Fragmente, das heißt Antikörperprodukte innerhalb derer keine konstanten Regionen mit Aminosäureresten vorliegen. Derartige Fragmente können beispielsweise hergestellt werden, wie im US Patent Nr. 4,642,334 beschrieben.

Die Entwicklung monoklonaler Antikörper Antikörper und andere Reagenzien

Der monoklonale Antikörper anti-7A6 wurde gescreened und von einem Hybridom kloniert, das erzeugt wurde, indem ein Mausmyelom P3-x63-Ag.8.653 (Kearney et al. 1979, J. Immunol. 123: 1548-1550) mit Splenozyten einer Maus fusioniert wurde, die mit sämtlichen apoptotischen Jurkat-Zellen immunisiert wurde. Weibliche BA1b/c Mäuse wurden 4 mal immunisiert, entweder subkutan oder intraperitonal über Intervalle von 3 bis 4 Wochen mit Jurkat-Zellen, die durch 1-β-D-Arabinofuranosylcytosin (Ara-C), ein Antimetabolitenwirkstoff, angeregt wurden, einer Apoptose zu unterliegen. Drei Tage vor der Zellfusion wurden die Mäuse durch intraperitonale Injektionen mit den zellulären Antigenen (Apoptotische Jurkat-Zellen) weiter angeregt. Die Splenozyten aus den immunisierten Mäusen wurden mit Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol mit der vorstehend beschrieben Methode verschmolzen (Köhler and Milstein 1975, Nature 256: 495- 497). Anti-7A6 wurde gegen Zellen, die einer Apoptose unterliegen, gescreent. Es wurde unter Verwendung kommerzieller Antikörper Isotypenreagenzien gezeigt, dass es eine IgGl Unterklasse ist (Amersham, Life Science Arlington Heights, Il). Asciten für Anti -7A6 wurden in Mäusen hergestellt und der Antikörper wurde aus der Ascitenflüssigkeit über Protein A Affinitätssäulen gereinigt (Pharmacia, Piscataway, NJ).
Anti -7C11 (IgN) ist ein monoklonaler Antikörper von Mäusen, der mit dem Cd59 (Fas/Apo- 1) Antigen reagiert (Robertson et al. 1995, Leuk. Lymphoma 17: 51-58) und wurde von Dr. Robertson zur Verfügung gestellt. Affinitätsgereinigte Ziegen Antimaus IgG - FITC Konjugate für die Durchflusszytometrie und Ziegen Antimaus IgG - Goldkonjugate für die Elektronenmikroskopie wurden von Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove DA) und von Amersham Life Science (Arlington Heights IL) erhalten. Monoklonales Maus anti-α-Tubulin(IgG1), Ara-C und alle anderen chemischen Reagenzien wurden von Sigma Immunochemicals (St. Louis, MO), soweit nicht anders angegeben, erhalten.

Zellkultur und Apoptose Induktion

Es wurden in dieser Studie menschliche T-Zellinien (Jurkat, CEM, Molt-4 und HAT-102), B- Zelllinien (RAJY, DAUDI und RAMOS), eine histiozytische Zellinie (U - 937) und eine promyeloide Zelllinie (HL-60) verwendet. Alle Zelllinien wurden in einem RPMI-1640 Medium, das mit 10%igem fötalen Rinderserum ergänzt war, 0,45 mM Pyruvinsäure und 2 mM L-Glutamin gehalten. Die menschlichen peripheren Blutlymphozyten wurden aus gesunden Spendern isoliert oder aus HIV-infizierten Spendern über Dichtegradientenzentrifugation über Fikoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ).
Zur Apoptoseinduktion in der Zellkultur wurden die Jurkat-Zellen mit Ara-C oder Anti-CD95 (Fas/Apro-1) wie vorstehend beschrieben behandelt (Zhang et al. 1995, Cell. Immunol. 165: 161-167). Apoptoseinduktion in menschlichen peripheren Blutlymphozyten Jurkat-Zellen, und allen anderen Zelllinien wurden ebenso über Gamma-Bestrahlung gefolgt von Inkubierung über Nacht bei 37ºC erreicht. Die Strahlungsdosen variierten innerhalb der Zellen von 1000 bis 3000 Rads unter Verwendung eines GammaCell-1000 mit einer ¹³&sup7;Cs Quelle (Atomic Energy of Canada Ltd:, ON, Canada). Der apoptotische Zelltod durch Bestrahlung oder apoptoseinduzierende Wirkstoffe wurden durch Analyse der DNA Fragmentierung und der Zellmorphologie bestimmt.

Zellpermeabilisierung durch Digitonin und Immunofluoreszenzfärbung für die Durchflusszytometrie

Menschliche periphere Blutlymphozyten und ihre Zelllinien wurden durch die vorstehend beschriebenen Verfahren mit geringen Modifizierungen permeabilisiert (Fiskum et al. 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3430-3434, Anderson et al. 1989 J. Immunol.. 143: 1899- 1904). Kurz gesagt, wurden die Zellen in 1%igem Formalin in PBS für 20 Minuten auf Eis fixiert und 2 mal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden anschließend durch Inkubation auf Eis für 5 Minuten mit Digitonin (Aldrich, Milwaukee, WI) permeabilisiert. Eine Vorratslösung von 10 mg ml&supmin;¹ Digitonin wurde hergestellt, indem es in Dimethylsulfoxid gelöst wurde, und eine Endkonzentration von 10 ug ml&supmin;¹, die aus der Vorratslösung mit PBS verdünnt wurde, wurde für die Zellpermeabilisierung verwendet. Die Permeabilisierung von Zellen durch Digitonin wurde durch die Aufnahme von Trypanblau bestätigt. Auf die Permeabilisierung folgend, wurden die Zellen gewaschen und in PBS für die Immunofluoreszenzfärbung wieder suspendiert.
Zellen mit oder ohne Digitoninpermeabilisierung wurden mit Antikörpern für die Durchflusszytometrie durch einen indirekten Immunofluoreszenzessay markiert. Nach Inkubierung für 40 Minuten auf Eis mit 100 uL eines monoklonalen Antikörpers in der überstehenden Lösung oder verdünnter Ascites, wurden die Zellen (ungefähr 1 · 10&sup6; Zellen/Probe) 3 · mit PBS, das 0,1% Albuminrinderserum und 0,01 NaN&sub3; enthielt gewaschen. Gefolgt von einer weiteren Inkubierung für 40 Minuten mit affinitätsgereinigten Ziegen Antimaus IgG-FITC Konjugat (1: 500) wurden die Zellen 3 mal mit dem vorstehenden Puffer gewaschen und in 1%igem Formalin in PBS für die Durchflusszytometrieanalyse fixiert.
Für die Immunofluoreszenzmarkierung für die Zellsortierung wurde ein Gemisch von 2 · 10&sup7; normalen Jurkat-Zellen und 4 · 10&sup7; ARA-C behandelten Jurkat-Zellen mit Anti-7A6 gefärbt, gefolgt von Ziegen AntimausIgG- FITC Konjugat. Nach Inkubierung und Waschschritten wurden die Zellen zu Pellets geformt und anschließend in PBS anstelle der Fixierung in1-%igen Formalin wieder suspendiert. Unter Verwendung eines Epics V Zellensortierers wurden die Proben auf 7A6 positive und negative Zellpopulationen hinaussortiert. Die Reinheit der getrennten 7A6 positiven und negativen Zellen war größer als 98%, bestimmt über Durchflusszytometrie, und die Sichtbarkeit von nachsortierten Zellunterpopulationen, die durch durch Trypanblauausschluß bestimmt wurde. Die 7A6 positiven oder negativen Zellen wurden anschließend gewaschen, zu Pellets geformt und für den DNA Fragmentierungsassay verwendet.

Herstellung von Zelllysaten

Normale oder apoptotische Zellen, die durch γ-Bestrahlung oder ARA-C behandelte Jurkat- Zellen induziert wurden, wurden aus Zellkulturen gesammelt und 2 · mit PBS durch Zentrifugierung gewaschen. Die Zellpellets wurden in einem Lysepuffer der 0,5% Triton X- 100, 50 nM Tris-HCl, pH 7,6, 140 nM NaCl, 5 nm EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 2 ug ml&supmin;¹ Aprotinin enthielt, solubilisiert. Nach der Inkubierung auf Eis für 40 Minuten wurden die Proben für 15 Minuten bei 14.0000 rpm bei 4ºC zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeiten wurden für die nachstehend beschrieben ELISA-Tests und Immunoblotting Essays gesammelt.

ELISA zum Nachweis des Antikörpers

Ein ELISA-Assay unter Verwendung von Zelllysaten als Target Antigene wurde durch eine Modifizierung der früher beschriebenen Verfahren durchgeführt (Cobbold and Waldman, 1981, J. Immunol. Meth, 44: 125-133). ELISA-Plättchen wurden hergestellt, indem zelluläre Proteine in die Vertiefungen von Polystyrol Falcon-Mikrotest-Plättchen mitflachem Boden (Becton-Dickinson, Labware, Lincoln Park, NJ) unter Verwendung von Poly-L-Lysin und Glutaraldehyd angebracht wurden. Nach Behandlung mit Poly-L-Lysin über eine Stunde wurden die Plättchen mit 50 ul von verdünnten Zellysaten, die 2,5 · 105 Zellen pro Vertiefung entsprechen, beschichtet. Nach Inkubierung bei Raumtemperatur für eine Stunde wurden die Plättchen mit 50 ul 0,2% frisch hergestelltem Glutaraldehyd gefüllt und für ca. 15 Minuten inkubiert. Die Plättchen wurden geleert und einmal mit PBS gewaschen. Ein Blockierungspuffer, der 100 uMol Glycin und 0,1% Albuminrinderserum enthielt, wurde zugegeben und für 30 Minuten inkubiert. Die Plättchen wurden anschließend mit 0,2% Gelatine gefüllt und bei 4ºC über Nacht inkubiert. Allein diesem Assay verwendeten Lösungen wurden in regulärem PBS bei einem pH von 7,4 hergestellt. Die Verdünnung der Testantikörper und der Ziegenantimaus-IgG Peroxydase (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) wurde im 10%igem normalen Ziegenserum in PBS durchgeführt.
Für ELISA-Tests wurden monoklonale Antikörper mit verschiedenen Verdünnungen (25 ul/Vertiefung) zu vorbeschichteten Platten gegeben und jede Antikörperverdünnung wurde 3 fach getestet. Ein Maus Anti-α-Tubulin und ein isotypenentsprechender nicht reaktiver Antikörper wurden als positive und negative Kontrollen verwendet. Nach Inkubierung für einer Stunde bei Raumtemperatur wurden die Plättchen 3 mal mit 0,1%iger Gelatinelösung gewaschen und für 10 Minuten mit 10%igem normalen Ziegenserum inkubiert, um das nicht spezifische Binden zu blockieren. Die Plättchen wurden anschließend für 30 Minuten mit Ziegen AntiMaus IgI Peroxydase inkubiert. Nach dem Wäschen mit 0,05% TWEEN-20 in PBS wurde die enzymatische Reaktion durch Inkubierung der Plättchen für 45 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Substratlösung (30 mg Orthophenylendiamin gelöst in 10 ml eines 100 mM Zitratpuffers bei einem pH von 4,5 und 4 ul 30%iges Wasserstoffperoxid) entwickelt und gestoppt, indem 50 ul von 2,5 M Schwefelsäure in jede Vertiefung zugegeben wurde. Die Plättchen wurden bei 492 nM unter Verwendung eines automatischen ELISA- Lesers (Dynatec Laboratories, Inc. Alexandria, VA) gelesen.

Immunoblotting Assay

Zelllysate, die aus normalen oder apoptotischen Zellen hergestellt wurden, wurden auf 515- PAGE getrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert (Schleicher und Schüll, Keene, NH). Nach Inkubierung mit 3%igem Albuminrinderserums in PBS, um nichtspezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurde die Membran mit anti-7A6 inkubiert, gefolgt von einem Protein-G-Peroxidasekonjugat (Bio-Rad, Richmond, CA). Die Membran wurde nach jeder Inkubation 4 mal mit Tris-HCl-Pufferlösung bei einem pH von 7,6 gewaschen, die 0,05% Tween-20 und 0,1% Gelatine enthielt. Die Monoblots wurden durch eine verstärkte Chemolumineszenz (Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den Instruktionen des Herstellers nachgewiesen.

Isolierung von Mitochondrien

Normale oder apoptotische Jurkat-Zellen induziert von ARA-C wurden gewaschen und in einer eisgekühltem Pufferlösung, die 10 uMol HEPES bei einem pH von 7,5, 1,5 uMol MgCl&sub2;, 5 uMol KCl und 250 uMol Sucrose enthielt, wieder suspendiert und anschließend über Doounce-Homogenisierung unter Verwendung eines Typ B Pistills (Wetten, Millville; NJ) zerstört. Postnukleare überstehende Lösungen, die zytoplasmische Organellen enthielten, wurden durch Zentrifugierung während 5 Minuten bei 1300 g gesammelt. Die Pellets wurden in 250 umol Sucroselösung wieder suspendiert und zentrifugiert, um wieder die überstehende Lösung zu sammeln. Die überstehenden Lösungen von beiden Zentrifugierungen wurden zusammengeführt und für die Isolierung der Mitochondrien verwendet.
Die Mitochondrien wurden aus den postnuklearen überstehenden Lösungen unter Verwendung eines Percoll-Metrizamidgradienten, wie er von Story and Madden (1990, in Methods in Enzymology, Vol. 182: 203-225) beschrieben ist, isoliert. Kurz gesagt wurde ein diskontinuierlicher Dichtegradient in einem Zentrifugenröhrchen durch Beladung mit 35% Metrizamid als unterste Lage, eine 17%ige Methrizamidlösung als zweite Lage, gefolgt von 6 % Percoll, erhalten.
Alle Gradientenlösungen wurden in 250 uMol Sucroselösung hergestellt. Postnukleare überstehende Lösungen, die zytoplasmische Organellen enthielten, wurden auf die Percoll Schicht beladen. Nach der Zentrifugierung für 20 Minuten bei 20.000 rpm bei 4ºC wurden die Mitochondrien an der Zwischenschicht zwischen der 17%igem und 35%igem Methrizamidlage angereichert. Die resultierenden Mitochondrien wurden gewaschen und durch Zentrifugation zu Pellets geformt.

Immunogoldfärben für die Elektronenmikroskopie

Normale oder Ara-C behandelte Jurkat-Zellen wurden fixiert und für Frierschnitte vorbereitet, wie es schon früher beschrieben wurde (Griffith and Hoppiler, 1986, J. Histochem. Cytochem. 34: 1389-1398). Die Schnitte wurden mit anti-7A6 oder einem isotypangepassten Kontrollantikörper markiert, gefolgt von Ziegen Antimaus IgG, das an 10 nM Goldpartikel konjugiert war. Nach Waschschritten und Behandlungen wurden die Proben mit einem Elektronenmikroskop untersucht.
Die Zellen oder isolierten Mitochondrien aus normalen und Ara-C behandelten Jurkat-Zellen wurden ebenfalls mit einem Elektronenmikroskop auf Immunogoldteilchen hin unter Verwendung eines Markierungsassays, der vor dem Einbetten durchgeführt wurde, untersucht. Nach der wie vorstehend beschrieben Fixierung und Permeabilisierung durch Digitonin wurden die Zellen oder die isolierten Mitochondrien mit anti-7A6 oder einem Kontrollantikörper als einem Wirkstoff für den ersten Schritt gefärbt und es wurde Ziegen Antimaus IgG-Goldkonjugat als zweites Reagens zugegeben. Nach Inkubation und Waschschritten wurden die Proben durch Zentrifugation zu Pellets geformt und in ein gelatinöses Medium eingebettet. Die Proben wurden mit einem Ultramikrotom geschnitten und mit einem Elektronenmikroskop untersucht.

Reaktivität von Anti-7A6 mit apoptotischen Zellen, die durch Bestrahlung, Behandlung mit Ara-C oder Anti-CD95 (FAS/Apo -1) induziert wurden und mit normalen Zellen

Es wurde gefunden, dass anti-7A6 mit apoptotischen Zellen, die durch Bestrahlung, Behandlung mit Ara-C oder Anti-CD95(Phas/Apo-1) induziert wurden, reagiert, jedoch nicht mit normalen Zellen.
Anti-7A6, ein Antikörper des Maus IgG1Isotyps, wurde gescreent und von einem Hybridom geklont, das von Maussphänozyten abgeleitet war, die mit Ara-C behandelten Jurkat-Zellen, einer Tumorzelllinie immunisiert wurden. Ara-C ist ein anti-metabolitischer Wirkstoff, der effizient Jurkat-Zellen induziert, damit sie dem apoptotischen Zelltod in mikromolaren Konzentrationen unterliegen. Wenn Jurkat-Zellen in Gegenwart von Ara-C gezüchtet wurden, dann zeigten sie eine Spaltung der DNA in internukleosomale Fragmente, die für Apoptose charakteristisch sind. Morphologisch gesehen, zeigten diese Zellen einen Verlust der Oberflächenmikrozotten, zytoplasmische Kondensierung und Kernzerstörung und apoptotische Körper (Fig. 1A). Im Gegensatz zu normalen Zellen schrumpften die Zellen, die durch Ara-C induzierte Apoptose starben, in großem Ausmaß und ihre Größe wurde um 20-30% reduziert, was über ein Elektronenmikroskop unter Verwendung der gleichen Vergrößerung (Fig. 1) nachgewiesen wurde.
Die Reaktivität von Anti-7A6 mit Jurkat-Zellen wurde anfangs über Durchflusszytometrie unter Verwendung einer indirekten Fluoreszenzfärbetechnik untersucht. Fig. 2 stellt Durchflusszytometrieprofile des 7A6 Antigens auf nichtpermeabilisierten oder mit Digitonin permeabilisierten normalen und apoptotischen Jurkat-Zellen dar. Wie in Fig. 2A gezeigt, wurde keine Reaktivität von Anti-7A6 in den normalen Jurkat-Zellen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde gefunden, dass Anti-7A6 Jurkat-Zellen, die einer Apoptose unterliegen, die durch y-Bestrahlung, Behandlung mit Ara-C oder anti-CD95 (Phas/Apo-1) hervorgerufen wurde, selbst wenn die Zellen nicht mit Digitonin permeabilisiert wurden. Jedoch konnte dieser Antikörper Jurkat-Zellen, die durch Mitogene, umfassend Con - A oder PMA, aktiviert wurden, nicht färben. Zur weiteren Bestätigung der Reaktivität von anti-7A6 wurden normale oder apoptotische Jurkat-Zellen mit Digitonin permeabilisiert, mit Antikörpern gefärbt, gefolgt von Immunofluoreszenz-Durchflusszytometrie (Fig. 2B). Verglichen mit dem isotypenübereinstimmenden Kontrollantikörper, der sowohl mit normalen oder apoptotischen Jurkat-Zellen keine Reaktivität aufwies, reagierte anti-7A6 mit Ara-C behandelten Jurkat-Zellen in einer zeitabhängigen Weise, jedoch nicht mit unbehandelten Jurkat-Zellen, selbst wenn die Zellen mit Digitonin permeabilisiert wurden. Wie erwartet, färbte monoklonales Antitubulin sowohl normale als auch apoptotische Jurkat-Zellen nach einer Digitoninpermeabilisierung. Siehe Fig. 2.
Die Fähigkeit von anti-7A6, apoptotische Zellen in HIV-infizierten peripheren Blutlymphozyten nachzuweisen und zu bestimmen, wurde ebenfalls getestet. PBLs von einem infizierten Spender wurden sowohl mit CD3 oder PMA, Wirkstoffen, die T-Zellen- Aktivierung induzieren, behandelt. Die zytometrischen Analysen wurden anschließend auf den aktivierten Zellen unter Verwendung eines Kontrollantikörpers oder von anti-7A6 durchgeführt. Verglichen mit der Kontrolle wurde gefunden, dass anti-7A6 HIV-infizierte PBL's, die einer Apoptose unterliegen, nachweisen und bestimmen kann. Siehe Fig. 7A-7D.
Die Reaktivität von anti-7A6 gegenüber menschlichen peripheren Blutlymphozyten und Zelllinien ist in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefasst. Wie durch Durchflusszytometrie bestimmt wurde, schaffte es anti-7A6 nicht, normale menschliche periphere Blutlymphozyten zu färben, ebenso alle Zelllinien, die getestet wurden, unabhängig davon, ob die Zellen mit Digitonin permeabilisiert wurden oder nicht. Sobald die Zellen dahingehend induziert wurden, dass sie einer Apoptose durch γ-Bestrahlung oder durch Ara- C-Behandlung unterliegen, reagierte anti-7A6 jedoch in großem Ausmaß mit diesen Zellen, obwohl der Prozentsatz von 7A6-positiven Zellen bei verschiedenen Zellinien schwankte. Tabelle 1 Reaktivität von anti-7A6 gegenüber menschlichen hämopoetischen Zellen*
* Normale Zellen mit oder ohne Digitoninpermeabilisierung oder apoptotische Zellen, die durch γ-Bestrahlung bei 3000 Rads mit anti-7A6 markiert wurden, wie es bei der Entwicklung monoklonaler Antikörper beschrieben wurde. Die Reaktivität von anti -7A6 wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt.
Die Ergebnisse sind wie folgt angegeben:
- = < 5% positive Zellen über der Hintergrundkontrolle,
+ = 10-50% und
++ = > 50%,
** nt = nicht getestet
Um weiterhin die Spezifizität von anti-7A6 zu testen, wurde unter Verwendung von Zellysaten als Target-Antigene ein ELISA-Test durchgeführt (Fig. 3). Es wurde gefunden, dass anti -7A6 mit Lysaten, die aus bestrahlten oder mit ARA-C behandelten Jurkat Zellen hergestellt wurden, reagierten, jedoch nicht mit Lysaten aus normalen Jurkat-Zellen. Für die Zellysate von apoptotischen Jurkat-Zellen war der ELISA-Absorptionswert für anti -7A6 wenigstens 4 · größer als derjenige von isotypentsprechenden negativen Kontrollantikörpern, wobei jedoch der Absorptionswert für anti-7A6 auf normalen Zellysaten fast so niedrig war wie derjenige des negativen Kontrollantikörpers. Es wurde kein signifikanter Unterschied in Bezug auf den ELISA-Absorptionswert für Ziegenantitubulin auf die Zellysate gefunden, die aus apoptotischen und normalen Zellen hergestellt wurden.

DNA Fragmentierungsanalyse

Es wurde beobachtet, dass die gereinigten 7A6+ Zellen, jedoch nicht die 7A6- Zellen DNA Fragmentierung aufwiesen, die charakteristisch für Zellen ist, die einer Apoptose unterliegen.
DNA Fragmentierung ist ein gemeinsames Merkmal der Apoptose und dient als molekularer Marker zum Nachweis von Zellen, die an Apoptose sterben. Um zu untersuchen, ob 7A6+ Zellen vorzugsweise einer DNA Fragmentierung unterliegen, wurde eine spezifische Zellreinigung unter Verwendung von anti -7A6 und einem Zellsortierer durchgeführt, um 7A6 positive und negative Zellen aus einer Mischung von normalen und Ara-C behandelten Jurkat-Zellen auszusortieren (Fig. 4A). Nach Färbung mit Trypanblau nach Sortierung verloren die 7A6 Zellen jedoch nicht die 7A6- Zellen die Fähigkeit, den Farbstoff auszuscheiden. DNA wurde aus beiden Zellpopulationen hergestellt und über Agarosegel- Elektrophorese analysiert. Wie in Fig. 4B gezeigt ist, wurde gefunden, dass die auf 7A6 positiven Zellen ein Leitermuster von DNA Fragmenten auf dem Agarosegel aufwiesen. Im Gegensatz dazu, wurde keine DNA Fragmentierung bei der 7A6 Zellpopulation nachgewiesen.

Molekulare Charakteristika des Antigens

Anti -7A6 weist ein 38 kD Protein in Zellysaten nach, die aus apoptotischen Jurkat-Zellen hergestellt wurden. Der Immunoblotting Assay unter Verwendung von Jurkat-Zellysaten wurde durchgeführt, um die molekularen Charakteristika des 7A6 Antigens zu bestimmen.
Die Zellysate wurden aus normalem, γ-bestrahlten oder Ara-C behandelten Jurkat-Zellen durch Solubilisierung in Triton X -100 Lysepuffer hergestellt. Die Proteine der Zellysate wurden über SDS-Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen abgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran, die mit Anti-7A6 geblottet war, transferiert. Wie in Fig. 5 gezeigt ist, wies anti-7A6 ein spezifisches Proteinband mit einem Molekulargewicht von ungefähr 38 kD bei Zellysaten auf, die aus apoptotischen Jurkat-Zellen, die durch Bestrahlung oder Ara-C Behandlung induziert wurden (Spuren 1 + 2) hergestellt wurden. Im Gegensatz dazu, wurde das 38 kD Proteinband nicht in den Lysaten aus normalen Jurkat-Zellen unter identischen experimentellen Bedingungen nachgewiesen (Spur 3). Außerdem konnte anti-7A6 das 38 kD Proteinband aus normalen Zellysaten, die in einem SDS enthaltenden Lysepuffer hergestellt wurden, nicht nachweisen.

Das durch Anti-7A6 definierte Molekül scheint auf der Membran von Mitochondrien lokalisiert zu sein

Elektronenmikroskopie unter Verwendung von Immunogoldmarkierung von mit Digitonin permeabilisierten Zellen mit anti-7A6 Zellen zeigte eine punktuelle Verteilung von Antigen auf Mitochondrien Organellen von Jurkat-Zellen, die mit Ara-C behandelt wurden. Immunreaktivität auf Gefrierschnitten zeigte, dass anti-7A6 Mitochondrien, aber keine anderen, mit Organellen assoziierten Proteine markieren kann (Fig. 6A& B). Die stärkste Markierung von anti-7A6 wurde jedoch in isolierten Mitochondrien beobachtet (Fig. 6C & D). Die Mitochondrien wurden aus normalen oder aus durch Ara-C induzierten apoptotischen Jurkat-Zellen über eine Percoll-Metrizamidgradientenzentrifugation isoliert und mit Digitonin vor der Markierung mit Immunogold permeabilisiert. Es wurde gefunden, dass anti-7A6 Antigene entlang der Mitochondrien-Membran markiert, die aus apoptotischen Jurkat-Zellen isoliert wurden (Fig. 6C). Es wurde bei einer stärkeren Vergrößerung bei der Elektronenmikrographie beobachtet, dass die Immunomarkierung von 7A6 anscheinend direkt auf der Oberfläche der inneren Mitochondrien Membran überlagert, aber nicht innerhalb der Mitochondrien Matrix (Fig. 6D). Im Gegensatz dazu zeigte Anti-7A6 keine Reaktivität mit Mitochondrien, die aus normalen Jurkat-Zellen isoliert wurden (Fig. 6D). Wenn ein isotypentprechender Kontrollantikörper unter identischen Bedingungen verwendet wurde, wurde keine Immunogoldmarkierung auf Mitochondrien, die aus apoptotischen Jurkat-Zellen isoliert wurden, beobachtet (Fig. 6F).
Anti-7A6 identifiziert ein Epitop, das auf dem Protein von Mitochondrienmembranen exponiert ist und dessen Expression anscheinend auf Zellen beschränkt ist, die einer Apoptose unterliegen. Die monoklonalen Antikörper und immunreaktive Fragmente der Erfindung können dazu verwendet werden, apoptotische Zellen von normalen Zellen zu unterscheiden, die molekularen Mechanismen der Apoptose zu studieren und Proben aus apoptosebezogenen Krankheiten zu diagnostizieren und neue Agonisten oder Antagonisten für Apoptose zu identifizieren.
Es wird auf den Artikel von Thompson verwiesen (1995, Science 267: 1456-1462), der im Detail die Rolle der Apoptose bei der Pathogenese und der Behandlung von Krankheiten beschreibt. Wie von Thompson festgestellt wurde, wird Homöostasis über ein Gleichgewicht zwischen Zellwucherung und Zelltod aufrechterhalten. Der physiologische Zelltod tritt vorzugsweise durch "Zellsuizid" oder Apoptose auf. Änderungen im Überleben von Zellen tragen zur Pathogenese einer Anzahl von menschlichen Krankheiten bei, einschließlich Krebs, viraler Infektionen, Autoimmunkrankheiten, neurodegenerative Störungen und AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom), daher können Behandlungen, die spezifisch ausgestaltet sind, um den Ablauf der Apoptose zu ändern, das Potential haben, den natürlichen Verlauf dieser damit verbundenen Krankheiten zu ändern.
Insbesondere ist bekannt, dass Krebs mit einer Inhibierung der Apoptose verbunden ist, während AIDS mit einer zunehmenden Apoptose verbunden ist. Es liegt auch innerhalb des Rahmens der Erfindung, dass der Antikörper (anti-7A6) bei Verfahren zur Bestimmung, Unterscheidung, Verfolgung oder Messung apoptotischer Zellen in diagnostischen Anwendungen für die Behandlung von sowohl Krebs als auch AIDS verwendet werden kann.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Antikörper in Assays zum Screening neuer Wirkstoffe verwendet werden, die Apoptose inhibieren oder induzieren. Beispielsweise können Wirkstoffe, die Apoptose in tumorbildenden Zellen induzieren, unter Verwendung von in vitro Assays identifiziert werden, die den Gehalt an apoptotischen Zellen in behandelten und nicht behandelten Tumorproben unter Verwendung der anti-7A6 Antikörper der Erfindung vergleichen. In ähnlicher Weise können die erfindungsgemäßen Antikörper ebenfalls dazu verwendet werden, Wirkstoffe zu identifizieren, die Apoptose von beispielsweise aktivierten, mit HIV-infizierten PBL's inhibieren.

Hinterlegung

Eine Kultur der Hybridomazellen, die den anti-7A6 monoklonalen Antikörper produzieren, wurde am 14. März 1996 bei der American Type Culture Collection (A.T.C.C.), 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA) unter der Zugangsnummer A.T.C.C. HB- 12065 hinterlegt.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an ein Antigen auf der Membran von Mitochondrien in apoptotischen Zellen bindet, wobei das Antigen ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 38 kd ist und in Zellen, die einer Apoptose unterliegen, nachweisbar und in normalen Zellen nicht nachweisbar ist.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei das Antigen durch Zelllysate, hergestellt aus apoptotischen Jurkat-Zellen, erhältlich ist.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 mit Maus Isotyp IgG1, der durch die Zelllinie, die bei der American Type Culture Collection, A.T.C.C. Zugangs-Nr. HB 12065 hinterlegt ist, hergestellt wird.

4. Hybridzelllinie, welche bei der American Type Culture Collection, A.T.C.C. Zugangs-Nr. HB 12065 hinterlegt ist.

5. Antikörperfragment, das einen funktionellen Bereich der Antigenbindungsdomäne eines in Anspruch 1 definierten Antikörpers umfaßt.

6. Antikörper nach Anspruch 1, welcher einen Immunkomplex mit demselben Epitop wie der durch das Hybridom (identifiziert durch die American Type Culture Collection A.T.C.C. Zugangs-Nr. HB 12065) hergestellte, monoklonale Antikörper bildet.

7. Verfahren zum Nachweis und zur Messung von apopototischen Zellen, umfassend:

(a) Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit einem monoklonalen Antikörper, der mit einer Detektorgruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Fluoreszenzverbindung, einem radioaktiven Element und einem Enzym, konjugiert ist, wobei der monoklonale Antikörper spezifisch an ein Antigen auf der Membran von Mitochondrien in apoptotischen Zellen bindet und das Antigen in Zellen, die einer Apoptose unterliegen, nachweisbar und in normalen Zellen nicht nachweisbar ist und wobei das Antigen ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 38 kd ist;

(b) Nachweisen und Messen des gebildeten, immunologischen Komplexes, wenn vorhanden, durch Verwendung von Nachweis- und Messungsmitteln, die für die ausgewählte Detektorgruppe geeignet sind; und

(c) Bestimmen der Anzahl von Zellen, die einer Apoptose unterliegen, in der biologischen Probe als das Ergebnis des Nachweises und der Messung des Komplexes von Schritt (b).

8. Verfahren nach Anspruch 6, welches den Schritt der durchflußzytometrischen Zellsortierung von apoptotischen Zellen, die an den konjugierten monoklonalen Antikörper gebunden sind, einschließt.

9. Verfahren zur Unterscheidung zwischen normalen und apoptotischen Zellen in einer Probe von menschlichen hämapoetischen Zellpopulationen, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einem monoklonalen Antikörper für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, immunologische Komplexe zwischen dem Antikörper und den apoptotischen Zellen zu bilden, und dann das Nachweisen der immunologischen Komplexe, die aus dem Kontakt zwischen dem monoklonalen Antikörper und den Zellen in der Probe resultieren, wobei der monoklonale Antikörper spezifisch an ein Antigen auf der Membran der Mitochondrien in apoptotischen Zellen bindet, wobei das Antigen in Zellen, die einer Apoptose unterliegen, nachweisbar und in normalen Zellen nicht nachweisbar ist und wobei das Antigen ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 38 kd ist.