CN1215406A - 检测程序性细胞凋亡抗原的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
一种专一性结合程序性凋亡细胞的线粒体膜上的一种抗原的单克隆抗体。该抗原是在经历程序性细胞凋亡的细胞中可检测到而在正常细胞中检测不到的38KD蛋白质。此单克隆抗体的选择性提供了一种从人造血细胞群样品中区分正常细胞和程序性凋亡细胞的方法。也提供了一种检测和测量经历程序性细胞凋亡的细胞的方法。
Description
本发明涉及单克隆抗体,更具体的,涉及一种与暴露在经历程序性细胞凋亡的细胞上的线粒体膜蛋白(7A6)上的新型表位结合的单克隆抗体。
调控程序性细胞凋亡的基因及其产物的确认近来刺激了对程序性细胞死亡的生物学和分子水平的认识的研究。程序性细胞凋亡代表一种在生理或病理性条件下发生的自主性细胞死亡的活性过程(Clarke等人,1990,分析胚胎学杂志(Anal.Embryol.)181:195-213;Boehmer,1992,今日免疫学(Immunology Today)13:454-458;Gougeon和Matagnier等人,1993,科学(Science)260:1269-1270;Thompson,1995,科学,267:1456-1462)。不同细胞中引发程序性细胞死亡的途径可以各不相同,但是程序性细胞凋亡的调控一般是由从程序性细胞凋亡过程中的分子级联启动的诱导和抑制信号来调节。例如,某些肿瘤坏死因子/神经生长因子受体基因家族的成员能够通过干扰这些分子来引起程序性细胞凋亡(Trauth等人,1989,科学245:301-305;Itoh等人,1991,细胞(Cell)66:23-243;Oehm等人,1992,生物化学杂志(J.Biol.Chem)267:10709-10715),这表明它们可以用来引发一个诱导死亡的信号或用来封闭细胞生存所需的信号。相反,由Bc1-2基因编码的蛋白质能通过干扰导致程序性细胞凋亡的途径来促进细胞生存,虽然Bc1-2看上去并不影响细胞循环进程(Vaux等人,1988,自然(Nature)335:440-442;Hockenbery等人,1990,自然248:334-346;Nunez等人,1990,免疫学杂志(J.Immunol.)144:3602-3610)。最近这些调控程序性细胞死亡的基因及其产物的识别大大地提高了我们对程序性细胞凋亡的分子机理的认识,并且也代表了确定参与程序性细胞凋亡的新型分子的新挑战。
程序性细胞凋亡伴随有特征性形态学改变以及核小体间(internuclosomal)DNA的降解。(Kerr等人,1972,不列颠肿瘤杂志(Br.J.Cancer)26:239-257;Wylite,1980,自然284:555-556)。最近的证据表明,在自发的或诱导的程序性细胞凋亡中形态改变和死亡本身发生之前,细胞在表型和功能性上均经历了实质性的变化。这些包括内切核酸酶的激活(Duke等人,1983,美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80:6361-6365;Barry和Eastman,1993,EMBO J.12:371-377;Zhang等人,1995,细胞免疫(CellImmunol.)165:161-167),分子标记的表达(Estus等人,1994,细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)127:1717-1727;Fernandez等人,1994,美国国家科学院院报91:8641-8645)和蛋白质表达的减少或增加(Kishimoto等人,1995,实验医学杂志(J.Exp.Med.)181:649-655;Casciola-Rosen等人,1994,实验医学杂志179:1317-1330;Ajmani等人,1995,实验医学杂志181:2049-2058)。虽然已经表明分子改变与程序性细胞凋亡紧密相关,但是对在程序性细胞凋亡的过程中它们的精确作用知道的很少。
不仅在细胞膜和核中而且在线粒体中也观察到程序性细胞凋亡中的分子改变。在程序性凋亡的细胞中的线粒体DNA不一定片段化,但它的核DNA已被内切核酸酶切割成片段(Murgia等人,1992,分子生物学杂志(J.Biol.Chem)267:10939-10941;Tepper和Studzinski,1992,癌症研究(Cancer Res.)52:3384-3390)。然而,已经在经历程序性细胞凋亡的细胞中发现线粒体的异常超结构和线粒体膜电位的降低(Vayssiere等人,1994,美国国家科学院院报91:11752-11756;Zamzami等人,1995,实验医学杂志,181:1661-11672;Steller,1995,科学267:1445-1449)。Bc1-2在线粒体膜上的位置暗示线粒体对程序性细胞凋亡有一些功能性的影响,虽然在核膜和内质网上也发现有Bc1-2基因产物(Hockenbery等人,1990,自然248:334-346;Krajewski等人,1993,癌症研究,53:4701-4714)。利用缺乏线粒体DNA的人成纤维细胞系,Jacobson等人(1993,自然,361:365-369)报道了通过生长因子的减少对程序性细胞凋亡的诱导及Bc1-2的抗程序性细胞凋亡的效果都不象是依赖于线粒体呼吸链的活性。然而,Bc1-2的过度表达可以增加线粒体膜电位且将细胞从程序性细胞凋亡中拯救出来(Hennet等人,1993,癌症研究53:1456-1460)。与这些发现相一致,Zamzami等人(1995,实验医学杂志181:1661-1672)最近显示线粒体膜电位的降低是体内淋巴细胞程序性细胞凋亡的一个早期的不可逆的事件,并且表明一些能封闭程序性细胞凋亡早期信号途径的药剂有效地稳定了线粒体膜电位的值。这些资料提示在程序性细胞凋亡中线粒体组成成分的参与。
为确认程序性凋亡细胞的分子标记,用濒死的Jurkat细胞免疫小鼠制得单克隆抗体。发现了一种命名为抗7A6的抗体特异地与经历程序性细胞凋亡的细胞反应,而不与普通细胞反应。该抗体限定的分子是一个位于线粒体膜上的38KD的蛋白质。
该单抗可用于区分普通细胞和程序性细胞凋亡的细胞,研究程序性细胞凋亡的分子机理以及来源于程序性细胞凋亡相关疾病的样本的诊断,监测治疗方案的效果和确定诱导或抑制程序性细胞凋亡的新型药剂。参见Thompson的文章(1995,科学267:1456-1462),其中详细描述了在致病机理和疾病治疗中程序性细胞凋亡的作用。
本发明描述了一些单克隆抗体或其免疫活性片段的特征,其能从人细胞群中区分普通细胞和程序性凋亡的细胞。该单克隆抗体特异性地结合到程序性凋亡的细胞中线粒体膜上的抗原上。该抗原是一种38KD的蛋白质,在经历程序性细胞凋亡的细胞中可以检测出而在普通细胞中不能检测出。
本发明的单克隆抗体优选是鼠源的,也可以是源于其他哺乳类包括但不局限于人和大鼠或其组合。在一优选的实施方案中,抗体是由用程序性细胞凋亡的Jurkat细胞免疫的Balb/c小鼠培育的杂合细胞系产生的。该杂合细胞系已在美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏,指定保藏号为A.T.C.C No.HB12065。
本发明的单克隆抗体识别一种新型抗原(7A6),且能特异性地结合到程序性细胞凋亡的细胞中的线粒体膜上的该抗原的一个表位上。这些抗体或其片段可用于从生物样本中区分普通细胞和程序性细胞凋亡的细胞的方法,例如,在人造血细胞群中,包括外周血淋巴细胞,T细胞系,B细胞系,组织细胞细胞系和前髓细胞系。此外,由于抗体的这种选择性,也提供了检测和测量经历程序性细胞凋亡的细胞的方法。
当将优选的实施方案的详细描述与说明性而非限制性的附图一起考虑时,本发明的其它目的、特征和优点是显而易见的。
图1A和1B展示由Ara-C(1-β-D-阿拉伯糖呋喃胞嘧啶)诱导的程序性凋亡的Jurkat细胞的电镜照片。Jurkat细胞在含有(图1A)或不含有10μM Ara-C(图1B)的添加10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。两种细胞用透射电镜在同样倍数下(×18,000)观察。箭头指示程序性细胞凋亡体的结构。图中短线代表1μ。
图2A和2B是抗7A6在正常的和程序性凋亡的Jurkat细胞的流式细胞分析的图示。Jurkat细胞分别用γ-辐照、Ara-C或抗CD95(Fas/Apo-1)处理诱导程序性细胞凋亡。程序性凋亡的或正常的Jurkat细胞在被用于流式细胞术的免疫标记之前分别不用(图2A)或用(图2B)毛地黄皂苷透化。每图中均显示了阳性细胞的百分数。
图3是从正常的或程序性凋亡的Jurkat细胞制得的细胞裂解液的ELISA试验的图示。从正常的或经过γ-辐照或Ara-C诱导的程序性凋亡的Jurkat细胞制备的细胞裂解液预包被在ELISA板上。ELISA板与抗7A6或一种同型匹配的对照抗体一起培养,随后与山羊抗鼠IgG-过氧化物酶偶联物培养。酶反应用邻苯二胺底物显色,492nm下用ELISA读数仪读数。
图4A和4B显示在纯化的7A6+和7A6-细胞中DNA片段化的检定。正常的和Ara-C处理过的Jurkat细胞混合后用抗7A6免疫荧光标记。7A6-阳性(pc)和阴性(nc)细胞用细胞分选仪分选(图4A)。从两种细胞群中分离DNA且用如前述的1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析(Zhang等人,1995,细胞免疫165:161-167)。泳道1,100bpDNA梯度的分子量标准;泳道2,分离自7A6-细胞的DNA;和泳道3,分离自7A6+细胞的DNA(图4B)。显示了DNA分子量标准(bp)的相对迁移。
图5是细胞裂解液用抗7A6进行的免疫杂交。从正常的、辐照过的或Ara-C处理过的Jurkat细胞中制备细胞裂解液并在还原性条件下进行含10%丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE电泳。蛋白质转移到先后与抗7A6和蛋白G-过氧化物酶孵育过的硝酸纤维素膜上。利用增强的化学发光技术观察杂交。泳道1,来源于辐照过的Jurkat细胞的细胞裂解液;泳道2,来源于Ara-C处理过的Jurkat细胞的细胞裂解液;和泳道3,来源于正常Jurkat细胞的细胞裂解液。显示了蛋白质分子量标准的相对迁移。
图6A-F是显示线粒体膜上7A6抗原的位置的电镜照片。从Ara-C处理过的(图6A)或正常Jurkat细胞(图6B)制得的细胞切片先后用抗7A6和免疫金偶联物标记,并用电镜观察。在正常Jurkat细胞中观察不到标记而在Ara-C处理过的Jurkat细胞(箭头)中发现免疫金粒的簇。在利用Percoll-metrizamine梯度离心法从正常的和Ara-C处理过的Jurkat细胞中分离的线粒体上检测抗7A6的活性(图6C-F)。在为电镜观察进行免疫金标记前用毛地黄皂苷透化线粒体。图6C显示用抗7A6染色的程序性凋亡的细胞中的线粒体(×35,000原始放大倍数)。图6D显示在较高放大倍数(×72,000)下观察的图6C的样品。观察到金粒位于线粒体(m)内膜的表面。图6E显示用抗7A6染色的源自正常细胞的线粒体;和图6F显示用同型匹配的对照抗体染色的源自程序性凋亡的细胞的线粒体。图中横线代表0.5μ。
图7A-D是源自HIV-感染的供体的外周血淋巴细胞的流式细胞分析的图示。图7A描述了利用由CD3激活的HIV-感染细胞的对照抗体的细胞计量分析。图7B描述了利用由PMA激活的HIV-感染细胞的对照抗体的细胞计量分析。图7C描述了利用由CD3激活的HIV-感染细胞的抗7A6的细胞计量分析。图7D描述了利用由PMA激活的HIV感染细胞的抗7A6的细胞计量分析。
本发明提供一种限定了暴露在程序性凋亡细胞上的独特表位的单克隆抗体,命名为抗7A6。通过流式细胞仪分析,抗7A6不能使正常的细胞、毛地黄皂苷透化的人外周血淋巴细胞和一系列受试的人细胞系染色。相反,对经历程序性细胞凋亡的细胞无论该细胞是否用毛地黄皂苷透化均可用该抗体标记。利用Triton X-100裂解缓冲液制备的细胞裂解液的ELISA和免疫杂交表明抗7A6能和程序性凋亡的Jurkat细胞反应而不能和正常细胞反应。抗7A6限定的抗原是一个38KD的位于线粒膜上的蛋白质。这些发现表明7A6是暴露在经历程序性细胞凋亡的细胞上的一种新型表位。
已发现由不断增加的一系列分子事件调控由程序性细胞凋亡引起的细胞死亡。认为由程序性细胞凋亡的诱导激活了负责将DNA降解成核小体大小的片段的内切核酸酶(Duke等人,1983,美国国家科学院院报80:6361-6365;Barry和Eastman,1993,生物化学和生物物理学文献(Arch.Biochem.Biophys.)300:440-450;Peitsch等人,1993,EMBO J.12:371-377)。最近发现了核酸酶蛋白质三联体(NP42-50),它在经历程序性细胞凋亡的Jurkat细胞中被激活,通过其分子特征和酶学要求可以与DnaseⅠ和DNaseⅡ区别开(Zhang等人,1995,细胞免疫,165:161-167)。虽然线粒体DNA的片段化非经历程序性细胞凋亡的细胞所必需,在程序性细胞凋亡中除去核被破坏外,在程序性细胞凋亡的早期阶段也发现线粒体是被破坏的细胞靶点(Murgia等人,1992,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267:10939-10941;Tepper和Studzinski,1992,癌症研究,52:3384-3390;Yoneda等人,1995,生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)209:723-729)。实际上,一些程序性细胞凋亡诱导剂已被证明能引起导致细胞死亡的线粒体完整性及其功能的丧失(Vukmanovic等人,1991,欧洲免疫杂志(Eur.J.Immunol.)21:419-424;Hennet等人,1993,生物化学杂志(Biochem.J.)289:587-592)。相反,一种通过封闭程序性细胞凋亡途径增强细胞存活的蛋白质Bc1-2的过度作用,可以增加转染子细胞线粒体膜电位值,且对抗程序性细胞凋亡造成的线粒体膜电位的丧失(Hennet等人,1993,癌症研究53:1456-1460;Smets等人,1994,血液(Blood)5:1613-1619)。7A6抗原在线粒体膜上的特异性定位和在程序性凋亡的细胞上的限制表达表明7A6抗原参与了程序性细胞凋亡的分子级联。
在程序性凋亡细胞上优先检测到7A6抗原的表达,而在正常细胞表面或在毛地黄皂苷透化的细胞上检测不到。此外,由丝裂原对Jurkat细胞的激活对于7A6抗原的表达无影响。流式细胞计量图显示在程序性细胞凋亡早期的阶段可检测出7A6抗原,进一步表明7A6抗原的表达代表了程序性细胞凋亡的早期事件而不是死亡细胞的终产物。利用单克隆抗体技术,Rotello等人(1994,发育(Development)120:1421-1431)报道了在鸡胚发育过程中由于程序性细胞凋亡而濒死的细胞表达称作apogens的特异性抗原,虽然已发现这些抗原也在坏死细胞上表达(Fernandez等人,1994,美国国家科学院院报91:8641-8645)。有趣的是,在程序性细胞凋亡过程中一些正常细胞胞内的分子也暴露在细胞表面(Casciola-Rosen等人,1994,实验医学,179:1317-1330;Koopman等人,1994,血液(Blood)184:1415-1420)。相反,由于用流式细胞仪在毛地黄皂苷透化的正常细胞或对这些细胞裂解液用免疫杂交方法均不能检测到7A6,说明7A6不是表达到程序性凋亡的细胞表面上的常规胞内蛋白质。
用于生产本发明的单克隆抗体和限定的抗原的方法及材料如下面所述。概括地讲,通过用程序性凋亡的Jurkat细胞免疫小鼠产生了一系列针对濒死细胞的单克隆抗体。发现这些抗体之一抗7A6可与程序性凋亡的细胞反应。如流式细胞术和ELISA所测得,在正常的或毛地黄皂苷透化的人外周血淋巴细胞中以及所有受试的淋巴细胞系中均未观察到抗7A6的反应。然而,当通过辐照或用程序性细胞凋亡诱导剂处理诱导这些细胞经历程序性细胞凋亡后,该抗体可与这些细胞强烈反应。细胞分选和DNA片段化实验表明7A6+细胞而非7A6-细胞具有明显的经历程序性细胞凋亡的细胞的DNA片段特征。在还原条件下利用免疫杂交技术从程序性细胞凋亡的细胞制备的细胞裂解液中用抗7A6检测出一条38KD的蛋白带。免疫电子显微镜显示7A6抗原位于程序性细胞凋亡的Jurkat细胞的线粒体膜上。这些结果表明抗7A6限定了暴露在经历程序性细胞凋亡的细胞中的线粒体膜蛋白上的一种新型表位,表明7A6分子可能参与了程序性细胞凋亡细胞死亡的分子级联。
可以用此处所述方法或用本领域技术人员周知的方法产生如下面列出的实施例中所述的带有抗7A6的抗体特征的其他的单克隆抗体。此处也描述了检定带有期望特征的抗体的筛选方法。此外,在本发明范围之内的抗体及其有免疫活性的片段的检定可以用本领域技术人员已知的标准竞争性结合鉴定方法利用ATCC保藏号为HB12065的杂合细胞系提供的抗7A6抗体来完成。
本发明范围之中也包括至少含有抗7A6抗体分子的抗原结合区域的功能部分的抗体片段或衍生物。
含有该分子结合区域的抗体片段可用已知技术来产生。例如,这样的片段包括但不局限于:抗体分子经胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段;通过F(ab')2片段二硫桥的还原产生的Fab'片段;用木瓜蛋白酶(papaim)和一种还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。见例如:国立卫生研究院(National Institutes of Health),免疫学现代方法,Coligan等人编,2.8,2.10(Wiley Interscience,1991)。抗体片段也包括Fv片段,即:没有恒定区域氨基酸残基的抗体产物。这样的片段可以用例如美国专利4,642,334中所述的方法生产。单克隆抗体显影抗体和其它试剂
从鼠骨髓瘤P3-X63-Ag.8.653(Kearney等人,1979,免疫学杂志123:1548-1550)与源自用完全程序性凋亡细胞Jurkat细胞免疫的鼠的脾细胞融合产生的杂交瘤中筛选并克隆单克隆抗体抗7A6。用已由1-β-D-阿拉伯糖呋喃胞嘧啶(Ara-C)(一种抗代谢剂)诱导经历程序性细胞凋亡的Jurkat细胞皮下或腹膜内免疫雌性Balb/c小鼠,间隔3-4周。细胞融合前三天,用细胞抗原(程序性细胞凋亡的Jurkat细胞)腹膜内注射对鼠加强免疫。按已知方法(Kohler和Milstein,1975,自然256:495-497)利用聚乙二醇将源自免疫过的鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。用经历程序性细胞凋亡的细胞筛选抗7A6。用商业性抗体同型试剂(Amersham Life Science,Arlington Heights,IL)显示抗7A6为IgG1亚族。在小鼠中产生抗7A6的腹水且用蛋白A亲和层析柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)从腹水液中纯化抗体。
抗7C11(IgM)是一种与CD95(Fas/Apo-1)抗原反应的鼠单克隆抗体(Robertson等人,1995,Leuk.Lymphoma 17:51-58)且由Robertson博士提供。用于流式细胞术的亲和纯化的山羊抗鼠IgG-FITC偶联物和用于电镜的山羊抗鼠IgG-金偶联物分别获自Jackson免疫研究实验室(West Grove,PA)和Amersham Life Science(Arlington Heights,IL)。单克隆鼠抗α微管蛋白(IgG1)、Ara-C和所有其他化学试剂除非指明均获自Sigma免疫化学(St.Louis MO)。细胞培养和程序性细胞凋亡的诱导
人T细胞系(Jurkat,CEM,Molt-4和HT-102),B细胞系(Raji,Daudi和Ramos),组织细胞细胞系(U-937)和前髓细胞系(HL-60)用于此研究。所有细胞系均在补加10%胎牛血清,0.45mM丙酮酸和2mM L-谷氨酸的RPMI 1640基本培养基中培养。用Ficoll-Hypaque(Pharmacia,Piscataway,NJ)的密度梯度离心从健康供体或HIV感染的供体中分离人外周血淋巴细胞。
为了在细胞培养中诱导程序性细胞凋亡,用如前所述的Ara-C或抗CD95(Fas/Apo-1)处理Jurkat细胞(Zhang等人,1995,细胞免疫165:161-167)。可以用γ-辐照后37℃培养过夜的方式在人外周血淋巴细胞,Jurkat细胞和所有其它细胞系中诱导程序性细胞凋亡。用Gamma Cell-1000以137Cs源在细胞中按1000-3000 Rads的剂量辐射(加拿大原子能有限公司,ON,加拿大)。通过DNA片段化和细胞形态的分析确认由辐照或程序性细胞凋亡诱导剂引起的程序性细胞凋亡的细胞死亡。用毛地黄皂苷透化细胞以及用于流式细胞术的免疫荧光染色
用略加修改的已述方法(Fiskum等人,1980,美国国家科学院院报77:3430-3434;Anderson等,1989,免疫学杂志,143:1899-1904)透化人外周血淋巴细胞或细胞系。简要地,在1%福尔马林的PBS中于冰上固定细胞20分钟,用PBS洗涤两次。然后用毛地黄皂苷在冰上孵育5分钟透化细胞(Aldrich,Milwaukee,WI)。通过溶于二甲亚砜制成10mg/ml毛地黄皂苷贮存液且用PBS从贮存液稀释到终浓度为10μg/ml用于细胞透化。用锥虫蓝的吸收证实毛地黄皂苷对细胞的透化。透化后,洗涤细胞并重悬于PBS中用于免疫荧光染色。
通过一种间接免疫荧光检定方法以流式细胞术所用抗体标记用或未用毛地黄皂苷透化的细胞。与100μl单克隆抗体上清液或稀释的腹水在冰上培养40分钟后,用含有0.1%牛血清白蛋白和0.01%NaN3的PBS洗涤细胞(约1×106细胞/样品)3次。在与亲和纯化的山羊抗鼠IgG-FITC偶联物(1∶500)进一步培养40分钟之后,用上述缓冲液洗涤3次,且在1%福尔马林PBS中固定用于流式细胞术分析。
为进行用于细胞分选的免疫荧光标记,2×107个正常Jurkat细胞和4×107个Ara-C处理过的Jurkat细胞的混合物先后用抗7A6和山羊抗鼠IgG-FITC偶联物染色。培养和洗涤后,在PBS中沉淀细胞并且重悬,而不是在1%福尔马林中固定。用EpicsⅤ细胞分选仪,将样品分成7A6阳性和7A6阴性细胞群。如流式细胞仪测得的分离的7A6阳性和阴性细胞的纯度大于98%且通过锥虫蓝的外排测定分选后细胞亚群的活性。洗涤并沉淀7A6阳性或阴性细胞且用于DNA片段化的鉴定。细胞裂解液的制备
从细胞培养液中收集正常的细胞或是用γ-珈照或Ara-C处理Jurkat细胞诱导的程序性细胞凋亡的细胞,通过离心用PBS洗涤2次。细胞沉淀溶于含有0.5%Triton X-100,50mM Tris-HCl,pH7.6,140mM NaCl,5mM EDTA,1mM苯甲基磺酰氟和2μg/ml抑蛋白酶肽的裂解缓冲液中。冰上培养40分钟后,4℃下以14,000转/分离心样品15分钟,收集上清液用于如下所述的ELISA和免疫杂交鉴定。用于抗体检测的ELISA
用改进的已述方法(Cobbold和Waldman,1981,免疫学方法(J.Immunol.Meth.)44:125-133)以细胞裂解液作为靶抗原进行ELISA试验。利用聚-L-赖氨酸和戊二醛通过将细胞蛋白质附着在平底的聚苯乙烯Falcon微孔板上(Becton Dickinson Labware,林肯公园,NJ)准备ELISA板。用聚-L-赖氨酸处理一小时后,立即用相当于2.5×105个细胞/孔的50μl稀释的细胞裂解液包被板。室温培养1小时后,用50μl 0.2%新配的戊二醛注满板,培养15分钟。倒空板并用PBS洗涤一次。加入含有100mM甘氨酸和0.1%牛血清白蛋白的封闭缓冲液培养30分钟。用0.2%明胶注满板4℃下培养过夜。本试验中所有溶液均用pH7.4的PBS制备。测试抗体和山羊抗鼠IgG-过氧化物酶的稀释液(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)在10%普通山羊血清的PBS中制得。
为了ELISA试验,不同稀释度的单克隆抗体(25μl/孔)加入到预包被的板上,每个抗体稀释液测定三份。用鼠抗-α-微管蛋白和一同型匹配的非活性抗体分别作为阳性和阴性对照。室温培养1小时后,用0.1%明胶溶液洗板3次,用10%普通山羊血清培养10分钟以封闭非特异性的结合。再用山羊抗鼠IgG-过氧化物酶与板培养30分钟。用0.05%Tween-20的PBS洗涤板后,将板与底物溶液(30mg邻苯二胺溶于10ml 100mM柠檬酸缓冲液,pH4.5,4μl 30%的过氧化氢)室温下培养45分钟使酶反应显色,每孔中加入50μl 2.5M硫酸终止反应。板用自动ELISA读数仪(Dynatech Laboratories,Inc.,Alexandria,VA)492nm读数。免疫杂交试验
从正常的或程序性凋亡的细胞制得的细胞裂解液在SDS-PAGE上分离后转移到硝酸纤维素膜上(Schleicher & Schuell,Keene,NH)。在3%牛血清白蛋白的PBS中培养封闭非特异性结合位点后,先后用抗7A6和蛋白G-过氧化物酶偶联物(Bio-Rad,Richmond,CA)与膜培养。用含有0.05%Tween-20和0.1%明胶的pH7.6的Tris-HCl缓冲液在每次培养后洗涤膜4次。按照制造商指示用强化化学发光法(Amershan,Arlinton Heights,IL)检测免疫杂交。线粒体的分离
正常的或用Ara-C诱导的程序性凋亡的Jurkat细胞在含有10mMHEPES,pH7.5,1.5mM MgCl2,5mM KCl和250mM蔗糖的冰冷的缓冲液中洗涤并重悬,再用B型研杆的Dounce匀浆破坏(Weaton,Millville,NJ)。含有胞质细胞器的核后(post-nuclear)上清液通过1300g离心5分钟收集。沉淀重悬在250mM蔗糖溶液且再次离心收集上清液。合并两次离心所得上清液用于线粒体的分离。
按Storrie和Madden所述(1990,醇学方法(Methods inEnzymology)卷182:203-2245)利用Percoll-metrizamide梯度从核后上清液中分离线粒体。简言之,在离心管底部加入35%metrizamide,17%metrizamide为第二层,再加入6%的Percoll形成不连续梯度。全部梯度溶液在250mM蔗糖中制备。含有胞质细胞器的核后上清液加到Percoll层顶部。4℃下以20,000转/分离心20分钟后,线粒体富集在17%和35%metrizamide层之间的交界处。所得线粒体通过离心洗涤和沉淀。用于电镜的免疫金染色
如已述方法(Griffths和Hoppeler,1986,组织化学和细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)34:1389-1398),固定并制备正常的或Ara-C处理过的Jurkat细胞以进行冰冻切片。切片用抗7A6或一种同型匹配的对照抗体标记后再用偶联在10nM金粒上的山羊抗鼠IgG标记。经过洗涤和处理,用电镜观察样品。
利用预包埋标记方法用电镜观察来源于正常的和Ara-C处理过的Jurkat细胞的细胞或分离的线粒体中的免疫金颗粒。在如前述固定和毛地黄皂苷透化后,用抗7A6或对照抗体作为一级试剂,用山羊抗鼠IgG-金偶联物作为二级试剂染色细胞或分离的线粒体。培养和洗涤后,离心沉淀样品且包埋在明胶介质中。用超薄切片机切割样品并用电镜观察。抗7A6与辐照诱导的、用Ara-C或抗CD95(Fas/Apo-1)处理的程序性凋亡的细胞以及正常细胞的反应性。
已发现抗7A6可以与用辐照诱导的及用Ara-C或抗CD95(Fas/Ap0-1)处理的程序性凋亡的细胞反应,但不能与正常细胞反应。
抗7A6是一种鼠IgG1同型的抗体,是从由用AraC处理一种肿瘤细胞系Jurkat细胞免疫的鼠的脾细胞衍生而来的杂交瘤中筛选和克隆到的。Ara-C是一种抗代谢剂,可在微摩尔浓度下有效地诱导Jurkat细胞经历程序性细胞凋亡。有Ara-C存在时进行培养,Jurkat细胞表现出DNA切割成核小体样片段的程序性细胞凋亡的特征。形态学上,这些细胞显示出表面微绒毛损失、胞质缩聚、核的破坏以及程序性细胞凋亡体(图1A)。与正常细胞相比,由Ara-C诱导程序性细胞凋亡的濒死细胞显著萎缩,体积减少了20-30%,如同样放大倍数的电镜所示(图1)。
抗7A6与Jwkat细胞的反应性最初是利用间接荧光染色通过流式细胞术测定。图2代表在未用和用毛地黄皂苷透化的正常的和程序性凋亡的Jurkat细胞上7A6抗原的流式细胞术图。如图2A所示,在正常的Jurkat细胞中未检测到抗7A6的反应性。相反,甚至在未用毛地黄皂苷透化时已发现抗7A6可以使由γ-辐照、用Ara-C或抗CD95(Fas/Apo-1)处理的经历程序性细胞凋亡的Jurkat细胞染色。然而,该抗体不能标记由包括伴刀豆球蛋白A和PMA的促细胞分裂剂激活的Jurkat细胞。为进一步证实抗7A6的反应性,正常的或程序性凋亡的Jurkat细胞用毛地黄皂苷透化后,由抗体染色,再进行免疫荧光流式细胞术(图2B)。与对正常的或程序性凋亡的Jurkat细胞均无反应性的同型匹配对照抗体相比,抗7A6以一种时间依赖性方式与Ara-C处理过的Jurkat细胞反应,对未处理过的Jurkat细胞既使已用毛地黄皂苷透化也不反应。如预期的,在毛地黄皂苷透化后,单克隆抗微管蛋白可以使正常的或程序性凋亡的Jurkat细胞染色。见图2。
也检测了抗7A6检测和定量HIV感染的外周血淋巴细胞中程序性凋亡细胞的能力。来自感染的供给者的外周血淋巴细胞(PBL)用诱导T细胞活化的CD3或PMA处理。利用对照抗体或抗7A6在激活的细胞上进行细胞计数分析。与对照相比,抗7A6能检测和定量经历程序性细胞凋亡的HIV感染的外周血淋巴细胞(PBL)。见图7A-7D。
抗7A6与人外周血淋巴细胞和细胞系的反应性归纳于下面的表1中。如流式细胞术所测,无论是否用毛地黄皂苷透化,抗7A6均不能染色正常的人外周血淋巴细胞和所有受测试的细胞系。当用γ-辐照或Ara-C处理使细胞经历程序性细胞凋亡时,尽管在不同的细胞系中7A6阳性细胞的百分数不同,抗7A6可以广泛地与这些细胞反应。
表1 抗7A6与人造血细胞的反应性*
细胞类型 | 正常细胞(未透化的) | 正常细胞(透化的) | 由γ-辐照诱导的程序性凋亡细胞 |
外周血淋巴细胞 | - | - | + |
T细胞系:Jurkat | - | - | ++ |
T细胞系:MOLT-4 | - | - | ++ |
T细胞系:CEM | - | - | nt** |
T细胞系:HUT-102 | - | - | nt |
B细胞系:DAUDI | - | - | ++ |
B细胞系:RAMOS | - | - | ++ |
B细胞系:RAJI | - | - | nt |
组织细胞细胞系:U-937 | - | - | ++ |
前髓细胞系:HL-60 | - | - | + |
*如单克隆抗体显影下所述的方法用抗7A6标记用和未用毛地黄皂苷透化的正常细胞或者由3000Radsγ-辐照诱导的程序性凋亡细胞。用流式细胞术测定抗7A6的反应性。
结果表示为:-表示背景对照以上<5%的阳性细胞
+表示10-50%;和
++表示>50%
**nt表示未检测
为进一步检测抗7A6的专一性,利用细胞裂解液作为靶抗原进行ELISA(图3)。发现抗7A6能与辐照过的或Ara-C处理过的Jurkat细胞制得的细胞裂解液反应,而不与普通Jurkat细胞的细胞裂解液反应。在源自程序性凋亡的细胞的细胞裂解液中,抗7A6的ELISA吸收值要比同型匹配的阴性对照抗体的值至少高四倍,其中在正常的细胞裂解液的吸收值几乎与阴性对照抗体的吸收值一样低。从程序性凋亡的细胞和正常的细胞制得的细胞裂解液的山羊抗微管蛋白的ELISA吸收值无显著区别。DNA片段化分析
观察到纯化的7A6+细胞而非7A6-细胞显示经历程序性细胞凋亡的细胞的DNA片段化特征。
DNA片段化是程序性细胞凋亡的共同特征,且作为检测由程序性细胞凋亡而濒死的细胞的分子标记。为检测是否7A6+细胞偏好经历DNA片段化,利用抗7A6和细胞分选仪进行特异性细胞纯化,以从正常的和Ara-C处理过的Jurkat细胞的混合物中分选7A6阳性和7A6阴性细胞(图4A)。当分选后用锥虫蓝染色后,7A6+细胞而不是7A6-细胞失去了外排该染料的能力。从两种细胞群中制得DNA并且用琼脂糖凝胶电泳分析。如图4B所示,发现7A6阳性细胞在琼脂糖凝胶上具有DNA片段的梯度模式。相反,在7A6-细胞群中未检测到DNA片段化。抗原的分子特征
从程序性凋亡的Jurkat细胞中制备的细胞裂解液中用抗7A6检测出一个38KD蛋白质。利用Jurkat细胞裂解液进行免疫杂交检测以确定7A6抗原的分子特征。通过在Triton X-100裂解缓冲液中溶解制得正常的细胞、γ辐照或Ara-C处理的Jurkat细胞的细胞裂解液。细胞裂解液在还原条件下用SDS聚丙烯酰胺凝胶分离并转移到用抗7A6杂交的硝酸纤维素膜上。如图5所示,抗7A6在由辐照或Ara-C处理诱导的程序性凋亡的Jurkat细胞制备的细胞裂解液中检测到一个分子量约为38KD的特异性蛋白质带(泳道1和2)。相反,在同样实验条件下源自正常Jurkat细胞的裂解液中未检测到38KD的蛋白质带。此外,从含有SDS的裂解缓冲液制备的细胞裂解液中抗7A6也没有检测到38KD蛋白质带。由抗7A6限定的分子似乎位于线粒体膜上
利用免疫金标记的毛地黄皂苷透化的带有抗7A6的细胞的电镜观察显示在已由Ara-C处理过的Jurkat细胞的线粒体细胞器上的抗原呈小片状分布。冰冻切片的免疫反应性显示抗7A6标记线粒体而不标记其他细胞器相关的蛋白质(图6A和B)。然而,观察到抗7A6最显著的标记是在分离的线粒体上(图6C和D)。利用Percoll-metrizamide梯度离心从正常的或Ara-C诱导的程序性凋亡的Jurkat细胞中分离线粒体,在免疫金标记之前用毛地黄皂苷透化。发现抗7A6标记从程序性凋亡的Jurkat细胞分离的线粒体膜上的抗原(图6C)。在较高的电镜放大倍数下,观察到7A6的免疫标记似乎是直接覆盖在线粒体内膜上,而不在线粒体的基质内(图6D)。相反,抗7A6和从正常Jurkat细胞分离出的线粒体无反应性(图6E)。当在同样条件下使用一种同型匹配的对照抗体时,从程序性凋亡的Jurkat细胞分离的线粒体上未观察到免疫金标记(图6F)。
抗7A6识别一种仅限于经历程序性细胞凋亡的细胞中表达的线粒体膜蛋白质上暴露的一个表位。本发明的单克隆抗体和免疫反应性片段可用于区分正常细胞和程序性凋亡的细胞,研究程序性细胞凋亡的分子机理,诊断来自程序性细胞凋亡相关疾病的样品和检定程序性细胞凋亡的新型激动剂或拮抗剂(antogonists)。
参见Thompson的文章(1995,科学,267:1456-1462),其中详细描述了在病原学和疾病治疗当中程序性细胞凋亡的作用。如Thompso所说,通过细胞增殖和细胞死亡的平衡维持体内平衡。生理性细胞死亡的发生主要通过“细胞自杀”或程序性细胞凋亡。细胞生存的更迭对于一系列人类疾病包括癌症、病毒感染、自身免疫疾病、神位变性疾病和AIDS(获得性免疫缺损综合症)的发病机制有作用,因此,为特异性改变程序性凋亡阈设计的治疗可以有改变这些相关疾病的自然过程的潜力。
具体的,已知癌症与程序性细胞凋亡的抑制相关而AIDS则与程序性细胞凋亡的增加有关。在用于癌症和AIDS的治疗的诊断应用中检测、区别、监测或定量程序性凋亡细胞的方法中使用该抗体(抗7A6)落在本发明的范围之中。
此外,本发明的抗体可用于筛选抑制或诱导程序性细胞凋亡的新型试剂的鉴定中。例如,比较利用本发明的抗7A6抗体处理过的或不处理的肿瘤样品中的程序性凋亡细胞的水平进行体外鉴定,可以识别在肿瘤发生细胞中诱导程序性细胞凋亡的试剂。类似地,本发明的抗体也可以用于识别抑制如激活的HIV-感染的外周血淋巴细胞(PBL)的程序性细胞凋亡的试剂。
保藏
产生抗7A6单克隆抗体的杂交瘤细胞培养物已于1996年3月14日保藏在美国典型培养物保藏中心(A.T.C.C.),12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,美国,保藏号为A.T.C.C.No.HB-12065。
Claims (13)
1.一种专一性结合到程序性凋亡的细胞中线粒体膜上一种抗原的单克隆抗体,该抗原:
在经历程序性细胞凋亡的细胞中可检测到且在正常细胞中检测不到;且
限定了一个含有38KD蛋白质的细胞结构。
2.权利要求1的单克隆抗体,其中所述单克隆抗体结合到7A6抗原的一个表位上。
3.权利要求1的单克隆抗体,其有与保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)No.HB12065的样品有相同特征的细胞系生产的鼠同型IgG1。
4.一种专一性结合到程序性凋亡的细胞的线粒体膜上的一个表位且可区分人细胞群中正常细胞和程序性凋亡的细胞的单克隆抗体。
5.权利要求4的单克隆抗体,其中所述的程序性凋亡细胞是人外周血淋巴细胞、T细胞系、B细胞系、组织细胞细胞系和前髓细胞系。
6.一种由杂交瘤技术产生的杂合细胞系,其产生可专一性结合到经历程序性细胞凋亡的细胞的线粒体膜上一种抗原的单克隆抗体。
7.权利要求6所述的杂合细胞系,其中所述细胞系由用程序性凋亡的Jurkat细胞免疫的鼠的脾细胞产生。
8.一种由杂交瘤技术产生的具有与保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),Rockville,Maryland,A.T.C.C.保藏号为HB12065的细胞系有相同特征的杂合细胞系。
9.一种根据权利要求1的抗体的免疫活性片段。
10.一种根据权利要求1的抗体,其与ATCC保藏号为HB12065的杂交瘤产生的单克隆抗体的相同表位形成免疫复合物。
11.一种检测和测量经历程序性细胞凋亡的细胞的方法,包含:
(a)与选自荧光化合物、放射活性元素以及酶的检测物偶联的7A6单克隆抗体同生物学样品接触;
(b)利用与所选择的检测物适宜的检测和测量方法检测和测量形成的免疫复合物;且
(c)通过步骤(b)中检测和测量复合物的结果确定在该生物学样品中经历程序性细胞凋亡的细胞的数量。
12.权利要求11的方法,其包括用流式细胞技术分选与所述偶联的单克隆抗体结合的经历程序性细胞凋亡的细胞的步骤。
13.一种区分人造血细胞群样品中正常细胞和程序性凋亡的细胞的方法,其中包括确认为7A6单克隆抗体的单克隆抗体与该样品在足以使所述抗体和程序性凋亡细胞之间形成免疫复合物的条件下接触一段时间后,检测该样品中细胞和所述单克隆抗体之间的接触形成的免疫复合物。
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