JPH05509308A - がん関連ｓｃｍ認織因子、その生成法および使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

　Ａ ５４、癌認識因子を産生ずる方法であって、（ａ）癌を患ったドナーから体液を 得る工程、（ｂ）　１０００ダルトンより大きな公称分子量をカットする限外濾 過器を通過させる限外濾過により設定したように見掛けの分子量を有する分子か らなる前記体液の第１の画分を、１０００ダルトン未満の見掛けの分子量を有す る分子からなる第２の画分から分離する工程、および（ｃ）前記第２の画分を精 製して実質的に純粋な癌認識因子を得る工程からなることを特徴とする方法。 ５５、前記体液が、末梢血、尿、プラズマ、および細胞吸引液からなる群より選 択されることを特徴とする請求の範囲第５４項記載の方法。 ５６、前記第１の画分から第２の画分の分離か、公称１０００ダルトン分子量で カットする限外濾過器を通過させる前記体液の限外濾過により行われることを特 徴とする請求の範囲第５４項記載の方法。 ５７．０から約７００ダルトンの分画範囲を有しそこから塩を分離することので きるゲル濾過カラム上に前記第２の画分を装填し、蒸留水で前記カラムから前記 装填した材料を溶出し、そして全クロマトグラフィー床容積の約０．３から約０ ．５倍の間の溶出容積で溶出した部分を集積することにより前記第２の画分を脱 塩し、それにより請求の範囲第５４項記載の第２の両分の固有活性と比較して、 前記集積し脱塩した部分の癌認識因子の固有活性を増大せしめる各工程を含むこ とを特徴とする請求の範囲第５４項記載の方法。 ５８、　（ａ）約１５００から約３０，０００ダルトンの分画範囲を有するゲル 濾過カラム上に前記集積し脱塩した部分を装填し、（ｂ）アンモニウム塩の弱水 溶液で前記カラムから工程（ａ）のカラムに装填した材料を溶出し、（Ｃ）全ク ロマトグラフィー床容積の約０．４から約０．６倍の間の溶出容積で溶出した部 分を集積し、それにより請求の範囲第５７項記載の集積し脱塩した部分の固有活 性と比較して、前記集積した溶出物の癌認識因子の固有活性を増大せしめる各工 程を含むことを特徴とする請求の範囲第５７項記載の方法。 ５９、（ａ）ジエチルアミノエチルセルロース陰イオン交換カラムに前記集柘し た溶出物を装填し、 （ｂ）アンモニウム塩の濃度を増大させながら、前記カラムより工程（ａ）のカ ラムに装填した材料を溶出し、（ｅ）アンモニウム塩の約０．２８から約０　、 ３１　Ｍで前記カラムより溶出した溶出物の部分を集積し、それにより請求の範 囲第５８項５己載の集積した溶出物の固有活性と比較して、前記集積した溶出物 の癌認識因子の固有活性を増大せしめる各工程を含むことを特徴とする請求の範 囲第５８項記載の方法。 ６０、逆相高圧クロマトグラフィーにより前記癌認識因子を請求の範囲第５９項 記載の前記集積した溶出物から精製して実質的に均一性とする工程をさらに含む ことを特徴とする請求の範囲第５９項記載の方法。 ６１、請求の範囲第５４項、第５７項、第５８項、第５９項または第６０項記載 の方法により産生された実質的に精製した癌認識因子。 ６２、癌患者を扱う方法であって、該患者の体液の少なくとも１つが癌認識因子 を含有し、該因子が配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にのものと実質的に 同等な両親媒性プロフィールを有する９のアミノ酸残基のコア配列を含む少なく とも９のアミノ酸残基のペプチドであり、（ａ）前記癌認識因子を含有する体液 を処理し、選択的にその因子を不活性にすることにより該因子の生体内効果を減 じ、 （ｂ）その体液を前記患者に戻し、それにより癌に対する患者の抵抗を高める各 工程を含むことを特徴とする方法。 ６３、前記体液が末梢血であり、該体液を処理する工程が１０００ダルトン未満 の見掛けの分子量のペプチドを除去する末梢血の透析からなり、それにより前記 癌認識因子が前記血からのペプチドの除去により選択的に不活性化されることを 特徴とする請求の範囲第６２項記載の方法。 ６４、前記体液を処理する工程が該体液中の前記癌認識因子を該癌認識因子に特 異的な抗体で中和することからなることを特徴とする請求の範囲第６２項記載の 方法。 ６５、前記体液を処理する工程が該体液中の前記癌認識因子を該癌認識因子に特 異的な抗体の１価抗原結合断片で中和することからなり、該１価の抗原結合断片 がＦａｂ断片およびＦａｂ’断片から選択されることを特徴とする請求の範囲第 ６２項記載の方法。 ６６、前記体液の処理工程が該体液中の前記癌認識因子を、そのセンス鎖が配列 Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にのものと実質的に同等な両親媒性プロフィ ールを有する９のアミノ酸残基のコア配列を含む少なくとも９のアミノ酸残基の 癌認忠因子をコード化するＤＮＡ配列のアンチセンス鎖によりそのアミノ酸配列 がコード化されたペプチドであるアンチセンスペプチドで不活性化することから なることを特徴とする請求の範囲第６２項記載の方法。 ６７、前記癌認識因子か前記アミツノ酸配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ− Ｋを有することを特徴とする請求の範囲第６８項記載の方法。 ６８、前記癌認識因チがアミノ酸配列Ｍ−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に −Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ −Ｋを何することを特徴とする請求の範囲第６６項記載の方法。 ６９、前記体液を、α−１−Ｐｌプロファーゼインヒビターと非相同性で実質的 にＳＣＭ因子により阻害される他のプロテアーゼと非相同性の天然または合成プ ロテアーゼインヒビターにより処理する工程をさらに含み、その処理に用いられ る前記プロテアーゼインヒビターはＳＣＭ因子によりα−１−ＰＩ阻害に対して 保護される癌関連プロテアーゼを阻害することができることを特徴とする請求の 範囲第６２項、第６３項、第６４項、第６５項または第６６項記載の方法。 ７０、前記患者を、腫瘍細胞による前記ＳＣＭ因子の産生を減少させる臨床的に 受容可能な代謝インヒビターで処理する工程を含むことを特徴とする請求の範囲 第６２項、第６３項、第６４項、第６５項または第６６項記載の方法。 ７１、前記代謝インヒビターがアスコルビン酸であることを特徴とする請求の範 囲第７０項記載の方法。 ７２、　（ａ）請求の範囲第３８項記載の抗体に画像化物質で標識付けし、 （ｂ）標識付けた抗体を用いて、癌細胞を前記標識付けた抗体に露出することに より癌細胞を画像化する各工程からなる癌細胞の画像化方法。 ７３、（ａ）請求の範囲第４１項記載の前記単クローン性抗体を画像化物質で標 識付けし、 （ｂ）標識付けた単クローン性抗体を用いて、癌細胞を前記標識付けた抗体に露 出することにより癌細胞を画像化する各工程からなる癌細胞の画像化方法。 ７４、抗癌物質を癌細胞に導入する方法であって、（ａ）請求の範囲第３８項記 載の抗体に前記抗癌物質で標識付けし、 （ｂ）前記標識抗体が癌患者の癌細胞に結合するように前記患者に前記標識抗体 を施し、これにより前記癌細胞に前記抗癌物質を導入する方法。 ７５、抗癌物質を癌細胞に導入する方法であって、（ａ）請求の範囲第４１項記 載の単クローン性抗体に前記抗癌物質で標識付けし、 （ｂ）前記標識抗体が癌患者の癌細胞に結合するように前記患者に前記標識単ク ローン性抗体を施し、これにより前記癌細胞に前記抗癌物質を導入する方法。 ７Ｂ、Ｆ　Ｘ、Ｋ　Ｐ　Ｆ　Ｘ１３　Ｆ　Ｘ１５　Ｍ　Ｘｌ−、−Ｘ１８　Ｘ１ ９　Ｘ２０　Ｘ２１　Ｋ−Ｘ２３　Ｐ　Ｘ２９　Ｆ　−Ｍ−Ｇ−にのナチュラル キラー抑制（ＮＫ−抑制）配列を含む少なくとも２２のアミノ酸残基の実質的に 精製したペプチドであって、ここでＸ１３、Ｘ１９、Ｘ１７、Ｘ２３およびＸ２ ５が、Ｉ、Ｌおよび■からなる群よりそれぞれ独立して選択され：Ｘ１８が、Ｄ およびＥからなる群より選択され；Ｘ、、Ｘｌ、およびＸ２ｏが、ＱおよびＮか らなる群よりそれぞれ独立して選択され；Ｘ２１が、ＳおよびＴからなる群より 選択され、前記ペプチドがＮＫ抑制活性を有することを特徴とするペプチド。 ７７、前記ＮＫ抑制配列がＦ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ　−Ｄ−Ｑ −Ｎ−Ｔ−にであることを特徴とする請求の範囲第７６項記載のペプチド。 ７８、前記ペプチドが配列Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ− Ｎ−Ｔ−Ｋを有することを特徴とする請求の範囲第７７項記載のペプチド。 ７９、細胞培養中の悪性細胞の成長を阻害することのできる抗癌剤の効果性を評 価する方法であって、前記培養がＮＫ活性を示すリンパ球と悪性細胞の両者を含 み、（ａ）前記細胞培養を、該細胞培養のリンパ球のＮＫ活性を実質的に抑制す るのに十分な量の請求の範囲第７６項記載の実質的に精製したＮＫ抑制ペプチド でインキュベーションし、 （ｂ）前記細胞培養に、前記悪性細胞の成長を阻害するのに十分な量の前記抗癌 剤を添加し、 （Ｃ）リンパ球により生じたＮＫ活性が実質的にない状態で抗癌剤により生じた 前記悪性細胞の成長の阻害を観察することにより、前記悪性細胞への前記抗癌剤 の効果を測定する各工程を含むことを特徴とする方法。 ８０、リンパ球のＮＫ活性を抑制する方法であって、該リンパ球にに５６２細胞 の生体外リーシスにより測定された前記リンパ球のＮＫ活性を実質的に抑制する のに十分な量の請求の範囲第７６項記載の実質的に精製したペプチドを施すこと からなることを特徴とする方法。 ８１．３ＣＭ因子に対する抗体、３０Ｍ因子に対する抗体の１価抗原抗体断片、 およびそのセンス鎖がＦ−Ｘ、−ＫＰ−Ｆ−Ｘ１３　Ｆ　Ｘ１５　１ＶＩ　Ｘｌ ７　Ｘ１８　Ｘｌ９　Ｘ２０　Ｘ２１　Ｋ　Ｘ２３　Ｐ　Ｘ２５　Ｆ　Ｍ　Ｇ　 ＫのＮＫ抑制配列にコード化するＤＮＡのアンチセンス鎖によりそのアミノ酸配 列がコード化されたペプチドのアンチセンスペプチドからなる群であり、ここて Ｘ１３、Ｘ１５、Ｘ１７、Ｘ２３およびＸ２５が、■、ＬおよびＶからなる群よ りそれぞれ独立して選択され：Ｘ、８か、ＤおよびＥからなる群より選択され； Ｘ９、Ｘ１９およびＸ２゜か、ＱおよびＮからなる群よりそれぞれ独立して選択 され；Ｘ２１が、ＳおよびＴからなる群より選択されるものである群より選択さ れたＳＣＭ因子阻害物質を、前記３０Ｍ因子のＮＫ抑制活動を実質的に逆転し、 前記リンパ球によるに５６２細胞の生体外リーシスにより測定される前記患者の リンパ球の正常なＮＫ活性を貯蔵するのに十分な量で、その体液の少なくとも１ つが３０Ｍ因子を含有する患者に施すことからなる生体内の３０Ｍ因子のＮＫ抑 制活動を逆転する方法。 ８２、生体内免疫抑制を誘発する方法であって、請求の範囲第１項、第１３項、 第１４項または第３１項記載の実質的に精製した癌認識因子、および請求の範囲 第７６項記載の実質的に精製したペプチドからなる群より選択された免疫抑制画 分を、単体でまたは同種移植片の生存を高めることのできる免疫抑制の度合いを 生じるのに十分な量の薬学的に容認できる担体と組み合わせて施す工程からなる ことを特徴とする方法。 ８３．５ＣＭ因子に対するＳＣＭ反応リンパ球の感作を測定する方法であって、 （ｄ）ＳＣＭ反応リンパ球を単離し、 （ｅ）該単離したＳＣＭ反応リンパ球を洗浄し、（「）該単離したＳＣＭ反応リ ンパ球を検出可能な標識で標識付けた請求の範囲第１項、第１３項、第１４項ま たは第３１項記載の実質的に精製した癌認識因子の飽和量でインキュベーション し、 （ｇ）前記リンパ球への３０Ｍ因子に特異的な受容体の存在と、３０Ｍ因子に対 する前記リンパ球の感作とを測定するために前記ＳＣＭ反応リンパ球に対する標 識付けた癌認識因子の結合程度を測定する各工程からなることを特徴とする特許 明　細　書 ヒトや動物中における多くの病気は、病気または状態と特に関連がある異物の存 在、特に血液中の異物の存在によって検定できる。 そのような病気の結果として産生されたその他前述のような異物または抗原を検 査することは、抗原またはその他異物を産生ずる特定の病気の早期発見のための 診断手段として大いに役立つ。そのような異物の検出方法は、健康管理ザービス を行う者にとって実際的な診断方法となるよう、信頼性があり、再現性があり、 感度かよくなければならない。さらに、そのような診断方法は通常の技能を有し 、１＋＋究室で訓練を行った者によってすみやかにそして安価に行い得るもので なければならない。 例えば、通常かんと呼ばれる、ヒトや動物を苦しめる種々の悪性腫瘍の治療にお いて、特に、かんの早期段階において、そのより進行した段階より、はとんどの 治療方法かより有効かつ安全であるため、早期発見は有効な治療の決め手である ことが認識されている。例えば、悪性腫瘍細胞にとって有毒な多くの化学療法薬 は正常な細胞にとっても有毒であり、より進行したがんの治療または進行阻止に 必要なより多量の投与量は不快かつ重大な副作用を生じさせる可能性がある。ま た、病気が広がるか転移する前に手術することのみがしばしば最もかつ有効な手 段である。非常に多くのケースにおいてがんは、有効な治療を行うには遅過ぎる 状態になって始めて発見される。 従って、がんを早期に診断できる信頼性あるテストが今だに望まれており、多く の研究がその目的に向って行われている。この点に関し、がんの早期診断行うた めに新しいテストおよび方法が開発されている。 そのようなテストの１つの極めて望ましい側面は、使用する物質に応じて、一般 的に全てのタイプのがんを検出するか、あるいは特定のタイプのがんを検出する かできることである。そのようなテストの前者のような使い方は、決まった手順 の健康診断においてなされるような、多くの患者の集団スクリーニングにおいて 大変重要である。そのような集団スクリーニングにおいて、特定のタイプのがん にかたよったテストは望ましくない。というのは、がんには、何千とはないにし ても事実上何百というタイプがあり、１つあるいは２〜３のタイプのがんのみに 焦点をあてたテストは多くのがんを見のがしてしまいやすい。一般に、それらの 患者は、全く症状がないか、ある特定のがんに特冑なものではない漠然とした一 般的な症状があるだけであり、従っであるタイプのがんを疑ったり、そのたイブ のがんを見つけるためのテストを受ける根拠がみつからないもので球を反応させ るのに十分である。ハツカネズミにわずかＬ５　ＸＩＯ’個のＥｈｒｌｉｃｈ　 、ａｓｃｌｔｅｓ　（腫瘍）細胞を移植した場合、８０Ｍテストにおける反応の パターンは変化し、がん特異性抗原に対する反応が誘発され、一方、植物凝集素 に対する正常な反応は事実上なくなる（Ｌ、Ｃｅｒｃｅｋ　ａｎｄ　Ｂ、Ｃｅｒ ｃｅｋ、　”Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ＳＣＭ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｏｆ　Ｌｙ ｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｅ　Ａｆｔｅｒ　ＩＩＩｐｌａｎｔａｔｉｏ ｎ　ｗｉｔｈ　Ｅｈｒｌｉｃｈ　Ａｓｃｉｔｅｓ　Ｃｅ１ｌｓ、”Ｅｕｒｏｐ、 Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　１７．１６７−１７１（１９８１））。 ８０Ｍテストはがんの早期発見を可能にする。それは、しばしば従来の方法より ずっと早くに発見でき、血液サンプルを採取する際以外は患者にとって比較的不 快なことはない。 しかしながら、この方法には欠点がある。例えば、腫瘍組識等からの粗抽出物を 調整する必要性、あるいは腫瘍組識自体をがん関連抗原のソースとして使用する 必要性がある。８０Ｍテストにおいて腫瘍組識またはその抽出物を使用すること はいくつかの問題がある。例えば、必要な量の組識を得ることが困難なことがあ る。また、全組識（ｗｈａｌｅｔｉｓｓｕｅ）または組諧の粗抽出物を使用する と、干渉物質をテスト工程に混入させてしまう可能性がある。それらの干渉物質 はテストの感度に悪影響を与えるか、テスト結果そのものに悪影響を与える。こ れらの干渉物質の有無は腫瘍組識のバッチごとに容易に変化し、８０Ｍテストに 望ましくない変動性を与える。さらに、干渉物質が全組識（ｗｈａｌｅｔｉｓｓ ｕｅ）または粗抽出物に存在するので、識別または定量するのが大変困難である 。 従って、ＳＣＭ反応リンパ球による反応を誘発する因子を識別し、分離し、そし て純化することが大変型まれている。そのような純粋化因子を用いることによっ てＳＣＭがんスクリーニングテストが促進される。というのは、干渉物質が存在 せず、がん、その原因、並びにヒトおよび動物の身体への影響の研究の助けとな るからである。 そのようなＳＣＭ活性因子の完全な化学組成および構造を決定することも大変型 まれている。それらがペプチドまたはタイバクであることが判明すれば、それら の完全なアミノ酸配列を決定することが特に望まれている。それらの完全なアミ ノ酸配列を知れば、固相ペプチド合成技術または組換ＤＮＡ技術によってそれら を生成することが可能となる。それら技術を用いることができるようになれば、 血漿またはがん組識から分離することなく多量の因子が得られる。 概　要 我々は、体液、特に血漿中のかん認識因子を発見し、それらの因子を実質的に均 質に純化した。それらの因子は、がんのドナーから得られたＳＣＭ反応リンパ球 に、８０Ｍテストにおいてがん関連抽出部および／または腫瘍組識によりＳＣＭ 反応リンパ球に生じた反応と同様の反応を生じさせる。 ここに述べるように、それら因子は、細胞質基質の構造（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｎｅｓｓ　ｏｆ　ｃｙｔｏｐｌａｓａｉｃ　ｍａｔｒｌｘ　；　Ｓ　ＣＭ）テス トに有用ながん認識因子、がん認識因子、あるいは単に８０Ｍ因子と称す。 ８０Ｍ因子の活性は、限外濾過の工程から始まる、血漿から因子を精製する多く の工程で表示できる。この工程において、１，０００ダルトン未満の見掛分子量 の分子がより大きい分子量の分子から１，０００ダルトンの公称分子量でカット する濾過器を用いた限外−過によって分離される。８０Ｍ因子は、他のほとんど のペプチドおよび全てのタンパクとは対照的に、濾過器を通過する画分中に見つ かる。この因子は、前記フィルターを通過する低分子量ペプチドから実質的に成 り、標準的ＳＣＭテストにおいてリンパ球を攻撃するのに用いられるがんにかか ったドナーから分離されたＳＣＭ反応リンパ球の細胞間蛍光偏光値を少なくとも １０％低下させる。 以下に説明するように、８０Ｍ因子のさらなる純化は、２９−３５のアミノ酸残 基のほぼ均質なペプチドを生じさせる。 異なったがんのタイプの患者から得られた血漿サンプルより分離された８０Ｍ因 子は十分に相同なので、合成８０Ｍ因子と称される合成２９−アミノ酸ペプチド が生成された。 このペプチドは８０Ｍテストにおいて十分に活性があり、以下に示すようにこの ペプチド中のある断片もまた、８０Ｍテストにおいて活性があった。 １、ペプチド含有ＳＣＭ因子活性 合成８０Ｍ因子の断片に関する研究かられかるように、配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ　− Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にと略等価の両親媒性特性を有する９アミノ酸残基のコア配列 （ｃｏｒｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を含む少なくとも９アミノ酸残基のペプチドは 、８０Ｍ因子活性を有すると共にがんのドナーから得られるＳＣＭ反応リンパ球 の細胞間蛍光偏光値を少なくとも１０％低下させることが予想される。 ９アミノ酸残基のコア配列はＦ　Ｘ１５　Ｍ−Ｘｌ７　Ｘ＋５Ｘ１９　Ｘ２０　 Ｘ２＋−にとすることができる。この配列において、Ｘｌ、およびＸ１７はそれ ぞれ独立に、Ｉ、ＬおよびＶから成る群より選択され、Ｘ１８はＤおよびＥから 成る群より選択され、Ｘｌ、およびＸ２０はそれぞれ独立に、ＱおよびＮから成 る群より選択され、そしてＸ２１はＳおよびＴから成る群より選択される。これ らの成分は、アミノ酸の特性が類似しているので、他のアミノ酸に代えである群 のアミノ酸の１つを用いても、ペプチドの活性の構造に実質的な変化が起こらな いような保存的アミノ酸置換の例である。 特に、コア配列はＦ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にとすることができる。 異なったタイプのがんの患者の血漿から得られた純化ＳＣＭ因子のアミノ酸配列 の決定により、そのような因子は、Ｆ　Ｌ　Ｍ　Ｉ　Ｘ＋ａ　Ｑ　Ｎ　Ｔ　Ｋ　 （ここでＸ１８はＤまたはＥ）のアミノ酸残基１４−２２におけるコア配列を含 む２９−３５のアミノ酸残基のペプチドから実質的になることが結論づけられた 。 この一般的配列パターンに合致し、８６Ｍ因子活性を有するペプチドの例は以下 の通りである。 （１）　ＸＩ　Ｉ　Ｐ　Ｐ　ＸＳ　Ｖ　Ｋ　Ｆ　Ｎ　Ｋ　Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ− Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｘｌ、−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−に、　ここで：Ｘ ｌはＶ、　Ｍ、またはＳ　；　Ｘ　ｓはＥまたはＤ：モしてＸ２ＢはＴまたはＶ ：この配列パターンのペプチドの具体例はＶ−Ｉ　−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ− Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ− Ｍ−Ｇ−におよびＭ−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ− Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−に−。 （２）Ｍ−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１ −Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｃ； （３）Ｘｉ　−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ −１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｃ−Ｃ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−に、ここで：ＸｌはＭま たはＶ、特にＭ。 （４）Ｘ、−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ− Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｒ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−に、ここで：Ｘ、はＲまた はＳ、特にＳ　；　（５）Ｖ−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ− Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｃ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋ　。 （６）Ｖ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−Ｃ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１ −Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋ　。 （７）Ｘ、−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ− １−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−ＣまたはＸ、−Ｉ−Ｐ−Ｐ −Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に −Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｃ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｃ−Ｔ−Ｅ、　ここでＸｌはＲま たはＳ：この配列は、典型的には２９のアミノ酸を有し、ＸＩは特にＲ：（８） Ｘ、−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｅ −Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−３−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−に＊；／：はＸ、−１−Ｐ−Ｐ− Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ　−Ｅ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に −５−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−に−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｐ−Ｔ−Ｑ、　ここでＸｌはＶま たはＳ；この配列は、典型的には２９のアミノ酸を有し、Ｘｌは特にＶ：（９） ＸＩ　−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ　 −Ｅ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−９−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−に−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｐ−Ｔ−Ｑ 、ここでＸ工はＳまたはＶ、特にＳｏ これらの配列はかなり相同である。従って、２９のアミノ酸のコンセンサス配列 が合成された。このコンセンサス配列は、がん患者、特に結腸がんと肺がんの患 者の血漿から精製されたＳＣＭ因子の標本の配列分析から決定された配列の１つ と同じである。上述したように、この配列においであるアミノ酸を他のアミノ酸 と置換してもＳＣＭ因子の活性は実質的に変らないものであり、保存的アミノ酸 置換によりコンセンサス配列から誘導される以下の配列も８６Ｍ因子活性を有す るものである。 Ｍ−Ｘｌ−Ｐ−Ｐ−Ｘ、−Ｘ６−に−Ｆ−Ｘ、−に−ＰＦ　Ｘ１３　Ｆ　Ｘ＋２ Ｍ　Ｘ１７　Ｘ１８　Ｘ１９　Ｘ２０　Ｘ２１　Ｋ　Ｘ２３　Ｐ　Ｘ２５　Ｆ　 Ｍ　Ｇ−に、ここで、Ｘｌ。 Ｘｂ　、　Ｘ１３．　Ｘ１５．　ＸＩ７．　Ｘ２３およびＸｌ、は、それぞれ独 立に、Ｉ、ＬおよびＶから成る群より選択され：Ｘ５およびＸ１８はそれぞれ独 立にＤおよびＥから成る群より選択され；　Ｘ９　、Ｘ　１ｅおよびＸ２０は、 それぞれ独立に、ＱおよびＮから成る群より選択され：そしてＸ２１はＳおよび Ｔから成る群より選択される。 さらに、コンセンサス配列の特定断片、または保存的アミノ酸置換によりコンセ ンサス配列から誘導されたペプチドの特定断片は、８６Ｍ因子活性を有すること か知られているか（コンセンサス配列自体の断片の場合）あるいは期待されてい る（保存的アミノ酸置換によりコンセンサス配列から誘導されたペプチドの断片 の場合）、コンセンサス配列の断片を表わす配列は、それぞれ次の通りである二 Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ　−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ　（アミノ酸残基１４−２２）　；Ｆ− Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ− Ｍ−Ｇ−Ｋ　（アミノ酸残基８−２９）：およびＭ−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に− Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ　（アミノ酸残 基１−２２）。 これらのペプチドの最短、Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にはコア配列その ものを表わしている。 保存的アミノ酸置換によってこれらペプチドから誘導された以下のペプチドもま た、８６Ｍ因子活性を有

【、ていると考えられる。 （Ｌ）　Ｆ　ＸＩ５　Ｍ　ＸＩ７　Ｘ１８　ＸＩ９　Ｘ２０　Ｘ２１　Ｋｏここ でＸ１５およびＸ１７は、それぞれ独立に、Ｉ、ＬおよびＶから成る群より選択 され；Ｘ１８はＤおよびＥから成る群より選択され：Ｘ１．およびＸ２０は、そ れぞれ独立に、ＱおよびＮから成る群より選択され；そしてＸ２□はＳおよびＴ から成る群より選択される。 （２）　Ｆ　Ｘ９−Ｋ　Ｐ　Ｆ　Ｘｌ３Ｆ　Ｘ１５　Ｍ　ＸＩ□−Ｘｌｓ　ＸＩ ｅ　Ｘ２０　Ｘ２＋　ＫＯここでＸ、、、Ｘ、、およびＸ１７は、それぞれ独立 に、■。 Ｌおよび■から成る群より選択され；Ｘ１８はＤおよびＥから成る群より選択さ れ；Ｘ９．Ｘ１９およびＸ２ｏは、それぞれ独立に、ＱおよびＮから成る群より 選択され；そしてＸ２＋はＳおよびＴから成る群より選択される。 （３）Ｆ−Ｘ、　−に−Ｐ−Ｆ−Ｘ１３−Ｆ−Ｘ、５−Ｍ−ＸＩ□−ＸＩ８　Ｘ Ｉ９　Ｘ２゜−Ｘ２１　Ｋ−Ｘ２３　Ｐ　Ｘ２５−　Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋ。 ここでｘ、、ｘ、、、Ｘ、、、ｘ２．およびＸ２５は、それぞれ独立に、Ｉ、Ｌ およびＶから成る群より選択され；Ｘ１８はＤおよびＥから成る群より選択され ；Ｘ９．Ｘ１９およびＸ２゜は、それぞれ独立に、ＱおよびＮから成る群より選 択され：そしてＸ２１はＳおよびＴから成る群より選択される。 （４）Ｆ−Ｘ２−Ｐ−Ｐ−Ｘ、−Ｘ６−に−Ｆ−Ｘ、−に−Ｐ　Ｆ　Ｘ１３　Ｆ −Ｘｒｓ　Ｍ−Ｘｒ□−Ｘｒｓ　Ｘｒｅ　Ｘ２゜−Ｘ２．−に０ ここで、Ｘ２　、　Ｘｂ　、　Ｘｒｓ、　Ｘ１５およびＸ１□は、それぞれ独立 に、Ｉ、ＬおよびＶから成る群より選択され；Ｘ９＋Ｘ１９およびＸ２ｏは、そ れぞれ独立に、ＱおよびＮから成る群より選択され：そしてＸ２１はＳおよびＴ から成る群より選択される。 ２、ペプチド含有ＳＣＭ因子活性の純化り、０００ダルトンより大きい見掛分子 量の分子からなる体液の第１画分を１．０００ダルトン未満の見掛分子量の分子 からなる第２画分から分離するため、がんのドナーからの体液を限外枦遇するこ とによって、３６Ｍ因子を純化できる。 体液は、末梢血、尿および血漿から成る群より選択される。 好ましくは、限外−過後、因子は、各工程がより高純度の因子を作り出すような いくつかの工程からなるさらなる純化プロセスに供される。 この純化プロセスの第１工程は、０から約７００ダルトンの分別範囲を有しかつ 限外−過物から塩を分離できるゲル濾過フィルターからの溶出を含む。全クロマ トグラフ床容積の約０．３倍から約０．５倍で因子が溶出する。 第２工程は、約１，５００ダルトンから約３０，０００ダルトンの分割範囲を有 するゲル濾過フィルターからの溶出を含む。 因子は、全クロマトグラフ床面積の約０．４倍から約０．６倍でカラムから溶出 する。 この純化プロセスの次の工程は、約０．２８Ｍから約０．３１Ｍの重炭酸アンモ ニウムを用いてジエチルアミノエチルセルロースのアニオン交換カラムからの溶 出を含む。 最終工程は逆相高圧液体クロマトグラフィ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ　ｌｉ ｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｅｒ　１ｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｖａｔｏｇｒａｐｈｙ）によ って因子を略均質に純化することからなる。 ＳＣＭテストにおいて、より高純度の因子試料を用いることが好ましいが、最初 の限外濾過を含む、純化のあらゆる工程からの因子を該テストで使用することが できる。 ３．８ＣＭ因子のＤＮＡ配列コード化 前述したような３６Ｍ因子をコード化したＤＮＡ配列は、診断目的および組換Ｄ ＮＡ法による多量の３６Ｍ因子の生成に有用である。 一般に、所望のＤＮＡ配列は、通常、３６Ｍ因子を伴うＤＮＡコード化タンパク からの分離において３６Ｍ因子をコード化する。特に重要なものは、Ｆ−Ｌ−Ｍ −１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にのコア配列およびＭ−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ− Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ− Ｍ−Ｇ−にのコンセンサス配列をコード化するＤＮＡ配列である。 ＤＮＡ配列は、適合性宿主細胞でＳＬＭ因子をコード化する。ＤＮＡを表現する のに有効な制御配列に作用的に結合できる。制御配列を含むこのＤＮＡ配列は、 ＤＮＡがその中で表現され得る宿主細胞の少なくともいくつかをトランスフェク ト（ｔｒａｎｓｒｅｃｔ）であるベクターに含ませ得る。 このベクターをトランスフェクトした宿主細胞もまた、本発明の範囲内である。 ４．３ＣＭ因子に特異的な抗体およびその用途実質的に純粋化された３６Ｍ因子 に特異的な抗体は、ペプチドに対する抗体の標準的な方法によって産生でき、こ れは本発明の範囲に入る。特に重要なものは、コア配列およびコンセンサス配列 に特異的な抗体である。抗体は公知の方法により産生されたモノクローナル抗体 とすることができる。 これらの抗体は体液中の３６Ｍ因子のレベルを測定する方法に使用できる。 その方法は以下の各工程からなる （＋、）体液と抗体を混合し、 （２）イムノアッセイを行うことにより、体液中の３６Ｍ因子と抗体との間の反 応の程度を測定する。 ここで、イムノアッセイは、ラジオノムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、ケミ ルミネッセンスイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイまたは抗原−抗体複合 体の凝集に依存するイムノアッセイとすることができる。 がん検出のためのＳＣＭテストの代替として、ＳＣＭ反応反応９琢３ 並びに３６Ｍ因子に対するリンパ球の感作を測定するのに標識化ＳＣＭ因子が使 用できる。 受容体の存在を測定する方法は次の各工程から成る＝（１）ＳＣＭ反応リンパ球 を分離し、 （２）分離したＳＣＭ反応リンパ球を洗浄し、（３）検出可能な標識で標識化さ れたナチュラルまたは合成ＳＣＭ因子の飽和量を用いて、分離されたＳＣＭ反応 リンパ球をインキュベートし、 （４）ＳＣＭ反応反応９琢３ 受容体の存在並びに３６Ｍ因子に対するリンパ球の感作を測定するために、ＳＣ Ｍ反応リンパ球に対する標準化ＳＣＭ因子の結合程度を測定する。 本発明による３０Ｍ因子は、ＳＣＭテストでがんを検出するのに使用できる。が ん患者の体液から純化された３０Ｍ因子を用いる際、より高度に純化された因子 の試料を用いるのが好ましく、特に、高圧液体クロクトグラフィによって略均質 にまで純化された因子の試料を用いるのが好ましい。しかｌ、なから、最初の限 外濾過を含む、純化のあらゆるステージからの因子がＳＣＭテストに使用できる 。 ３０Ｍ因子は、３０Ｍ因子がそこから分離されるところのドナーに存在するがん のタイプに関係なく、種々の異なったタイプの悪性腫瘍を有するドナー由来の“ ＳＣＭ反応リンパ球”として知られるリンパ球の限定画分における５（ｌｉテス トては陽性反応（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を示す。また、３０Ｍ 因子は、悪性腫瘍のないドナー由来のリンパ球におけるＳＣＭテストては陰性反 応（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　）を示す。この特性により、ＳＬＭ 因子は、悪性腫瘍の有無に関して血液サンプルまたは他の体液サンプルの一般的 スクリーニングに有用である。 最も基本的には、補乳動物ドナーにおける悪性腫瘍の有無に関して該ドナーから のリンパ球をテストする方法は、次の各工程から成る： （１）前記リンパ球の懸濁液を前述したような実質的に純化されたかん認識因子 （ＳＬＭ因子）に接触させ、（２）前記リンパ球の懸濁液を接触させる工程によ り生じた該リンパ球の細胞質基質の明確な構造性（ｓｔｒｕｃｔｕｒｃｄｎｅｓ Ｓ）の減少を測定する。 前記明確な構造性の減少を定量化するための好ましい方法は次の各工程から成る ： （１）がん認識因子と接触されたリンパ球のアリコートに関して、蛍光偏光Ｐ、 を測定し、 （２）がん認識因子と接触されていないリンパ球の対照アリコートに関し、蛍光 偏光ＰＣをａｌ定し、（３）Ｐｃに対するＰＳの比を決定する。この比が約０． ９未満であると、３０Ｍ因子に対する陽性反応があると認められ、そのリンパ球 のドナーに悪性腫瘍があることが示される。 より好ましい方法は、ミトゲン、典型的には植物凝集素に接触されたリンパ球の アリコートの蛍光偏光ＰＭとＰ５を比較して、ＳＣＭ反応比ＰＲ５ＣＭを決定す ることがら成る。ここでＰＲｓｃＭ−Ｐｓ　／ＰＭである。 このＰＲ５ＣＭが約０．９未満であると、そのリンパ球のドナーに悪性腫瘍があ ることを示している。 あるいは、ＳＣＭテストにおいて３０Ｍ因子を使用する方法は次の各工程から構 成することもできる：（１）血液サンプルから潜在的ＳＣＭ反応リンパ球を分離 し、（２）分離したリンパ球をがん認息因子（ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｃｏｇｎｉＨ 。 ｎ　ｆａｃｔｏｒ）と接触させてリンパ球を刺激し、（３）細胞間的にフルオロ ジェニックエージェント（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ）に加水分解可 能なノンフルオロジェニック化合物であるフルオロジェニックエージェント先駆 体と前記刺激したリンパ球を接触させて、細胞間酵素的加水分解のため前記リン パ球をフルオロジェニックエージェントに浸透させ、それによって刺激されたフ ルオロジェニックエージェント含有リンパ球を生成し、（４）その刺激されたフ ルオロジエニックエーンエント含有リンパ球を偏光光で励起して蛍光を生しさせ 、（５）蛍光リンパ球から発せられる垂直および水平に偏光された蛍光を測定し て蛍光リンパ球の偏光値を測定し、（６）刺激された蛍光含有リンパ球の測定し た偏光値を、同じドナー由来のリンパ球の対照アリコートの偏光値と比較して、 そのリンパ球のドナーの身体にがんがあるかどうかを調べる。工程（３）および （４）は同時に行いうる。 リンパ球は垂直に偏光された光によって励起することかできる。垂直に偏光され た光を用いた場合の偏光値は、以下の関係式により、蛍光分光測光器を用いて測 定される。 ここてＩｖおよびＩＨは、それぞれ垂直平面および水平平面における偏光蛍光の 強度、そしてＧは分光測光器の光学系を通る偏光光の水平および垂直成分の不等 透過（ｕｎｅｑｕａｔ　ｔｒａｎｓａ＋１ｓｓｉｏｎ）を補正する補正ファクタ ーである。 本発明はがんの診断技術を提供するのみならず、がんの治療のための方法をも提 供する。それらの方法は以下に示す所見に基づいている。それら所見によれば、 ３０Ｍ因子はかん細胞によって産生され、３０Ｍ因子はいくつかの影響をおよほ す：すなわち、ＤＮＡ合成の促進、がん関連プロテアーゼのナチュラルインヒビ ターα−１−ＰＩによる阻害に対する保護、および悪性腫瘍細胞に対するモラー リンパ球のナチュラル細胞障害性の抑止である。モラーリンパ球のナチュラル細 胞障害性のそのような低下は、免疫防御機構の種々の段階におけるＳＣＭ因子活 性の結果である。 そのようなＳＣＭ因子活性は、エフェクターモラーリンパ球の目標がん細胞との 複合体を形成する能力の抑止、またはリンパ球における信号変換ミトゲン受容体 のブロッキングを含み、よって腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））およびその他の細胞障 害性および／または細胞溶解性分子などのシトリシンの産生の減少を含む。 ＳＣＭ因子活性はまた、前記のような細胞溶解性分子との直接相互作用、および そのような分子の不活性化を含むと共に、種々の白血球かがん細胞に対して産生 ずる過酸化物およびその他の酵素含有反応性種の排除（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ） を含む。 ３０Ｍ因子はいくつかの様式でがん細胞を保護するようなので、３０Ｍ因子の生 体内活性の低減は、悪性腫瘍細胞に対するリンパ球の免疫学的監視の効率を高め る。 最も広くいって、この治療方法は、患者の少なくとも一種の体液かがん認識因子 を含んでいるがん患者を治療する方法である。この因子は、Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ −Ｑ−Ｎ−Ｔ−に配列のそれと略等価の両親媒体特性を有する９アミノ酸残基の コア配列を含む少なくとも９アミノ酸残基のペプチドである。この方法は次の各 工程からなる：（１）がん認識因子を含む体液を処理して、それを選択的に不活 性化することによって該因子の生体内効果を抑止し、（２）その体液を患者に戻 して、患者のがんに対する低効力を高める。 この体液は末梢血とすることができる。その場合、体液を処理する工程は、末梢 血を透析して１．０００ダルトン未満の見掛分子量を有するペプチドを除去する ことから構成し得る。これによって、血液から除去されることによりがん認識因 子が選択的に不活性化される。 あるいは、体液を処理する工程は、体液中のかん認識因子を、それに対して特異 的な抗体か、あるいはＦａｂ断片またはＦａｂ’断片のような抗体の一価抗原結 合断片によって中和することから構成し得る。 あるいは、体液を処理する工程は、そのセンストランド’　（ＳｅｎＳｅ　５ｔ ｒａｎｄ）がＳＣＭ因子をコード化するＤＮＡ配列のアンチセンスストランド（ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ）によってコード化されたアミノ酸配列を有 するアンチセンスペプチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ）によってが ん認識因子を不活性化することから構成Ｉ７得る。 これらの方法は、さらに、α−１−ＰＩプロテアーゼインヒビターと非相同であ り、がっＳＣＭ因子によって実質的に阻害されたその地金てのプロテアーゼイン ヒビターと非相同なナチュラルまたは合成プロテアーゼインヒビターで体液を処 理する工程から構成することもできる。処理に使用するプロテアーゼインヒビタ ーは、ＳＣＭ因子によってα−１−ＰＩ阻害に対して保護されたがん関連プロテ アーゼを阻害することができる。それらはまた、腫瘍細胞によるＳＣＭ因子の産 生を減少させる、アスコンビン酸のような臨床的に受け入れられる代謝インヒビ ター（ａｅＬａｂｏｌ　１ｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で患者を治療する工程がら構 成されてもよい。 ＳＣＭ因子はがん細胞によって産生されそしてがん細胞中に見い出されるので、 処理のもう１つの方法は、抗がん物質をがん細胞に到達させることも含む。この 方法は次の各工程から構成できる： （１）抗がん物質をＳＣＭ因子に特異的な抗体にっけ（ｔａｇ）　。 （２）この抗体が患者のかん細胞に結合できるようにこの抗体をがん患者に与え 、それによって抗がん物質をがん細胞に到達させる。抗体はモノクローナル抗体 とすることができる。 処理のもう１つの方法は、ＳＣＭ因子によって生じるＮＫ−サブレッシブ効果の 逆行（ｒｅｖｅｒｓａｌ）に焦点を当てている。以下に説明するように、このＮ Ｋ−サブレッシブ効果は、Ｓ　ＣＭ因子の特定領域（カルボキシル末端２２残基 ）に局地化し得る。従って、生体内でＳＣＭ因子のＮＫサブレッンブ活性を逆行 させる（　ｒｅｖｅｒｓｅ）させる方法は、少なくとも１種の体液がＳＣＭ因子 を含んでいる患者に５０Ｍ因子阻害物質を、ＳＣＭ因子のＮＫサブレッシブ活性 を実質的に逆行させそしてリンパ球によるに５６２細胞の生体外リーシス（Ｉｙ ｓｉｓ）によって測定した患者のリンパ球の正常ＮＫ活性を実質的に回復させる のに十分な量与えることから構成し得る。５０Ｍ因子阻害物質は、ＳＣＭ因子に 対する抗体、ＳＣＭ因子に対する抗体の一価抗原結合断片、あるいは以下の“ナ チュラルキラー活性を抑止することにおけるＳＣＭ因子の使用“において述べる ようなＮＫサプレッシブ配列をコード化するセンスストラッドを有するＤＮＡ配 列のアンチセンスストランドによってコード化されたアミノ酸配列を有するアン チセンスペプチドとすることがＳＣＭ因子はかん細胞中に見い出させるため、Ｓ ＣＭ因子に対する抗体は、がん細胞を画像化するのに（特に診断目的ののため） 使用できる。 その方法は次の通りである： （１）抗体を画像形成物質で標識化し、（２）がん細胞を標識化した抗体にさら すことによって、該標識化抗体を用いてがん細胞を画像化する。 ９、ナチュラルキラー活性を抑止することにおけるＳＣＭ実質的に精製（純化） されたＳＣＭ因子と合成ＳＣＭ因子のどちらもリンパ球のナチュラルキラー（Ｎ Ｋ）活性を抑止する。このＮＫサブレッシブ活性はＦ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ −Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−にのアミノ酸配 列を有する合成ＳＣＭ因子のアミノ酸残基８−２９に局地化されることがゎがっ た。従って、上述した保存的アミノ酸置換に従って、実質的に精製されたペプチ ドがＮＫサプレッシブ活性を有することが予想される。ここで前記ペプチドとは 、Ｆ−Ｘ、−に−ＰＦ　ＸＩ３　Ｆ−Ｘ１５　Ｍ　ＸＩ７　Ｘ１８　ＸＩ９　Ｘ ２０　Ｘ２１　Ｋ−Ｘ２３　Ｐ　Ｘ２．Ｆ　Ｍ　Ｇ−にのナチュラルキラーサブ レッシブ（ＮＫサブレッシブ）配列を含む少な（とも２２のアミノ酸残基を有す るものであり、上記配列中、ｘ、３．　Ｘ１５．　ＸＩ７．　Ｘ２３およびＸ２ ５はそれぞれ独立に、Ｉ。 ＬおよびＶから成る群より選択され：Ｘ１８はＤおよびＥから成る群より選択さ れ；Ｘ９．ＸＩ９およびＸ２０は、それぞれ独立に、ＱおよびＮから成る群より 選択され；そしてＸ２□はＳおよびＴから成る群より選択される。断片Ｆｌ（残 基１−２２）　、Ｆ　３　（残基８−２２）　、Ｆ４　（、残基１４−２２　） 　、Ｆ　５（残基１−１３）　、Ｆ　７　（残基１４−２９）およびＦ８（残基 ２３−２９　）を含む、合成ＳＣＭ因子の上記以外の断片はＮＫサブレッシブ活 性を有しなかった。 ＳＣＭ因子またはＳＣＭ因子のある部分のＮＫサブレッシブ活性を働かせる能力 により、細胞培養において悪性腫瘍の細胞の成長を阻害することができる抗がん 剤の有効性を評価する方法が可能になる。この方法において、細胞培養はＮＫ活 性を示すリンパ球と悪性腫瘍細胞の両方を含む。 この方法は次の各工程から成る： （１）細胞培養を、細胞培養のリンパ球のＮＫ活性を実質的に抑止するのに十分 な量の実質的に精製されたＮＫサブレッンブベブチドと共にインキュベートし、 （２）その細胞培養に、悪性腫瘍細胞の成長を阻害するのに十分な量の抗がん剤 を加え、 （３）リンパ球により生じるＮＫ活性が本質的にない状態で抗がん剤により達成 される悪性腫瘍細胞の成長抑制をみることによって、悪性腫瘍細胞に対する抗が ん剤の効果を測定する。　゛ ＮＫサブレッシブペプチドまたはＳＣＭ因子分子全体を、免疫系の活性を調整す るために使用できる。そのような調整は、移植の拒絶を防止する際に望まれる。 実質的に精製されたＮＫサブレッシブベブチドは、Ｋ５６２細胞の生成外リーシ スによって測定したリンパ球のＮＫ活性を実質的に抑止するのに十分な量の前記 ペプチドをリンパ球に施すことによって、リンパ球のＮＫ活性を実質的に抑止す るのに使用できる。同様に、生体内イムノサブレッンヨンを誘導する方法が、イ ムノサプレッシブ画分単独または調剤上許容できるキャリアとの組合せを、同種 移植片生存を促進できる程度のイムノサプレッションを実現するのに十分な量で 与えることから構成できる。このイムノサブレッシブ画分は、実質的に精製され たナチュラルまたは合成ＳＣＭ因子またはＮＫサブレッシブペプチドとすること ができる。 本発明のこれらおよびその他の特徴、側面および効果は、以下の説明、請求の範 囲および図面を参照することによってより良好に理解されよう。 第１図は、合成ＳＣＭ因子のアミノ酸残基１４−２２を表わす、合成ＳＣＭ因子 のＳＣＭ活性Ｆ４断片の両親媒性特性を示す図 第２図は、Ｆ−Ｗ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｇ−０−Ｒの配列を有し、実験的アレルギー姓 脳炎誘発性ペプチド（ｅｘｐｅｒｉＩｌｅｎｔａｌ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｅｎｃ ｅｐｈａｌｉｔｏｇｅｎｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　：　Ｅ　Ａ　Ｅペプチド）のい くつかの試料中の不純物として生じることがわかっているＳＣＭ活性オクタペプ チドの両親媒性特性を示す図、第３図は、ＳＣＭ因子のＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイ の１つの形態を示す図、 第４図は、ＥＬＩＳＡアッセイの１つの形態における４０５ｎＩＩでの吸光度で 測定した、未複合ＳＣＭ因子（ｕｎｃｏｎｊ　ｉｇａｔｅｄ　ＳＣＭ　ｆａｃｔ ｏｒ）に対する抗血清の反応性を抗血清の稀釈の関数として測定した実験から得 られた結果を示す図、そして である１２のペプチドを実質的に均質なものに純化することに関する。これらの ペプチドは、長さが２９−３５のアミノ酸からなり、８０Ｍテストで交さ反応し 、アミノ酸配列において顕著な相同性を示す。この相同性は大変顕著であって、 １２の精製ペプチドのコンセンサス配列を示す２９アミノ酸ペプチドが合成され ている。合成５０Ｍ因子と称されるこのペプチドはＭ−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に −Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ　−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ− Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−にのアミノ酸配列を有する。この合成ペプチドは、８０Ｍテス トにおける活性および免疫化学反応性を含む、リンパ球から分離された一般的が ん関連ＳＣＭ認諏因子の特性を全て共有する。より予想外ではあっても、その配 列内の９つのアミノ酸の領域、Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にの配列を有 するアミノ酸１４−２２が８０Ｍテストにおいて同じように活性を有する。この １４−２２配列を含有するアミノ酸配列８−２２．８−２９および１−２２など のその他の部分配列も十分に活性を有する。 ナチュラル精製ＳＣＭ因子および合成ＳＣＭ因子相方の生物学的特性を説明する 。これら相方の因子に関して、測定されている限りにおいてそれらの生物学的特 性は実質的に同じである。それら特性には次のものがある：（１）悪性腫瘍のな いドナーからのリンパ球のＳＣＭ反応を変更するＳＣＭ因子の能力。 （２）種々のタイプのがんにかかっているドナーから分離された因子の８０Ｍテ ストにおける交さ反応性。 （３）キラーリンパ球の悪性腫瘍細胞に対する生体外ナチュラル細胞障害性を抑 止する能力。 （４）がん細胞の増殖および浸潤を促進させると考えられるプロトチアーゼを、 それらプロテアーゼ、α−１−ＰＩのナチュラルインヒビターによる障害から保 護するというＳＣＭ因子の新に発見された特性。 さらに、α−１−ＰＩは、ＳＣＭ因子に対するがん患者のＳＣＭ反応リンパ球の 生体外反応を逆行させ得るという事実と共に、α−１−ＰＩを有するＳＣＭ因子 の相同性が発見された。血漿からＳＣＭ因子を実質的に均質なものに精製する方 法が、合成５０Ｍ因子および血漿から精製されたＳＣＭ因子を８０Ｍテストの誘 発剤（ｃｈａｌｌｅｎｇｌｎｇ　ａｇｅｎｔ）として使用する方法と共に説明さ れる。ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイを含む、リンパ球受容体アッセイおよび種々の免 疫化学アッセイも、ＤＮＡ配列を組込んだベクターおよびＳＣＭ因子のためのＤ ＮＡ配列コード化と共に説明される。 また、ＳＣＭ因子をがんの管理に使用する方法も説明される。 １０分離および精製された一般的がん関連ＳＣＭ認識因子１２の異なったタイプ のがんの患者から得られた血漿から一般的がん関連ＳＣＭ認識因子を分離し、物 質的に精製した。以下に詳述するように、それらのペプチドは全て、長さにおい て２９または３５のアミノ酸であり、アミノ酸配列において実質的に相同である 。 Ａ、精製（純化） ＳＣＭ認識因子を血漿から実質的に均等物へ精製した。 これは、米国特許出願箱０７／１８７．００７、タイトル“一般的がん関連ＳＣ Ｍ認識因子、生成および使用法′に記載されるように行った。この特許出願の開 示内容を本願に引用する。 この精製プロセスは、好ましくは次の５つの工程から成る（１）限外濾過；（２ ）脱塩；（３）ゲル濾過；（４〉アニオン交換クロマトグラフィ：および（５） 逆相高圧液体クロマトグラフィ　（ＲＰ−ＨＰＬＣ）。 １、限外濾過 ＳＣＭ因子の精製における第１の工程は、がんのドナーの体液から限外濾過物を 得ることである。この体液は末梢血、血漿または尿とすることができる。体液が 末梢血の場合、この末梢血は遠心分離されて血漿から赤血球が分離される。ＳＣ Ｍ因子の分離に使用される体液のトナーは、８０Ｍテストにおいて、使用される リンパ球に対して自己由来か同種異系とすることができる。あるいは、ＳＣＭ因 子は、悪性腫瘍の患者から誘導された細胞吸引液（ｃｅｌｌ　ａｓｐｉｒａｔｅ ）またはその他の細胞物質（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｅｒｉａｌ）から精製で きる。 限外濾過プロセスは、１，０００ダルトンを超える見掛分子量の分子から成る体 液の第１画分を、１，０００ダルトン未満の見掛分子量の分子から成る第２画分 から分離する。本発明に係る一般がん関連８０Ｍ因子が限外濾過の第２画分中に みつかる。ここでは、“見掛分子量”および“公称分画分子量”という用語を用 いる。というのは、限外−過は、この分子量範囲の分子量による分子の分離方法 としてはいくらか不正確であり、１，０００ダルトンの公称分画分子量のフィル ターで取り除かれる正確な分子量は、若干、分子の構造（ｃｏｎｆｏｒａ＋ａｔ ｉｏｎ）に依存するからである。真性分子量（ａｅｔｕａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒνｅｉｇｈｔ）が１，０００ダルトンを超える分子は、例えばそれら分子が比 較的長くて幅が狭いならば、実際、公称分画分子量１，０００ダルトンの限外濾 過器を通過し得る。事実、本発明に係る精製された一般的がん関連８０Ｍ因子は 、長さが２９か３５のアミノ酸であり、分子量かそれぞれ約３．２００または３ ，９００ダルトンである。しかしながら、これらのペプチドはどちらも公称分画 分子ｊＥｔｌ、０００ダルトンの限外−過器を通過する。 好ましくは、第１画分と第２画分の分離は、Ａｍ１ｃｏｎ　ＵＭ２またはＹＭ２ 濾過器（Ａｍｉｃｏｎ社製）などの（もちろんこれらに限定されないが）公称分 画分子量１０００ダルトンの限外濾過器を用いた体液の濾過により行われる。 限外濾過工程またはそれ以降におけるＳＣＭ因子試料の純度は、その比活性によ って説明できる。ここで、“比活性“とは、８０ＭテストにおいてＳＣＭ反応リ ンパ球にチャレンジする（ｃｈａｔ　Ｉｅｎｇｅ）のにある両分を使用する場合 に、細胞内蛍光偏光をある値（例えば２０％）減少させるのにＺ要なタンパクの 量の逆数として定義する。５０Ｍ因子の精製の目標は、粗限外ｒ過物にみられる 比活性よりもＳＣＭの比活性を大きくすることができる。各精製のステージにお いて、精製のプロセスにつづいて、精製された画分の比活性を測定する。ここで 報告する実施例におけるタンパク濃度は、紫外線吸光度（好ましくは２２０ｎｍ における吸光度）においておおよそＭ１定されるのみであり、そして５０Ｍ因子 の完全な用量反応曲線は今だ決定されていないので、５０Ｍ因子の精製における 種々の工程の比活性に関する特性付けは概略のみである。しかしながら、５０Ｍ 因子の活性は比較的影響を受けないまま５０Ｍ因子が種々の精製工程を通過する うちにタンパク濃度は目立って減少し、それによって５０Ｍ因子の比活性は大き くなることは明らかである。ところが、限外濾過物でさえも、精製された一般的 がん関連ＳＣＭ認識因子から実質的に成るというように正１−く説明できる。と いうのは、公称分画分子量１．０００ダルトンの膜による限外濾過は、全てのタ ンパクおよび大きいペプチドを含む、生物学的活性を有する分子の圧倒的多数を 生体液から除去するからである。 ２、脱　塩 一般的がん関連ＳＣＭ因子の精製における次の工程は脱塩工程であって、そこで は、限外濾過から得られる画分をクロマトグラフィカラムに充填する。このカラ ムは塩を分離できるものである。このカラムに充填した物質は、次に蒸留水を用 いてカラムから溶離され、クロマトグラフィ金床容量の約０．３倍から約０，５ 倍の範囲の溶出容量において溶出した部分（５０Ｍ因子を含有する）が集められ る。好ましくは、この工程に用いるカラムは、５ｅｐｈａｄｅｘ”　Ｇ　−１（ １（ＰｈａｒｒＡａｃｉａ社製）、デキストランゲルなどの、約Ｏから約７００ ダルトンの分別範囲を有するゲル濾過カラムである。 同様の分離特性を有するポリアクリルアミドゲルも使用できる。 ３、ゲル濾過 精製におけるその次の工程はもう１つのゲルー過工程であり、ここでも大きさに 応じて分離が行われる。脱塩工程から得られたＳＣＭ含有物質は、約１．５００ から約３０，０００ダルトンの分別範囲を有するもう１つのゲル濾過カラムに充 填される。好ましくは、このゲル濾過カラム材料は、５ｅｐｈａｄｅｘＲＧ−５ ０などのデキトランであるか、同様の特性を有するポリアクリルアミドゲルも使 用できる。カラムに充填された物質は、次に、アンモニウム塩の弱水溶液を用い て溶離される。好ましくは、このアンモニウム塩は重炭酸アンモニウムであり、 より好ましくは５０ｍ　Ｍの重炭酸アンモニウムである。クロマトグラフィ金床 容積の約０．４倍から約０．６倍の範囲の溶出容積で溶出する部分は５０Ｍ因子 を含有し、該部分は集められる。 ４、アニオン交換クロマトグラフィ 精製のその次の工程は、アニオン交換クロマチグラフィつあるいは２つの部分に おいてエドマン分解により確認される２つのアミノ酸を含有している。２つを超 えるそのような置換はない。また、２つのケース、すなわちガストリックサルコ ーマ（ｇａｓｔｒｉｃ　５ａｒｃｏ■ａ）および前立腺がんのケースにおいて、 ＳＣＭ因子が２つの形態で現れている１つは２９のアミノ酸残基であり、もう１ つは３５のアミノ酸残基である。その中間の長さの形態はみられない。こう丸の 精上皮腫では、３５のアミノ酸形態のもののみがみつかっている。アミノ酸配列 におけるこのような若干の相違は、８６ＭテストにおけるＳＣＭ因子の交さ反応 性には影響しない。 配列の１つの領域はほとんど変化しない。すなわち、残基１４−２２である。こ の配列はＦ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にである。ただし、前立腺がんとこ う丸の精上皮腫の場合のＳＣＭ因子だけは、位置１８においてＤ（アスパルテー ト）がＥ（グルタメート）におき代わっている。この変化はきわめて保存的であ る。というのは、グルタメートとアスパルテートは同じ電荷を有し、１つのメチ ル基の点でのみ異なっているからである。この不変の領域は、後述するＳＣＭ因 子の機能にとって極めて重要であると考えられる。 精製ＳＣＭ因子は、数種の異なったタイプの悪性腫瘍の患者から分離されたリン パ球のチャレンジング剤（ｃｈａｌ　ｌ　ｅｎｇｉｎｇ　ａｇｅｎＯとして使用 した場合、８６Ｍテストにおいて十分活性を有する。この活性は、限外濾過から 始まって、ＳＣＭ因子の精製中のどの段階におれるアッセイからでも示される。 そのようなアッセイの結果の詳細は後の実施例で述べる。最大の活性は、最終の ＲＰ−ＨＰＬＣ工程から得られる物質において見られる。４０ピコモルペプチド の近似タンパク含有量を有する１７１０ｍ１のその最大活性の画分は、がん患者 から分離されたＳＣＭ反応リンパ球にチャレンジする（ｃｈａｌ　Ｉｅｎｇｅ） のに使用すると、４４．６％もの細胞内蛍光偏光の減少を生じさせるが、健康な ドナーから分離された同じ個体群のリンパ球にチャレンジする（ｃｈａｔ　Ｉｅ ｎｇｅ）のに使用すると、細胞内蛍光偏光の減少は生じない。 ２．３ＣＭ因子のトリブチツクペプチド肺がんおよび乳がんの患者の血漿からの ＳＣＭ因子の精製された試料をトリブチツク消化（ｔｒｙｐｔｉｃ　ｄｉｇｅｓ ｔｉｏｎ）に供し、その後トリブチツクペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製 した。核ケースにおいて、Ａｑｕａｐｏｒｅ”　ＲＰ　−３００カラムを用いた ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、３０．４容量％の溶媒Ａと６９．６容量％の溶媒Ｂで 、ある断片を溶出した。配列分析により、それらの画分は、残基８−２２からな るＳＣＭ因子の断片であることがわかった。（どの場合も、残基７はリシンであ り、トリプシンはりシン残基の後で分割することが知られている。） これらのトリブチツクペプチドは８６Ｍテストにおいて十分活性がある（実施例 １０）。肺がん患者の血漿から分離されたＳＣＭ因子（肺がん由来ＳＣＭ因子） からの約５×１．０−２ＸＩＯ−５グラム（ｆｅｍｔｏｇｒａｍｓ　）のトリブ チツクペプチド（約１８．０００分子に相当する）は、がんのドナー由来のリン パ球に対するチャレンゲ剤（（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｆ　ａｇｅｎｔ）として使 用する場合、８６Ｍテストで十分な活性を与える。肺がんＳＣＭ囚子んからの断 片は、肺がんおよび乳がんのドナー由来のリンパ球と同じように反応したが、正 常のドナー由来のリンパ球にチャレンジする（ｃｈａｔ　Ｉｅｎｇｅ）のに使用 した場合にはとそもテストで反応を生じさせなかった。より詳細は後の実施例で 述べる。どちらのトリブチツク断片のも、アミノ酸１４−２２から成るペプチド の部分にほとんど不変の領域を含んでいる。 ３、ＳＣＭ因子の交さ反応性 本発明の分離された因子は一般的がん関連ＳＣＭ認識因子である。というのは、 全てのタイプのがんのドナーから分離されたリンパ球が８６Ｍテストにおいてこ の因子の全ての試料と反応するからである。リンパ球のドナーがかかっているが んのタイプは、ＳＣＭ因子か精製されたところの体液のドナーかかかつているが んのタイプと同しである必要はない（実施例１１）。 ４、一般的かん関連ＳＣ〜１因子によるＳＣＭ反応の変更分離された一般的がん 関連ＳＣＭ因子は、悪性腫瘍のないドナーからえられる潜在的ＳＣＭ反応リンパ 球が前記因子と接触した際に前記リンパ球の反応を変更できる特性を有する。上 記接触の前は、悪性腫瘍のないドナー由来のリンパ球は、８６Ｍテストにおいて 、植物凝集素、コンカナバリンＡおよびアメリカヤマゴボウミトゲンなどのミト ゲンのみと反応し、がん関連因子とは反応しない。しかしながら、ＳＣＭ因子と 長時間接触した後、細胞のＳＣＭ反応は変更されて、がん関連因子のみと反応し 、ミトゲンとは反応しなくなる。言いかえると、前記のようなリンパ球がＳＣＭ 因子と接触すると、悪性腫瘍のないドナー由来のリンパ球の正常な反応からがん にかかったドナー由来のリンパ球にみられる反応へと、８６Ｍテストにおける前 記リンパ球の反応が変更される。ＳＣＭ反応の変更かどのよってあるかについて 詳細は後の実施例で延べる。 ＳＣＭ因子は、リンパ球の密度特異性ＳＣＭ反応副次集団（ｄｅｎｓｉｔｙ−ｓ ｐｅｃｉｒｉｃ　ＳＣＭ−ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ）の生体外自発性ナチュラル細胞障害性のみならず、従来の技術によって分離さ れた末梢血リンパ球の一般集団の生体外自発性ナチュラル細胞障害性をも不可逆 的に抑止する特性を有する。合成ＳＣＭ因子による細胞障害性の抑止は用量依存 的であり、細胞障害効果を５０％低下させるにはＳＣＭ因子が１１．５Ｘ　１０ −１５モル（ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ）あればよい。ＳＣＭ因子による細胞障害性の 抑止には合成ＳＣＭ分子の一部が必要なだけであり、この抑止活性に関連する５ ６Ｍ因子の領域がわかっている。５６Ｍ因子は、がん細胞のキラーリンパ球に対 する防御に関与していると考えられる。この防御はがん細胞の生存および抑制さ れない生成に寄与していると考えられる。がんの生成を抑制することに対する免 疫系の正常な機能の重要性は、免疫低下した患者において異常な形態のかんがし ばしば発現することでわかる。そのような免疫低下は、後天性免疫不全症候群（ ＡＩＤＳ）などの病気の結果、または移植の拒絶反応を防止するために免疫抑制 剤を投与した結果として起こる。そのような異常な形態のがんの重要な例は、通 常ゆっくりと広がりそれ程致命的ながんではないカポシ肉腫攻撃的形態のものか エイズ患者に発現することである。リンパ球のナチュラル細胞障害性の低下につ いての詳細は後の実施例で述べる。 しかしながら、５６Ｍ因子のこのような免疫抑制効果はがんにかかっていない患 者にとって有益な場合がある。例えば、組識移植を受け、拒絶反応の現れるおそ れのある患者にとって、５６Ｍ因子および／またはその活性部分によるリンパ球 の細胞障害性活性の抑止は拒絶反応を防止するＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄ ｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｃｌａｔｉｏｎタンパク配列データバン クのコンピュータ調査により、予期せずに、１２の分離精製一般的がん関連ＳＣ Ｍ認工因子のアミノ酸配列は、グリコプロティンα−１−プロテアーゼインヒビ ター（α−１−ＰＩ）からの内部２８−３３アミノ酸配列と８２，８％から８９ ．７％と同じであることがわかった。α−１−ＰＩは５５，０００ダルトンの分 子量を有するグリコプロティンであり、３９４残基の単一ポリペプチド鎖であり 、そしてセリンプロテアーゼを阻害する。５６Ｍ因子と相同なα−１−ｐＩの配 列は、１２のがんのうち９のがんからの因子においては、アミノ酸３５８とアミ ノ３８８の間であり、位置３５９のセリンが欠落している。１２のがんのうちの その他のがん、胃がん、前立腺の腺がん、およびこう丸の精上皮腫では、相同な 配列は残基３５９と残基３９３の間である。こう丸の精上皮腫からの因子におい て、相同性は１００％であり、前立腺の腺がんからの因子において、相同性は９ ７％であり、胃がんからの因子において、相同性は９４％である。これらの計算 結果は、未確認残基を除外してのものである。 １２のタイプのがんのうち９つのがんから確認された５６Ｍ因子において、アミ ノ末端残基はメチオニン（５つのかん）またはバリン（４つのかん）であり、さ らなる２つの因子においてはアルギニンである。１２の５６Ｍ因子のうち１１の ５６Ｍ因子ては、元々位置３５９にあり、メチオニンおよびα−１−ＰＩの位置 ３５８の次にあるアミノ酸セリンか欠落している。こう丸精上皮腫ｓｃＭ因子に おいて、セリンはアミノ末端位置に存在するが、メチオニンはない。 α−１−ＰＩは肝臓で通常構成されるグリコプロティンであり、血漿中で急速に 遊離される。血漿中のこのグリコプロティンの正常レベルは１．３　ｇ／に！で あると報告されている。これは急性反応性タンパクであり、その合成は、炎症信 号およびその他の生体恒常性要件に応答して４倍まで高められる。α−１−ＰＩ はセリンプロテアーゼを阻害し、炎症の部位および炎症源において白血球によっ て放出されるタンパク分解酵素の攻撃に対して組識を防御することにより、炎症 プロセスにおいて重要な役割をはたす。これはまた、ＤＮＡ合成の調節機構、細 胞分裂サイクル、並びに分化および成熟プロセスの一部と考えられる。不適合プ ロテアーゼ阻害はこれらのプロセスを不均衡にし、しばしば宿主に悪影響を与え る一方、プロテアーゼ阻害がないと、受容効率が向上し、おそらくα−１−ＰＩ 欠損の個体の繁殖を促進スる。α−１，−Ｐ　Ｉのレベルまたはタイプは病体生 理学的プロセスに影響を与え、そして病気の発病、経過および発病度（ｓｅｖｅ ｒｉｔｙ）を決定すると思われる。 しかしながら、がん細胞のプロテアーゼとの阻害反応中の活性中心における異常 分割（ａｂｅｒｒａｎｔ　ｃｌｅａｖａｇｅ）の生成物として、あるいは合成中 の欠陥として、血漿中の５６Ｍ因子の存在を説明するα−１−ＰＩの遺伝的変異 体は知られていない。 また、５６Ｍ因子に類似したペプチドが限外−過により生じる切断の結果として 生成されることを示す証拠はない。 炎症性の病気の患者からの血漿を含む、がんにかかっていないドナーからの血漿 を、５６Ｍ因子の精製プロセスにおける第１工程として使用されるのと同じ限外 −過プロセスに供した。この限外濾過では、５６Ｍ因子に類似したペプチドある いはα−１−ＰＩの画分は検出されなかった。さらに、８０Ｍテストにおいてが ん患者からのＳＣＭ反応リンパ球は前記限外濾過に反応しなかった。 腫瘍細胞により分泌されるいくつかの特異性攻撃的プロテアーゼがα−１−ＰＩ を分割して５６Ｍ因子に類似した分子を生成することがないようにするため、下 記の物質の存在下、種々のヒト腫瘍生検材料およびヒト培養がん細胞株を３７℃ で１番インキュベートした：（ａ）純粋ヒトα−１−ＰＩ；（ｂ）トリプシンと α−１−ＰＩの複合体、および（Ｃ）がん患者の血漿の、α−１−ＰＩを含有す る５、０００ダルトンを超える分子量画分。これにより、がん患者の血漿中にα −１−ＰＩの変動性遺伝的変異体がないことを確かめる。インキュベーション後 、組識または細胞を遠心分離により分離し、上清をまず１．．０００ダルトンの 分画分子量濾過器（＾ａ＋１ｃｏｎ″ＹＭ２）による限外濾過に供し、次に５６ Ｍ因子の精製に使用するようなりロマトグラフィ工程にさらに供した。未処理対 照がん細胞の上滑において測定されたものより多い量の５６Ｍ因子を生じる試料 はなかった。 ７、培養中のかん細胞による５６Ｍ因子の合成Ｔ１．０８０６線維肉腫細胞、Ｍ ＣＦ７乳がん細胞、Ａ　２７８０卵巣がん細胞およびＨＣＴ８０結腸がん細胞を 含む、培養中で育った代謝的に活性のためヒトがん細胞は、前記分子は、ＳＣＭ 因子精製プロセスを通るとＳＣＭ因子自体のそれに等しい保持時間で光学密度ピ ークを示した無血肩紐１培地分子中に排出された。 ヒトＭＣＦ７乳がん細胞およびＨＣＴ８０結腸かん細胞が育成された上滑培地か らのＳＣＭ因子の精製試料に存在するピコモル量のＳＣＭ因子の配列決定により 、生体外で育成された細胞が、ＳＣＭ因子と相同な分子を配設することが確認さ れた。実施例２４に示されるように、ＭＣＮ７乳がん細胞からの試料における最 初の１６アミノ酸残基の１５、並びにＨＣＴ８０結腸がん細胞からの試料におけ る最初の６アミノ酸残基の５、それぞれ、乳がんおよび結腸がん患者の血漿から 精製されたＳＣＭ因子から得られた配列と同じである。 これらの結果は、抗ＳＣＭ因子抗体を用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡテスト（実施例２５ ）によって支持された。ＥＬ　Ｉ　ＳＡテストを培養ヒトがん細胞に対して行っ たところ、ＳＣＭ因子の存在がテストされた細胞株全てにおいて検出された。異 なった細胞株から、同じ条件下で１細胞当り異なった量のＳＣＭ因子が産生じた 。このバリエーションは、それら異なった細胞株の発がん性または代謝活性にお ける差異の発現であると思われる。このことは、ＭＣＦ７乳がん細胞およびＴ　 １０８０線維肉腫細胞をタンパク合成の翻訳インヒビターであるシクロへキシミ ドで処理するとＳＣＭ因子の合成が低下したことを示す結果によって支持される 。これらの結果は、がん細胞が積極的にＳＣＭ因子分子を合成するという我々の 仮説と一致する。 上清長培地および／または培養細胞が退治細胞によって産生されたα−１−ＰＩ のいくつかの変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）によって汚染されることがないように 、ウシ胎児血清を最後の２つの培地変更に使用する生成培地（ｇｒｏｗｔｈ　ｍ ｅｄｉｕｍ）から除外した。さらに我々はウシ胎児血清を１．０００ダルトンの 分画分子量の濾過器を用いた限外濾過に供し、次に８０Ｍ因子精製に用いたのと 同じクロマトブラフイエ程を行った。得られたＲＰ−ＨＰＬＣ溶出物はＳＣＭ因 子に特徴的な保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）で光学密度ピークを示 さなかった。しかしながら、ＳＣＭ因子のそれに隣接するもう１つのピークを順 に集めた。このピークと同じ遺伝的起源を示すＳＣＭ因子との間に存在するアミ ノ酸の４４，７％の非線形配列相同性があったが、配列の相違は大変大きく、α −フェトプロティンのようなＳＣＭ因子かがん細胞逆分化の生成物であるとの結 論付けを正当化することはできない。 このことは、ＳＣＭ因子が異所性（ｅｃｔｏｏｉｃ）通分化腫瘍マーカーではな いことを示唆している。さらに重要なことには、ＳＣＭ因子自体はウシ胎児血清 中に存在しなかった。 がん細胞によるＳＣＭ因子の生成にとって活性タンパク合成は必要である。実施 例２Ｂは、培養ヒトかん細胞をタンパク合成インヒビター、シクロへキンミドで 処理すると、Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａアッセイで測定して、ＳＣＭ因子の合成が大き く低下したことを示している。同様に、実施例３０は、ＭＣＦ７乳かん細胞の培 養にアスコルベートイオンを加えると、ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイで測定してＳＣ Ｍ因子の合成か大きく低下することを示している。アスコルベートイオンは、か ん細胞のミトコンドリアを休止している正当な構造（ｉｄｌｅｏｒｔｈｏｄｑｘ 　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に戻す（ｒｅｖｅｒｔ）すことによってタンパク 合成に阻害し得るので（Ｌ、ＣＥＲＣＥＫ　＆　Ｂ、ＣＥＲＣＥＫ　。 −Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｓｃｏｒｂａｔｅ　Ｉｏｎｓ　ｏｎ　Ｉｎｔｒａｃｅ ｌｌｕｌａｒ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｃｅｉｎ　Ｅｏ＋１ｓｓｉｏｎ　Ｐｏ１ａｒ ｉｚａｔｉｏｎ　５ｐｅｃｔｒａ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｎ。 結果は、ＳＣＭ因子の生成に活性タンパク合成が必要であることを示すものであ る。 ８．５ＣＭ因子によるＤＮＡ合成の刺激実施例２７で示されるように、トリチウ ム標識チミジン摂取によってａｊ定して、ＳＣＭ因子は培養中で育成されたラッ ト肝細胞のＤＮＡ合成を促進する。ＤＮＡ合成の促進は投与した５ｃＰｖ１因子 の用量に依存する。ＤＮＡ合成の刺激における５（ｌｉ因子の活性とがん細胞の 成長を促進することにおけるＳＣＭ因子の役割との関係を以下に述べる。 ９．５ＣＭ因子によるα−１−ＰＩ活性の阻害ＳＣＭ因子は、α−１−ＰＩとは 異なって、セリンプロテアーゼに対する阻害または不活性化活性を有しない。し かしながら、ＳＣＭ因子分子をα−１−ＰＩより前があるいはそれと同時にプロ テアーゼに加えた場合、プロテアーゼに対するα−１−ＰＩの障害または不活性 化活性をブロックできる。これにより、ＳＣＭ因子を産生ずるがん細胞における プロテアーゼ活性を向上できるがもじれない。それについては後述する。 ■２合成がん関連ＳＣＭ認識因子 １２の異なるタイプのがんから分離されたＳＣＭ因子間における高度な配列相同 性により、標準的固相ペプチド合成法を用いて合成ＳＣＭ因子を生成した。この 合成ＳＣＭ因子は２９のアミノ酸のコンセンサス配列を有し、分離精製ＳＣＭ因 子の特性および活性を公有している。 合成ＳＣＭ因子の試料は次のような種々の理由により望ましい：（１）がん組識 から分離することなく多量に入手できる。（２）構造および活性が均一である。 （３）構造と活性の関係を決定するために配列を変えられる。 Ａ１合成ＳＣＭ因子分子の配列 合成ＳＣＭ因子は次のアミノ酸配列を育する：Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ −Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ −Ｍ−Ｇ−に０ この配列が、ＳＣＭ活性を保有すると考えられる２９のアミノ酸を有する唯一の 配列ではない。保存的アミノ酸置換と称せられるある種のアミノ酸置換が、タン パクあるいはペプチドの構造または機能を変えることなくタンパクあるいはペプ チドにおてしばしば行い得るというのは、タンパクおよびペプチドの化学におけ る確立された原則である。 そのような変更には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ ）のいずれかをそれらアミノ酸の他のいずれかと置換すること：グルタミン酸（ Ｅ）の代わりにアスパラギン酸（Ｄ）を用いること、およびその逆；アスパラギ ン（Ｎ）の代わりにグルタミン（Ｑ）を用いること、およびその逆：さしてスレ オニン（Ｔ）の代わりにセリン（Ｓ）を用いること、およびその逆かある。 これらの適当な等価物により、配列Ｍ−Ｘ２−Ｐ−Ｐ−Ｘｓ　Ｘｂ　Ｋ　Ｆ−Ｘ ９　Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｘ１３　Ｆ　Ｘ１５Ｍ　ＸＩ７　Ｘ１８　Ｘ１９　Ｘ２０　Ｘ ２１　Ｋ　Ｘ２３　Ｐ−Ｘ２５　Ｆ　Ｍ　Ｇ　Ｌのペプチド（ここでＸ２　、　 Ｘｂ　、Ｘ１３゜Ｘ、、、Ｘ、□、Ｘ２．およびＸ２５は、それぞれ独立に、Ｉ 、ＬおよびＶから成る群より選択され；Ｘ、およびＸ１８はそれれ独立に、Ｄお よびＥから成る群より選択され；Ｘ９．Ｘ１９およびＸ２ｏは、それぞれ独立に 、ＱおよびＮから成る群より選択され；そしてＸ２．はＳおよびＴから成る群よ り選択される）はＳＣＭ因子活性を有すると思われる。この配列のおよびその他 の配列の表示において、記号に示される数字は２９個のアミノ酸の因子において 特定されたアミノ酸の位置を表わす。例えば、“Ｘ２″はアミン末端から２番目 のアミノ酸を表わす。 前述した置換は保存的であると考えられるアミノ酸置換に限られない。他の置換 も、あるアミノ酸の環境に応じて、保存的であると考えられる。例えば、グリシ ン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、アラニンとバリン＜Ｖ＞がそうであるように 、しばしば相互交換可能である。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、しば しばロイシンおよびイソロイシンと、そして時々バリンと交換できる。リジン（ Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷でありそ してそれら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫ値（ｐＫ’　ｓ）は重要ではないよ うな位置においてしばしば相互交換可能である。ある環境下において、さらにそ の他の変更も保存的となり得る。 合成ＳＣＭ因子分子はＳＣＭテストにおいて高度に活性がある、後の実施例１５ に示すように、わずか２　Ｘ　１０−”モル（フェトモル）の合成ＳＣＭ因子分 子が、ＳＣＭ反応リンパ球にチャレンジする（ｃａｔ　！ｅｎｇｅ）するのに使 用された際に、ＳＣＭテストにおいて細胞内蛍光偏光を２０％も下げた。 合成ペプチドは、異なった組識学的タイプおよび異なった器官の腫瘍をもつドナ ーからのＳＣＭ反応リンパ球にチャレンジ（ｃａｔ　Ｉｅｎｇｅ）するのに使用 された際に、ＳＣＭテストにおいて活性かある。正常で健康なドナーからのＳＣ Ｍ反応リンパ球の対応する両分は、９６０ピコモル（９８０ＸＩＯ’２モル）も の量のＳＣＭ因子に反応しなかった。 合成８０Ｍ因子は健康なドナーからのリジンく球のＳＣＭ反応を、そのようなリ ンパ球に特徴的な反応（すなわち、ＰＨＡには反応してがん関連因子には反応し ない）からがんのドナーからのリンパ球に特徴的な反応（すなわち、ＰＨＡには 反応せず、がん関連因子には反応する）に変更し得る。実施例１９において詳述 するように、健康なドナー力）らのＳＣＭ反応リンパ球はＳＣＭテストにおいて 合成８０Ｍ因子には反応しなかった。しかしながら、５　Ｘ　１０ｅ′個の細胞 当り４００ピコモルの合成８０Ｍ因子の存在下、３７℃で２．５時間インキュベ ートした後、食塩力ロリン酸緩衝液で３回洗浄すると、それらの細胞は細胞内蛍 光偏光か３７％下がり、合成８０Ｍ因子に反応し得る受容体か誘導されたことを 示した。 これら受容体の誘導にはタンパク合成が必要である。５×１０６個の細胞に対し て１０Ｍｇのタンノくり合成インヒビター、シクロへキシミドまたはアクチノマ イシンＤの存在下でインキュベーションを行うと、合成８０Ｍ因子に対する反応 は誘発されず、ミトゲンＰＨＡへの正常な反応が停止されなかった。 ３、合成８０Ｍ因子の免疫特性 合成８０Ｍ因子は、主α−ラセンニ次構造（ａ　ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｙ　ａ −ｈｅｌｉｃａｌ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有し、免疫反 応を誘発させる腫瘍組識適合遺伝子複合体（ＭＨＣ複合体）によって提示され得 ることを示唆するのに十分な程大きい。 このことを確かめるため、合成８０Ｍ因子を用いて実験動物を免疫してみた。こ れについては実施例２０に詳述しである。純粋ＳＣＭ因子およびキーホールリン ベットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に複合された合成８０Ｍ因子の両方を免疫化 に使用した。後者の場合、合成８０Ｍ因子は、Ｎ−スクシニルブロモアセテート を架橋剤として用いて、ＳＣＭ因子上の加えられたカルボキシ末端システィン残 基を介してＫＬＨに複合された。 ポリリシンなどの、その他のキャリアも免疫化に使用できる。そのようなキャリ アの使用は公知である。 合成８０Ｍ因子は、がん細胞に対するリンパ球のナチュラル細胞障害性活性を抑 止することが示された（実施例３１）。合成８０Ｍ因子は、リンパ球当り３５Ｘ １０−”モル（３５フ工トモル）の用量で使用した際に、Ｋ５６２ヒト骨髄腫標 的細胞に対する正常で健康なドナーからのリンパ球のナチュラルキリング（ＮＫ ）効率を９７％から９９．９％低下させた。 リンパ球当り１１．５Ｘ　１Ｏ−１５（１１，５フ工モルト）の用量で細胞障害 性が５０％低下した（表２３）。このような量のＳＣＭ因子は、それらの分子を 産生ずる代謝的に活性なかん細胞の直接周囲（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｓｕｒｒｏ ｕｎｄｉｎｇ）に存在すると思われる。このＮＫ抑止効果は不可逆的であり、処 理した９２７４球を３回完全に洗浄しても排除することはできない。 合成ＳＣＭ因子分子のどの部分のアミノ酸配列がこのＮＫ抑止活性に寄与してい るのかをつきとめるため、合成ＳＣＭ因子分子のさまざまな合成ペプチド断片を テストした。 実施例３１（表２６）かられかるように、ＮＫ抑止効果は合成ＳＣＭ因子全体（ ２９アミノ酸）およびＦ２断片（アミノ酸８−２９）にのみみられた。合成５０ Ｍ因子のカルボキシル末よびＦ５（表２６）はずれも活性がなく、このことは、 ７つのカルボキシ末端アミノ酸残基がリンパ球のＮＫ活性の抑止に関係している ことを示していると思われる。しかしながら、これら７つのカルボキシル末端残 基、残基２３−２９（画分Ｆ８）から成るペプチド断片はＮＫ活性を抑止せず、 残基１４−２９から成るペプチド断片Ｆ７もＮＫ活性を抑止しなかった。このこ とはＮＫ抑止活性を保持する最短配列は残基８−２９を含有するＳＣＭ因子の部 分内にあり、そして最初の７つのアミノ末端残基のみではＮＫ抑止活性に寄与し ないことを示している。これは、α−１−ＰＩによる阻害に対する保護に関係す る合成ＳＣＭ因子分子の部分（分子の最初の７つのアミノ末端残基）、あるいは ＳＣＭ活性自体に関係する分子の部分（分子のアミノ酸残基１４とアミノ酸残基 ２２との間の部分）とは対照的である。このように、ＳＣＭ因子は、がん細胞の 成長および浸潤を促進することおよび宿主の防御を抑止することにおいて多様な 機能を発揮する。 これらの結果は、発現させるべきＮＫ抑止活性にとって、ペプチドは合成５０Ｍ 因子の最初の７つのアミノ末端残基を含有する必要がないことを示している。断 片Ｆ２はアミノ酸配列Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ− Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有する。 上述したように、保存的アミノ酸置換を含む断片Ｆ２の変異体もまた、ＮＫ抑止 活性を有すると思われる。 さらに、実施例３１の結果に見られるように、合成５０Ｍ因子のＮＫ抑止活性は リンパ球の密度特異的（ｄｅｎｓｉｔｙ−ｓｐｅｃｌｆｉｃ）　Ｓ　ＣＭ反応副 次集団に影響を与えるのみならず、旧５ｔｏｐａｑｕｅ密度媒体を用いた従来の 密度勾配遠心技術により末梢血から分離したリンパ球のより広い範囲の集団にも 影響を与える。このことは、リンパ球の細胞障害性の抑止に対する合成５０Ｍ因 子の効果は広範囲の作用を有することを示している。この広範囲の作用には、Ｓ ＣＭ因子が悪性腫瘍細胞に対するリンパ球の細胞障害性を阻害する際の種々の機 構が含まれる。例えば、キリングプロセス（ｋｉｌｌｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ）の 第１段階の１つである、リンパ球とに５６２付髄腫細胞との間での複合体形成か 、リンパ球をＳＣＭ因子で処理すると、低下することを見つけた。ＳＣＭ因子の 他の効果は、ロイコリシン（Ｉｅｕｋｏｌｙｓｉｎ）の合成阻止および／または 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの種々の細胞溶解性分子の直接的不活性化である。 ＳＣＭ因子またはＳＣＭ因子の部分のＮＫ抑止活性は、ＮＫ活性を有するリンパ 球と悪性腫瘍細胞の両方を含む細胞培養中における悪性腫瘍細胞の成長を抑制で きる抗がん剤の有効性を評価するのに使用できる。この有効性は次のようにして 評価できる： （１）無傷ＳＣＭ因子（ｉｎｔａｃｔ　ＳＣＭ　ｆａｃｔｏｒ　）または上述し たＮＫ抑止活性を有すると思われるペプチドの１つのような実質的に精製された ＮＫサブレッシブペプチドを、細胞培養のリンパ球のＮＫ活性を実質的に抑止す るのに十分な量を用いて、前記細胞培養をインキュベートし、（２）悪性腫瘍細 胞の成長を測定できる程に抑制するのに十分な量の抗がん剤を前記細胞培養に加 え、（３）リンパ球により生じるＮＫ活性が実質的にない状態で抗がん剤により 得られた悪性腫瘍の成長抑制をみることにより、悪性腫瘍細胞に対する抗がん剤 の効果を測定する。 合成５０Ｍ因子のどの部分か５０Ｍテストにおける活性に寄与するのかを確かめ るため、合成５０Ｍ因子の５つのペプチド断片を合成し、それぞれＦ１〜Ｆ５と した。それ−９ｒ） らは無傷分子の以下の部分を表わす：Ｆ１．アミノ酸１−２２　；Ｆ２．アミノ 酸８−２９　、　Ｆ　３．アミノ酸８−２２；Ｆ４．アミノ酸１４−２２　；　 Ｆ　５．アミノ酸１−１３゜これらの断片は以下のアミノ酸配列を有する： Ｆｌ　：　Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ −Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ　。 Ｆ２　：　Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ　−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に− Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋ　。 Ｆ３　：　Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ　。 Ｆ４　＋　Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ　。 Ｆ５　：Ｍ−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ。 実施例１７に詳述されているように、断片Ｆｌ、Ｆ２．Ｆ３およびＦ４は全て５ ０Ｍテストにおいて活性があるが、断片Ｆ５は不活性である。これら活性のある 断片は全てＦ４のアミノ酸セグメントを含有している。このセグメントはＳＣＭ 活性に寄与する活性部位を示すと考えてよいたろう。 ５０Ｍテストにおいて活性かあるのはこれらペプチドＦ１〜Ｆ４だけではなく、 保存的アミノ酸置換を伴うそれらペプチドの変異体もＳＣＭ活性があると考えら れ、従ってそれらも本発明の範囲に入る。前述した保存的置換には、イソロイシ ン、バリンおよびロイシンのいずれかをそれらアミノ酸の他のいずれかと置換す ること：グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸を用いたりその逆を行うこと： グルタミンの代わりにアスパラギンを用いたりその逆を行うこと−並びにスレオ ニンの代わりにセリンを用いたりその逆を行うことなどがある。これら保存的置 換が存在することは、次のペプチドがＳＣＭ活性を有すると考えられることを意 味する： Ｍ　Ｘ２　Ｐ　Ｐ　Ｘ５　Ｘｂ　Ｋ　Ｆ　Ｘ９　Ｋ　Ｐ−Ｆ−Ｘ１３　Ｆ　Ｘｔ ｓ　Ｍ　Ｘ１７　Ｘ１８　Ｘ１９　Ｘ２０　Ｘ２１−Ｋ。 Ｆ　Ｘ９　Ｋ　Ｐ　Ｆ　Ｘ１３　Ｆ　Ｘ１５　Ｍ　Ｘ１７　Ｘ１８Ｘ１９　Ｘ２ ０　Ｘ２１　Ｋ　Ｘ２３　Ｐ　Ｘ２５　Ｆ　Ｍ−Ｇ−に： Ｆ−Ｘ　９　Ｋ　−Ｐ　−Ｆ　７　Ｘ　ｌ　３　Ｆ　−Ｘ　Ｉ　６Ｍ　Ｘ　１□ −Ｘ１８Ｘ１９　Ｘ２０　Ｘ２１　Ｋおよび Ｆ　Ｘ’ｓ　Ｍ　Ｘ１７　Ｘ１８　Ｘ１９　Ｘ２０　Ｘ２１　Ｋこれらの配列中 、あるアミノ酸残基を示す記号は、２９のアミノ酸から成る合成ＳＣＭ因子全体 における保存的アミノ酸置換を述べた際と同じものをさす。 両親媒性プロフィールは、ペプチドまたはタンパクのセグメントの相対的親水性 または疎水性のプロットである。 アミノ酸残基は、大変親水性のもの（例えば帯電した残基またはセリン）から大 変疎水性のもの（例えばフェニルアラニン）までにおよぶ。典型的には、このプ ロットは、タンパクまたはペプチド内の短い範囲のアミノ酸に亘る移動−平均と し、て表わされる。特定し、認識するため、短い範囲のペプチドの両親媒性特性 はアミノ酸配列自体と同じ程に重要である。実施例１８に示すように、ＳＣＭ活 性のあるＦ４ペプチド断片の両親媒性プロフィールは、Ｆ　−Ｗ−Ｇ　−Ａ−Ｅ −Ｇ−Ｑ−Ｒの配列を有する、ＳＣＭ活性のある合成８アミノ酸ペプチドの両親 媒性プロフィールと著しく類似する。このことは、このペプチドと前記Ｆ４ペプ チドとの間で配列の相同性が限られているにもかかわらずである。 実験的アレンギー性脳淡誘発性ペプチド（ＥＡＥペプチド）はＦ−３−Ｗ−Ｇ− Ａ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｒの配列を有する。 疎水性残基フェニルアラニンとトリプトファンの間に相対的に親水性のセリンが あることにより、両親媒性プロフィールが大きく変更される。本国特許出願０７ ／　１６７　、００７号に詳述するように、ＥＡＥペプチドは３０Ｍ因子活性を 有しない。 ペプチドが３０Ｍ因子活性を有するかどうかを決定するのにペプチドの両親媒性 プロフィールが重要であるとすれば、配列Ｆ−Ｌ−１ｖｉ　−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ− Ｔ−にと実質的に等価な両親媒性プロフィールを有する９アミノ酸残基のコア配 列を含む少なくとも８アミノ酸量列のペプチドは３０Ｍ因子活性を有すると考え られる。 ■、精製および合成ＳＣＭ因子の使用 精製ＳＣＭ因子および合成ＳＣＭ因子の両方が、ＳＣＭテストにおけるチャレン ジング（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）として使用でき、８０Ｍ因子検 出のための抗血清を調整するのに使用でき、そして種々の遺伝的工学工程に使用 する等価遺伝情報（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎ「ｏｒａ＋ａ ｔｉｏｎ）を運ふＤＮＡ配列の発現に使用できる。以下に述べるように、この８ ０Ｍ因子はまた、がんの管理にも使用できる。 Ａ、ＳＣＭテストの遂行 ８０Ｍ因子の断片と同様に、精製ＳＣＭ因子および合成ＳＣＭ因子の活性は、下 記の文献に従って、生存可能なＳＣＭ反応リンパ球に対する効果によって確かめ られる：Ｌ。 Ｃｅｒｃｅｋ　ａｎｄ　Ｂ、Ｃｅｒｃｅｋ、“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｏｆ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　５ｔｒｕ ｃｔｕｒｅｄｎｅｓｓ　ｏｒＣｙｔｏｐｌａｓＩｌｉｃ　Ｍａｔｒｉｘ　（ＳＣ Ｍ）　ｊｎｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｄｉｓｏ ｒｄｅｒｓ　：　ＡＲｅｖｉｅｗ、　”　Ｅｕｒｏｐｌ、Ｃａｎｃｅｒ　１３． ９０３−９１５゜本発明の一般的かん関連ＳＣＭ認識因子は、上記文献に述べら れるようにして行うＳＣＭテストにおいて、がんにかかったドナーからの潜在的 ＳＣＭ反応リンパ球にチャレンジする（Ｃｈａ　ｌ　ｌ　ｅｎｇｅ）のに使用す ると、該リンパ球の細胞内蛍光偏光値を大きく下げる。そのようにチャレンジさ れた（ｃｈａｔ　ｌｅｎｇｅ）リンパ球の細胞内フルオレセイン蛍光偏光値の低 下の度合はかなりのものであり、がんのトナーからの血漿から限外濾過したもの を前記リンパ球にチャレンジ（ｃｈａｔ　ｌｅｎｇｅ）するのに使用する場合で あっても少なくとも２０％、精製ＲＰ−ＨＰＬＣ画分または合成ペプチドを使用 する場合には４Ｑ−５５％もの低下となる。 ここに述べるＳＣＭテストを正しく行うために、２つの既に確立された方法が重 要である。それらの方法とは、潜在的ＳＣＭ反応リンパ球の分離と、蛍光部光値 自体を測定する技術並びにそれをＳＣＭテストにとって意味のある数内に変換す る技術である。 １．５ＣＭ反応リンパ球の分離 潜在的ＳＣＭ反応リンパ球を分離するためのいくつかの方法か“Ｅｕｒｏｐｅａ ｎ　Ｊｏｖｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ”　、　ｒｅｖｉｅｗ　ａｒｔｉｃｌ ｅおよび米国特許出願第０７７２６０．９２８号（名称：　Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ 　ｏｆ’Ｄｅｎｓｉｔｙ　５ｐｅｃＨｉｃ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　ｒｏｒ　 ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｄｎｅｓｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ 　Ｍａｔｒｉｘ　（ＳＣＭ）　Ｔｅ５ｔ　、　−）に記載されている。上記米国 特許出願の開示内容は本願に引用として取り込む。一般的リンパ球集団から上記 リンパ球を分離することは、ＳＣＭテストを適切に行うために重要である。 というのは、ＳＣＭテストにおいて比較的部分のリンパ球（およそ２０−２５％ の全リンパ球集団）のみががん関連因子に反応できるからである。したがって、 ＳＣＭテストで実際に反応し得るリンパ球が、使用されるチャレンジング剤（ｃ ｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ　ａｇｅｎＯに十分に反応する場合でも、未分画リンパ球 （ｕｎｆｒａｃＮｏｎａｔｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）にＳＣＭテストを行う と、細胞内偏光値の観察される低下はずっと小さくなる。さらに、ＳＣＭテスト において異なった様式で反応するリンパ球のもう１つの両分が存在する。それら の細胞はがん関連因子と全く反応せず、がんにかかったドナーから分離された場 合にＰＨＡに反応する。後に詳述するように、ＳＣＭテストのバリエーションで は、ＰＨＡに対する反応とがん関連因子（例えば本発明のペプチド）に対する反 応を比較して、リンパ球のドナーが悪性腫瘍にかかっているかどうかを判定する 。従って、リンパ球のこの第２の画分は、結果をゆがみないようにするため、厳 格に排除しなければならない。 免疫学的に、ＳＣＭ反応リンパ球はＴ細胞単核白血球である。十分にわかっては いないが、ＳＣＭ反応リンパ球は、がん細胞上に発現し、がん細胞によって腫瘍 の間質空間（ｉｎｔｅｒｓｔｉＮａｌ　５ｐａｃｅｓ）に排泄される、血流中を 循環している抗原の認識に関与していると考えられる。この抗原認識は身体の免 疫系の引き金になる。従って、それらの細胞は感作され、病気または身体に影響 を与える状態によって生じる、抗原などの異物を認識する。 ＳＣＭ反応リンパ球は、単一密度溶液（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｅｍｓｉｔｙｓｏｌｕ ｔｉｏｎ）　、ステップグラジェント（ｓｔｅｐ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）または連 続ブレフォームドグラジェント（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｐｒｅｆｏｒｃｅｄ　 ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用いて分離できる。 ａ、単一密度溶液を用いる分離 単−密度溶液法によるＳＣＭ反応リンパ球の分離のため、末梢血のサンプルをド ナーから取って、ヘパリン化チューブ（ｈｅｐａｒｉｎｌｚｅｄ　ｔｕｂｅ）に 採集する。採集後、その末梢血を鉄粉末またはカルボニル鉄粉末で処理し、この 血と鉄イオン混合物を含有するチューブをマグネット上において、血液サンプル から鉄粉末と共に食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　ｃｅｌｌ）分離する。食細胞 を取りさった血液サンプルの部分をＦｉｃｏｌ　Ｉ”−Ｔｒｉｏｓｉｌ”密度勾 配溶液に移して遠心分離し、密度差に基づいてＳＣＭ反応リンパ球を分離する。 この分離法は通常、２５℃において密度１．０８１　ｇ／ｃｍ’　、重量オスモ ル濃度０．３２００ｓ＋＊／　ｋｇを有する密度勾配溶液を用いる。 遠心分離は、２５℃で２０分間、５５０Ｘｇで行う。ＳＣＭ反応リンパ球をパス ツールピペットを用いて回収し、密度勾配物質上に分離された細胞層を除去する 。この密度勾配物質の除去は、できる限りさけなければならない。というのは、 この物質は、テスト結果に干渉する種々のより重い血漿および細胞成分を含むか らである。汚染成分あるいはＳＣＭ反応細胞がテストサンプルに入り込むのをさ けるため、より軽い血漿物質の除去もできる限りさけなければならない。 分離につづいて、ＳＣＭ反応リンパ球を複数の洗浄工程に供する。まず、０．９ ％の保存薬の入っていない塩化ナトリウム溶液で、次に完全なダルベツコリン酸 緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗浄し、３７℃に保って後にＳＣＭテストに使 用できるようにする。 ｂ、ステップグラジェントを用いた分離ステップグラジェントを用いたＳＣＭ反 応リンパ球の分離のため、上述したように食細胞を取りさった全血サンプルを用 いるか、あるいは末梢血リンパ球の全集団（ｔｏｔａｌ　Ｉ）ｏｐｕｌａｔｉｏ ｎ）が使用できる。血液リンパ球の全集団を用いるのか好ましい。というのは、 有害であるかもしれない鉄またはカルボニル鉄粉末を使用しなくて済むからであ る。 ヘパリン住血サンプルを得るために末梢血リンパ球の全集団分離することも、密 度勾配遠心分離を用いて行う。この遠心分離工程は、約４００，０００の分子量 を有するショ糖の非イオン性合成ポリマーおよびナトリウムジアドリゾエート（ ｓｏｄｉｕｍ　ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ）を含有する密度１．０７７　ｇ／ＣＩ Ｈ３の溶液の頂部にヘパリン住血を層にすることによって行われる。どちらの溶 液も室温に均衡化させ、密度溶液の容量は少なくともヘパリン住血の容量と同じ 大きさである。次に、層にされた溶液を遠心分離（典型的には５５０Ｘｇ、室温 。 ３０分間）、リンパ球を溶液間の界面でバンド（ｂａｎｄ）する。 次に、リンパ球を界面から集める。 ＳＣＭ反応リンパ球の分離工程のため、密度１．０５９　ｇ／ａｍ３および重量 オスモル濃度０．３２００ｓｍ　／ｋｇの溶液を、密度］、、０６７０　ｇ　／ 　ｃｍ”および上記と同じ重】オスモル濃度の溶液の頂部に層化することによっ てステップグラジェントを調製する。これらの溶液は通常、ＰｅｒｃｏｌｌＲ（ Ｐｈａｒｉａｃｉａ社製）のようなポリビニルピロリドンカバーのシリカ媒体か ら調製される。ステップグラジェントの全容量の約半分の容量の血液サンプルま たは末梢血リンパ球をステップグラジェントの頂部に層化し、この混合物を典型 的には５５０Ｘｇて３０分間遠心分離する。ＳＣＭ反応リンパ球は第１および第 ２密度溶液間の可視バンドに集まり、これを回収する。 Ｃ１連続ブレフォームドグラジェントを用いた分離ステップグラジェントの代わ りに、連続ブレフォームドグラジェントをＳＣＭ反応リンパ球の最終分離に使用 することができる。このグラジェントは１．０５０　ｇ／ｅｒａ３から１゜０７ ０　ｇ／ｃｒｇ３の範囲の密度に亘る。ポリビニルピロリドンカバーのシリカの 溶液を２６，０ＯＯＸ　ｇで２９″の固定角ローター　（２９’　ｒｉｘｅｄ− ａｎｇｌｅ　ｒｏｔｏｒ）により、あるいは１１．４００Ｘ　ｇて３４＠の固定 角ローグーにより遠心分離することにより、ＳＣＭテストにおけるＳＣＭ反応リ ンパ球の蛍光偏光値を測定する方法が＋Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ ｆ　Ｃａｎｃｅｒ”　ｒｅｖｉｅｗａｒＨｃｌｅおよび米国特許出願第８［ｉ７ ．０７９号（名称：　−Ｍｅｔｈｏｄ　ｒｏｒ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｐｏ１ａ ｒｉｚｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｅｍｉｓｓｉｏｎｓ　、　”に記載さ れている。この特許出願の開示内容は引用とｌ、て本願に取り込む。これらに記 載されているように、テストの対照である末梢血から分離されたＳＣＭ反応リン パ球は、無菌ガラスチューブ内で、植物凝集素などのミトゲンまたは本発明の対 照である一般的がん関連ＳＣＭ認識因子などのがん関連抗原の既知濃度のものを 用いて、３７℃でインキュベートされる。コンカナバリンＡおよびアメリカヤマ ゴボウミトゲンなどの、植物凝集素（ＰＨＡ）以外のミトゲンも使用されている が、ＳＣＭテストにはＰＨＡが好ましい。このインキュベーションは、０．１ｍ ｉの適切に稀釈されたミトゲンまたは抗原を１ｍＪの細胞懸濁液に、６×１０６ 個の細胞／　ｍ　１で加えることによって開始される。このインキュベーション は３０−６０分間行う。 次に、インキュベートされたリンパ球は、懸濁液中で、フルオレセインジアセテ ート（ＦＤＡ）などのフルオロジェニックエージェント先駆体と本明細書で称す る、細胞内でフルオロジェニック化合物に加水分解できる適当なノンフルオロジ ェニック化合物と混ぜ合わされる。フルオレセインジアセテートは、完全ＰＢＳ 中、２．５ｍＭおよび０７ｍＭの最終濃度で、ｐＨ７，４、重量オスモル濃度０ ．３３００ｓ＋ｎ／ｋｇで使用され、それぞれアセトンおよび氷酢酸中に調製さ れた濃縮ストック溶液から稀釈される。０．２ｍｆ！の対照懸濁液および刺激さ れたリンパ球懸濁液のアリコートを、注射器を用いて、３ｒｒ＋Ｉ！のＦＤＡ基 質溶液の入ったビーカーにゆっくりと注入する。 細胞をＦＤＡに、ＦＤＡ基質溶液かリンパ球に浸透するのに十分な時間（約５分 間）さらす。細胞の内側で、ノンフルオロジェニック　フルオレセイン　ジアセ テート分子が酵素的加水分解によってフルオレセイン分子に転換される。励起光 の偏光に対する発行蛍光の偏光は、リンパ球を励起するのに使用される平面偏光 光の方位に依存しないので、フルオロ含有リンパ球（Ｎｕｏｒ−ｃｏｎｔａｉｎ ｉｎｇ　ｌｙｍｐｈｏｕｙｔｅ）は偏光光に対する反応において等方性を有する 。しかしながら、ここで使用している従来からの蛍光偏光測定器は、リンパ球を 励起（ｅｘｅｉｔｅ）させるのに垂直に偏光された励起光を用いているので、測 定の方法を、垂直偏光励起光に基づいて説明する。 垂直偏光光の形態の励起エネルギーに暴露されると、フルオレセイン分子は蛍光 を発する。垂直偏光発光と水平偏光発光との関係を測定する。これは、偏光蛍光 の強度を垂直平面と水平平面の両方で測定し、下記の式に基づいて偏光値（Ｐ値 ）を決定することにより行う：ここでＩＶおよびＩ□は、それぞれ垂直平面およ び水平平面における偏光蛍光の強度であり：Ｇは、使用した装置の光学系を通る 健康光の垂直成分および水平成分の不等透過を補正する補正ファクターである。 Ｇの値は水平偏光光の強度を垂直偏光光の強度で割ることによって決定され、過 によって外挿された全蛍光強度（ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ ｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ　ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｈａ ｌｆ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｆｌｌｔｒａｔｉｏｎ）から濾過物から得られる値を引 くことにより、細胞に関する補正フルオレセイン強度を得る。この外挿（ｅｘｔ ｒａｐｏｌａｔｌｏｎ）は必要である。その理由は、細胞からのフルオレセイン のもれおよびＦＤＡの自発的加水分解によってインキュベーション中にバックグ ラウンドが増加するからである。 あるいは米国特許出願第０７／２２２．１１５号に記載されたバックグラウンド 蛍光を補正する方法が使用できる。この特許出願は名称が“Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏ ｒ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｐｏ１ａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｔｈｏｃｈｒ ｏｍｉｃａｌｌｙ　５ｈｉｒｔｅｄ　Ｆｉｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”であり・その 開示内容は引用として本明細書に取り込む。簡便に述べると、この方法は、複数 の波長において水平および垂直に偏光された蛍光発光を測定し、それから細胞内 蛍光発光を計算することにより各サンプルをＰ遇する必要性を排除する。 上述したプロトコルに従って実行したＳＣＭテストを標準的ＳＣＭテストと称す る。そこでは、１ｍ１当り６×１０６個の細胞を有するリン球懸濁液を１．ｏｍ ｆ！、ミトゲンまたは抗原を０．１ｍＪ！、そしてフルオロジェニックエージェ ント先駆体としてＦＤＡを用い、４７０ｎｍの励起波長と５１０ｎ−の発光波長 を使用する。 ｂ、ＳＣＭテストの解釈 ＳＣＭテストの結果はチャレンジされたリンパ球（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ　Ｉｙ ｗｐｈｏｃｙｔｅｓ）の細胞内フルオレセイン蛍光偏光の値である。この値はＰ 値として指定される測定されたＰ値が大きい程、偏光の度合が大きい。本発明の ３０Ｍ因子などのチャレンジ剤（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）を用い てチャレンジ（ｃｈａｔ　Ｉｅｎｇｅ）されたリンパ球のアリコートのＰ値を表 わすのに“Ｐ５″を用いる。同様に、チャレンジング剤を用いてチャレンジされ ていないリンパ球のアリコートのＰ値を表わすのに“ＰＣ“を用いる。Ｐ、をＰ 。と比較した際、ＰＣに対するＰＳの比が約０．９未満ならば、チャレンジされ たリンパ球（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ　Ｉｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）のドナーの身体 には悪性腫瘍が存在することが示される。 ＳＣＭテストにおいてチャレンジ剤として３０Ｍ因子を使用する好ましい方法は 、ＰＳを、植物凝集素（ＰＨＡ）などのミトゲンと接触されてリンパ球のアリコ ートの蛍光偏光値、ＰＭと比較して、ＳＣＭ反応比ＲＲ５ＣＭを決定することか ら成る。ここでＲＲＳＣＭ　＝　Ｐ　Ｓ÷ＰＭである。２２５０Ｍが約０．９未 満の場合、悪性腫瘍の存在が示される。 悪性腫瘍のないドナーからのリンパ球はＰＨＡに反応するががん関連ＳＣＭ因子 には反応せず、一方、悪性腫瘍のあるドナーからのリンパ球はＰＨＡに反応せず にがん関連ＳＣＭ因子に反応するため、ＲＲ５ＣＭの使用が好ましい。このよう な反応パターンが２重に変化するので、悪性腫瘍の有無の判定がより鋭敏になる 。 上述のごとく諭したように、抗体産生動物を３０Ｍ因子それ自身またはキーホー ルリナペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のような担体タンパク質に結合した３０Ｍ 因子のいずれかで免疫することにより、３０Ｍ因子に対して抗体を産生ずること ができる。これらの抗体は、体液中のＳＣＭ因子アッセイ、蛍光顕微鏡使用法ま たは流動血球計算法によるバイオプシーまたは吸引液中の癌細胞の検出を含む多 くの免疫化学反応、および下記の”　Ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＳＣＭ　Ｆａｃｔ ｏｒｉｎ　ｔｈｅ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｒＣａｎｃｅｒ　’に論じられた 他の目的に使用できる。 １．３０Ｍ因子のイムノアッセイ いったん３０Ｍ因子に対する抗体を単クローン性または多クローン性のいずれか に産生ずると、それらは、競合または競合サンドイッチイムノアッセイ、比色分 析アッセイ（例えば、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ、ＰＧＬ　ＩＡ　（補欠分子族標識イムノ アッセイ）、５ＬＩＰＩＡ（基質標識蛍光イムノアッセイ）、等）：放射性同位 元素標識免疫測定（ＲＩ　Ａ）のような放射線ａ定方性、直接および触媒ケミル ミネセンスの両者を含むルミネセンスを用いたアッセイを含むどのような種類の イムノアッセイにも用いられる。直接ケミルミネセンス方法は、アクリジニウム 絖導体のような発光原子団を用いることができる：触媒ケミルミネセンス方法は 、ホースラディッシュベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または他の酵素的または金属 を含む非酵素的触媒のようないずれかの酵素を用いることができる。多くのイム ノアッセイが従来技術において知られており、Ｍ、０ｅｌｌｅｒ４ｃｈ　、の“ ＥｎｚｙＩＩｅ−１ｍＩＩｕｎｏａｓｓａｙ：　Ａ　Ｒｅｖｉｅｗ、　−Ｊ、Ｃ ｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２２゜８９５−９０４（１９ ８４）　、およびＣ，ＢＩａｋｅ　＆　Ｂ、Ｊ、Ｇｏｕｌｄの’Ｕｓｅ　ｏｆＥ ｎｚｙｍｅｓ　ｉｎ　Ｉａｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　’＾ ｎａ　Ｉ　ｙｓ　ｔ　ユサ、５３３−５４７（１９８４）、に要約されており、 両者をここに文献として含む。抗原抗体複合体の凝集によるイムノアッセイを除 いたこれら全ての種類のイムノアッセイにとって、ＦａｂまたはＦａｂ’断片の ような抗体の単砺断片は完全二価抗体分子へのいくつかの用途において置換でき る。 酵素結合イムノアッセイの特に有用な種類の１つは、酵素結合免疫吸着検定法（ ＥＬＩＳＡ　アッセイ）である。 ３０Ｍ因子の検出のためのＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイを実施例２１に記載する。手 順に言えば、このアッセイは：（＋、）３０Ｍ因子の固相、典型的にプラスチッ クへの取付け＝（２）検定するサンプルの添加：（３）固相の家兎抗ＳＣＭ因子 抗体によるインキュベーション；（４）酵素アルカリ性ホスファターゼで標識付 けたヒツジ抗家兎ＩｇＧ抗体によるインキュベーション、（５）アルカリ性ホス ファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸塩の添加；および（６）　４ ０５　ｎｍでの吸収の測定を必要とする。この方法において、固相に付着した抗 体に結合したアルカリ性ホスファターゼのみが色を呈する；サンプル中に３０Ｍ 因子の量が多ければ多いほど、４０５ｎｍで測定した吸収が低くなる。ＥＬＩＳ Ａテストは、血漿の限外濾過におけるＳＣＭ因子の水準（実施例２３）、血清無 上澄癌細胞培地からの精製産生におけるＳＣＭ因子の存在（実施例２５）、およ び培養ヒト癌細胞中のＳＣＭ因子の存在（実施例２６）を検出するのに用いられ る。 α−１−ＰＩを有する抗ＳＣＭ抗体の潜在する交差反応性とそれらの間の配列相 同性のために、これらの免疫診断テストは好ましくは、α−１−ＰＩ分子が除去 された体液について行なわれる。このα−１−ＰＩ分子は、限定するものではな いが、クロマトグラフィーのカラムを通過することによる、またはα−１−ＰＩ が安定な複合体をともに形成するトリプシンのような固定化プロテアーゼにα− １−ＰＩを結合することによる、ｔ、ｏｏｏがら３．０００ダルトンの公称分子 量でカットするフィルターを用いた限外濾過を含む多くの技術により除去できる 。 蛍光マーカーで標識した抗ＳＣＭ抗体は、標準蛍光顕微鏡使用法または流動血球 計算法によるバイオプシーまたは吸引液中の癌細胞産生ＳＣＭの検出に用いられ る。 Ｃ，ＳＣＭ特定受容体の検出 ＳＣＭ因子のＳＣＭ反応リンパ球への影響は、ＳＣＭ因子がリンパ球の細胞膜中 に位置するＳＣＭ因子特定受容体に特定に結合することにより媒介されると思わ れている。 これらの受容体は、放射性機＝ＳＣＭ因子、蛍光標識８０Ｍ因子、酵素標識ＳＣ Ｍ因子またはケミルミネセンス標識で標識されたＳＣＭ因子のような標識ＳＣＭ 分子の使用により検出できる。あるいは、ＳＣＭ因子はビオチンにｆＡ６できる 。アビジンまたはストレプトアビジンは次いで、酵素、蛍光標識、または放射性 標識により標識できる。標識アビジンまたはストレプタビジンは、標識のために ビオチン結合ＳＣＭ因子を結合せしめるのに用いられる。 単離および精製ＳＣＭ因子の両者のアミノ酸配列、ならびに合成ＳＣＭ因子の既 知のアミノ酸配列の決定は、これらのアミノ酸配列に対応したＤＮＡオリゴヌク レオチド配列の構成を認める。これらのオリゴヌクレオチド配列の構成は、それ らの所望の使用が生体外表現系に表現されること、またはヒトゲノムのＤＮＡ中 に存在するＳＣＭ因子の自然遺伝子を検出することであるかによりいくぶん変化 する。しかしながら、いずれの場合においても、オリゴヌクレオチドは、Ｋ、Ｉ ｔａｋｕｒａ　、　Ｊ、Ｊ、Ｒｏｓｓｉ　、　＆Ｉ？、Ｂ、Ｗａｌｌａｃｅの’ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｊｄｅｓ　、　”Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、　５３ ．３２３（１９８４）に記載されているようなホスフォトリエステル法またはホ スファイトトリエステル法のようなよく知られた技術にしたがって合成される。 配列の最も有効な使用が生体外系における表現による遺伝子的に設計したＳＣＭ 因子の産生のためのものである場合、ある特定のアミノ酸配列に対応した１つの ＤＮＡ配列を合成することのみが必要である。しかしながら、遺伝子コードは退 化したものであり、異なるコドンの同一のアミノ酸への使用は宿主細胞中の配列 の翻訳の比率に影響する。 使用される表現系がそれから誘導される特定の宿主有機体中の翻訳について好ま しいコドンにしたがってそのための選択のあるそれらのアミノ酸のためのコドン を選択することが望ましい。コドンの使用法は細菌と新正核細胞との間のように 変化するので、ＤＮＡ配列が表現されるべき宿主に従って正確なりＮＡの配列を 変化させることが望ましい。 細菌とヒトを含むは乳類との間のコドン使用法における差異は従来技術において よく知られている。 ｂ、検出の配列 合成したＤＮＡ配列がＤＮＡ中のＳＣＭ因子のための自然遺伝子を検出するのに 用いられる場合には、ヌクレオチド配列の選択について異なる考慮がなされる。 正確な雑種形成を得るために、所望のアミノ酸配列に対応する全ての可能な配列 が存在するように多数の配列を用いることかしばしば望ましい。１つの可能な実 施例として、アミノ酸１４と２２との間の領域は、Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ −Ｔ−ＫまたはＦ−Ｌ−Ｍ−１−Ｅ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にのいずれかである精製５（ ｌｉ因子においてと同様に合成された場合においてもほとんど不変である。しか しながら、全ての可能なコドンが用いられた場合には、これらのアミノ酸配列に 対応することのできる２、３０４の２７−ヌクレオチド長さ配列となった。異な る配列のこの数字は、あまりに大きすぎて雑種形成反応において能率的に操作で きない。そのため、可能な妥協はＲ，Ｌａｔｈｅの’５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｏ１ ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ＋ｄｅ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｄｅｄｕｃｅｄ　ｒｒｏｔｘ　Ａ ａｉｎｏ　Ａｃ１ｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ　：　Ｔｈｅｏｒｅｔｊｃａ ｌ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｃｏｎ５ｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ、　”　Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１８３゜１（１９８５）にしたがって、少なくともヒトＤ ＮＡ中に用いられそうにないコドンを除去することである。例えば、用いられそ うにない３つのコドンをロイシンとして除去し、用いられそうにない１つのコド ンをアイソロイシンとして除去し、そして用いられそうにない２つのコドンをス レオニンとして除去した場合、可能なものは合計で３８４の分離２７−ヌクレオ チド長さ配列となる。分離配列のこの数字は、例えば、ｉｎ　Ｒ，Ｂ、警ａｌ　 １ａｃｅ、Ｍｊ、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｔ、Ｈｉｒｏｓｅ、Ｔ、Ｍｉｙａｋｅ、Ｅ、 Ｈ，Ｋａｖａｓｈｉｒａａ、ａｎｄ　Ｋ、Ｉｔａｋｕｒａ、”Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　 ｏｆ　ＳｙｎｔｈｅｔｊｃＯｌｉｇｏｕｎｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ｈｙｂｒ ｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｌ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｘｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　 ｔｏ　ｌ？ａｂｂｉｔ　β−Ｇｌｏｂｉｎ　ＤＮＡ、　”　Ｎｕｃｌ、Ａｃｊｄ ｓ　Ｒｅｓ、　９　、８７９−８９４（１９８１）において用いられている。 ２、ＤＮＡ配列のベクターへの包含 形質移入または転換のためのベクターは、ＳＣＭ因子およびプロモーターとコー ド化配列に有効に結合したエンハンサーのような対照配列にコード化するＤＮＡ 配列を含む。 ベクターはまた、適した複製部位を含む。対照配列および複製部位の両者は意図 された宿主細胞株中で活性である。 その宿主細胞株が細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉである場合、ｐＢＲ３ ２２のようなプラスミドは適したベクターである。宿主細胞株がヒト細胞のよう な培養されたは乳類細胞である場合には、ベクターは典型的にＳＶ４０のような ウィルスである。適した宿主−ベクター系は従来技術においてよく知られており 、Ｂ、Ｐｅｒｂａｌの“＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−（２ｄ　ｅｄ、、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏ ｎｓ、１９８８）ａｎｄ　”Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　”（Ｓ、Ｌ、Ｂｅｒｇｅｒ　ａｎｄ　Ａ、Ｒ， Ｋ１ｍ１ｅ１．ｅｄｓ、、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｖｏｌｕ ＩＩ！ｅ　１５２　ｏｆ’　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）に 記載されている。 結さつによる所望の配列のベクターへの包含、結さつベクターによる宿主細胞の 形質移入または転換、ベクターを含む宿主細胞の増殖および選択、およびＤＮＡ 配列によるＳＣＭ因子がコード化される表現の技術が従来技術においてよく知ら れており、ＰｅｒｂａｌまたはＢｅｒｇｅｒ　＆　Ｋｉａｏｎｅｔの前述文献に 記載されている。 ＩＶ、ＳＣＭ因子と癌との関係 Ａ、ＳＣＭ因子による生体中の癌細胞の保護ＳＣＭ因子分子は癌細胞により合成 されることか今日知られている。ＳＣＭ因子遺伝子は、化学的またはウィルス性 因子により被る遺伝子的損傷の結果となり得、または清浄な対照物が細胞中に存 在するオンコ遺伝子となり得る。 他の知られたα−１−ＰＩ変異体のように、ＳＣＭ因子遺伝子は、細胞部分を調 整する機構が腫瘍プロモーターにより活性化される場合に、腫瘍誘発剤により抑 制解除され表現される見込みがある。プロテアーゼとそのインヒビターは細胞複 製の調整、分割、熟成、および発酵工程において、密接に関係している。α−１ −ＰＩ分子の機能的に未成熟の軍部の産生を生しる遺伝子的欠陥は、開始されて 促進された癌細胞の不規則で制御されない増殖に帰することができた。我々の結 果により、ＳＣＭ因子分子は癌細胞を保護しいくつかの方法：癌細胞のＤＮＡ合 成の刺激（実施例２７）、癌細胞関連プロテアーゼの活性の保護（実施例２８） 、および宿主の免疫監視機構および他の抗腫瘍反応の回避によりその転移による 広がりを増長せしめることか示される。独特の保護効果の１つは、ＳＣＭ因子に よるリンパ球のナチュラルキラー（Ｎ　Ｋ）活性の抑圧である（実施例１３と３ １）。別の可能性のある保護効果は、ＳＣＭ因子配列に包含されたメチオニン残 基を通じて癌細胞に対するマクロファージにより放出される活性酸素含有種を排 除することである。 α−１−ＰＩおよびＳＣＭ因子の共通起源の別の徴候、並びにそれらの間の相同 性は、癌を有するものと有さないものの両者のドナー中に血漿の５０から１００ キロダルトン分子量分画で存在するタンパク質が、癌患者からのリンパ球のＳＣ Ｍ反応サブすピユレーション中のＳＣＭ因子に対するＳＣＭ反応を変更するまた は廃止することができるという我々の発見にある。このタンパク質はまた、これ らの細胞中のＰＨＡに対するＳＣＭ反応を修復できる。このＳＣＭ反応変更因子 は元来、「血漿因子２Ｊ　（ＰＦ２）として呼ばれた。癌患者からのＳＣＭ反応 リンパ球の、同種または自己ドナーからの血漿の５０から１００キロダルトン分 子量分画の存在化で２．５時間のインキュベーションは、続くリンパ球の洗浄に おいて、ＳＣＭ因子を含有する癌関連因子の受容体を除去し、再びＰＨＡに反応 するこれらのリンパ球の能力を修復する。すなわち、タンパク質は、癌を有する ドナーからの典型的なリンパ球の値（１未満）から癌を有さないドナーからの典 型的なリンパ球までの値（１以上）のＰＲ５ＣＭを可逆にする。ＰＦ２タンパク 質は予期せぬことに、α−１−ＰＩと同一である（実施例２９）。そのα−１− ＰＩタンパク質は、ＳＣＭ因子により処理された正常リンパ球のＳＣＭ反応を逆 転でき、また癌で病んでいるドナーからのリンパ球のＳＣＭ反応も逆転できる。 Ｂ、癌の検出および管理におけるＳＣＭ因子の使用状々の特許出願公報第０７／ １６７．００７号に詳細に記載したように、本発明のＳＣＭ因子は、癌の検出お よび管理の両方において多くの目的に用いられる。 １、癌の検出 ａ、誘発剤（ｃｈａｌｌｅｎｇｔｎｇ　ａｇｅｎｔ　）としてのＳＣＭ因子の使 用 ＳＣＭ因子またはその活性断片のどれでもが、癌検出のＳＣＭテストにおいて誘 発剤として用いられる。癌を有さないドナーからではなく、癌を有するドナーか らのリンノく球は、ＳＣＭＣステスト中関連因子と反応するように活性化される 。したがって、癌を有するドナーからのリンノく球のみが、ＳＣＭテストにおい て細胞内フルオレセイン蛍光分極値の減少とともにＳＣＭ因子に反応する。この 反応は、ＳＣＭ因子を産生ずる癌細胞が、腫瘍細胞の数または腫瘍のサイズが一 方で検知できない場合でも、リンパ球のボディ中に存在するという早期の注意を 構成する。 ｂ、ｓｃＭ因子に独特な受容体の検出 標識されるＳＣＭ因子分子または画分はリンパ球のＳＣＭ反応画分上でＳＣＭ分 子の受容体の存在を検出できる。 その標識は、限定するものではないが、放射性標識、発酵標識、ケミルミネセン ト標識、または酵素標識で有り得る。 ３つの受容体の存在はそれ自身で癌の提示である。それらは、流動血球計算法、 蛍光顕微鏡法、酵素結合検定法、またはリンパ球受容体の他の検定法を用いて検 出てきる。ＳＣＭ分子が放射性同位体で標識されている場合には、オートラジオ グラフィー、シンチグラフィー、および放射性核種の他の検出法が、ＳＣＭ因子 の受容体の存在を検出するのに用いられる。 ＳＣＭ反応リンパ球が単離され、洗浄され、飽和量の漂識ＳＣＭ因子でインキュ ベートした場合、リンパ球に対する５０Ｍ因子の結合の程度は、リンパ球当たり に存在するＳＣＭ因子受容体の数を示す。このテストは、５０Ｍ因子に対するＳ ＣＭ反応リンパ球の感作を示すのに用いられ、癌の存在を検出する３０Ｍテスト の選択肢として用いられる。それはまた、３０Ｍテストの調査結果を確証するの にも用いられる。 Ｃ５癌バイオプシー中のＳＣＭ因子分子の検出流動血球計算法、蛍光顕微鏡法、 または酵素結合検定法により、ＳＣＭ因子分子は、適切な標識抗ＳＣＭ因子抗体 を用いて癌バイオプシー中に検出される。ＳＣＭ因子分子は癌細胞による量で産 生されるので、バイオプシー中のそれらの存在は、そのバイオプシーが採取され る組織の癌の性質の強い確証である。 ６５体液中のＳＣＭ因子分子の検出 上述したように、ＳＣＭ因子分子は癌細胞により血漿まは尿のような体液中に排 出される。それゆえ、対益虫のＳＣＭの存在は、一般的な癌特定マーカーとして 用いられる。 ＳＣＭ因子分子の存在は、ｒ　Ｉａｖｕｎｏａｓｓａｙｓ　ｒｏｒ　ＳＣＭ　Ｆ ａｃｔ。 「」の題名で上述したイムノアッセイ中の５０Ｍ因子に対する抗体を用いて癌患 者血漿の限外濾過において検出される。十分な特異性の多クローン性または単ク ローン性抗体のいずれかがイムノアッセイにおいて用いられる。５０Ｍ因子の断 片に対する抗体は、多くの用途における完全８０Ｍ分子に対する抗体と置換でき る。 癌細胞にによるＳＣＭ因子分子の産生はタンパク質合成のインヒビターにより減 少せしめられるので、体液中の５０Ｍ因子の濃度水準は処理に続くどの残留癌細 胞の代謝性活性を示すのに用いられ、そして癌の再発する増殖または潜在メタス ターゼ（＋５ｅｔａｓｔａｓｅｓ）の存在を検出するのに用いられる。ＳＣＭ分 子の存在は加えて、患者の体に存在する癌細胞が転移しそうであるという警告と して役立つ。 ２、癌の処理 上述のごとく詳細したように、５０Ｍ因子は正常な防御機構に対して癌細胞を保 護し、その増殖と繁殖を促進させる。５０Ｍ因子がこれを達成する機構は、限定 するものではないが、ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞の作用から癌細胞の保護 を含む（実施例１３および３１）。５０Ｍ因子のこの効果は、選択的に５０Ｍ因 子の生体内活性を減少させる測定が癌の管理において有用で有り得るという考え に至る。 そのような方法の最初の段階として、既知のまたは容疑のある癌患者からのリン パ球は、一度誘発剤としての本発明の５０Ｍ因子を用いる３０Ｍテストで陽性反 応を与えるように示される。体液の試料は患者から採取でき、１，０００ダルト ンの公称分子量でカットする限外濾過器を通過させ、その限外濾過器を通過した 画分を集積し、３０Ｍテストにおける同一の患者からのリンパ球を誘発する自己 症因子として使用してその画分中の５０Ｍ因子の存在を確証する。 特に他の指標が癌の存在を示す場合、この確証テストは必ずしも行なう必要はな い。 ８１体液中の５０Ｍ因子の不活性化 一度癌患者の体液中の５０Ｍ因子の存在が示されたり、または推測されたら、体 液は、その産生を阻害し、それを選択的に除去し、または選択的に不活性にする ことにより、因子の生体内の影響において減少させるいくつかの方法のうちの１ つにより処理でき、次いで、体液は患者に戻され、それにより悪性に対する患者 の抵抗を高める。本発明の５０Ｍ因子は、患者を苦しめる癌の種類にかかわらず 、３０Ｍテストで反応を生じるので、５０Ｍ因子の生体内影響を減少させること が、元来診断される癌の特定の種類たけてなく、続いて患者の中で発達する悪性 のどのほかの種類に対しても患者の抵抗を高める。このことは、免疫制御効果を 有する薬品で患者を扱う場合、またはＡＩＤＳのような条件によりすてに損傷し た免疫系を有する患者を扱う場合に重大となる。 （１）遜折による不活性化 体液が末梢血である場合、５０Ｍ因子の生体内活性を減少させる方法の１つは、 その実際の分子量はいくぶん大きいけれども、その因子は１．０００ダルトンま たはそれ未満の公称分子量をカットする限外濾過器を通過するので、末梢血の透 析によりそれを物理的に除去し、１，０００ダルトンまたはそれ未満の見掛は分 子量のペプチドを除去することである。 体液中の５０Ｍ因子の生体内活性を減少せしめる他の方法は、その因子に特異的 な抗体によりその活性を中和せしめること、または不活性化することである。そ の抗体は上述したように産生され、多クローン性または単クローン性で有り得る 。あるいは、Ｆａｂ断片またはＦａｂ′断片のような一価抗体断片が用いられる 。大きなＳＣＭ因子抗体複合体の形成が望ましくないと考えられる場合、ある用 途において一価断片の使用か、無傷抗体の使用よりも好ましい。末梢血中のその ような大きな抗原抗体複合体の存在は、血清病および他のアレルギー反応を生し させるかもしれない。 抗体の使用のかわりとして、そのセンス鎖か５０Ｍ因子にコード化するＤＮＡの アンチセンス鎖によりコード化されるアンチセンスペプチドもまた、５０Ｍ因子 の活性を阻害するのに用いられる。　Ｙ、５ｈａｉ、Ｔ、に、Ｂｒｕｎｃｋ、　 ＆　１．Ｍ、Ｃｈａｓｉ　ｋｅｎの＋Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒ ｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｅｎｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　：　５ｅｑｕｅ ｎｃｅ　Ｓｉｍｐｌｉｒｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｒ Ｆｏｒｅｅｓ　Ｌｌｎｄｅｒｌｙｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　、 　”　ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｓｔｒｙ　２８．８８０４−８８１１（１’１９）お よびＧ、Ｆａｓｓｉｎａ　、　Ｍ、Ｚａｍａｔ　、Ｍ、Ｂｒｉｇｈａｉ−Ｂｕｒ ｋｅ　、　＆１．Ｍ、ｃｈａｓｊｋｅｎの”Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｐｒｏｐ ｅｒｔｉｅｓ　ｏｒＡｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｔｏ　Ａｅｇ　８ −ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ／Ｂｏｖｉｎｅ　Ｎｅｕｒそのセンス鎖が生理学的に 活性なペプチドにコード化するＤＮＡ分子のアンチセンス鎖によりコード化され るペプチドはしばしば、活性ペプチドと明確に相互作用する。その「センス鎖」 は、それに対応するメ・ソセンジャ−ＲＮＡと配列において一致するＤＮＡの鎖 であり（ＤＮＡのＴをｍＲＮＡのＵで置換することを除く）、一方「アンチセン ス鎖」はｍ　ＲＮ　Ａの配列を補足する。例えば、センス鎖が配列ＡＴＧを有す る場合、アンチセンス鎖は配列ＣＡＴを有する。 ３０Ｍ因子の阻害に適応されるように、アンチセンスペプチドは、配列Ｆ−Ｌ− Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−にと実質的に等しい両親媒性プロフィールををする９ アミノ酸残基のコア配列を含む少な（とも９アミノ酸残基の癌認識因子にそのセ ンス鎖がコード化する、ＤＮＡ配列のアンチセンス鎖によりコード化されるアミ ノ酸配列を白−する。典型的に、癌認識因子は、合成ＳＣＭ因子分子の残基１４ −２２　ｉ二対窓するアミノ酸配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ、また は完全合成ＳＣＭ因子に対応する配列Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に −Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ −Ｋを有する。 ｂ、抗ＳＣＭ因子抗体の抗癌物質による標識材ＳＣＭ因子は、活性に代謝する癌 細胞により産生されるので（実施例２５および２６）　、３０Ｍ因子に特異的な 抗体か、抗ＳＣＭ因子抗体を抗癌物質により標識すること（こより、抗癌物質を そのような細胞に目標づけるのに用ｔ）られる。このことは抗癌物質を癌の部位 に向け、それ（こよりその癌の部位での抗癌物質の効果的な濃度を上昇せし、め る。 この方法は、抗癌物質が多量に与えられたときに副作用を生しるものである場合 に、特に有利である。このような漂識は、ｐ、Ｔｉｊｓｓｅｎの’Ｐｒａｃｔｉ ｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｒＥｎｚｙｍｅ　Ｉｓｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、 　’　（Ｅｌｓｅｖｌｅｒ、Ａｍｓｔｃｒｄａｍ、］、９８５）、　ｐａｇｅｓ 　２２１−２７８に記載されているような、抗体に酵素、発光標識、または放射 性標識を結合せしめるのに用いられた標準結合方法により達成できる。 Ｃ０非相同性プロテアーゼインヒビターの使用ＳＣＭ因子により高められた癌細 胞の増殖および侵害的な広がりの効果的な制御は、３０Ｍ因子とは非相同性であ るが同じ小さなサイズで拡散が容易である自然のインヒビターを用いて、３０Ｍ 因子により自然インヒビターに対して保護されるプロテアーゼを阻害することに より達成される。好ましくは、そのインヒビターは、実質的に３０Ｍ因子により 阻害されるどの他のプロテアーゼとも非相同性である。その実施例は、Ｃｕｃｕ ｒｂｉｔａ　ｍａｘｉｍａトリプシンインヒビター、２９−残基ペプチドの合成 変異体を含む。このような自然または合成プロテアーゼインヒビターは３０Ｍ因 子の保護効果を克服する能力により選択されるべきである。そのような潜在的な プロテアーゼインヒビターのスクリーニングは、それゆえ完全ＳＣＭ因子または α−１−ＰＩ、アミノ末端７残基の阻害において活性な分子部分のいずれかの３ ０Ｍ因子により保護されるプロテアーゼ上で行なわれるべきである。α−１−Ｐ Ｉと非相同性で、３０Ｍ因子の存在下でプロテアーゼを阻害することのできるプ ロテアーゼインヒビターの使用は、蒸処理にも用いられる。透析による血漿から の３０Ｍ因子の同時の除去は、患者の防御機構へのその影響を減少するのに役立 つかもしれない。 Ｓ　ＣＭ因子は癌細胞による活性タン／マク譬き成の結果であるので、３０Ｍ因 子の新たな合成は、シクロヘキサイミドまたはアスコルビン酸のような腫局細胞 によるＳＣＭの産生において減少するタンパク質合成の適切で臨床的に受け入れ られる非毒性インヒビターによる処理により減少できる。以前、アスコルビン酸 が、ミトコンドリアの癌細胞中で遊んでいる、正統な構造への転移、を選択的に ８発し、それによりその代謝活性を減少させることを示した。実施例３０は、培 養中のＭ　ＣＦ　７ヒト乳癌細胞中の５ｃｓｉ因子合成へのアスコルビン酸の効 果を示ス。１０−３Ｍ（７）アスコルビン酸塩を添加することにより、抗ＳＣＭ 抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定したように、これら細胞中のＳ　ＣＭ因子 の合成が著しく減少した。アスコルビン酸または他のタンパク質合成インヒビタ ーの使用は、それゆえＳＣＭ因子合成の癌特異的で非毒性のインヒビターとして 推奨される。それは、それ自身または３０Ｍ因子を除去または不活性化する他の 方法と組み合わせて用いられる。 ｅ、３０Ｍ因子のＮＫ抑制作用の逆転 ＳＣＭ因子のＮＫ抑制活性は自然防御から癌細胞を保護すると思われるので、そ れらの防御の効果性を修復する１つの方法は、３０Ｍ因子のＮＫ抑制効果を逆転 させることによるものである。そのような方法は、少なくとも１つの体液が３０ Ｍ因子を含む患者に、３０Ｍ因子のＮＫ抑制作用を実質的に逆転させ、リンパ球 によるに５６２細胞の生体外ジ−シス中で測定される患者のリンパ球の正常ＮＫ 活性を実質的に修復するのに十分な量でＳＣＭ因子阻害物質を施すことからなる 。そのＳＣＭ因子阻害物質は、３０Ｍ因子に対する抗体、３０Ｍ因子に対する抗 体の一価の抗原結合画分、またはそのアミノ酸配列が、センス鎖がＮＫ抑制ペプ チド配列をコード化するＤＮＡ配列のアンチセンス鎖によりコード化されるもの であるアンチセンスペプチドＳＣＭ因子は癌細胞により産生され、それらに関連 して発見されるので、抗ＳＣＭ因子抗体はまた、抗体を蛍光染料または放射性同 位体のような画像化物質で標識付けることにより癌細胞を映しだすのに用いられ る。そのように標識された抗体は、蛍光顕微鏡またはラジオオートグラフィーに よりバイオプシー中の癌細胞を検出するのに用いられる。蛍光標識抗体はまた、 流動血球計算法により癌細胞のオートメ化検出に用いられる。 ４、免疫系活性を変調する５０Ｍ因子の使用ＳＣＭ因子はリンパ球のＮＫ活性を 阻害することができるので（実施例１３および３１参照）、その５０Ｍ因子は、 免疫系活性を変調し、抗癌薬品の効果性を評価するのに用いられる。実施例３１ は、５０Ｍ因子のＮＫ抑制活性が完全な合成ＳＣＭ因子分子（２９アミノ酸）お よび断片Ｆ２（２９の合成ＳＣＭ因子）中のみに存在することを示す。断片Ｆ２ から誘導されたが１つ以上の保存的アミノ酸置換を包含するペプチドは、ＮＫ抑 制活性を有することも予期される。 ＮＫ抑制活性を有するそのようなペプチドは、細胞培養中に悪性細胞の増殖を阻 害することのできる抗癌剤の効果性を評価する方法に用いられる。細胞培養は、 ＮＫ活性を示すリンパ球と悪性細胞の両者を含む。その方法は以下の工程を含む 、（１）細胞培地中のリンパ球のＮＫ活性を実質的に抑制するのに十分な量の、 実質的に精製されたＮＫ抑制ペプチドを有する細胞培養をインキュベーションし ：（２）悪性細胞の増殖を阻害するのに十分な量で抗癌剤を細胞培養に添加し： （３）実質的にリンパ球のＮＫ活性を含まない悪性細胞の増殖の阻害を測定する ことにより悪性細胞への抗癌剤の効果を決定する。 このようなＮＫ活性ペプチドは、リンパ球のＮＫ活性を抑制法に用いることもで きる。その方法は、ＮＫ活性の標準テストにより測定したリンパ球によりリンパ 球ＮＫ活性を実施的に抑制するのに十分な量の、実質的に精製されたＮＫ抑制Ｎ Ｋ抑制ペプチドをリンパ球に施すことよりなる。 ＮＫ活性を抑制するこの方法は、免疫系活性を変調するのが望ましい場合に有用 である。そのような変調が望ましい臨床実施例は、組織移植を行ったばかりでそ の移植体を拒絶する恐れのある患者への輸血である。そのような血液のリンパ球 をＮＫ抑制ペプチドで処理し、そのような移植体拒絶の危険を減少することがで きる。 同様に、実質的に精製ＳＣＭ因子またはＮＫ抑制ペプチドは免疫抑制剤として用 いられる。使用方法は、同種移植片の生き残りを高めることのできる免疫抑制の 程度を生じるのに十分な量で免疫抑制画分を単体または薬学で容認できる担体と 結合させて施すことを含む。免疫抑制画分は、実質的に精製されて自然に生じる ５０Ｍ因子、２９アミノ酸合成ＳＣＭ因子、または合成ＳＣＭ因子の少なくとも ８−２９の残基を含むかあるいは保守アミノ酸置換が生じることによる配列から 誘導されたＮＫ抑制ペプチドである。

【実施例】

以下の実施例は、（１）癌患者の体液からの実質的に精製された５０Ｍ因子の単 離、精製、特徴付けおよび活性、および（２）合成ＳＣＭ因子および合成ＳＣＭ 因子の部分的な配列を含むペプチドの特徴付けおよび活性を説明する。これらの 実施例は説明のみを目的とするものであり、本発明を限定するように解釈される ものではない。 （実施例１） 血漿からの一般的な癌関連ＳＣＭ因子の最初の精製乳、肺、結腸、卵巣、子宮頚 、子宮、喉頭、または皮膚（基底細胞癌および悪性黒色腫）の癌のような活性癌 を有するとして陽性に診断された患者からの血液試料を、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ”ゞ１管のようなヘパリン化バイアル管に採取した。血液試料の２０ミリリツト ルを約４０分間約１．２００ｘｑで遠心分離した。沈殿した血液細胞上の血漿を 採取し、１０００ダルトン分子量でカットするＡｍｉｃｏｎＴＭＵ　Ｍ　２また はＹＭ２フィルターのような多孔性膜フィルターを圧力で通過させることにより 濾過した。これらの限外濾過物を凍結乾燥し、またはさらに精製するまで４℃で 貯蔵した。 （実施例２） 実施例１からの最初に精製した５０Ｍ因子のＳＣＭ活性実施例１の各試料からの 限外濾過物のアリコートを同一のドナーから得られた５Ｃｋｉ反応リンパ球およ び上述したＳＣＭテスト方法によりそのＳＣＭ反応を検査したリンパ＝９ｑ 球とともにインキュベーションした。全ての場合において、限外濾過物は、リン パ球が癌細胞それ自身または癌細胞の抽出物と接触した場合に存するような、Ｐ 値での減少に特徴的に反応するＳＣＭ反応リンパ球を生じた（表１）。 表　１ 実施例１の限外濾過のＳＣＭ活性 リンパ球ドナー　ＳＣＭ因子ドナー　ＳＣＭ応答：対照の透析　の透析　との％ としてのＰ値 悪性黒色腫　悪性黒色腫　７５゜７ 悪性点色腫　基底細胞癌−皮膚　８２．０喉頭癌　喉頭癌　６２．９ 乳癌　乳癌　７６．０ 表１のデータは、粗い限外濾過において存在する場合でさえも、５０Ｍ因子は、 リンパ球が癌細胞の粗い抽出物または癌細胞それ自身により刺激されたときに観 察されるＰ値の減少と少な（とも等しい癌を患うドナーからのＳＣＭ反応リンパ 球のＰ値の減少を生じることを示した。限外濾過による刺激のＰ値の減少は、少 なくとも１０９ｏてあった。 それは陽性ＳＣＭ反応の特性である。しかしながら、５０Ｍ因子は、公称５００ ダルトン分子量をカットするＡｍｉｃｉｎｒＭＵＭＯ５フィルターを通過しなか った。これらのデータはその因子が小さなサイズであることを確証するか、一方 その活性は単体のアミノ酸のような小さな分子より大きいことを示す。 （実施例３） 実施例１のＳＣＭ因子のさらなる精製 実施例１の試料からの凍結乾燥した粉末を、注入のために２ｍｌの無菌で防腐剤 を含まない水に溶解した。この段階で試料の３０Ｍ活性が確かめられ、同じ種類 と部位の癌を有するドナーからの活性試料を貯蔵した。貯蔵した試料を、０から ７００ダルトンの分画範囲を有する５ｅｐｈａｄｅｘ”２Ｇ−１０の０．９Ｘ１ ８ｃｍのカラム上で脱塩した。カラムクロマトグラフの検定ごとの試料の量はカ ラム容積の２５％を超えなかった。溶出は、８から９ｃｍ／時間の線形溶出速度 で二重蒸留水により行った。脱塩は室温（２１℃−２３℃）で行った。全クロマ トグラフィー床容積の０．３と０．５倍の間で溶出した１ｍｌの画分を集積し、 その両分の光学濃度を測定した。３０Ｍ活性は最初の溶出ピークに含まれていた 。 そのピークの３０Ｍ活性の存在をＳＣＭテストにより確証した。乳癌を有する患 者の血漿からもともと誘導した限外濾過物から調製した最初の溶出ピークのアリ コートは、乳癌を有する患者からのリンパ球のＰ値をＳＣＭテストの対照値の８ ６．３％まで減少させ、３０Ｍ活性の存在を示した。 これらの両分を集積し、凍結乾燥させた。 溶出物をさらに、１５００から３０，０００ダルトンの分画範囲を有するＳｅｐ ｈａｄｅｘＴＭＧ　−５０ゲル濾過カラム上の画分により精製した。凍結乾燥し 脱塩した試料を５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中に溶解し、３ｃｍ／時間の線形溶出 速度で０．９　Ｘ１８ｃｍの５ｅｐｈａｄｅｘ”Ｇ　−５０のカラム上に、カラ ム容積の５％未満を装填した。溶出は室温で行われ、全クロマトグラフィー床容 積の０．４と０．６倍の間で溶出した１ｍｌの画分を集積した。これらの試料を ３０Ｍ活性についてテストした。 これらの結果を下記の実施例４に示す。ＳＣＭテストの画分のテストの後に１ミ リリツトルの光学濃度により測定した最初の溶出ピーク内に、ＳＣＭ活性画分は 含まれた。 一度画分をＳ　ＣＭ活性についてテストしたら、同し癌の種類からの活性画分を 貯蔵し、凍結乾燥した。 さらに精製するために、凍結乾燥した試料を１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ，中に溶解 し、ワンドマンＤＥ−５２微粒剤ＤＥＡＥ−セルロースの０．８　Ｘ２Ｂｃｍの カラム上に、カラム容積の４％未満を装填した。そのカラムをｌｏｍ　ｌの水性 ＮＨ４ＨＣＯ３で洗浄し、１分ごとに０１０８％ずつ１０ｍＭからＩＭのＮＨ４ ＨＣＯ３まで増大させた。１ミリリツトルの画分を集積し、２２０ｎｍでの光学 吸収を各両分について測定した。光学吸収に基づいて、全クロマトグラフィー床 容積の４，５と４．７倍の間で溶出した１ｍｌの活性画分を集積し、テストとさ らなる精製のために凍結乾燥した。活性画分のＳＣＭテストからの結果を実施例 ４に示す。 （実施例４） 実施例３のさらなる精製産物のＳＣＭ活性表２は、ＳＣＭテストにおいて、もと もとは様々な種類の癌を有するドナーからの実施例３からの５ｅｐｈａｄｅｘ　 Ｇ−５０画分のアリコートが、様々な種類の癌を有するトナーからのリンパ球を 抗原投与したときの結果を示す。潜在的なＳＣＭ反応リンパ球が以前に特徴付け た癌関連抗原に反応するように、Ｇ−５０画分に反応する同様な特性を有するこ とか分かる。この脱塩され部分的に精製されたタンノ々り様物質は、表１に示し た結果の粗い限外濾過物と比較して一般的に増大したＳＣＭ反応を示す。この増 大したＳＣＭ反応は、減少したＰ値により示される。 表　２ 実施例３　ノ５ＥＰＡＤＥＸ　Ｇ−５０画分のＳＣＭ活性リンパ球ドナー　ＳＣ Ｍ因子ドナー　ＳＣＭ応答：対照の透析　の透析　との％とじてのＰ値 肺癌　乳癌　７３，０ 肺癌　類題　６９．６ 肺癌　気管支癌　７３６ 喉頭癌　気管支癌　７７．６ 乳癌　気管支癌　８０．２ 結腸癌　乳癌　６３．５ 喉頭癌　乳癌　６３．０ 悪性黒色腫　悪性黒色腫　７４．９ 健康なドナー　悪性黒色腫　９９，３ 健康なドナー　結腸癌　９８．０ 結腸炎　結腸癌　９８．９ 表３は、ＳＣＭテストにおいて、ＤＥＡＥ−セルロース段の通過による精製の後 に様々な悪性度のドナーから得たＳＣＭ因子が、様々な悪性度のドナーから、ま たは悪性ではないドナーからのいずれから単離されたリンパ球に抗原投与するの に用いられたことを示す。予期されたように、癌患者からのリンパ球はＰ値が著 しく減少したＤＥＡＥ−セルロースカラムから精製されたＳＣＭ因子に反応し、 −万態性の病気のないドナーからのリンパ球では減少したＰ値を示さなかった。 表　３ 実施例３のＤＥＡＥ−セルロース画分のＳＣＭ活性リンパ球ドナー　ＳＣＭ因子 ドナー　ＳＣＭ応答：対照の透析　の透析　との％としてのＰ値 乳癌　乳癌　６９．２ 乳癌　気管支癌　６９．５ 乳癌　類題　６９，０ 基底細胞癌−皮膚　基底細胞癌−皮膚　８２．０健康なドナー　結腸癌　９８． ６ 胆石症　悪性黒色腫　ｔｏｏ、。 尿道炎　類題　９９，８ 虫垂炎　結腸癌　９８，０ 良性胸成長　乳癌　９７８ 良性下垂体腺腫　脳癌　１００．０ （実施例５） ＲＰ−ＨＰＬＣによる実施例３のＳＣＭ因子の最終精製実施例４のＤＥ−５２一 般癌関連ＳＣＭ活性画分を次いで再構成し、２．１　ｍｍＸ２５ｃｍのＨＰＬＣ カラムを用いた逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製 して均一性とした。そのカラムにアクアボアＰＲ−３００ＴＭ（７ミクロン）を 詰めた。ＲＰ−ＨＰＬＣＧ製工程に用いられた移動相は以下のとおりである：相 Ａ　：　０．１容積パーセント水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。 相Ｂ：水性７０％アセトニトリル中の０．０９容積パーセント水性ＴＦＡ。 凍結乾燥したＤＥ−５２５ＣＭ活性画分を注入のために無菌水で再構成し、その ２５０マイクロリツトルをＲＰ−ＨＰＬＣカラムに注入した。移動相の流速は毎 分５０マイクロリツトルであり、その組成物のプロフィールは、初めの１０分間 は相Ａが９０容積パーセント、相Ｂが１０容積パーセントであり、続いての３０ 分間は毎分３容積パーセントの速度で相Ｂを増大させた。２２０ｎｍでの光学吸 収により検出した光学濃度のピークは、「ナノボア」テフロン管により１．５ｍ ｌのプラスチックコニカルエッペンドルフ遠心分離管に手で集積し、その溶媒を 真空遠心分離機中で蒸発せしめた。 全ての場合において、一般癌関連ＳＣＭ認識因子は、相Ｂの７４容積パーセント のときのカラムから溶出された。 （実施例６） ＳＣＭ因子の選択的ＲＰ−ＨＰＬＣ精製あるいは、ＳＣＭ因子は実施例４のＤＥ ＡＥ−５２５ＣＭ活性画分とともに、ベツクマンインストルメンツ社により供給 されたウルトラスファ−ＯＤＳＴＭ（５ミクロン）を詰めた４、８　ｍｍＸ２５ ｃｍのＨＰＬＣカラムを用いてＨＰＬＣを行い精製できる。このカラムに用いた 移動相は以下のとおりである： 相Ａ　：　０．１容積パーセント水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。 相Ｂ：水性７０％アセトニトリル中の０．１容積パーセント水性ＴＦＡ。 移動相の流速は毎分１．００ｍ　ｌであり、その組成物のプロフィールは、初め の５分間は相Ａが７０容積パーセント、相Ｂが３０容積パーセントであり、続い ての２０分間は毎分３．５容積パーセントの速度で相Ｂを増大させたことを除い ては、アクアボアカラムとしてのこのカラムに続いて同様の一般工程を施した。 光学濃度ピークを２２０ｎｍで検出し、溶媒を真空遠心分離機中で蒸発せしめた 。このＨＰＬＣシステムを用いた場合、全てにおいて頚の偏平上皮癌、乳腺癌、 気管支腺癌および悪性黒色腫を含む１９の異なる癌の種類からの一般癌関連ＳＣ Ｍ認識因子の精製は、常に相Ｂの５６．３容積パーセントで溶出する１つの活性 の光学濃度ピークを生じた。 （実施例７） 実施例６のＲＰ−ＨＰＬＣ精製産物Ｓ　ＣＭ活性ンペプチド画分は、約３０マイ クロリツトルの合計容積において相Ｂの６９．６容積パーセントおよび相Ａの３ ０，４容積バーセントで溶出した。 肺癌を患った患者から精製したＳＣＭ因子から分割したトリプシンペプチドは以 下の実施例１０においてＳＣＭ活性のテストを行い、完全に活性であることが判 明した。実施例１４において決定された完全単離ＳＣＭ因子の配列と比較するこ とにより、これらのトリプシンペプチドはＳＣＭ因子分子のアミノ酸８−２２を 代表することが判明した。 （実施例９） ＳＣＭテストにおける攻撃誘発剤としての単ＭＳＣＭ因子の使用 表５は、ＳＣＭテストにおける攻撃誘発剤として実施例１．３および６から精製 した様々な段階の精製での一般癌関連ＳＣＭ認識因子の産物を用いることにより 得られた結果を要約する。数多くの異なる悪性腫瘍を患ったドナーからのリンパ 球をＳＣＭテストにおいて本発明の因子とともに用いた場合、全ての場合におい て、重大な反応か見られた。この反応を、その因子とインキュベーションしなか った同一のリンパ球に８０Ｍ７１１１定を施すことにより得られた対照極性化値 のパーセントとして表５に示す。その値か小さければ小さいほど、ＳＣＭテスト における因子に対する応答が大きくなる。テストした因子の最も粗い産物である 限外濾過物でさえ、１８．０％から３７．１％まで極性化値の減少を示し、ＲＰ −ＨＰＬＣにより精製された最も純度の高い精製画分は、４４．６％の極性化値 の減少を示した。本発明の因子は、特異性であり、癌を患ったドナーからのリン パ球を攻撃誘導するのに用いられた場合にのみ極性化値を減少させる。ＲＰ−Ｈ ＰＬＣ精製画分てさえ、健康なドナーからのリンパ球を攻撃誘導に用いられた場 合に極性化において減少を示さなかった。 精製の段階　癌患者からのリンパ球を使用した場合のＰ値における減少百分率の 範囲 プラズマの限外濾過 （１０００ダルトンでカット）　１８．０−３７．１Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５ ０画分　１９．８−３７．０ＤＥ−５２セルロ一ス画分　１８．０−３１．０Ｒ Ｐ−ＨＰＬＣ画分　３２．０−４４．８健康なドナーまたは非悪性腫瘍の病気を 有するドナーからのリンパ球に対して試験した場合にはどの画分ち活性を示さな かった。 （実施例１０） ＳＣＭテストにおける実施例８のトリプシンペプチドの活性 その精製が上記実施例８に記載された、肺癌を患った患者の血漿からのＳＣＭ因 子より得られたトリプシンペプチドは、標準ＳＣＭテストにおいて完全に活性で あった。 この画分の約５　Ｘ　１０−”フェムトグラム（すなわち、５×１０−１７グラ ム、または画分の分子量１６．０００）がこのテストにおいて活性であった。そ の両分が肺癌を患った患者から単離された場合、表６に示すように、小細胞肺癌 を患った患者からのリンパ球に対してテストされたとき、そして乳アデノカルシ ノーバを患った患者からのリンパ球と完全に交差反応したときに、ＳＣＭテスト において活性であることが証明された。しかしながら、健康なドナーからのリン パ球が用いられた場合には、どのような反応も見られなかった。 リンパ球ドナーの透析　ＳＣＭ反応：対照との０６としてのＰ値 小細胞肺癌　７０．０　６８．０ 乳アデノカルチノーマ　８７．５　８８．０健康なドナー　１０２．０　１０４ ．０（実施例１１） 単ＭＳＣＭ因子の交差反応 以下の実施例は、非類似性癌を患ったドナーから誘導されたリンパ球を攻撃誘導 するのに用いられた場合、ＳＣＭテストにおいて反応を生じる単離ｓｃＭ因子の 可能性を示す。この交差反応性を示すために、癌壱者それぞれからの多くの血液 試料から、２ミリリツトルの無細胞血液プラズマを得た。その血液試料をヘパリ ン化バクテナーＴＭ管に集積した。その試料を、少なくとも１２時間、公称分子 量を１０００ダルトンでカットするアミコンＴＭＵＭ２またはＹＭ２フィルター を通過させて限外濾過し、４℃の無菌条件で貯蔵した。潜在的にＳＣＭ反応する リンパ球を癌患者からのヘパリン化血液試料、健康なドナー、および非悪性病の ドナーから単離した。限外濾過物を含む一般痛関連ＳＣＭ認識因子の活性および 癌特異性をテストするために、潜在的なＳＣＭ反応リンパ球の０．７５ｍ　ｌの アリコート（ＰＢＳ中５×１０６細胞／ｍ１）を限外濾過物とともに４０分間３ ７℃でインキュベーションした。ＳＣＭａ１１１定を、前述したり、Ｃｅｒｃｅ ｋとＢ、Ｃ５ｒｃｅｋの′″Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏ「ｔｈｅ　Ｐｈｅｎｏ Ｉｌｌｅｎｏｎ　ｏｆ’　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｎｅｓｓ　ｏｒ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｊｃ　Ｍａｔｒｔｘ　（ＳＣＭ）ｉｎ　 ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｄｌｓｏｒｄｅｒｓ 　：　ａ　Ｒｅｖｉｅｗ、　’Ｅｕｒｏｐ、ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　１３，９０３− ９１５（１９７７）およびり、Ｃｅｒｃｅｋ、ｌ！：Ｂ、Ｃｅｒｅｅｋにより１ ９８６年５月２７日に出願された特許出願節８８７．０７９号で題名がｒＭｅｔ ｈｏｄ　ｆｏｒ　ＭｅｓｕｒＬｎｇ　Ｐｏ１ａｒｉｚｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｎｃｅ　ＥｍｉｓｓｉｏｎｓＪに記載されたように行った。ＳＣＭ検定法におい て、細胞内フルオレセンス極性化値（Ｐ値）の少なくとも１０％の減少が、攻撃 誘発限外濾過物に対する陽性反応として生じた。 表　７ 実施例１１の限外濾過の５ｃｂｉ活性の交差反応性肺癌　−Ｚ／２　Ｍ／３−５ ７５　３／３　３／３　２／２　０１５　０／３気管支癌　１／１　ｊ／１２／ ２　２／２　Ｚ／２−２ｔ２　ｙｔ−Ｏ／２乳癌　１／１　ｊ／ｌ　５１５　２ ／２　２／２−３／３　＋／ｌ　Ｏ／３　０／２卵巣癌　１／１　２／２　２／ ２　３／３　Ｚ／２−２／２−０／４　０／２ｇ癌　１／１　＋／＋　５１５　 １／ｊ　２／２−２／２　２／２　０／３　０／３結腸癌　２／２−３７３−２ ／２−２／２　＋／１　０／２　０／２０癌　２／２−＋／１−ｊ／＋−＋／１ 　＋／１−０／２喉癌　１／ｊ　６／６　３／３−２／２　−　η２　＋／＋　 Ｏ／２　−恕性黒色腫　−−−−−−−−−−−−１／ｊ　＋／ｌ−０／２神経 グリア芽１ｈＴ［−−−−ｖｚ　−−−−２１２Ｚ／２　１／＋　ｏｔｚ　Ｏ／ ２虫垂炎−−−−−−−−０／Ｉ−０／１　０／３　０１３　０／２尿道炎　− −−−０／２−Ｑｔ２−Ｏｔｊ　Ｏ／２　０４　０／３感染Ｂ傷−０１１０ｔ１ 　−−　−−　−−　０／ｌ　０１１０／２　０／２大腸炎　−＋　ｏ７＋　− ＋−＋＋　ｏ／ｌ　Ｏ／３　０／２　０／２ＵＩＭナトｆ　−−−−０／２　０ ／１　０／３−０１５　０／１　０／４　０／６表７のデータが示すように、８ 種の異なる癌の患者からの潜在的なＳＣＭ反応リンパ球は、９種の異なる癌がら の一般癌関連ＳＣＭ認識因子を含む限外濾過物に反応した。 対称的に、健康なドナーおよび非癌疾病のドナーのプラズマからの限外濾過物は どの陽性ＳＣＭ反応も生じなかった。 また、健康なドナーまたは非悪性条件のドナーからの潜在的なＳＣＭ反応リンパ 球もＳＣＭテストにおける限外濾過物に反応しなかった。 （実施例１２） 単離された３０Ｍ因子によるＳＣＭ反応の変調単離した３０Ｍ因子と行うインキ ュベーションにより悪性のないリンパ球のＳＣＭ反応の変調を説明するために、 −潜在的なＳＣＭ反応リンパ球を健康なドナーの血液試料から単離し、　Ｅｕｒ ｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　ａｒｔｉｃｌｅ、　５ｕｐ ｒａおよびＢ、　Ｃｅｒｃｅｋにより１９８６年３月ＩＯ日に出願された特許出 願公報第８３８，２６４号で、題名がｒＡｕｔｏｓａｔｅｄ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎｏｆ　Ｂｕｏｙａｎｅ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｃｅ１ｌｓ　 ｆｒｏｍ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　Ｇｒａｄｔｅｎｔｓ　Ｊに記載されたように、５　 Ｘ　１０’細胞／ｍｌの完全なダルベツコリン酸緩衝生理食塩水に懸濁せしめた 。これらの細胞のアリコートは、以下の３ｍｌ中でインキュベーションした＝（ ａ）癌患者からの無細胞血液プラズマ；（ｂ）１０００ダルトンの分子量でカッ トするアミコンＴＭＵＭ２フィルターを１２時間で通過させて限外濾過した癌患 者からのプラズマ；　（Ｃ）　５００ダルトンの分子量でカットするアミコンＴ ＭＵＭ２フィルターを１２時間で通過させて限外濾過した癌患者からのプラズマ ；（ｄ）脱塩または５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０カラム段を通過させて精製した 一般癌関連ＳＣＭ因子；　（ｅ）　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０力ラム段を通過 させて精製した因子、（ｆ）ＤＥＡＥ−セルロースカラム段を通過させて精製し た因子；（ｇ）最終的にＲＰ−ＨＰＬＣ段を通過させて精製した因子；および（ ｈ）　１０００ダルトンの公称分子量でカットするアミコン”ＵＭ２フィルター を通過させることにより限外濾過した健康なドナーからのプラズマ。これらのイ ンキュベーションを２．５時間行った。 健康なドナーからのリンパ球のＳＣＭ反応を変調する３０Ｍ因子の能力は、上述 した各画分とともに行ったインキュベーションの前後にリンパ球のＳＣＭ反応比 （ＲＰＳＣＭ）を決定することにより示した。分裂促進因子またはＲＰＳＣ２を 決定するための３０Ｍ因子のいずれかと接触する前に、インキュベーションした 細胞を完全に洗浄した。変調の存在または欠如は、植物凝集素（ＰＨＡ）との短 い接触期間の後のリンパ球懸濁液の極性化値を超えた３０Ｍ因子を含む物質との 短い接触の後のリンパ球懸濁液の極性化値の比により決定される。ＳＣＭテスト 方法に従って、１．０未満のＲＰｓｃＭはドナー中に悪性の存在する陽性インキ ユベーシヨンであり、一方１．１またはそれより大きいＲＰＳＣＭは悪性のない ことを示す。 表　８ ３０Ｍ因子による健康なドナーからのリンパ球のＳＣＭ反応の変調（実施例１２ ） 変調に用いたＳＣＭ産物　ＲＰＳＣＭ：変調前　変調後 無細胞癌血液プラズマ　１．３８　０．８０癌血液プラズマの限外−適切 （１０００ダルトンカツト）　１．３５　０．７８Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０ （８０Ｍ活性）　１．４０　０．８０Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（８０Ｍ活性 ）　１．３８　０．７３ＤＥＡＥセルロース（８０Ｍ活性）　１．３９　０．７ ０ＲＰ−ＨＰＬＣ（８０Ｍ活性）　１．４０　０．６５癌血液プラズマの限外濾 過物 （５００ダルトンカツト）　１．３８　１．３８健康なドナーからの自己および 同種血液プラズマ限外濾過物　ＩＪ８　１．３８表８は、ＲＰ　ＳＣＭとして表 わした、３０Ｍ因子または植物凝集素のいずれかに対するリンパ球の反応につい てのＳＣＭ因子含有画分によるインキュベーションの効果を示す。 予備インキュベーションをしていないか、または公称１０００ダルトン分子量で カットするフィルターを通過させて濾過した健康なドナーからの限外濾過物によ り予備インキュベーションしたか、または公称５００ダルトン分子量でカットす るフィルターを通過させて濾過した癌を有するドナーからの限外濾過物により予 備インキュベーションしたいずれかのリンパ球は、予期したように、ｌ、３５ま たはそれより高いＲＰ　ＳＣＭを示した。対称的に、ＳＣＭ因子を含む画分て予 備インキュベーションしたリンパ球は全て、悪性疾病の患者からもともと単離し たリンパ球の特徴である０、６５−０．８０の値までＲＰ　ｓｃＭにおいて減少 した。 （実施例１３） リンパ球細胞障害作用の単離ＳＣＭ因子の効果悪性細胞への潜在的ＳＣＭ反応リ ンパ球の自然細胞障害性についての単離ＳＣＭ因子の効果を説明するために、健 康なドナーから得られたリンパ球を、前述したように癌を、＠ったドナーの血液 試料から単離したＳＣＭ因子を含むプラズマにより３７℃で２１ノ２時間インキ ュベーションした。 これらのリンパ球のアリコートをまた対照として保持し、インキュベーションは しなかった。加えて、潜在的ＳＣＭ反応リンパ球を、癌を有するトナーから得て 、同様に処理した。ナなわな、あるアリコートはＳＣＭ因子を含むプラズマによ りインキユベーシヨンし、他のは対照として保持してインキュベーションしなか った。 インキュベーションの後に、リンパ球の細胞障害性をＨｏＲ，ＰＯｌｔｅｒとＭ 、Ｍｏｏｒｅの　＋Ｎａｔｕｒａｌ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｒｅａｅｔｉｖｉｔ ＞ｏｒＨｕｍａｎ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ、　 −１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　３７．１８７−１９４（１９７９）に記載されている 方法に従ってテストした。 この公開された方法に従って、９＋　Ｃｒと標識付けられたに５６２ヒト骨髄性 細胞系の細胞をその検定法の標的細胞として用いた。潜在的ＳＣＭ反応リンパ球 を効果細胞として用いた。標的細胞の効果細胞に対する比は１から２０であった 。 ５１Ｃｒの放出は、効果細胞が標的細胞に対して有害であることを示す。細胞障 害性のパーセントを以下に示す：Ｒ５−ＲＣ パーセント細胞障害性　−−Ｘ　１００Ｒア　−　Ｒに こで、Ｒ５は試料中の５　ｒ　Ｃｒ放出のパーセント、ＲＣは対照中の５１Ｃｒ 放出のパーセント、モしてＲＴは洗浄剤、トリトンＸ　−ｔｏｏの存在下の５１ 　Ｃｒ放出のパーセントである。その結果を表９に示す。これらの結果は、公称 １０００ダルトンの分子量でカットするフィルターを通過させることにより濾過 した限外濾過物により２．５時間、健康なドナーからの潜在的ＳＣＭ反応リンパ 球をインキュベーションすることにより、その細胞障害性を９０％を超えて減少 せ１−めたことを示す。癌患者からの潜在的ＳＣＭ反応リンパ球によりインキュ ベーションを行った場合、細胞障害性の減少はより小さく、４０と９０％の間で あった。しかしながら、そのような癌患者からのリンパ球はインキュベーション 前でも障害性の水準は低く、限外濾過物によるインキュベーション後に残留する 細胞障害性の残存水準は健康なドナーからのリンパ球のインキュベーション後に 残留する細胞障害性の水準に匹敵する。癌患者からの細胞中に存在する細胞障害 性のより低い水準は、癌関連ＳＣＭ認識因子のような因子に対する生体内露出に より生じた細胞障害性の減少とに５６２ヒト骨髄性細胞系に対する自然リンパ球 毒性健康なドナー１　頭痛　４０．０　２．２　９４．５健康なドナー２　気管 支癌　３０．０　１．７　９４．３健康なドナー３　喉頭癌　１１．０　０．７ ８　９３．１健康なドナー４　喉頭癌　２２．０　２．２　９０．０健康なドナ ー５　咽頭癌　４１０　０．３３　９９．２舌癌　喉頭癌　２３．０　２．Ｌ　 ９０．９唇癌　気管支癌　７．４　２．７　８３．５卵巣癌　気管支癌ｒＯ，Ｑ 　６．１　３９．０頚癌　頭痛　２５．２　１，５　９４．０第１４実験例 分ＪＷＳＣＭ因子のアミノ酸配列 異なる１２の癌患者の血しょうから精製した試料で測定した分ＭＳＣＭ因子のア ミノ酸配列を表１０に示す。これらの配列は、オンライン１２０Ａ　ＰＴＨ−ア ミノ酸分析器に接続された応用バイオシステム４７７Ａタンパク質シーケンサ− を用いて自動エドマン分解法（ａｕｔｏａ＋ａｔｅｄ　Ｅｄｍａｎｄｅｇｒａｄ ａｔｌｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）で測定した。各サイクル毎のアミノ酸残基の 断定する際には配列呼出（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃａｌｌｉｎｇ　）ソフトウェア を使用した。ＳＣＭ因子のペプチドの配列は、同じ種類の癌と診断された約５− ５０人の別々の患者の血しょうをプールしたものから分離精製した２から３個の 別々の試料を繰り返し分析してめたものである。特定の分解周期で検出されるも のうちで最も重要な残基である一部アミノ酸残基の下に括弧書きしたアミノ酸残 基は、分解周期の一部で大量に存在する第二アミノ酸残基を表している。 配列化に使用した試料プールに含まれる各血液ドナーにはＳＣＭ因子の遺伝子型 性が存在することがこれらの二次残基から分かる。しかしながら、全てではない にしても、これらの多型性における置換物（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）の多 くは保存的な置換物（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　５ｕｂｓｔＨｕｔｌｏｎｓ） である。二件のケースでは、全体として３５個のアミノ酸が確認されており、こ のうち最後の六個のアミノ酸はかすかであった。 二のことから、二つの因子がそれぞれ前記試料中に存在していることが分かる、 すなわち一つの因子は２９個のアミノ酸の中に、またもう一つの因子は最大３５ 個のアミノ酸の中に存在している。これら二つの試料は前立腺および精上皮腫試 験で癌と判断されたドナーがら生成されたものである。特定の周期ではアミノ酸 が検出されない場合があり、°Ｘ”で表している。これらのアミノ酸のほとんど はシスティンのようなものであり、システィン（Ｃ）と称している。アミノ酸が 検出されないのは、２０個の共通アミノ酸のうちシスティンたけがエドマン分解 法で検出できないがらである。 表　１０ 精製針１１１ＳＣＭ因子のアミノ酸量列肝臓癌　ＶＩＰＰＥＶＫＦＮＸＰＦＶＦ ＬＨＩＤＱｍｒＫＶＰＬＰＨＧＫ第１５実験例 合成ＳＣＭ因子のＳＣＭ活性度 従来の固相ペプチド合成技術を用いて、コンセンサス配列がＭ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ −Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｌ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ −Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−にである合成ＳＣＭ因子を生成する。例えば、このよう な技術としては、Ｍ、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙの「ペプチドの化学Ｊ　Ｃ５ｐｒｉｎ ｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒ　１　ｉｎ、１９８８）第１０章の「固相ペプチ ド合成」が知られている。 合成ＳＣＭ因子のＳＣＭ活性度は標準的なＳＣＭ試験方法で試験する。複数種の 癌患者と正常な健康なドナーから採取したＳＣＭ反応性リンパ球の画分を合成Ｓ ＣＭ因子で誘発（ｃｈａｔ　Ｉｅｎｇｅ）する。注射用に前記因子を無菌水で溶 解し、３ｘ１０６リンパ球当たり１９０ピコモルのＳＣＭ反応性リンパ球に投与 する。表１１から分かるように、複数種類の癌を有する患者から採取したリンパ 球の反応により合成ＳＣＭ因子に対する細胞間フルオロセイン蛍光偏光か大幅に 減少であった。フルオロセイン偏光の減少の最大値は４０％以上あり、血しょう から分離した高純度ＳＣＭ因子試料での減少幅に匹敵するものである。この反応 は、癌患者のリンパ球に特有な反応でもある。健康なドナーのリンパ球を合成Ｓ ＣＭ因子で誘発した場合、例えば、最高３ＸＩＯ″リンパ球当たり９６０ピコモ ルまで５ｃＮｉ因子の量を増加してセルを誘発しても蛍光偏光は減少しなかった 。 第１６実験例 合成ＳＣＭ因子の断片 従来の固相ペプチド合成技術を用いて実験例１５の合成ＳＣＭ因子に固有な断片 を表すペプチドを合成する。 これらのペプチドはＦｌ−Ｆ５として示されており、その配列は以下の通りであ る。 Ｆｌ　：　Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ −Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−ＫＦ２　：　Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−〜ｌ−１− Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−に−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−ＫＦ３　：　Ｆ−Ｎ−に−Ｐ− Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ　−Ｄ−ＱＮ−Ｔ−Ｋ Ｆ４　：　Ｆ−Ｌ−Ｍ−１−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−ＫＦ５　：　Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ −Ｖ−に−Ｆ−Ｎ−に−Ｐ−ＦＶ−Ｆ これらの断片は完全な合成ＳＣＭ分子の以下の領域を表している。すなわち、Ｆ ｌは第１番目−第２２番目のアミノ酸、Ｆ２では第８番目−第２９番目のアミノ 酸を、Ｆ３では第８番目−第２２番目のアミノ酸、Ｆ４では第１４番目−節２２ 番目のアミノ酸を、Ｆ５では第１番目−第１３番目のアミノ酸をそれぞれ表して いる。 第１７実験例 １６実験例の合成ＳＣＭ因子断片の ＳＣＭ試験における活性度 破片Ｆｌ−Ｆ５は合成ＳＣＭ分子の別々の部分をそれぞれ表しており、こられの 因子は、ＳＣＭ試験では癌患者のリンパ球と正常ドナーのリンパ球の双方の誘発 剤として使用されている。ＳＣＭ試験を表１５に示す通りに行う。この試験結果 は表１１に示されている。断片Ｆｌ、Ｆ２．Ｆ３、Ｆ４はＳＣＭ試験では全てに 十分に活動的であった。 断片Ｆｌ−Ｆ４の場合、悪性でないドナーから分離したリンパ球の誘発に使用し ても蛍光偏光は減少しないため予想されたＳＣＭ反応の特異性は保たれた。 合成ＳＣＭ分子の活性断片を表すこれらのペプチドのうち、最も小さいのはＦ４ の残基１４−２２である。これ以外の活性ペプチドには全てこの断片が含まれて いるが、この断片を含んでいないＦ５は不活性になっている。従って、残基１４ −２２は合成ＳＣＭ因子分子の活性部位と考えられる。前記因子中の第１８番目 の位置のアスパラギン酸（Ｄ）が極度に保存的なグルタミン酸（Ｅ）で置換され ている点を除いては、ペプチドのこの領域は分離ＳＣＭ因子内では実質的に不変 である。 表　１１ 合成ＳＣＭ因子とＦｌ−Ｆ５までの断片のＳＣＭ活性度卵巣癌　５Ｌ４　−　Ｂ ５．Ｄ　−８０，２−乳癌　−５９，０−６１，２−＝ 黒色腫　−６６，４６５，０５９，４−一−乳癌　５８．７　８５．７　−　６ ３．２　−　−乳癌　−６８，４６１，５５８，７−−肝臓癌　−５８，０５１ １，８５５，０−−胃癌　６０．０　８６．７　６７．０　−　−　−精巣癌　 ５７．３　−　−　６７．０　５６．２　−肺癌　５９．７　−　−　−　５７ ．０　９９．５肺癌　６９，０　７３．０　−　８８．５　−　−−乳癌　５７ ．０　−　−　−　５８．０　９９．０ａｌＦ　（男ａ、３０り　１０２．０　 １０４．０　−　−　１００．０　−健康（女性、２９歳）　１００．０　＋０ １．０　−　１０４．０　１０３．０　−健Ｈ（男性、３６歳）　１００．５　 −　−　１００．０　１０２．０　−ｍｓ＜女性、５９歳）　９９．ｆ　１０Ｑ 、０　−　−　９９．２　−リンパ球当たり１９０ピコモルであった。 断片とは、以下の合成ＳＣＭ因子のアミノ酸残基のことである。Ｐｌ　（１−２ ２）：Ｆ２　（８−２９）　；　Ｆ３　（８−２２）　、　Ｆ４　（１４−２２ ）　；　Ｆ５　（１利３）Ｐ値とは、ＳＣＭ試験法を用いて測定した細胞間フル オロセイン蛍光偏光値を表している。 第１８実験例 ＳＣＭ−活性ペプチドとペプチド断片 の両親媒性プロフィール 第１図にはＦ４ペプチド断片の両親媒性プロフィールが図示されている。これと の比較のため、第２図には合成８０Ｍ活性オクタペプチドの両親媒性プロフィー ルが図示されている。このオクタペプチドの配列およびＳＣＭ活性度が本願と同 時係属出願中である米国特許出ｊＯＮｏ、０７／１６３．２５０　（１９８８年 ３月２日出願）「合成ＳＣＭ活性癌認識ペプチド」に開示されており、本願にお いても参照している。ＳＣＭ活性オクタペプチドとＦ４断片の両親媒性はほとん ど同じであり、８個のアミノ酸からなるオクタペプチドのうちわずかに４個がＦ ４のアミノ酸と相同しているにすぎない。 表１２には、Ｆ４の配列におけるアミノ酸を各親水性値と、本願の同時係属出願 Ｎｏ、０７／１６３．２５０の合成８０Ｍ活性オクタペプチドと、ＳＣＭ試験で 不活性な実験的アレルギー性脳炎誘発性ナノペプチド（ＥＡＥ）の精製物の各々 の親水性値が示されている。合成８０Ｍ活性オクタペプチドと不活性ＥＡＥナノ ペプチドとの差は、わずかにセリン残基がもう一つ第２番目の位置に存在してい るにすぎない。セリンの親水性値（＋０．　３）は正であるが、これに対して活 性Ｆ４断片の最初の４個の残基は全て負の親水性値を有しており、合成ＳＣＭＣ 性活性オクタペプチド中基１．２．４の親水性値は負である。また、グリシンの 第３残基の親水性値は０．０である。ＥＡＥの第３番目の位置における親水性セ リンは、配列の負の親水性を分裂してしまう。このような分裂があるため、ＳＣ Ｍ活性ペプチドを認識する癌患者のリンパ球中のレセプターによるＥＡＥペプチ ドの認識は十分に阻止されていると考えられる。 従って、ＳＣＭ活性オクタペプチドから精製した純粋ＥＡＥペプチドにはＳＣＭ 活性は全くない。この例から、対応レセプターで５Ｃｂｉ因子の認二を制御する には両親媒性が重要となることが判る。 表　１２ ＳＣＭ活性およびＳＣＭ不活性ペプチドのアミノ酸（ＡＡ）配列の親水性値（Ｈ Ｖ）Ｆ　−２，５Ｆ　−２，５Ｆ　−２，５Ｌ　−１，１１Ｗ　−３，４Ｓ　＋ ０．３Ｍ　−１，３Ｇ　Ｏ，ＯＷ　−３，４ １−１，１１Ａ　−０，５Ｇ　Ｏ，Ｏ Ｄ　＋３．Ｇ　Ｅ　＋３．ＯＡ　＋３．ＯＱ　＋０．２　Ｇ　Ｏ，Ｇ　Ｅ　＋３ ．３Ｎ　＋０．２　０　＋０．２　Ｇ　Ｏ，ＯＴ　−０，４Ｒ＋３．ＯＱ　＋０ ．２ Ｋ　＋３．ＯＲ＋３．０ 第１９実験例 合成５０Ｍ因子を用いた健康なドナー のリンパ球の悪性度ＳＣＭ応答特性の誘発健康なドナーのリンパ球の悪性度につ いてのＳＣＭ反応特性を合成５０Ｍ因子で誘発することができる。この応答特性 の誘発には活性合成タンパク質合成が必要である。 この誘発を行うため、健常ドナーのＳＣＭ反応性リンパ球を分離し、５ｘ１０６ セル／ｍｌの容積の４本のアリコツトを準備する。第一のアリコツトに中のリン パ球をＰＢＳで懸濁し、未処理対照標準（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ ｓ）として使用する。第二のアリコツトのリンパ球は、４００ピコモルの合成５ ０Ｍ因子、あるいは癌患者の血しょうから精製したＳＣＭ因子で培養する。第三 のアリコツトのリンパ球は、１０μｇ　／　ｍ　１のシクロへキシミドを加えた ４００ピコモルの合成５０Ｍ因子で培養する。第四のアリコツトのリンパ球は、 １０μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを加えた４００ピコモルの合成５０Ｍ因子 で培養する。これら四つのアリコツト全てを３７℃の温度で２．５時間培養する 。 次に、ＰＢＳを用いて三回アリコツトを水洗し、遠心沈澱法で収集し、ＰＢＳで 再度懸濁する。さらに、このアリコツトを、２Ｘ１０６セル当たり１９０ピコモ ルの合成５０Ｍ因子を用いて３７℃の温度で４０分間誘発し、上述したように各 サンプル毎に細胞間フルオロセイン蛍光偏光を測定する。表１３に示されている ように、健常ドナーの未処理対照標準リンパ球はＳＣＭ試験の合成５０Ｍ因子に 反応していない。すなわち、未誘発の対照標準リンパ球と比べてもなんら蛍光偏 光は減少していない。これとは対照的に、合成５０Ｍ因子で前処理して活性化あ るいは誘発されたリンパ球の場合は、合成５０Ｍ因子あるいは大腸癌患者の血し ょうから分離した精製ＳＣＭ因子を用いて誘発すると蛍光偏光が大幅に減少する といった反応を示した。しかしながら、シクロへキシミドやアクチノマイシンＤ といった合成タンパク質の存在下で予備培養すると、このような反応は妨げられ てしまった。このように、ＳＣＭ活性ペプチドに対する反応を誘発するには活性 タンパク質合成か必要であることが判る。 表　１３ ＶＩＴＲＯにおける合成５０Ｍ因子を用いた前処理による健富者リンパ球（ＮＨ Ｌ）のＳＣＭ反応の誘発ＳＣＭ因子による攻撃前の　攻撃ＳＣＭ因子の　ＳＣＭ 反応：ＮＨＬ　十　合成５０Ｍ因子　合成　６３．５（２，５時間培養）；洗浄 済み ＮＨＬ　十　合成５０Ｍ因子　血しょう　６２．２（２，５時間培養）；洗浄済 み　（大腸癌）ＮＨＬ　十　合成５０Ｍ因子　合成　１０４．０＋　１０　μｇ ／ｍ＋　シクロへキンミド（２，５時間項ＩＩ）　：洗浄済み ＮＨＬ　十　合成５０Ｍ因子　合成　９９．７＋　１０　μｇ／ｍｌ　アクチノ マイシンＤ（２，５時間培養）；洗浄済み 第２０実験例 合成ＳＣＭ因子の抗体生成 試験用動物を免疫化する際に合成ＳＣＭ因子分子を使用する。純粋合成ＳＣＭ因 子分子とＳＣＭの双方は、Ｎスクンニルブロモアセテートを架橋結合剤として用 い添加カルボキシ末端システィンを介して担体キーホールリンベットヘモシアニ ン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）と接合している。これらの免疫原性を用いて雌のニューシーラ ントラビットを免疫化する。 −次免疫化のため無菌ＰＢＳを用いてこれら免疫原性をいずれも１．０ｍｇ／ｍ ｌまで希釈し、同量のフロイト完全アジュバントに結合させて乳化する。−次免 疫化を行うため、各ラビットに合成ＳＣＭ因子またはＫＬＨ（ＳＣＭ−ＫＬＨ） と接合した合成ＳＣＭ因子のいずれかを全体として２５μｇあるいは５０μｇを 注射し、これら二重のラビットを各投与量範囲で使用する。二本の足には０．２ ｍｌの接種を筋肉内投与し、また背側の最低１２箇所以上の部位に一部位当たり ０．２ｍｌを皮下投与する。１力月後に、ブースター注射を行う。合成ＳＣＭ因 子とＳＣＭ−ＫＬＨに同量のフロイト完全アジュバントと不完全アジュバントを それぞれに投与し、乳化する。−次接種で使用したのと同じ部位すなわち筋肉内 および皮下部位へブースター接種を投与する。−匹当たり全体として２５μｇま たは５０μｇの免疫原性をブースター注射て投与する。 −次免疫化から１０週間後に血液サンプルを採取すると、２５μｇの免疫原性を 投与したウサギよりも５０μｇの免疫原性を投与したウサギの血液サンプルから 大量の免疫グロブリンを含有する抗血清が得られた。免疫化学６の５３９ページ （１９６９）に発表されたＷ、Ｂｅｃｋｅｅｒの「単一放射状免疫拡散法を用い た抗血清力価の測定方法Ｊに従って放射状免疫拡散試験を行った結果、未接合Ｓ ＣＭ因子とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に接合したＳＣＭ因子の沈降反応が得 られた。所望の抗体を含有した免疫グロブリンと抗血清とを分離するため、まず 免疫グロブリンを同量の飽和硫酸アンモニウムと一緒に沈澱させる。次に、この 沈澱物を０．　９％の塩化ナトリウムで溶解する。硫酸アンモニウムを除去する ため、抗体含有溶液を、５０００ダルトンの分子量を遮断するアミコン（登録商 標）膜フィルターを用い１０倍の限外ろ過または透析で処理する。抗体は使用時 まで一４０℃の温度で凍結させておく。 第２１実験例 ＳＣＭ因子のＥＬＩＳＡ分析試験 二重抗体酵素結合競合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ、）は、ＳＣＭ因子に対 して産生された抗体を用いてＳＣＭ因子を検出するよう開発されたものである。 第３図にＥＬＩＳＡアッセイの概略を示す。第一段階では、通常、ＳＣＭ因子は 、受動吸着によってプラスチックなどの固相に結合する。第二段階では、分析試 験を行う試料を、限られた量の抗ＳＣＭ抗体と共に添加する。完全に洗浄を終え た後、第三段階ではアルカリ性ホスファターゼ酵素で標識化されたヤギ抗ウサギ ＩｇＧから成る第二標識化抗体の余剰分を添加する。アルカリ性ホスフオターゼ 用担体、すなわちｐ−ニトロフェニールフォスフェートを次に添加し、４０５ｎ ｍ（Ａ　４０５　）の波長で吸収度を測定する。このアッセイでは、第二段階で 添加された自由ＳＣＭ因子か固相に吸着したＳＣＭ因子と競合する。前記第一お よび第二抗体か結合した固相ＳＣＭだけが発色する。従って、試験試料中のＳＣ Ｍ因子の濃度が高くなるに従いＡ　４０．の測定値は低くなる。これが、典型的 な競合アッセイである。 上記の方法を一部変更して癌細胞中のＳＣＭ分子、成長培養基の上澄み液、癌患 者から採取した血しよう試料、複数のソースから抽出した精製ＳＣＭを検出する 。 第２２実験例 抗ＳＣＭ抗体の活性度 未接合ＳＣＭ因子とＫＬＨ−５ＣＭ因子接合体に対して産生された抗体の活性度 を第２１実験例のＥＬＩＳＡアッセイを一部変更して測定した。希釈度の異なる 抗体の希釈液を複数使用するが、自由ＳＣＭを表す試料はアッセイには添加しな い。第４図には未接合のＳＣＭ因子に対して産生された抗血清が示されており、 また第５図にはＫＬＨ−５ＣＭ因子接合体が示されている。図からも分かるよう に、抗体試料はいずれも精製ＳＣＭ因子に対しては活動的であった。 第２３実験例 ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイによるＳＣＭ因子レベルの測定と血しょうの限外ろ過 健康なドナーと癌患者の血しょうの限外ろ過物の数でＳＣＭ因子レベルを測定す る。１２人の癌患者の血しょうと１２人の健常ドナーの血しょうを１０００ダル トン分子量の遮断能力を有したアミコン（登録商標）ＹＭ２を用いてろ過し、限 外ろ過物を作製する。ＳＣＭ因子のレベルは、第２１実験例のＥＬＩＳＡアッセ イで免疫化学的に分析した。この結果を表１４に示す。ＥＬＩＳＡアッセイで検 出したＳＣＭ因子のレベルは、ミリメーター当たりナノグラムの限外ろ過範囲で あった。癌を患ったドナーの限外ろ過物は４．８−２５．５ｎｇ／ｍｌの範囲で ある。健常ドナーの場合は、ＳＣＭ因子のレベルは、最小検出可能レベルより小 さいかあるいは最大レベル１．８５μｇ／ｍｌまての大きさである。 表　１４ 競合ＥＬＩ　ＳＡアッセイで抗ＳＣＭ因子抗体を用い、アミコン（登録商標）Ｙ Ｍ２で限外ろ過した癌患者および健常ドナーの血しょうから検出したＳＣＭ因子 レベル血液ドナーの診断　ドナーの性別および年齢　ＳＣＭ因子乳癌　Ｆ　３９ 　Ｌ２．０ 乳癌　Ｆ　５０　１０．１ 乳癌　Ｆ　４９　７．０ 肺癌　Ｆ　７Ｂ　１３．４ 肺癌　Ｆ　Ｂ７　８．７ 肺癌　Ｍ　４７　５．５ 膵臓癌　Ｆ　５０　８．５ 大腸癌　Ｍ　４２　４．８ 大腸癌　Ｍ　４４　１４．＋１ 大腸癌　ｐ　ｓｏ　ｔｏ、ｓ 悪性黒色ＩＩ　Ｆ　３８　１５．７ 悪性黒色！　Ｆ　５０　２５．５ 健Ｆｒｔ／正常　Ｍ　３１　ＮＤ” 健康／正常　Ｍ　４９　ＮＤ 健康／正常　Ｍ　２６　０．６０ 健康／正常　Ｍ　３１１　１．１１５ 健康／正常　Ｍ　２９　１．０３ 健康／正常　Ｍ　３８　１．６５ 健康／正常　Ｆ　２７　０．２２ 健康／正常　Ｆ　３２　０．８２ 健康／正常　Ｍ　３４　ＮＤ 健康／正常　Ｍ　４８　０．２２ 第２４実験例 培養基中の人癌細胞から分泌された ＳＣＭ因子のＮＨ２末端アミノ酸配酸 量の癌を成長させている無血清培養基の上澄み液の中に存在するＳＣＭ因子分子 の一部であるＮＨ２末端アミノ酸配列を測定する。ＭＣＦ７乳癌細胞とＨＣＴ８ ０大腸癌細胞を使用する。癌患者の血しようからＳＣＭ因子を精製する際に説明 したように実験例１．３．５の方法を組み合わせて推定ＳＣＭ因子分子を前記上 澄み液から分離精製して均質化する。 人ＭＣＦ７乳癌細胞の培養基上澄み液から分離した８ピコモル量の因子の配列分 析から第一の１６ＮＨ２末端残基はＭ−１−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｘ−Ｆ−Ｎ−に− Ｐ−Ｆ−（Ｖ−１−Ｆ−Ｍ）と判明した。最後の四つの残基からの信号かは弱い ものであった。比較的保存的な二つの置換物質、すなわち位置１のバリンはメチ オニンで、また位置１５におけるロイシンはイソロイシンで置換されており、こ のセグメントの１６個のアミノ酸のうち１５個は第１４実験例の乳癌患者の血し ようから分離したＳＣＭ因子の主配列と同じである。血しようから精製した試料 中の第１番めの位置では、比較的頻度の低いバリン代替物としてメチオニンも検 出された。 同様に、ＨＣＴ−８０大腸癌の培養基の上澄み液から精製した５ピコモル量のＳ ＣＭ因子を配列させる。６個のアミノ末端アミノ酸、すなわちＭ−Ｉ−Ｐ−Ｐ− Ｘ−Ｖが決定された。これら６個のアミノ酸のうち５個は、大腸癌患者の血しょ うを精製したＳＣＭ試料から測定したアミノ酸と同じてあった。符号Ｘで示され た第４番目の位置のアミノ酸は信号が弱いため判別かできなかった。 第２５実験例 抗ＳＣＭ因子抗体を用いた培養基における人癌細胞の分泌ＳＣＭ因子の活性度 第２４実験例のアミノ酸配列を有する培養基内に分泌された人癌細胞のＳＣＭ因 子は、第２０実験例の抗ＳＣＭ抗体にも反応する。この実験では第２１実験例の ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイの一部を変更して用いる。このＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイ では、シーケネーターディスク（ｓｅｑｕａｎａｔｏｒ　ｄｉｓｋ）上に大量の 溶出物を載置した後、エッペンドルフ（登録量ｌｓ）収集管に吸着されたままに なっているＲＰ−ＨＰＬＣ精製段階の溶出物を直接分析試験する。他のＳＣＭ因 子は添加しておらず、またアッセイへのサンプルの追加もない。このＳＣＭ　Ｅ ＬＩＳＡアッセイは非競合的で、エソペンドルフ（登録商標）管に吸着している ＳＣＭ因子量か増大するほど、測定Ａ　４０５値も増加する。表１５からこれら の断片中には明らかに抗ＳＣＭ抗体に反応する物質か存在している。 表　１５ 癌細胞培養基から精製したＲＰ−ＨＰＬＣ溶出物のＳＣＭ因子に関するＥＬＴＳ Ａアッセイ信号／バックグラウンド比。 ＭＣＦ７乳癌細胞　１　４３ ＭＣＦ７乳癌細胞　２　１７ ＭＣＦ７乳癌細胞　３　７１ ＨＣＴ８０大腸癌細胞　１　３４ ＨＣＴ８０大腸癌細胞　２　１２ “バックグラウンドとは、吸着ＳＣＭ因子を有さない管内ＥＬＩＳＡ　Ａ４ｏｓ である。 第２６実験例 ＥＬＩＳＡアッセイによる培養幕内人癌細胞中のＳＣＭ因子の検出 抗体反応により、培養基内の人癌細胞がＳＣＭ因子分子を含んでいる様子を直接 観察する。複数の人癌細胞の単層培養地から洗浄して得た細胞、すなわち、ＭＣ Ｆ７乳癌細胞、Ｔ１０８０繊維肉腫細胞、Ａ２７８０卵巣癌細胞、ＨＣＴ８０大 腸癌細胞を第２５実験例の非競合ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイ法で直接分析試験する 。表１６にはその結果が示されている。算出されたＥＬ　Ｉ　ＳＡ吸着率（すな わち、吸着物によって分割された抗ＳＣＭ抗体が存在する場合、および抗ＳＣＭ 抗体が存在しない場合における吸着率であり、４ｘ１０６セル当たりのＳＣＭ因 子の量を相対的に測定したもの。）から異なる癌細胞系が、同じ条件下で、異な る量のＳＣＭ因子を生成したことが分かる。 タンパク合成抑制因子シクロへキシミドを有した培養癌細胞を処理した結果、タ ンパク合成を抑制すると培養癌細胞に伴うＳＣＭ因子の濃度が減少することが判 明した。ＭＣＦ７乳癌細胞の場合の減少率は２５．３％であり、またＴ１０８０ 繊維肉腫細胞の場合は３４％であった。この結果を表１７に示す。 表　１６ 抗ＳＣＭ因子抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイで検出される培養基内の人癌細胞 中のＳＣＭ因子 （４Ｘ１０’セル） ＭＣＦ７　乳癌細胞　６、Ｏ ＭＣＦ７　乳癌細胞　１０．０ ＭＣＦ７　乳癌細胞　７．　０ ７１０８０　繊維肉腫細胞　６．５ Ａ２７８０　卵巣癌細胞　４．６ ＨＣＴ８０　大腸癌細胞　３．　０ ＥＬＩＳＡ　Ａ４゜、（細胞＋抗体） ’ＥＬ　ｒ　ＳＡ　Ａ−ａｓ比−−−一−−−−−−−−−−−−ＥＬＩＳＡ　 Ａ４゜、（細胞−抗体） 表　１７ 抗ＳＣＭ因子抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイで検出された培養幕内人癌細胞中 のＳＣＭ因子合成に対するシクロへキシミドの作用癌細胞系　シクロへキンミド 　培養　補　正　対象標準の補正（４Ｘ１０’セル）　（μｇ／１０’セル）　 （時間）　Ａ４ｏｓ’　Ａａｏｓ　（％）ＭＣＦ７乳癌細胞　０　０　２．０７ １８　１００．０ＭＣＦ７乳癌細胞　２０　３　１．１１１１９３　９１．２Ｍ ＣＦ７乳癌１１１胞ＯｏＯ，９８５４１００，０ＭＣＦ７乳癌細ｔｌ　５０　１ ６　０．７２１７　７４．７Ｔ１０８０繊維細胞　０　０　１．５０６０　１０ ０．０Ｔ１０８０繊維細胞　５０　１８　０．９９４０　８６．０’Ｗ正Ａ、ａ ｏｓ　−（細胞存在下テノＥＬＩＳＡ　Ａ、。、　）　−（細胞不存在下’ｔ’ ）ＥＬｌｓＡ　Ａ−ａｓ　）第２７実験例 ＤＮＡ合成に対するＳＣＭ因子の作用 培養基中で成長した正常ラットの肝細胞を基にしてＤＮＡ合成に対するＳＣＭ因 子の効果を研究した。この方法は、１、Ｈａｙａｓｈｉ　＆　Ｂ、１．　Ｃａｒ ｒによってＪ。 Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２５の８２ページ（１９８５）に発表された［ラ ット肝細胞内でのＤＮＡ合成、血小板第９因子による抑制および内因性因子によ る刺激」にその詳細が示されている。つまり、前記肝細胞は、高圧コラゲナーゼ 環流法を用いて雄のラットの肝臓から得たものである。これらの細胞を１０％の 子牛の血清を補充したダルベツコ修正イーグル成長培地（ＤＭＥ）内で３５ｍｍ の組織培養回当たり３ｘ１０５セルの量で培養する。細胞培養から三時間経過す ると、１０ｎｇ／ｍｌの表皮細胞成長因子を添加する血清の無いＤＭＥへと前記 培地は変化し、ＤＮＡ合成が開始される。細胞懸濁液のアリコツトに各々１１０ ００ｎ／ｍｌ、１１００ｎ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ。 １、Ｏｎｇ／ｍｌ、Ｏ，ｌｎｇ／ｍｌの濃度のＳＣＭ因子を添加する。培養培質 は毎日変化していったが、一方、培養プレートは５％の炭酸ガスの中に３７℃の 温度で維持した。 培養から７２時間経過後に、各培養皿に５μＣｉ／ｍｌのトリチウム化チミジン を約６−８時間の間添加し続けた。 細胞がガラス管の中に削り落とした培養組織を遠心沈澱法で収集してＤＮＡ合成 を測定する。ＰＢＳでいったん水洗した後、２ｍｌの１０％低温トリクロロ酢酸 を容管に添加し、細胞を４℃の温度で１時間維持する。１０％ＴＣＡでさらに洗 浄した後に、遠心沈澱法で細胞を収集し、１ｍｌの０．５Ｎ　ＮａＯＨの中で３ ７℃の温度で一晩加水分解する。これらの試料のアリコツトは、比色測定法を用 いたタンパクアッセイに使用する。前記測定方法では、クーマン−（Ｃｏｏｍａ ｓｓｉｅ）ブリリアントブルーのタンパク特定染料で着色した後に５９５ｎｍの 波長で比色を行うものである。 試料の残りはトリチウム化チミジンの取り込み測定に使用する。このため、５０ ％ＴＣＡを０．２５ｍ１添加して試料を沈澱させる。氷の上に１０分間載置した 後にホワ・ソトマンＧＦ／Ｃフィルターでろ過し、乾燥させる。沈澱可能な酸性 材料中に取り込まれたトリチウム加チミジンをベックマンシンチレーションカウ ンターでカウントする。表１８にはその結果が示されており、細胞性タンパクミ リグラム当たりの取り込まれたチミジンの一分間当たりのカウントで表されてい る。供給量効果は、３０Ｍ因子の供与量が最低の時すなわちＯ９ｌｏｇ／ｍｌの 時に最大になっており、供与量が増大すると効果も低下し、１１０００ｎ／ｍｌ の時にＤＮＡ合成（１３％）がわずかながら抑制されてしまう。細胞成長やＤＮ Ａ合成のプロモーターであるＥＧＦの効果に加えて、このシステムではＤＮＡ合 成に対するＳ　ＣＭ因子の増大効果を分析しているため、３０Ｍ因子の供与量が 最大の時に起こる抑制効果は、３０Ｍ因子とＥＧＦの双方の存在による過剰な刺 激作用に対する反動であるラット肝細胞のＤＮＡ合成に及ぼす３０Ｍ因子の作用 ５０Ｍ因子供与量　μｇＤＮＡ当たりの相対ＤＮＡ合成（％）１０００　８６． ５ １μｇ当たりの相対ＤＮＡ合成− ｃｐｓ／μｇ　ＤＮＡ　（ＥＧＦ）　−ｃｐｓ　（バックグラウンド）タンパク の含有量の変化により発生したクエンチングに関してデータの補正を行った。 第２８実験例 α−１−ＰＩタンパク質分解酵素によるセリンタンパク質分解酵素の抑制作用へ 及ぼす３０Ｍ因子の効果カゼイン−レゾルフィン（Ｃａｓｅｉｎ−Ｒｅｓｏｒｕ ｆ　ｉｎ）をタンパク質分解酵素の基質として使用しながらタンパク質分解を行 わせてセワンタンパク質分解酵素抑制因子α−１−ＰＩによるセリンタンパク質 分解トリプシン、エラスターゼ、カテプシンＧの抑制作用へ及ぼす３０Ｍ因子の 効果を測定する。製造業者であるＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂ ｉｏｃｈｍｉｃａから提出された臨床記録に従いながらタンパク質分解酵素の活 性度を分析試験する。表１９にはトリプシンを使用した際の結果が示されており 、表２０にはエラスターゼを使用した際の結果が、さらに表２１にはカテプシン Ｇを使用した際の結果が示されている。 それぞれの場合、ＳＣＭ因子自体はタンパク質の分解作用には影響を及はすこと はなかった。しかしながら、α−１−ＰＩとの混合物中にα−１−ＰＩを添加す る前あるいは添加と同時に３０Ｍ因子を添加するとこα−１−ＰＩによってトリ プシンの抑制作用が阻止されてしまった。この影響の程度は添加する３０Ｍ因子 の量による。これに対して、表１９に示されているように、ますトリプシンとα −１−ＰＩを反応させることが可能な場合は、３０Ｍ因子をさらに添加してもα −１−ＰＩによってトリプシンの抑制作用が逆転することはない。α−１−ＰＩ てタンパク質分解酵素の抑制作用を阻止する分子の活動部分は、３０Ｍ因子の最 初の７つのアミノ末端アミノ酸残基内に存在している。 分子のこのような部分は、断片６あるいはＦ６として示されている。表２２には 、ＳＣＭ因子分子（表２０）全体と比べたα−１−ＰＩがエラスターゼの抑制作 用を阻止する際の等モル量のペプチドＦ６の有効性が示されている。 表　１９ α−１−ＰＩタンパク質分解酵素抑制因子によるトリプシンの活動性の抑制へ及 ぼす３０Ｍ因子の作用反応成分の添加順序°　未処理対照標準酵素からなるカゼ イン−レゾルフィンアッセイに ３ｕｇ）リブンン＋２３０ｕｇ　３０Ｍ因子　９９．９３μｇトリプシン＋６６ μｇ　α−１−ＰＩ　１３．６３μｇトリプシン＋６６μｇ　α−１−ＰＩ　１ ４．０（６０分間培養）　＋２３０μｇ　ＳＣＭ因子３μｇトリプシン＋２１μ ｇ　３０Ｍ因子　１５．６（１０分間培養）　＋８．８μｇ　α−１−ＰＩ３　 ｕ　ｇ　ト’）ブンン＋ＢＯｕｇ　３０Ｍ因子　４０．０（１０分間培養）＋６ ６μｇ　α−１−ＰＩ３μｇトリプシン＋１００μｇ　３０Ｍ因子　６２．５（ １０分間培養）　＋６．８μｇ　α−１−２１３８ｇトリプシン＋１５０μｇ　 ＳＣＭ囚子　９７７（１０分間培＃）　＋６．８μｇ　α−１−ＰＩ３μｇトリ プシン＋２３０μｇＳＣＭ因子　１０１７（１０分間培養）＋６６μｇ　α−１ −ＰＩＧ、６　ｕｇ　ａ　−４−ＰＩ＋２３０　ｕｇ　ＳＣＭ因ｆ’　１００． ６（１０分間培養）＋３μｇトリブンノ “全体反応量は３００μＬ 表　２０ α−１−ＰＩタンパク質分解酵素抑制因子によるトリプシンの活動性の抑制へ及 ぼすＳＣＭ因子の作用カゼイン−レゾルフィンアッセイに おけるトリプシンの活性度（％） ３．２μｇエラスターゼ（対照標準）１００．０３２μｇエラスターゼ＋２３０ μｇ　ＳＣＭ因子　１００．０３．２μｇエラスターゼ＋６６μｇ　α−１−Ｐ Ｉ　３．５３．２μｇエラスターゼ＋１０μｇ　ＳＣＭ因子　６．４（１０分間 培養）＋６．６μｇ　ａ−１−ＰＩ３２μｇエラスターゼ＋３０μｇ　ＳＣＭ因 子　７．０（１０分間培養）　＋８．８μｇ　α−１−ＰＩ３．２μｇエラスタ ーゼ＋６０μｇ　ＳＣＭ因子　５５．８（１０分間培養）　＋８．８μｇ　α− １−ＰＩ３．２μｇエラスターゼ＋ＩｆｌＯμｇ　ＳＣＭ因子　７１．１（１０ 分間培養）＋６６μｇ　α−１−ＰＩ３２μｇエラスターゼ＋１５０μｇ　ＳＣ Ｍ因子　７７．５（１０分間培養）　＋６．６μｇ　α−１−ＰＩ３２μｇエラ スターゼ＋２３０μｇ　ＳＣＭ因子　９０．　１（１０分間培養）　＋ａ、ｅμ ｇ　α−１−ＰＩ第２９実験例 表　２１ α−１−ＰＩタンパク質分解酵素抑制因子によるカテプンンＧの活動性の抑制へ 及ぼすＳＣＭ因子の作用１μｇ力テブンンＧ（対照標準）　１００．０１μｇカ テブンンＧ＋２４０μｇ　ＳＣＭ因子　９７０１μｇ力テブンンＧ＋６．８　ａ ｆｔ　ａ−１−ＰＩ　２０．　０１μｇカテブンンＧ＋２４Ｑμｇ　ＳＣＭ因子 　１０３０（ＩＱ分間培１り　＋８．６　ａｔ　ａ−１−ＰＩ０全体反応量は３ ００μＬ 表　２２ ａ−１−ＰＩタンパク質分解酵素抑制因子によるエラスターゼの活動性の抑制へ 及ぼすＳＣＭ因子から成るアミノ末端ペプチド断片Ｆ６　（１−７番目のアミノ 酸）の作用３．２μｇエラスターゼ＋１２０μｇＦ６　９８．０３．２μｇエラ スターゼ＋６．８　ｕｇ　ａ−１−ＰＩ　３．４３．２μｇエラスターゼ＋７２ μｇ　Ｆ６　３．８（１０分間培養）＋６６μｇ　α−１−Ｐ夏３２μｇエラス ターゼ＋２１．６μｇＦ６　９．８（ＩＯ分間培１）＋８．８μｇ　α−１−Ｐ Ｉ３．２μｇエラスターゼ＋３０，０μｊｌＦ６　３４．２（１０分間培養）＋ ６８μｇ　α−】−Ｐ夏３２μｇエラスターゼ＋８００μｇＦ５　３Ｂ、０（１ ０分間培養）＋６６μｇ　α−１〜Ｐ＋３２μｇエラスターゼ＋１２００μｇＦ ６　９６．３す、この値は健常ドナーのリンパ球の一般的な値である。 ＳＣＭ因子レセプターを有したタンパク質分解酵素抑制囚子α−１−ＰＩの相互 作用癌患者のＳＣＭ反応性リンパ球に関して、タンパク質分解酵素α−１−ＰＩ とＳＣＭ因子レセプターは互いに強く作用し合うことか確認された。α−１−Ｐ Ｉで培養した後に水洗を行い、上記のようなリンパ球からＳＣＭ因子レセプター を除去するとこのような相互作用が起こる。この結果、癌に侵されていないドナ ーの一般的なリンパ球に対するＳＣＭの反応は逆転してしまう。 悪性黒色腫の患者の血液サンプルと健常なドナーからＳＣＭ反応性リンパ球を分 離する。各サンプルのリンパ球懸濁液の半分を６ｘ１０６セル当たり３０ナノモ ールのα−１−ＰＩを用いて３７℃の温度で２，５時間培養する。そして残りの 半分を未処理の対照標準として保存しておく。 次に、ＰＢＳで細胞を三回洗浄する。未処理対照標準のアリコツトとα−１−Ｐ Ｉ処理済みサンプルの双方を植物凝集素（ＰＨＡ）またはＳＣん１因子て４０分 間誘発する。ＳＣＭの反応は、ｒＳＣＭ試験の実施」方法に基づき先述の細胞間 フルオロセイン蛍光偏光の変化で測定する。表２３に示されているように、黒色 腫患者の対照標準リンパ球のＲＢ　ＳＣＭ値は０．６３であり、この値は癌を患 ったドナーのリンパ球の一般的な値である。α−１−ＰＩで前培養処理を行った 同じリンパ球の場合はＲＰ　ｓｃＭ値は１，８であこれとは対照的に、健常ドナ ーのリンパ球をα−１−ＰＩで培養してもＳＣＭ試験におけるＰＨＡへの細胞の 反応にはさしたる影響は見られなかった。このリンパ球のＲＰ５゜９値は、培養 前は１．７４で培養後は１．６８であった。 表　２３ ａ−１−ＰＩのＳＣＭ−反応性修飾効果（ａｏｄｉｆｙｎｇ　ｅｌＴｅｃｔ）Ｓ ＣＭ反応 １ルパ球ドナー　ｌルバ球のＶｌｔｒｏ処理において　対照標準に対するＰ値（ ％）の診断　Ｐ　ＨＡ　Ｓ　ＣＭ因子ＲＲｓｃＭ悪性黒色職　なし　ｌ０Ｌ７　 Ｂ２．５　０．６３１！−１−ＰＩで２．５時間培養　５３．５　１００．２　 １．８０三度洗浄 健康　なし　５７．５　１０＋、７　１．７４０−１−ＰＩで２．５時間培養　 ６１．２　１０３．６　１．６１１三度洗浄 第３０実験例 ＳＣＭ因子合成の抑制 第２６実験例の表１７に示されているように、シクロへキシミドすなわちタンパ ク質合成の抑制因子で培養人癌細胞を処理すると、これら癌細胞から作り出され るＳＣＭ因子の量は減少してしまう。同様に、培養基中のＭＣＦ７人乳癌細胞に よってアスコルビン酸がＳＣＭ因子の合成を抑制することが確認されている。１ ０−’モルのアスコルビン酸が存在する状態または存在しない状態で１６時間培 養を行った後の７ｘｌＯ６セル当たりのＳＣＭ因子の量を、第２５実験例で説明 した非競合ＥＬＩＳＡ法で測定する。表２４にはその結果を示す。アスコルビン 酸イオンの存在下で培養した癌細胞のアリコツトで生成されたＳＣＭ因子は未処 理の対照標準細胞の場合よりも４３．９％少なかった。 ”癌検出と予防”１０．１−２０頁（１９８７）におけるり、Ｃｅｒｃｅｋ　＆ 　Ｂ、Ｃｅｒｃｅｋの「癌および正常増殖細胞内での細胞間フルオロセイン蛍光 発光偏光スペクトルに対するアスコルビン酸イオンの作用」に記されているよう に、アスコルビン酸は癌細胞内のミトコンドリアを選択的に無為な通常構造へと 変異させることが知られており、このためアスコルビン酸によってＳＣＭ因子合 成が抑制されたのは処理済み癌細胞の代謝活動が低下した結果であると考えられ る。 表　２４ 培養ＭＣＦ７人乳癌細胞内でのＳＣＭ因子合成に及ぼすアスコルビン酸イオンの 作用 補正　対照標準における補正 ３７℃ノ１１　Ｉｔ　テ１８時間培養　ＥＬＩＳＡ　Ａ４ｏｓ値’　ＥＬＩＳＡ 　Ａａｏｓ値（％）なしく対照標準）　１．７４４８　１００．０１　ＸＩＯ” Ｍ　Ｌ７スフルヒンｉｌｌ、　０．９７ｇ８　５８．１ｐＨ値７１ １補正ＥＬＩＳＡ　Ａａｏ、値−（ＥＬＩＳＡ　Ａ４０％値）＝（バックグラウ ンドＡ４ｏｓ）第３１実験例 リンパ球の自然細胞毒性作用に対する合成３０Ｍ因子およびその断片の作用 従来の５１（、放出法（第１３実験例）で測定した人骨髄性細胞系に５６２を標 的として利用しながら、第１６実験例ですでに説明したように、精製合成ＳＣＭ 因子分子とペプチドＦｌ−Ｆ５．Ｆ７およびＦ８を調べて、癌細胞へのリンパ球 の自然細胞毒性作用に対する前記ＳＣＭ因子分子とペプチドの抑制効果を測定す る。 つまり、ＲＰＭＩ−ＦＢＳ培養基内の懸濁液中で成長したに５６２標的細胞を洗 浄し、１００μＣｉナトリウム［５１Ｃ，］　クロム酸塩を用いて３７℃の温度 で３時間標識化し、ＲＰＭＩ成長培養基内で４時間洗浄する。使用する作動体リ ンパ球は、リンパ球のＳＣＭ反応性副次集団を分離するのに適した密度の溶液、 または末梢血リンパ球の全体集団の分離用である従来の分離剤ヒストベーク１０ ７７のいずれか一方を用い上述したｒＳＣＭＳＣ性リンパ球の分離」法に従って 健常ドナーのヘパリン化末梢血から分離する。この実験で使用した作動体細胞と 標的細胞の割合は４０：１である。対象標準サンプルは標的細胞のみを含んでお り、このサンプルを用いて標的細胞から放出されるバックグラウンドアイソトー プを測定する。前記試験サンプルには、０．２ｍＬの作動体リンパ球を添加する 標識化標的細胞アリコツト０．２ｍＬが含まれている。また前記作動体リンパ球 は、未処理であるか、あるいは全体合成８０Ｍ因子またはＦｌ−Ｆ５．Ｆ７およ びＦ８の断片のいずれかの断片を用いて３７℃の温度で２．５時間前処理を行っ ている。この試験は三回実施する。細胞懸濁液は、９５％の空気と５％のＣＯ２ からなる大気の中において３７℃の温度で１８時間培養する。次にサンプルを２ ００ｘｇで１０分間遠心沈澱させる。各試験サンプル管から、上澄み液のアリコ ツト０．２ｍＬを取り出す。上澄み液と残りの細胞ベレットをベックマンガンマ カウンターを用いてカウントする。上澄み液でのカウント値と細胞ペレットのカ ウント値を加算して最大可能アイソトープ放出のカウントをめる。５１Ｃ，放出 の平均値を用いて三度行った試験の各試験での５１０ｒ放出の百分率をめ、細胞 毒性作用の割合を表２５に示されている式を用いて算出する。 表２５に結果を示すこの実験から、リンパ球当たり３５フ工ムトモルの合成３０ Ｍ因子を用いてＳＣＭ反応性リンパ球とＰＢＬを培養すると、Ｋ５６２に対する 殺傷効果すなわち細胞毒性作用は未処理作動体リンパ球の細胞毒性作用に比べて ９７−９９．９％はど低下した。このことから、癌患者の血しょうの限外ろ適切 中に存在する自然ＳＣＭ因子よってすでに得られていた結果が確認された。合成 ３０Ｍ因子は、リンパ球のＳＣＭ反応性副次集団とＰＢＬ集団全体の双方の細胞 毒性作用を抑制する。表２５からも分がるように、合成３０Ｍ因子のＮＫ抑制効 果は不可逆であり、処理済みリンパ球を複数回洗浄してもこの効果は逆転するに ５６２骨髄性細胞に対するリンパ球の自然細胞毒性作用に及ぼす合成ＳＣＭ因子 の作用 ＳＣＭ−Ｒ１１４，０±３．０　０．１±０９　０１±０９ＳＣＭ−Ｒ７２，０ ±２．８　０．１１±０　、７　−−−ＳＣＭ−Ｒ４５，８±２．７　０．１± ０　、１１　−−−Ｐ　Ｂ　Ｌ　７７．８±２．５　１．２±１．０　−−−Ｐ 　Ｂ　Ｌ　７２．７±１２　３．２±０７　３０±０８Ｐ　Ｂ　Ｌ　ｆＩＯ，４ ±１．８　２．６±０．９　３．０±０８°リンパ球は全て健康なドナーから分 離抽出したものである。ＳＣＭ−Ｒとは、傾斜濃度溶液から分離した末梢血リン パ球の副次集団（ｓｕｂｐｏ四ｌａ＋１ｏｎ）であり、前記傾斜１度溶液ではＳ ＣＭ試験での植物＃集電（ＰＨＡ）に反応する副次集団が生成される。ＰＢＬと は、ヒストベーク（Ｈｌｓｔｏｐａｑｕｅ）　１０７７密度溶液で分離した末梢 血リンパ球の全体集団である。 １細胞毒性作用は第１３実験例に：ｃ！載されている方法で行った。 １処理済みリンパ球は、リンパ球当たり３５フ工ムトモルの合成ＳＣＭ因子を用 いて処理した。 値は、各実験毎に三日づつ行った試験の甲均である。作動体と対象物の割合は４ ０：１であった。 ＮＫ抑制効果の原因となるＳＣＭ因子分子の領域を確定するため、合成ＳＣＭ因 子のアミノ酸配列の異なる領域を示すペプチドで作動体リンパ球を処理する。表 ２６に示されているように、７つのカルボキシル末端アミノ酸を含んでいないペ プチドはリンパ球の自然細胞毒性作用には同等影響を及ぼさない。しかしながら 、第１４番目−第２９番目（断片Ｆ２）または第２３番目−第２９番目（断片Ｆ ８）を含むペプチドも細胞毒性作用の抑制では不活性である。 従って、ＮＫ抑制活動を行うには、合成ＳＣＭ分子の第８番目−第２９番目のア ミノ酸残基が必要であると思われる。 この領域は、分子のアミノ末端に存在しく第２８実験例）、α−１−ＰＩによる タンパク質分解酵素の抑制を防止する合成ＳＣＭ因子の領域とも異なる。ＳＣＭ 活動を司るＳＣＭ分子領域（第１４番目−第２２番目の残基）とは重複してはい るが（第１７例）、この分子領域よりも広いものでもある。例えば、ペプチド断 片Ｆ４は第１４番目残基から第２２番目残基にまで及んでおり、ＳＣＭ試験では 十分に能動的である。しかし、この断片がＮＫ活動を抑制することはない。 表　２６ 合成ＳＣＭ因子分子の細胞毒性作用抑制部の決定７２．７ｔ　１．２３．２　宜 Ｏｊ　７ａ、５　ｔ　＋、Ｏ＋４Ｊ　愈１．５７４Ｊ　＊　＋、５７６．２　倉 １．３７２．７　念１．３　|−−　−−− １１０．４　ｔ　１．０３．＋　庶０．Ｂ　ａｌ、ｏ倉１．０２．６　＊　Ｌ７ 　Ｂｏ、５　ｔ　ｊ、０８１．０虞＋、５７９Ｊ倉０．９　E−−−−− ＆６２Ｓ倉Ｌ５０．＋倉Ｏ９δ　−２ｊ倉０．２　−−−　４Ｊ、６怠１４　− −−　−−−　−−−７１．２宜１．５　−−−　−−−　−−−　・−−−− −−−−７２，７倉＋、０７１．７糞１．２ｎ、ｏ倉２．０　−−−　−−−　 −−−　−−−　−−−　−−−　−−−　１３．Ｏ童＋、８′細胞毒性作用の 百分率は、ＰＢＬを用いて第１３実験例に２戴した方法で測定した。 リンパ球は、全体合成ＳＣＭ因子またはＳＣＭ因子でペプチドを表す部分を３５ フ工ムトモル用いて３７℃の温度で２．５時間培養した。 １括弧内の数字は、合成ＳＣＭ因子の特定断片に含まれているアミノ酸残基の数 を表している。 値は、各実験毎に三日づつ行った試験の平均である。作動体と対象物の割合は４ ０１であった。 本発明の効果 本発明に係る、分離および精製ＳＣＭ因子、合成ＳＣＭ因子および断片のそれぞ れは、本願明細書において先述した要件を満足するものである。特に、これらを 用いることにより、特定構造から成る均質な誘発剤を使用してＳＣＭ反応の分析 試験を行うことができる。このような誘発剤を利用することにより、ＳＣＭアッ セイで抽出した組織を部分的に精製した誘発剤を使用する必要がなくなる。この ように部分的に精製された誘発剤は、不均質であり、バッチ毎に純度や力量にば らつきが生じてしまい、含有されている不純物のためＳＣＭ試験が妨げられてし まう。従って、本発明の誘発剤により、臨床研究や学術研究の信頼性および均一 性が大幅に向上される。 このようなＳＣＭ因子分子の完全アミノ酸配列を知ることで、固相ペプチド合成 技術や、あるいは、組換ＤＮＡを含む細胞内ペプチドを発現することが可能な遺 伝子工学技術を用いて大量に合成することが可能となる。 さらに、均質な精製ＳＣＭ因子が利用できるため、この因子に固有の抗体を生成 することが可能となる。また、このような抗体を生成することにより、生体内に おける少量のＳＣＭ因子を検出したり、あるいは監視する免疫アッセイを行うこ とが可能となる。この結果、癌を早期発見するための新規な非侵襲的器具が得ら れ、また癌治療の効力を監視することができる。このようなアッセイにより、例 えば、検出可能となる以前に癌細胞の転移を発見することが可能となる。また、 前記抗体は、生体内ＳＣＭ因子の影響を低下させて病気に対する癌患者の抵抗力 を高めるために治療に直接使用することもできる。 アッセイの臨床上の重要性に加え、このような因子を利用することにより癌研究 における新たな研究方法か開かれることにもなる。すなわち、周知の方法でＳＣ Ｍ因子のアミノ酸配列を変化できるため、従来は不可能であった構造的活性の研 究が可能になる。また、これらの因子は標忠化ができるため、生体内においてＳ 　ＣＭ因子と相互作用するレセプターまたはその他の分子を分離することも可能 になる。このように、患者のリンパ球のＳＣＭ因子に対するレセプターの検出の 際に、好適に標識化された純粋ＳＣＭ因子を使用することができる。従って、Ｓ ＣＭ試験の代替試験方法が提供できる。 本発明の好適な実施態様のうち幾つかの態様についてはかなり詳細な説明を行っ てきたが、上記以外の態様も可能である。従って、以下の特許請求の範囲におい て主張している本発明の技術思想およびその範囲は、本願明細書に記載されてい る上記実施例にのみ限定されるものではない。 ＦＩｒ：Ｊ、１ 冷戎ＳＯ閂因）の５０閂テ名十ｔＬしうテ９　内ａｔづＥ、）生フちフィー１し ＦＬＭＩ　ロ　ＱＮＴＫ ７ミノ瓢史　＠Ｚ？’Ｊ ＩＴｈｉｔ、＋ｔ＋ｔ７°’０７−ＩＬｚｌｚ　べ’−ｔ７７ＶＭ４’）Ｑ　＞ ｚ＝−−コンビ−一ターヒ４更つＴるユ旨１；よソ　４Ｔｓ。 アＯり”ラム、　（ｌぐ一ジ：Ｌ／　ｏ−ｒ）ＦＩＧ、　２ 隻寓（６り７し１し４−＋ｔｍ凶：鉦を九りひ椛べ°７゛デドｐ・うつ千比１カ しＬ文ＦＷ　Ｇ　ＡＥ　Ｇ　口　Ｒ アミノＩ！！Ｉｌｔ　弔乙）Ｊ ｎＦ１ａ！、童°菟＋も　フちフィー１しは　べ゛−１２７／マイ７０　リ；ニ ーコンピューターｔ　便ｍ巧３ユヒＦＪソ　１子を乙。 フ０ログ′籟　（ｆぐ−Ｃ１ン　０．５）ＦＩＧ、　３ ＳＯ門因Ｌ）らそ釦式の「コめっＥＬｒ５Ａ判しＬ１阪り４ａｉ図１、Ｉ！Ｉ　 下目へｆ）　ＳｃＨｆｇ　）４ｆＡ２、ｇ（％ｉＬｓｃＭ因峯壬九ｆ杢乞弔（・ Ｎインξに−４７３、ヒツジ九幕丸工５ｃｒｔ串・・ｒ；インキ、メ°−ｙａ／ （”Ｐ時季、？−１１懺イす噛ｔｒミ坑停）４、　ｐ−コ＋ロフー４レヮンｌ！ １Ｌ１ＪＬ＜　ｐＦＪｐ　）ｔ　’ｉ、　＊　４　＊。 ５、　４ｏ’ｒｒｕｖ＋（Ｐ＃−ｏＨ）＋；ａｉ’ａＬ’ＬＬＬ（０，Ｄ、）＊ ５’ＬＬＬＦＩＧ、　４ 壬ｔ　ＳＯ／’Ｉ　Ｔｒｉ　”ｐ５′ＦＬ−イ条□　カ　イめ２．７５　３，１ ０　３．９０　４，９０　５．５０Ｌ口口　（浄収　（１：Ｘ）） ・　５０Ｍ因）斗良１青 ・　フ゛ランク　（ｃ、ｃ、固与１；蕉りＴ配へ８ｒ１よ　’＋ｔ−ｋＳＩＥａ ｋ　らＣＭ　０’）　＋＝　付ＬＺ　ｈＡｒ　ｔｋＴｚ。 ＦＩＧ、５ ａｓｃ、Ｍ巴）まえ忰のｐ＾也 ０、日０　１．５５　２．７５　３．１０　３．！９０　４，９０　５．５０Ｌ 口Ｇ　（青！　（１：Ｘ）） ・　ｓｃｎ　因）駒釘Ｍ °　ブ゛ランク（５０門明）１よ黒し）キ九伴１ま、Ａ−ホールリン△−γトヘ 叱シア；ン（ＫＬＨンヒ８ｔ４トし「；后威　ｓｃｈ　因シｌ；　ｔキして　− ａ４ｔイー−［；。 Ｆ＋ｙｍＰＣ丁ｎｓｋＭ６１＊＄ｗｔａｌｓｈｅ１ｉ１２１１．ＰＨ１２ＢＱＶ ｔ１１−−１−＾−−−’−ＰＣＴ／υＳ　９１１０４３１４国際調査報告 ＵＳ　９１０４３３４ ＳＡ　４９７４７

Claims (83)

【特許請求の範囲】
1. １．配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋのものと略等価の両親媒性プロフ ィールを有する９アミノ酸残基のコア配列を含む少なくとも９アミノ酸残基のペ プチドから成る実質的に精製されたがん認識因子であって、がんにかかったドナ ーから分離された細胞質基質の構造（ＳＣＭ）テストにおいて反応し得るリンパ 球の細胞内蛍光偏光値を少なくとも１０％下げることを特徴とする実質的に精製 されたがん認識因子。
2. ２．がんにかかったドナーからのＳＣＭ反応リンパ球の細胞内蛍光偏光値を少な くとも２５％下げることを特徴とする請求の範囲第１項記載のがん認識因子。
3. ３．９アミノ酸残基のコア配列がＦ−Ｘ１５−Ｍ−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ ２０−Ｘ２１−Ｋであり、ここでＸ１５およびＸ１７は、それぞれＩ，Ｌ，およ びＶから成る群より独立に選択され、Ｘ１８はＤおよびＥから成る群より選択さ れ、Ｘ１９およびＸ２０は、それぞれＱおよびＮから成る群より独立に選択され 、そしてＸ２１はＳおよびＴから成る群より選択されることを特徴とする請求の 範囲第１項記載のがん認識因子。
4. ４．９アミノ酸残基のコア配列がＦ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋであるこ とを特徴とする請求の範囲第３項記載のがん認識因子。
5. ５．前記ペプチドが配列Ｆ−Ｘ１５−Ｍ−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ ２１−Ｋを有し、ここでＸ１５およびＸ１７は、それぞれＩ，Ｌ，およびＶから 成る群より独立に選択され、Ｘ１８はＤおよびＥから成る群より選択され、Ｘ１ ９およびＸ２０は、それぞれＱおよびＮから成る群より独立に選択され、そして Ｘ２１はＳおよびＴから成る群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載のがん認識因子。
6. ６．前記ペプチドが配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋを有することを特 徴とする請求の範囲第５項記載のがん認識因子。
7. ７．前記ペプチドが配列Ｆ−Ｘ９−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｘ１３−Ｆ−Ｘ１５−Ｍ−Ｘ１ ７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｋを有し、ここでＸ１３，Ｘ１５および Ｘ１７は、それぞれＩ，Ｌ，およびＶからなる群より独立に選択され、Ｘ１８は ＤおよびＥから成る群より選択され、Ｘ９，Ｘ１９およびＸ２０は、それぞれＱ およびＮから成る群より独立に選択され、そしてＸ２１はＳおよびＴから成る群 より選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載のがん認識因子。
8. ８．前記ペプチドが配列Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ −Ｔ−Ｋを有することを特徴とする請求の範囲第７項記載のがん認識因子。
9. ９．前記ペプチドが配列Ｆ−Ｘ９−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｘ１３−Ｆ−Ｘ１５−Ｍ−Ｘ１ ７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｋ−Ｘ２３−Ｐ−Ｘ２５−Ｆ−Ｍ−Ｇ− Ｋを有し、ここでＸ１３，Ｘ１５，Ｘ１７，Ｘ２３およびＸ２５は、それぞれＩ ，Ｌ，およびＶから成るる群より独立に選択され、Ｘ１８はＤおよびＥから成る 群より選択され、Ｘ９，Ｘ１９，およびＸ２０は、それぞれＱおよびＮから成る 群より独立に選択され、そしてＸ２１はＳおよびＴから成る群より選択されるこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載のがん認識因子。
10. １０．前記ペプチドが配列Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ− Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有することを特徴とする請求の範囲 第９項記載のがん認識因子。
11. １１．前記ペプチドが配列Ｍ−Ｘ２−Ｐ−Ｐ−Ｘ５−Ｘ６−Ｋ−Ｆ−Ｘ９−Ｋ− Ｐ−Ｆ−Ｘ１３−Ｆ−Ｘ１５−Ｍ−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１− Ｋを有し、ここでＸ２，Ｘ６，Ｘ１３，Ｘ１５およびＸ１７は、それぞれＩ，Ｌ ，およびＶから成る群より独立に選択され、Ｘ５およびＸ１８はそれぞれ独立に ＤおよびＥから成る群より選択され、Ｘ９，Ｘ１９およびＸ２０は、それぞれＱ およびＮから成る群より独立に選択され、そしてＸ２１はＳおよびＴから成る群 より選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載のがん認識因子。
12. １２．前記ペプチドが配列Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ− Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋを有することを特徴とする請求の範囲 第１１項記載のがん認識因子。
13. １３．細胞質基質の構造（ＳＣＭ）テストに有用な実質的に精製されたがん認識 因子であって、 Ｍ−Ｘ２−Ｐ−Ｐ−Ｘ５−Ｘ６−Ｋ−Ｆ−Ｘ９−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｘ１３−Ｆ−Ｘ１ ５−Ｍ−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｋ−Ｘ２３−Ｐ−Ｘ２５− Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋのアミノ酸配列を有するペプチドから実質的になり、ここでＸ２ ，Ｘ６，Ｘ１３，Ｘ１５，Ｘ１７，Ｘ２３およびＸ２５は、それぞれＩ，Ｌ，お よびＶから成る群より独立に選択され、Ｘ５およびＸ１８はそれぞれ独立にＤお よびＥから成る群より選択され、Ｘ９，Ｘ１９およびＸ２０は、それぞれＱおよ びＮから成る群より独立に選択され、そしてＸ２１はＳおよびＴから成る群より 選択され、 がんにかかったドナーからのＳＣＭ反応リンパ球の細胞内蛍光偏光値を少なくと も１０％下げることを特徴とする実質的に精製されたがん認識因子。
14. １４．細胞質基質の構造（ＳＣＭ）テストに有用な実質的に精製されたがん認識 因子であって、 アミノ酸１４−２２の位置にＦ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｘ１８−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋのコア配 列を含む２９から３５のアミノ酸残基から成るペプチドから実質的に成り、ここ でＸ１８はＤおよびＥから成る群より選択され、 がんにかかったドナーからのＳＣＭ反応リンパ球の細胞内蛍光偏光を少なくとも １０％下げることを特徴とする実質的に精製されたがん認識因子。
15. １５．前記ペプチドがＸ１−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｘ５−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ− Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｘ２３−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋの アミノ酸配列を有し、ここでＸ１はＶ、ＭおよびＳから成る群より選択され、Ｘ ５はＥおよびＤから成る群より選択され、そしてＸ２３はＴおよびＶから成る群 より選択されることを特徴とする請求の範囲第１４項記載のがん認識因子。
16. １６．前記因子が配列Ｖ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ− Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有するこ とを特徴とする請求の範囲第１５項記載の癌認識因子。
17. １７．前記因子が配列Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ− Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有するこ とを特徴とする請求の範囲第１５項記載の癌認識因子。
18. １８．前記因子が配列Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ− Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｃを有するこ とを特徴とする請求の範囲第１４項記載の癌認識因子。
19. １９．前記因子が配列Ｘ１−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ −Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｃ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有し、 ここでＸ１はＭおよびＶからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲 第１４項記載の癌認識因子。
20. ２０．前記因子が配列Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ− Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｃ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有するこ とを特徴とする請求の範囲第１９項記載の癌認識因子。
21. ２１．前記因子が配列Ｘ１−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ −Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｒ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有し、 ここでＸ１はＲおよびＳからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲 第１４項記載の癌認識因子。
22. ２２．前記因子が配列Ｒ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ− Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｒ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有するこ とを特徴とする請求の範囲第２１項記載の癌認識因子。
23. ２３．前記因子が配列Ｖ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ− Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有するこ とを特徴とする請求の範囲第１４項記載の癌認識因子。
24. ２４．前記因子が配列Ｖ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｃ−Ｐ−Ｆ−Ｖ− Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有するこ とを特徴とする請求の範囲第１４項記載の癌認識因子。
25. ２５．前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ− Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｆ−Ｍ− Ｇ−ＣおよびＸ１−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ −Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｃ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｃ −Ｔ−Ｅを有するペプチドからなる群より選択され、ここでＸ１はＲおよびＳか らなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の癌認識因子 。
26. ２６．前記ペプチドがアミノ酸配列Ｒ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ− Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｐ−Ｃ−Ｆ−Ｍ−Ｇ− Ｃを有することを特徴とする請求の範囲第２５項記載の癌認識因子。
27. ２７．前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｘ１−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ− Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｅ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｓ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ− Ｇ−ＫおよびＸ１−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ −Ｍ−Ｉ−Ｅ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｓ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｐ −Ｔ−Ｑを有するペプチドからなる群より選択され、ここでＸ１はＶおよびＳか らなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の癌認識因子 。
28. ２８．前記ペプチドがアミノ酸配列Ｖ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ− Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｅ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｓ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ− Ｋを有することを特徴とする請求の範囲第２７項記載の癌認識因子。
29. ２９．前記ペプチドがアミノ酸配列Ｘ１−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ −Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｅ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｓ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ −Ｋ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｐ−Ｔ−Ｑを有し、ここでＸ１はＳおよびＶからなることを 特徴とする請求の範囲第１４項記載の癌認識因子。
30. ３０．前記ペプチドがアミノ酸配列Ｓ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ− Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｅ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｓ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ− Ｋ−Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｐ−Ｔ−Ｑを有することを特徴とする請求の範囲第２９項記載 の癌認識因子。
31. ３１．公称１０００ダルトンの分子量でカットするフィルターを通過せしめられ 、公称５００ダルトンの分子量でカットするフィルターにより保持された低分子 量ペプチドから実質的になる細胞質基質の構造（ＳＣＭ）において活性である実 質的に純粋な癌認識因子であって、該因子が、標準ＳＣＭ試験により測定した、 癌をわずらったドナーからのＳＣＭ反応リンパ球の細胞内蛍光偏光値において少 なくとも１０％減少せしめることを特徴とする癌認識因子。
32. ３２．標準ＳＣＭ試験により測定した、癌をわずらったドナーからのＳＣＭ反応 リンパ球の細胞内蛍光偏光値において少なくとも２５％減少せしめることを特徴 とする請求の範囲第３１項記載の癌認識因子。
33. ３３．ドナー中に悪性の存在する場合または存在しない場合における哺乳類のド ナーから得たりンパ球を試験する方法であって、 （ａ）リンパ球の懸濁液を請求の範囲第１項、第１３項、第１４項または第３１ 項記載の実質的に精製した癌認識因子と接触せしめる工程、および （ｂ）前記リンパ球の前記懸濁液の接触工程により生じたりンパ球の細胞質基質 の構造における減少を測定する工程からなることを特徴とする方法。
34. ３４．前記細胞質基質の構造における減少を測定する工程が、（ａ）前記癌認識 因子と接触したリンパ球の第１のアリコートの蛍光偏光、Ｐｓを測定する工程、 （ｂ）前記癌認識因子と接触していないリンパ球の第２のアリコートの蛍光偏光 、Ｐｃを測定する工程、および（ｃ）ＰｓのＰｃに対する比を測定する工程から なり、これにより、約０．９未済のＰｓのＰｃに対する比が、前記リンパ球のド ナーのボディ中に悪性の存在を示すことを特徴とする請求の範囲第３３項記載の 方法。
35. ３５．前記細胞質基質の構造における減少を測定する工程が、（ａ）前記癌認識 因子と接触したリンパ球の第１のアリコートの蛍光偏光、Ｐｓを測定する工程、 （ｂ）植物凝集素、コンカナバリンＡ、およびアメリカヤマゴボウミトゲンから なる群より選択されたミトゲンと接触したリンパ球の第２のアリコートの蛍光偏 光、ＰＭを測定する工程、および （ｃ）ＰｓのＰＭに対する比として、ＲＰＳＣＭを測定する工程からなり、これ により、約０．９未満のＲＰＳＣＭが、前記リンパ球のドナーのボディ中に悪性 の存在を示すことを特徴とする請求の範囲第３３項記載の方法。
36. ３６．血液試料のドナーのボディ中に悪性の存在についてその血液試料をスクリ ーニングする方法であって、（ａ）前記血液試料から潜在的ＳＣＭ反応リンパ球 を分離する工程、 （ｂ）その分離したリンパ球を請求の範囲第１項、第１３項、第１４項または第 ３１項記載の実質的に精製した癌認識因子と接触せしめて該リンパ球を刺激する 工程、（ｃ）その刺激したリンパ球をフルオロジェニックエイジェント前駆体と 、該前駆体が前記リンパ球を通過し細胞内酵素的加水分解してフルオロジェニッ クエイジェントとなるのに十分な時間接触せしめ、それによりリンパ球を含む刺 激されたフルオロジェニックエイジェントを産生する工程、 （ｄ）該リンパ球を含む刺激されたフルオロジェニックエイジェントを偏光で励 起し、これによりリンパ球に蛍光を発生させる工程、 （ｅ）蛍光リンパ球の偏光値を測定するために、蛍光リンパ球からの垂直偏光お よび水平偏光蛍光放出を測定する工程、および （ｆ）前記刺激したリンパ球の測定偏光値を、工程（ｂ）を除いた工程（ａ）、 （ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の操作を施した同一のドナーからのリンパ球の対照 アリコートの偏光値と比較し、これにより前記リンパ球のドナーのボディ中に癌 の存在または不在を示す工程を含むことを特徴とする方法。
37. ３７．工程（ｂ）および（ｃ）が同時に生じることを特徴とする請求の範囲第３ ６項記載の方法。
38. ３８．請求の範囲第１項、第１３項、第１４項または第３１項記載の実質的に精 製した癌認識因子に特異的の抗体。
39. ３９．アミノ酸配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋを有する癌認識因子に 特異的であることを特徴とする請求の範囲第３８項記載の抗体。
40. ４０．アミノ酸配列Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ −Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有する癌認 識因子に特異的であることを特徴とする請求の範囲第３８項記載の抗体。
41. ４１．請求の範囲第１項、第１３項、第１４項または第３１項記載の実質的に精 製した癌認識因子に特異的の単クローン性抗体。
42. ４２．アミノ酸配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋを有する癌認識因子に 特異的であることを特徴とする請求の範囲第４１項記載の単クローン性抗体。
43. ４３．アミノ酸配列Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ −Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有する癌認 識因子に特異的であることを特徴とする請求の範囲第４１項記載の単クローン性 抗体。
44. ４４．体液中の癌認識因子の水準を測定する方法であって、（ａ）前記体液と請 求の範囲第３８項記載の抗体とを混合する工程、および （ｂ）イムノアッセイを行なうことにより前記体液中の癌認識因子と前記抗体と の間に生じる反応の度合いを測定する工程からなることを特徴とする方法。
45. ４５．前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、ケ ミルミネセンスイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、および抗原抗体複合 体の凝集によるイムノアッセイからなる群より選択されることを特徴とする請求 の範囲第４３項記載の方法。
46. ４６．体液中の癌認識因子の水準を測定する方法であって、（ａ）前記体液と請 求の範囲第４１項記載の単クローン性抗体とを混合する工程、および （ｂ）イムノアッセイを行なうことにより前記体液中の癌認識因子と前記単クロ ーン性抗体との間に生じる反応の度合いを測定する工程からなることを特徴とす る方法。
47. ４７．前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、ケ ミルミネセンスイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、および抗原抗体複合 体の凝集によるイムノアッセイからなる群より選択されることを特徴とする請求 の範囲第４６項記載の方法。
48. ４８．正規に癌認識因子を伴うタンパク質にコード化するＤＮＡからの単離にお いて、請求の範囲第１項、第１３項、第１４項または第３１項記載の実質的に精 製した癌認識因子にコード化する組換えＤＮＡ配列。
49. ４９．アミノ酸配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋを有する癌認識因子に コード化することを特徴とする請求の範囲第４８項記載のＤＮＡ配列。
50. ５０．アミノ酸配列Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ −Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋを有する癌認 識因子にコード化することを特徴とする請求の範囲第４８項記載のＤＮＡ配列。
51. ５１．競合する宿主細胞中の癌認識因子にコード化するＤＮＡを表現するのに効 果的な対照配列に実施可能に結合されていることを特徴とする請求の範囲第４８ 項記載のＤＮＡ配列。
52. ５２．請求の範囲第５１項記載のＤＮＡを含み、該ＤＮＡが表現される宿主細胞 の少なくともいくつかを移入することができることを特徴とするベクター。
53. ５３．請求の範囲第５２項記載のＤＮＡベクターにより移入される宿主細胞。
54. ５４．癌認識因子を産生する方法であって、（ａ）癌を患ったドナーから体液を 得る工程、（ｂ）１０００ダルトンより大きな公称分子量をカットする限外濾過 器を通過させる限外濾過により設定したように見掛けの分子量を有する分子から なる前記体液の第１の画分を、１０００ダルトン未満の見掛けの分子量を有する 分子からなる第２の画分から分離する工程、および（ｃ）前記第２の画分を精製 して実質的に純粋な癌認識因子を得る工程からなることを特徴とする方法。
55. ５５．前記体液が、末梢血、尿、プラズマ、および細胞吸引液からなる群より選 択されることを特徴とする請求の範囲第５４項記載の方法。
56. ５６．前記第１の画分から第２の画分の分離が、公称１０００ダルトン分子量で カットする限外濾過器を通過させる前記体液の限外濾過により行われることを特 徴とする請求の範囲第５４項記載の方法。
57. ５７．０から約７００ダルトンの分画範囲を有しそこから塩を分離することので きるゲル濾過カラム上に前記第２の画分を装填し、蒸留水で前記カラムから前記 装填した材料を溶出し、そして全クロマトグラフィー床容積の約０．３から約０ ．５倍の間の溶出容積で溶出した部分を集積することにより前記第２の画分を脱 塩し、それにより請求の範囲第５４項記載の第２の画分の固有活性と比較して、 前記集積し脱塩した部分の癌認識因子の固有活性を増大せしめる各工程を含むこ とを特徴とする請求の範囲第５４項記載の方法。
58. ５８．（ａ）約１５００から約３０，０００ダルトンの分画範囲を有するゲル濾 過カラム上に前記集積し脱塩した部分を装填し、（ｂ）アンモニウム塩の弱水溶 液で前記カラムから工程（ａ）のカラムに装填した材料を溶出し、（ｃ）全クロ マトグラフィー床容積の約０．４から約０．６倍の間の溶出容積で溶出した部分 を集積し、それにより請求の範囲第５７項記載の集積し脱塩した部分の固有活性 と比較して、前記集積した溶出物の癌認識因子の固有活性を増大せしめる各工程 を含むことを特徴とする請求の範囲第５７項記載の方法。
59. ５９．（ａ）ジエチルアミノエチルセルロース陰イオン交換カラムに前記集積し た溶出物を装填し、 （ｂ）アンモニウム塩の濃度を増大させながら、前記カラムより工程（ａ）のカ ラムに装填した材料を溶出し、（ｃ）アンモニウム塩の約０．２８から約０．３ １Ｍで前記カラムより溶出した溶出物の部分を集積し、それにより請求の範囲第 ５８項記載の集積した溶出物の固有活性と比較して、前記集積した溶出物の癌認 識因子の固有活性を増大せしめる各工程を含むことを特徴とする請求の範囲第５ ８項記載の方法。
60. ６０．逆相高圧クロマトグラフィーにより前記癌認識因子を請求の範囲第５９項 記載の前記集積した溶出物から精製して実質的に均一性とする工程をさらに含む ことを特徴とする請求の範囲第５９項記載の方法。
61. ６１．請求の範囲第５４項、第５７項、第５８項、第５９項または第６０項記載 の方法により産生された実質的に精製した癌認識因子。
62. ６２．癌患者を扱う方法であって、該患者の体液の少なくとも１つが癌認識因子 を含有し、該因子が配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋのものと実質的に 同等な両親媒性プロフィールを有する９のアミノ酸残基のコア配列を含む少なく とも９のアミノ酸残基のペプチドであり、（ａ）前記癌認識因子を含有する体液 を処理し、選択的にその因子を不活性にすることにより該因子の生体内効果を減 じ、 （ｂ）その体液を前記患者に戻し、それにより癌に対する患者の抵抗を高める各 工程を含むことを特徴とする方法。
63. ６３．前記体液が末梢血であり、該体液を処理する工程が１０００ダルトン未満 の見掛けの分子量のペプチドを除去する末梢血の透析からなり、それにより前記 癌認識因子が前記血からのペプチドの除去により選択的に不活性化されることを 特徴とする請求の範囲第６２項記載の方法。
64. ６４．前記体液を処理する工程が該体液中の前記癌認識因子を該癌認識因子に特 異的な抗体で中和することからなることを特徴とする請求の範囲第６２項記載の 方法。
65. ６５．前記体液を処理する工程が該体液中の前記癌認識因子を該癌認識因子に特 異的な抗体の１価抗原結合断片で中和することからなり、該１価の抗原結合断片 がＦａｂ断片およびＦａｂ′断片から選択されることを特徴とする請求の範囲第 ６２項記載の方法。
66. ６６．前記体液の処理工程が該体液中の前記癌認識因子を、そのセンス鎖が配列 Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋのものと実質的に同等な両親媒性プロフィ ールを有する９のアミノ酸残基のコア配列を含む少なくとも９のアミノ酸残基の 癌認識因子をコード化するＤＮＡ配列のアンチセンス鎖によりそのアミノ酸配列 がコード化されたペプチドであるアンチセンスペプチドで不活性化することから なることを特徴とする請求の範囲第６２項記載の方法。
67. ６７．前記癌認識因子が前記アミノ酸配列Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ を有することを特徴とする請求の範囲第６６項記載の方法。
68. ６８．前記癌認識因子がアミノ酸配列Ｍ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｎ−Ｋ −Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ−Ｎ−Ｔ−Ｋ−Ｖ−Ｐ−Ｌ−Ｆ−Ｍ−Ｇ −Ｋを有することを特徴とする請求の範囲第６６項記載の方法。
69. ６９．前記体液を、α−１−ＰＩプロフアーゼインヒビターと非相同性で実質的 にＳＣＭ因子により阻害される他のプロテアーゼと非相同性の天然または合成プ ロテアーゼインヒビターにより処理する工程をさらに含み、その処理に用いられ る前記プロテアーゼインヒビターはＳＣＭ因子によりα−１−ＰＩ阻害に対して 保護される癌関連プロテアーゼを阻害することができることを特徴とする請求の 範囲第６２項、第６３項、第６４項、第６５項または第６６項記載の方法。
70. ７０．前記患者を、腫瘍細胞による前記ＳＣＭ因子の産生を減少させる臨床的に 受容可能な代謝インヒビターで処理する工程を含むことを特徴とする請求の範囲 第６２項、第６３項、第６４項、第６５項または第６６項記載の方法。
71. ７１．前記代謝インヒビターがアスコルビン酸であることを特徴とする請求の範 囲第７０項記載の方法。
72. ７２．（ａ）請求の範囲第３８項記載の抗体に画像化物質で標識付けし、 （ｂ）標識付けた抗体を用いて、癌細胞を前記標識付けた抗体に露出することに より癌細胞を画像化する各工程からなる癌細胞の画像化方法。
73. ７３．（ａ）請求の範囲第４１項記載の前記単クローン性抗体を画像化物質で標 識付けし、 （ｂ）標識付けた単クローン性抗体を用いて、癌細胞を前記標識付けた抗体に露 出することにより癌細胞を画像化する各工程からなる癌細胞の画像化方法。
74. ７４．抗癌物質を癌細胞に導入する方法であって、（ａ）請求の範囲第３８項記 載の抗体に前記抗癌物質で標識付けし、 （ｂ）前記標識抗体が癌患者の癌細胞に結合するように前記患者に前記標識抗体 を施し、これにより前記癌細胞に前記抗癌物質を導入する方法。
75. ７５．抗癌物質を癌細胞に導入する方法であって、（ａ）請求の範囲第４１項記 載の単クローン性抗体に前記抗癌物質で標識付けし、 （ｂ）前記標識抗体が癌患者の癌細胞に結合するように前記患者に前記標識単ク ローン性抗体を施し、これにより前記癌細胞に前記抗癌物質を導入する方法。
76. ７６．Ｆ−Ｘ９−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｘ１３−Ｆ−Ｘ１５−Ｍ−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１ ９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｋ−Ｘ２３−Ｐ−Ｘ２５−Ｆ−Ｍ−Ｇ−Ｋのナチュラルキ ラー抑制（ＮＫ−抑制）配列を含む少なくとも２２のアミノ酸残基の実質的に精 製したペプチドであって、ここでＸ１３、Ｘ１５、Ｘ１７、Ｘ２３およびＸ２６ が、Ｉ、ＬおよびＶからなる群よりそれぞれ独立して選択され；Ｘ１８が、Ｄお よびＥからなる群より選択され；Ｘ９、Ｘ１９およびＸ２０が、ＱおよびＮから なる群よりそれぞれ独立して選択され；Ｘ２１が、ＳおよびＴからなる群より選 択され、前記ペプチドがＮＫ抑制活性を有することを特徴とするペプチド。
77. ７７．前記ＮＫ抑制配列がＦ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ− Ｎ−Ｔ−Ｋであることを特徴とする請求の範囲第７６項記載のペプチド。
78. ７８．前記ペプチドが配列Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｄ−Ｑ− Ｎ−Ｔ−Ｋを有することを特徴とする請求の範囲第７７項記載のペプチド。
79. ７９．細胞培養中の悪性細胞の成長を阻害することのできる抗癌剤の効果性を評 価する方法であって、前記培養がＮＫ活性を示すリンパ球と悪性細胞の両者を含 み、（ａ）前記細胞培養を、核細胞培養のリンパ球のＮＫ活性を実質的に抑制す るのに十分な量の請求の範囲第７６項記載の実質的に精製したＮＫ抑制ペプチド でインキュベーションし、 （ｂ）前記細胞培養に、前記悪性細胞の成長を阻害するのに十分な量の前記抗癌 剤を添加し、 （ｃ）リンパ球により生じたＮＫ活性が実質的にない状態で抗癌剤により生じた 前記悪性細胞の成長の阻害を観察することにより、前記悪性細胞への前記抗癌剤 の効果を測定する各工程を含むことを特徴とする方法。
80. ８０．リンパ球のＮＫ活性を抑制する方法であって、該リンパ球にＫ５６２細胞 の生体外リーシスにより測定された前記リンパ球のＮＫ活性を実質的に抑制する のに十分な量の請求の範囲第７６項記載の実質的に精製したペプチドを施すこと からなることを特徴とする方法。
81. ８１．ＳＣＭ因子に対する抗体、ＳＣＭ因子に対する抗体の１価抗原抗体断片、 およびそのセンス鎖がＦ−Ｘ９−Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ｘ１３−Ｆ−Ｘ１５−Ｍ−Ｘ１７ ７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｋ−Ｘ２３−Ｐ−Ｘ２５−Ｆ−Ｍ−Ｇ− ＫのＮＫ抑制配列にコード化するＤＮＡのアンチセンス鎖によりそのアミノ酸配 列がコード化されたペプチドのアンチセンスペプチドからなる群であり、ここで Ｘ１３、Ｘ１５、Ｘ１７、Ｘ２３およびＸ２５が、Ｉ、ＬおよびＶからなる群よ りそれぞれ独立して選択され；Ｘ１８が、ＤおよびＥからなる群より選択され； Ｘ９、Ｘ１９およびＸ２０が、ＱおよびＮからなる群よりそれぞれ独立して選択 され；Ｘ２１が、ＳおよびＴからなる群より選択されるものである群より選択さ れたＳＣＭ因子阻害物質を、前記ＳＣＭ因子のＮＫ抑制活動を実質的に逆転し、 前記リンパ球によるＫ５６２細胞の生体外リーシスにより測定される前記患者の リンパ球の正常なＮＫ活性を貯蔵するのに十分な量で、その体液の少なくとも１ つがＳＣＭ因子を含有する患者に施すことからなる生体内のＳＣＭ因子のＮＫ抑 制活動を逆転する方法。
82. ８２．生体内免疫抑制を誘発する方法であって、請求の範囲第１項、第１３項、 第１４項または第３１項記載の実質的に精製した癌認識因子、および請求の範囲 第７６項記載の実質的に精製したペプチドからなる群より選択された免疫抑制画 分を、単体でまたは同種移植片の生存を高めることのできる免疫抑制の度合いを 生じるのに十分な量の薬学的に容認できる担体と組み合わせて施す工程からなる ことを特徴とする方法。
83. ８３．ＳＣＭ因子に対するＳＣＭ反応リンパ球の感作を測定する方法であって、 （ｄ）ＳＣＭ反応リンパ球を単離し、 （ｅ）該単離したＳＣＭ反応リンパ球を洗浄し、（ｆ）該単離したＳＣＭ反応リ ンパ球を検出可能な標識で標識付けた請求の範囲第１項、第１３項、第１４項ま たは第３１項記載の実質的に精製した癌認識因子の飽和量でインキュベーション し、 （ｇ）前記リンパ球へのＳＣＭ因子に特異的な受容体の存在と、ＳＣＭ因子に対 する前記リンパ球の感作とを測定するために前記ＳＣＭ反応リンパ球に対する標 識付けた癌認識因子の結合程度を測定する各工程からなることを特徴とする方法 。