DE69326347T2

DE69326347T2 - Neuartiges endothelzell-molekül, das die bindung von lymphozyten im menschen vermittelt

Info

Publication number: DE69326347T2
Application number: DE69326347T
Authority: DE
Inventors: Sirpa Jalkanen; Marko Salmi
Original assignee: Biotie Therapies Corp
Current assignee: Biotie Therapies Corp
Priority date: 1992-06-09
Filing date: 1993-06-09
Publication date: 2000-02-24
Anticipated expiration: 2013-06-10
Also published as: ES2135480T3; FI20095269L; FI121176B; EP0656906B1; JPH07507557A; HU217175B; KR950701938A; WO1993025582A1; DK0656906T3; JP3431922B2; EP0656906A1; AU4328193A; CA2137551C; NZ253151A; CA2137551A1; GR3031255T3; JP3500384B2; DE69326347D1; AU671837B2; JP2003180346A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues menschliches Endothelzellen-Adhäsions-Antigen, das mit VAP-1 bezeichnet wird, einen monoclonalen Antikörper, 1B2, der das VAP-1-Antigen erkennt, und die Verwendung dieser Moleküle für die Diagnose und Behandlung chronischer und akuter entzündlicher und infektiöser Zustände, die durch eine Wanderung von Lymphocyten gekennzeichnet sind.
Die meisten reifen Lymphocyten zirkulieren kontinuierlich zwischen dem Blut und den lymphatischen Organen (Butcher, E. C., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 128 (1986), 85). Die Lymphocyten verlassen das Blut, indem sie die vaskulären Endothelzellen erkennen und daran binden. Danach wandern sie zwischen den Endothelzellen durch in die umliegenden Gewebe. Durch die Wanderung der Lymphocyten wird das volle Repertoire der Spezifitäten der Lymphocyten im ganzen Körper für Immunreaktionen verfügbar gemacht, und außerdem erleichtert sie die Zell-Zell-Wechselwirkungen, die für die Erzeugung und Steuerung von Immunantworten erforderlich sind. Das Anheften von Lymphocyten an Endothelzellen ist von den Wechselwirkungen zwischen komplementären Adhäsionsmolekülen abhängig, die auf den beiden Zelltypen exprimiert werden (Springer, T. A., Nature 346 (1990), 425; Stoolman, L. M., Cell 56 (1989), 907; Osborn, L., Cell 62 (1990), 3; Pober und Cotran, Transplantation 50 (1990), 537; Butcher, E. C., Cell. 67 (1991), 1033). Unter normalen Bedingungen binden die Lymphocyten hauptsächlich an spezialisierte postkapilläre Venolen, die hochendothele ("high endothelial") Venolen (HEV) genannt werden. Funktionell verschiedene Lymphocyten-HEV-Erkennungssysteme, die die Wanderung der Lymphocyten zu den peripheren Lymph knoten, den lymphatischen Organen der Schleimhaut, der Synovialis und der Haut in einer organspezifischen Art und Weise vermitteln, wurden beschrieben (Butcher, E. C., et al., Eur. J. Immunol. 10 (1980), 210; Jalkanen, S., et al., Science 233 (1986), 556; Picker, L. J., et al., Nature 349. (1991), 796). Bei der Entzündung wird durch die Aktivierung der Endothelzellen der Zustand der Adhäsionsmoleküle verändert, wodurch weitgehend das Ausmaß und die Art des Einströmens von Leukocyten in das betroffene Gewebe bestimmt wird. Somit sind die Endothelzellenmoleküle Schlüsselelemente, die die Besonderheiten der lokalen Immunantwort steuern, und es ist liegt auf der Hand, daß durch eine genaue Klärung der Mechanismen, welche die Bewegungen der Lymphocyten und die Extravasation der Leukocyten regulieren, neue Mittel zur klinischen Beeinflussung der Entzündungsantwort gefunden werden können.
Da beim Menschen die Liganden der Endothelzellen, die eine gewebeselektive "Rückkehr" ("homing") der Lymphocyten vermitteln, weitgehend unbekannt sind, besteht ein Bedarf an der Identifizierung solcher Moleküle.
Bisher wurden zwei auf Kohlenhydraten basierende endotheliale Liganden für Rezeptoren der Lymphocyten-"Rückkehr" mit Molekulargewichten von etwa 50 kd bzw. 90 kd identifiziert (Imai et al., J. Cell Biol. 112 (1991), 1213).
Die Erfinder legten bei einem Treffen der "European Federation of Immunological Societies" im Juni 1991 einen Bericht mit einigen vorläufigen Ergebnissen vor, die auf die Existenz eines bisher unbekannten Endothelzellen-Antigens hinweisen, das an der Bindung der Lymphocyten an hochendothele Venolen beteiligt ist (Salmi et al., EFIS 11. Meeting Abstracts, 21-12; 1991).
Außerdem legten die Erfinder einen Bericht über ein Endothelzellen-Antigen vor, das an der Bindung der Lymphocyten an die hochendothele Venolen beteiligt ist und das dem in der vorliegenden Erfindung vorgestellten VAP-1-Protein entspricht. Dieser Bericht umfaßt jedoch keine Beschreibung, die es möglich machen würde, das Antigen eindeutig zu erhalten (Jalkanen et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 0, Abstract W610, (1992) S. 107).
Nachdem die Erfinder sich der Wichtigkeit bewußt waren, Entzündungen beeinflussen zu können, und erkannten, daß es hierfür erforderlich ist, die Endothelzellen-Liganden aufzuklären, welche eine gewebeselektive "Rückkehr" der Lymphocyten vermitteln, versuchten sie, solche Moleküle zu identifizieren, die durch menschliche Synovialgefäße exprimiert werden. Diese Untersuchungen führten zur Identifizierung eines neuen Endothelzellenmoleküls, VAP-1, das die Bindung der Lymphocyten beim Menschen vermittelt, und zur Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen dieses Molekül. Diese Antikörper können in Tests zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von VAP-1- Spiegeln und außerdem für klinische Behandlungen eingesetzt werden, wobei die Wirkung von VAP-1 bei Patienten, die eine solche Behandlung brauchen, antagonisiert wird.
Demgemäß betrifft die Erfindung als erstes ein im wesentlichen gereinigtes und isoliertes menschliches endotheliales vaskuläres Adhäsions-Protein-1 (VAP-1), das ein durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen bestimmtes Molekulargewicht von 90 kd aufweist und das durch den monoclonalen Antikörper erkannt wird, der durch die Hybridomzellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2041 erhältlich ist.
Das VAP-1-Protein ist im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen, die beim menschlichen oder tierischen Wirt mit einem solchen VAP-1-Protein assoziiert sind.
Die Erfindung betrifft ferner ein isoliertes VAP-1-Protein.
Die Erfindung betrifft außerdem Antikörper gegen das VAP- 1-Protein, insbesondere monoclonale Antikörper, oder ein Anti- VAP-1-bindendes Fragment davon, und Zusammensetzungen, die solche Antikörper enthalten. Der monoclonale Antikörper 1B2 wird durch diese Erfindung bereitgestellt, und außerdem wird die Hybridomzellinie bereitgestellt, die ihn produziert (DSM ACC2041).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Antagonisierung der VAP-1-vermittelten Bindung von Endothelzellen an Lymphocyten, wobei das Verfahren die in vitro-Hemmung der VAP- 1-vermittelten Adhäsionsreaktion zwischen Lymphocyten und Endothelzellen umfaßt, indem ausreichend große Mengen eines Anti-VAP-1-Antikörpers bereitgestellt werden, um die VAP-1-Stellen der Endothelzellen zu blockieren, die an einer solchen Reaktion beteiligt sind, insbesondere wenn eine solche Adhäsionsreaktion zwischen Lymphocyten und Endothelzellen mit einer Erkrankung einhergeht, z. B. einer Entzündung (chronisch oder akut), Arthritis, rheumatoider Arthritis, Infektion, Dermatose, einer entzündlichen Darmerkrankung und einem Autoimmunleiden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Diagnose eines medizinischen Zustands, der durch die VAP-1-vermittelte Bindung von Endothelzellen an Lymphocyten vermittelt wird, bei einem Individuum, wobei das Verfahren den Nachweis der Bindung des Anti-VAP-1-Antikörpers an VAP-1-positive Zellen, die aus einem solchen Individuum entnommen wurden, und die Diagnose des medizinischen Zustands aufgrund einer solchen Bindung umfaßt, wobei solche medizinischen Zustände eine Entzündung (chronisch oder akut), Arthritis, rheumatoide Arthritis, Infektionen, Dermatosen, entzündliche Darmerkrankungen und Autoimmunleiden umfassen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Arzneimittel, das verwendet wird, um die VAP-1-vermittelte Adhäsionsreaktion zwischen Lymphocyten und Endothelzellen zu hemmen, wobei das Arzneimittel einen Anti-VAP-1-Antikörper oder ein Anti-VAP-1-bindendes Fragment davon und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Die Erfindung betrifft außerdem eine diagnostische Zusammensetzung, die verwendet wird, um die VAP-1-vermittelte Bindung von Endothelzellen an Lymphocyten bei einem Patienten zu diagnostizieren, wobei die diagnostische Zusammensetzung einen Anti-VAP-1-Antikörper oder ein Anti-VAP-1-bindendes Fragment davon und gegebenenfalls einen Träger umfaßt.
Fig. 1. Verteilung von VAP-1 in menschlichen Geweben. (A) In einer entzündeten Synovialmembran färbt der mAb 182 HEV-artige Gefäße stark an. (B) In Tonsillen schwankt die Expression von VAP-1 in HEV von stark (Pfeilspitzen) bis sehr schwach (Pfeile) oder negativ. (C) Die Immunfluoreszenzfärbung einer Tonsille zeigt die deutliche Expression von VAP-1 auf der luminalen Oberfläche der Gefäße (Pfeile). (D) Im Appendix sind nur wenige schwach angefärbte HEV zu sehen (Pfeilspitzen). Vergrößerungen: A ist 100 x, B ist 250 x, C und D sind 400 · vergrößert.
Fig. 2. VAP-1 ist ein 90 kd-Protein. Bahn 1: Silberfärbung von immungereinigtem VAP-1; Bahnen 2 und 3 : 1251-markierte Stromazellen von Tonsillen wurden entweder mit dem mAb 1B2 (Bahn 2) oder mit dem Kontroll-mAb 3G6 (Bahn 3) immungefällt. Die Banden im Bereich von 180 bis 200 kd liegen nicht immer vor. An der linken Seite sind Molekulargewichtsstandards angegeben. Von Lymphocyten befreite Tonsillenextrakte wurden in Lysepuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-Base, 0,15 mM MgCl&sub2;, 1 % NP-40, 1 mM PMSF und 1% Aprotinin) über Nacht bei 4ºC solubilisiert. Das Lysat wurde 30 Minuten bei 10000 · g bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde vorgeklärt, indem das Lysat über eine Säule mit Sephadex CL-4B (Pharmacia, Schweden) passiert wurde. Anschließend wurde es nacheinander auf drei CNBraktivierte Sepharose-4B-Säulen (Pharmacia) aufgetragen, die mit normalem Mausserum, mit einem irrelevanten IgG&sub1;-mAb und mit dem mAb 1B2 derivatisiert waren (5 mg/ml, 5 ml Säulenvolumen). Die Säule wurde mit dem Lysepuffer gründlich gewaschen. Danach wurde das an die 1B2-Säule gebundene Material mit 50 mM Triethanolamin eluiert, gefriergetrocknet, mit SDS-PAGE (7,5%, reduziert) aufgetrennt und unter Verwendung einer Silberfärbung sichtbar gemacht.
Fig. 3. VAP-1 ist an der Bindung von Lymphocyten an HEV beteiligt. Die Bindung von Lymphocyten an Tonsillen-, periphere Lymphknoten (PLN)-, Synovialis- und Appendix-HEV sowie die Bindung von Granulocyten an Tonsillen-HEV wurden in Gegenwart und in Abwesenheit des mAb 1B2 untersucht, wobei der in vitro- Gefrierschnitt-Test verwendet wurde. Die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten sind jeweils als Prozentsatz der Kontrollbindung mit Standardfehlern angegeben (100% = Zahl der gebundenen Zellen auf den mit 3G6 behandelten Schnitten).
Fig. 4. Das isolierte VAP-1 fördert die Lymphocytenbindung. Immungereinigtes VAP-1 und Kontrollproteine (1E12; ein nicht verwandtes Endothelzellenmolekül, das die Lymphocytenbindung fördert, und BSA) wurden an Glas absorbiert, und die Lymphocytenbindung wurde bestimmt. (A) Die Ergebnisse aus zwei unabhängigen Experimenten sind jeweils als Prozentsatz der Kontrollbindung angegeben (100% = Zahl der Zellen, die an das Platten gebundene VAP-1 oder 1E12 nach der Behandlung mit dem mAb 3G6 gebunden sind). Der unspezifische Hintergrund (Bindung an BSA) wird von allen Werten subtrahiert. (B) Lymphocytenbindung an eine VAP-1-beschichtete Vertiefung in Gegenwart des mAb 3G6. (C) Lymphocytenbindung an eine VAP-1-beschichtete Vertiefung in Gegenwart des mAb 1B2. VAP-1 und 1E12 wurden aus den Tonsillenextrakten affinitätsgereinigt, wie in Fig. 2 angegeben. Gereinigtes VAP-1, 1E12 und Hitze-inaktiviertes BSA wurden in 20 mlvi Tris-HCl, pH 7,4, 150 mlvi NaCl, 2 mM MgCl&sub2;, 2 mM CaCl&sub2;, mit 0,01% β-Octylglucopyranosid als Detergens, verdünnt. Die Proteine wurden 16 Stunden bei 4ºC an Glasvertiefungen (Lab-Tek chamber slides, Nung) absorbiert. Nach 30 Minuten Blockierung bei Raumtemperatur in PBS, die 1 mg/ml BSA enthielt, wurden 1B2- oder 3G6-Überstände in die Vertiefungen zugegeben und die Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Inzwischen wurden frisch isolierte periphere Blut-mononucleäre Zellen in RPMI 1640, enthaltend 10% FCS und 10 mM Hepes, eine Stunde bei 37ºC in Gewebekulturflaschen inkubiert, um die an Kunststoff haftenden Monocyten zu entfernen. In jede Vertiefung wurden nicht-haftende Lymphocyten (1,8 · 10&sup6; zellen pro Vertiefung) in 100 ul RPMI 1640 eingebracht. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37ºC wurden die nicht-haftenden Zellen durch eine ruckartige Bewegung entfernt. Das Obere der Vertiefungen wurden entfernt, die Objektträger wurden unter einem schonenden PBS-Strom gewaschen und in kalter PBS, die 1 % Glutaraldehyd enthielt, fixiert. Danach wurden die Zellen unter Verwendung von Diff-Quick-Farbstoffen gefärbt. Die gebundenen Zellen wurden quantitativ bestimmt, indem die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung visuell ermittelt wurde (Gesamtfläche von 50 mm² pro Probe).
Fig. 5. VAP-1 ist im entzündeten Darm nach oben reguliert. Im normalen Darm sind lediglich wenige schwach positive Gefäße in der Lamina propria zu sehen (A, in diesem Bereich sind die Venolen praktisch negativ für VAP-1). Im entzündeten Darm (ulcerative Colitis) sind zahlreiche VAP-1-positive Venolen (Pfeile) sowohl B) in der Lamina propria als auch C) in organisierten lymphatischen Follikeln zu sehen. Endogene Peroxidase-enthaltende Zellen (Mastzellen) zeigen unspezifische Reaktivität. e, Epithelzellen des Darms; lp, Lamina propria. Vergrößerung: 250 x.
Fig. 6. VAP-1-Induktion bei chronischen Dermatosen. Die Hautbiopsien aus einem normalen Bereich (A) und aus einer psoriatischen Läsion (B) desselben Patienten zeigen die Induktion von VAP-1 in Hautgefäßen (Pfeilspitzen) an den Stellen der Entzündung. Um die VAP-1-positiven Venolen herum sind perivaskuläre Leukocyteninfiltrate zu sehen. e, Epidermis. Vergrößerung 200fach. C) Die Expression von VAP-1 (eingeteilt von + bis ++++) in normaler und kranker Haut wurde in den paarweise vorliegenden Biopsien (nicht-betroffen und betroffen) aus denselben Patienten bestimmt. In Klammern ist die Zahl der zu jeder Gruppe zählenden Patienten angegeben.
Fig. 7. Das durch Entzündung induzierte VAP-1 vermittelt die Lymphocytenbindung. Ein Gefrierschnitt-Bindungstest wurde durchgeführt, wobei die Bindung von PBL an Faktor VII-positive Venolen in der entzündeten Lamina propria untersucht wurde. Die Hemmtests erfolgten durch Vorinkubation von Gewebeschnitten mit den mAbs 1B2 und 3G6. Die Ergebnisse sind als der jeweilige Prozentsatz der Kontrollbindung mit Standardfehlern angegeben (d. h., die Bindung von PBL in Gegenwart des mAb 3G6 definiert eine Bindung von 100%).
Die Wechselwirkungen zwischen den Leukocyten-Oberflächenrezeptoren und ihren Liganden auf den vaskulären Endothelzellen steuern die Wanderung der Lymphocyten zwischen dem Blut und den verschiedenen lymphatischen Organen und außerdem die Extravasation der Leukocyten zu den Stellen der Entzündung. Wir beschreiben hier ein neues 90 kd-Adhäsionsmolekül menschlicher Endothelzellen, (VAP-1), das durch einen monoclonalen Antikörper, 1B2, bestimmt wird. VAP-1 wird vorzugsweise auf hochendothele Venolen (HEV) von Synoviälis, peripheren Lymphknoten und Tonsillen exprimiert, und 1B2 hemmt deutlich die Bindung von Lymphocyten an die HEV in diesen Geweben, im Gegensatz zu denen in Schleimhäuten. Darüberhinaus binden Lymphocyten an Immunaffinität-isoliertes VAP-1 in einer Art und Weise, die durch 1B2 gehemmt werden kann. Das Expressionsmuster, das Molekulargewicht und die funktionellen Eigenschaften definieren VAP-1 als einen neuen endothelialen Liganden für Lymphocyten. Wir folgern daraus, daß VAP-1 ein neues vaskuläres Molekül ist, das direkt an den Lymphocytenbewegungen beim Menschen beteiligt ist.

Herstellung von Atikörpern

Zur anfänglichen Identifizierung des VAP-1-Proteins wurden monoclonale Antikörper gegen Synovialgefäße produziert, indem ein geeignetes Tier, wie z. B. Mäuse, mit Stromaelementen menschlicher Synovialis immunisiert wurden. Solche Stromaelemente der menschlichen Synovialis können unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Synovialstroma kann isoliert werden, indem die Lymphocyten aus dem Synovialgewebe entfernt werden. Das Synovialgewebe wird zerkleinert und das zerkleinerte Gewebe durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl gepreßt. Die Stromaelemente werden von der Oberseite des Siebs gewonnen.
Das Immunogen wird vorzugsweise zusammen mit einem Adjuvans verabreicht, z. B. mit inkomplettem Freundschem Adjuvans, wobei jedoch auch jedes andere geeignete Adjuvans verwendet werden kann. Das Immunogen und das Adjuvans werden nach einem beliebigen Schema oder Protokoll injiziert, das die Induktion der Antikörpersynthese bewirkt. Z. B. kann die Immunantwort induziert werden, indem das Immunogen (Synovialstromaelemente, die etwa 1 ug VAP-1-Antigen pro Injektion enthalten) dreimal im Abstand von jeweils einer Woche in die Sohlenballen von Balb/c-Mäusen, die frei vom spezifischen Pathogen sind, injiziert wird.
Lymphocyten aus poplitealen Lymphknoten werden unter Verwendung von Verfahren isoliert, die dem Fachmann bekannt sind, wie vorstehend beschrieben, indem die zerkleinerten Lymphknoten durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl gepresst und die freigesetzten Lymphocyten aus dem durchfließenden Material gewonnen werden, sodann werden diese mit den nichtsezernierenden NS-1-Mausmyelomzellen (verfügbar von ATCC, Nr. TIB 18) unter Verwendung von Standardprotokollen fusioniert. Die Hybridome können nach einem beliebigen Verfahren durchgemustert werden, z. B. durch Immunperoxidase-Färbung der gefrorenen Schnitte. Ein Hybridom (1B2, Unterklasse IgG&sub1;), das einen Antikörper produzierte, der mit dem vaskulären Endothelium der Synovialis reagierte, wurde zweimal durch limitierende Verdünnung cloniert und für die weitere Analyse ausgewählt. Das durch den mAb 1B2 erkannte Antigen wurde VAP-1 genannt (für vasculäres adhäsions-Protein-1).
Antikörper, die in den Verfahren der Erfindung als VAP-1- bindende Proteine eingesetzt werden, sind vorzugsweise monospezifische Antikörper, d. h. Antikörper mit einer Spezifität nur gegen VAP-1, oder ein antigenes Fragment davon. Monospezifische Antikörper können sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper sein.
Polyclonale Antikörper können hergestellt werden, indem einem geeigneten Tier ein im wesentlichen reines Präparat von VAP-1 injiziert wird, worauf eine oder mehrere Booster-Injektionen in geeigneten Abständen folgen.
Jedoch ist in den erfindungsgemäßen Verfahren die Verwendung von monoclonalen Antikörpern (oder biologisch aktiven Derivaten davon, wie z. B. Fab'-, F(ab')&sub2;- oder Fv-Fragmenten) bevorzugt, die gegen das VAP-1-Antigen gerichtet sind. Es sollte beachtet werden, daß die monoclonalen Antikörper aus jeder geeigneten Quelle stammen können und somit z. B. aus murinen oder humanen monoclonalen Antikörpern ausgewählt werden können.
Der Antikörper kann auch hergestellt werden, indem eine DNA-Sequenz, die für den Antikörper oder ein biologisch aktives Derivat davon codiert, in eine geeignete Zelle, z. B. eine mikrobielle, pflanzliche, tierische oder menschliche Zelle, cloniert wird und die Zelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die zur Produktion des betreffenden Antikörpers oder eines biologisch aktiven Derivates davon führen, und schließlich der Antikörper oder das biologisch aktive Derivat davon aus der Kultur gewonnen wird.
Die im erfindungsgemäßen Reagens verwendeten Antikörper sollten vorzugsweise in einer im wesentlichen reiner Form vorliegen, um die Genauigkeit des Verfahrens zu erhöhen.

Eigenschaften von VAP-1

Isoliertes VAP-1 hat unter reduzierenden Bedingungen ein Molekulargewicht von 90 kd und unter nicht-reduzierenden Bedingungen ein Molekulargewicht von 100 kd.
Für die Isolierung des VAP-1-Antigens ist die bevorzugte Quelle des VAP-1-Proteins ein von Lymphocyten befreiter Tonsillenextrakt. Diese Extrakte werden unter Entfernung der Lymphocyten aus dem Tonsillengewebe hergestellt, indem das zerkleinerte Gewebe durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl gepreßt wird. Die Stromaelemente werden von der Oberseite des Siebs gewonnen. Jedoch kann im nachstehend beschriebenen Verfahren jeder VAP-1-exprimierende Zelltyp eingesetzt werden, denn das als Beispiel dargestellte Verfahren beruht bei der endgültigen Isolierung auf der Affinität von VAP-1 zum mAb 1B2.
Alle Schritte sollten bei gekühlten Temperaturen (etwa 4ºC) erfolgen. Die Zellen werden schonend in einem Puffer lysiert (z. B. über Nacht bei 4ºC), der Substanzen zur Hemmung der Proteolyse enthält, z. B. in einem Puffer, der 150 mM NaCl, 10 mM Tris-Base, 0,15 mM MgCl&sub2;, 1% NP40, 1 mM PMSF und 1% Aprotinin umfaßt. Anschließend werden solche Extrakte vorzugsweise von den Zelltrümmern gereinigt, indem eine schonende Zentrifugation, z. B. 30 Min. bei 10000 · g, erfolgt. Der Überstand wird sodann auf eine Reihe von Affinitätssäulen aufgetragen, die als Affinitätssubstanz in der Reihenfolge die folgenden Stoffe enthalten: (1) normales Mausserum, (2) einen nicht-spezifischen IgG&sub1;-mAb (wie z. B. 1E12 oder einen im Handel verfügbaren nicht-spezifischen IgG&sub1;-mAb) und (3) den mAb 1B2. Das an die 1B2-mAb-Säule gebundene Material wird mit 50 mlvi Triethanolamin eluiert und gefriergetrocknet. Anhand dieser Vorgehensweise wird VAP-1 aus dem Tonsillenstroma isoliert. Auch andere entsprechende Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können eingesetzt werden.
Wie schon unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers 1B2 in Zellen nachgewiesen wurde, ist VAP-1 in HEV-artigen Venolen in entzündeten Synovialmembranen reichlich vorhanden.
VAP-1 liegt nicht in infiltrierenden Leukocyten und nicht in Bindegewebekomponenten des Synovialstromas vor. In peripheren Lymphknoten und Tonsillen scheint VAP-1 in den meisten HEV vorzuliegen. VAP-1 ist an der luminalen Seite der Endothelzellen stark vertreten. Eine körnige Färbung von VAP-1 ist im Cytoplasma der Endothelzellen und auch auf der abluminalen Oberfläche zu sehen.
Insbesondere in Tonsillen variieren die VAP-1-Spiegel zwischen den verschiedenen HEV stark, wobei das VAP-1 nur bei wenigen einzelnen HEV (mit einer typischen rundlichen Morphologie) völlig fehlt. Im Appendix und in der Lamina propria des Darms liegen lediglich wenige schwach gefärbte Venolen vor. Eine schwache Expression von VAP-1 zeigt sich auf Dendritenartigen Zellen in germinalen Zentren und auf glatten Muskelzellen von Arterien, Venen und Darmwand.
Im Gegensatz dazu liegt VAP-1 auf der luminalen Oberfläche größerer Gefäße praktisch nicht vor. Neben Leukocyten in Gewebeschnitten scheinen die folgenden Zellen kein VAP-1 zu exprimieren: periphere Blutlymphocyten, Monocyten, NK-Zellen, Granulocyten und isolierte Tonsillenleukocyten, die T-Lymphoblastoid-Zellinie CCRF-CEM (CCL 119, ATCC); die B-Lymphoblastoid-Zellinien KCA und IBW-4 (EBV-transformierte B-Zellinien, die ursprünglich von E. Engleman, Stanförd University, erhalten wurden), eine Monocyten-Zellinie, U937 (CRL 1593, ATCC); und die Leukämie-Zellinien KG-1 (CCL 246, ATCC); KG-1a (CCL 246.1, ATCC) und K562 (CCL 243, ATCC); die Endothelzellinie EaHy-926 (eine Hybridomzellinie aus Carcinom- und Endothelzellen, Edgell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 3724); und Primärkulturen von glatten Muskelzellen, Fibroblasten und Keratinocyten, und die epithelartige Zellinie HeLa (CCL 2, ATCC). Menschliche Endothelzellen der Nabelvene (HUVEC), die nach dem Verfahren von Jaffe isoliert wurden (J. Clin. Invest. 52 (1973), 2745), exprimierten kein VAP-1, weder basal noch nach 4- oder 20-stündigen Behandlungen mit IL-1 (20, 100 U/ml), TNF (200 U/ml oder LPS (0,1, 1,0 ug/ml).
Der Vergleich von VAP-1 mit den bekannten Endothelzellenmolekülen, die eine Bindung der Leukocyten vermitteln, zeigt mehrere Unterschiede. Die interzellulären Adhäsionsmoleküle 1 und 2 (ICAM-1 und ICAM-2), das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1), E-Selectin (ELAM-1) und P-Selectin (CD62, PADGEM, GMP 140) werden alle auf den HUVEC entweder basal oder nach Induktion durch Entzündungsmediatoren exprimiert (Springer, T. A., Nature 346 (1990), 425; Stoolman, L. M., Cell 56. (1989), 907; Osborn, L., Cell 62 (1990), 3; Pober und Cotran, Transplantation 50 (1990), 537; Butcher, E. C., Cell 67 (1991), 1033; de Fougerolles, A. R., et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 253; Osborn, L., et al., Cell 59 (1989), 1203; Bevilacqua, M. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 9238; McEver, R. P., et al., J. Clin. Invest. 84. (1989), 92; Hattori, R., et al., J. Biol. Chem. 264. (1989), 7768; Wellicome, S. M., et al., J. Immunol. 144 (1990), 2558; Pober, J. S., et al., J. Immunol. 132 (1986), 1893; Dustin, M. L., et al., J. Immunol. 137 (1986); 245). Im Gegensatz dazu wird VAP-1 weder konstitutiv exprimiert noch kann es durch eine Behandlung mit IL-1, TNFa oder LPS auf der Oberfläche oder im Cytoplasma von HUVEC induziert werden. Die Gewebeverteilungen dieser Moleküle sind deutlich verschieden - wobei die Verteilung auch verschieden ist, wenn sie auf parellelen Schnitten von Tonsillen analysiert wird (Daten nicht gezeigt). Die ICAMs färben die luminale Oberfläche der meisten großen und kleinen Gefäße und bestimmte Leukocyten an (de Fougerolles, A. R., et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 253; Dustin, M. L., et al., J. Immunol. 137 (1986), 245). VCAM-1 und ELMA-1 dagegen färben nur ganz wenige Venolen in entzündeten Geweben an (Rice, G. E., et al., J. Exp. Med. 171 (1990), 1369; Rice, G. E., et al., Am. J. Pathol. 138 (1991), 385; Cotran, R. S., et al., J. Exp. Med. 164 (1986), 661). Stattdessen wird VAP-1 auf der überwiegenden Mehrzahl von HEV, die nicht in Schleimhäuten liegen, kräftig exprimiert und fehlt auf allen weißen Blutkörperchen und getesteten Zellinien. Auch die Molekulargewichte der bekannten Adhäsionsmoleküle unterscheiden sich deutlich von dem Molekulargewicht von VAP-1, mit Ausnahme von ICAM-1 (ICAM-2 ist ein 60 kd-, VCAM-1 ein 110 kd-, E-Selectin ein 115 kd- und P-Selectin ein 140 kd-Molekül, Stoolman, L. M., Cell 56 (1989), 907; Osborn, L., Dell 62 (1990) 3; und de Fougerolles, A. R., et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 253). Ferner ist VAP-1 hauptsächlich an der Bindung von Lymphocyten beteiligt, während die ICAMs, E- und P-Selectin auch wirksam die Adhäsion von polymorphkernigen Leukocyten vermitteln (Springer, T. A., Nature 346 (1990), 425; Stoolman, L. M., Cell 56 (1989), 907; Osborn, L., Cell 62 (1990), 3; Pober und Cotran, Transplantation 50 (1990), 537; Butcher, E. C., Cell 67 (1991), 1033). Das einzige bisher beschriebene endotheliale Adhäsionsmolekül, das beim Menschen an der Bindung von Lymphocyten beteiligt ist und das nicht auf HWEC exprimiert wird, ist das mit MECA-79 bezeichnete Antigen (Berg, E. L., et al., J. Cell Biol. 114 (1991), 343). Jedoch ist es ein gewebespezifisches "Adressin" peripherer Lymphknoten. Außerdem wird VAP-1 nicht in allen MECA-79- positiven Venolen exprimiert, und der mAb 1B2 erkennt das gereinigte MECA-79-Antigen nicht.
Somit zeigen das Expressionsmuster, die Funktion und das Molekulargewicht von VAP-1, daß es mit keinem der bisher definierten, an der Lymphocytenbindung beteiligten Endothelmoleküle identisch ist und daß in vivo der Grad der Entzündung mit der Expressionsrate von VAP-1 korreliert. Diese Ergebnisse machen deutlich, daß VAP-1 für das Verständnis des physiologischen Lymphocytenkreislaufs beim Menschen wichtig ist und daß VAP-1 besonders für die Aufklärung der molekularen Mechanismen der gewebeselektiven "Heimkehr" der Lymphocyten wertvoll ist.

Verwendung von VAP-1 und VAP-1-bindenden Verbindungen

Die VAP-1-bindenden Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung enthalten sind, sind Anti-VAP-1-Antikörper oder Anti-VAP-1-bindende Fragmente davon. Andere mögliche VAP-1-bindende Verbindungen können geeignet sein, für die gleichen Zwecke eingesetzt zu werden, die nachstehend für die VAP-bindenden Verbindungen angegeben und in der vorliegenden Erfindung enthalten sind. Jedoch sind weder solche anderen Verbindungen noch ihre Verwendung zu den nachstehend angegebenen Zwecken als Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Reagens zum Nachweis von VAP-1-Protein und VAP-1-positiven Zellen in Proben, die von einem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wurden. Ein solches Reagens kann ein Antikör per sein, der mit dem VAP-1-Protein oder mit einem VAP-1-reaktiven Fragment des Antikörpers reagieren kann, der gewünschtenfalls mit einer Substanz markiert ist, über welche die Bindung des Antikörpers an das isolierte VAP-1 oder an Zellen, die VAP-1 an ihrer Oberfläche exprimieren, nachgewiesen werden kann. Eine solche diagnostische Zusammensetzung kann als ein Kit bereitgestellt werden, wobei ein solches Kit in getrennten Behältern die folgenden Stoffe umfaßt:
(a) einen Antikörper, der mit VAP-1 reagieren kann, oder ein biologisch aktives Derivat des Antikörpers, vorzugsweise markiert mit einer Substanz, über welche die Bindung des Antikörpers an das VAP-1-Antigen nachgewiesen werden kann; und
(b) gereinigtes VAP-1-Protein, wodurch ein Standard für die Auswertung der Testergebnisse bereitgestellt wird.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, das wirksame Mengen einer VAP-1-bindenden Verbindung umfaßt (die ein Antikörper, der mit VAP-1 reagieren kann, oder ein biologisch aktives Derivat eines solchen Antikörpers ist), zur Abschwächung oder zur Behandlung einer Entzündung im menschlichen oder tierischen Körper durch Verabreichung an einen menschlichen oder tierischen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt.
Der Begriff "Behandlung" oder "Behandeln" soll die Verabreichung von VAP-1-bindenden Verbindungen an ein Individuum zu bestimmten Zwecken umfassen, welche die Prophylaxe, Linderung, Verhütung oder Heilung von Störungen einschließen können, die durch VAP-1-Adhäsionsvorgänge vermittelt werden. Die besonderen VAP-1-bindenden Moleküle, die Gegenstand der erfindungsgemäßen Verfahren sind, sind gereinigte native und rekombinante VAP-1-bindende Proteine, die Antikörper oder Anti-VAP-1-bindende Fragmente davon darstellen.
Für die Verabreichung an einen Patienten kann das erfindungsgemäße Reagens in einer Weise formuliert werden, daß es für die parenterale, nasale, enterale oder rektale Verabreichung geeignet ist. Somit kann das Reagens z. B. in Form einer injizierbaren Formulierung, Aerosol-Formulierung, Suspension, Lösung, eines Klistiers usw. vorliegen. Das Reagens kann mit pharmazeutisch verträglichen Excipienten oder Trägern, wie z. B. isotonischer Kochsalzlösung, gemäß der herkömmlichen pharmazeutischen Praxis formuliert werden. Die Dosierung des Reagens ist ausreichend hoch, um beim Patienten eine entzündungshemmende Wirkung bereitzustellen, indem die VAP-1-Adhäsionsvorgänge blockiert werden.
Das erfindungsgemäße Reagens ist für die Diagnose oder Behandlung eines Zustands geeignet, der eine durch VAP-1-Adhäsion vermittelte, stärkere Entzündungsreaktion umfaßt. Somit kann das Reagens zur Diagnose von Leiden wie Arthritis, lokalen Infektionen, Dermatosen, entzündlichen Darmerkrankungen, Autoimmunleiden usw. eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform sind die wirksamen Mengen der VAP-1-bindenden Verbindung, wie vorstehend definiert, für die Verabreichung so groß, daß ein therapeutischer Nutzen gegen die schädlichen sekundären entzündlichen Effekte einer Entzündung bereitgestellt wird. Mit einer "wirksamen Menge" der VAP- 1-bindenden Verbindung ist eine Menge gemeint, bei der die toxischen Effekte der VAP-1-vermittelten Vorgänge zumindest abgeschwächt werden. Mit "exzessiven" VAP-1-vermittelten Vorgängen bei einem Wirt ist ein Niveau von VAP-1-vermittelten Adhäsionsvorgängen bei Individuen gemeint, welches über der Norm für den gesunden medizinischen Status des Individuums liegt. Mit "sekundärer" Gewebeschädigung oder toxischen Effekten ist die Gewebeschädigung oder sind die toxischen Effekte gemeint, die bei ansonsten gesunden Geweben, Organen und den darin vorliegenden Zellen aufgrund von exzessiven VAP-1-vermittelten Adhäsionsvorgängen erfolgen, wobei sie die Folge eines "primären" Stimulus anderswo im Körper sein können.
Die Infusion der VAP-1-bindenden Verbindungen, wie vorstehend definiert, wie z. B. von VAP-1-Antikörpern, in einen Patienten führt zu einer Bindung solcher Antikörper an die Zellen des Patienten, welche auf ihrer Oberfläche VAP-1 exprimieren, wie z. B. Synovial-HEV, periphere Lymphknoten-HEV und Tonsillen-HEV, so daß ihre Adhäsion an andere Zellen durch VAP-1-Bindung verhindert wird, wodurch das Anheften von Lymphocyten an solche Gewebe und Zellen verhindert oder gehemmt wird, und auf diese Weise werden unerwünschte Bewegungen oder das Einströmen von Lymphocyten in die betroffenen Gewebe oder Zellen verhindert, somit werden unerwünschte entzündliche Antworten verhindert, die von VAP-1-gesteuerten Leukocytenbewegungen und Leukocyten-Extravasation herrühren.
Demgemäß stellen die Arzneimittel der Erfindung Zusammensetzungen bereit, die VAP-1-bindende Verbindungen, wie vorstehend definiert, in Mengen enthalten, die ausreichend groß sind, um die natürliche VAP-1-Bindung beim Patienten an biologische Ziele von VAP-1 im Patienten, und insbesondere an Endothelzellen, (vollständig oder teilweise) zu antagonisieren.
Die VAP-1-bindenden Verbindungen können entweder chemisch oder durch gentechnische Verfahren an Fragmente von anderen Mitteln konjugiert werden, welche diese VAP-1-bindenden Verbindungen, wie vorstehend definiert, zu einer bestimmten gewünschten Wirkstelle hinführen können. Alternativ können andere Verbindungen entweder chemisch oder durch gentechnische Verfahren an die VAP-1-bindende Verbindung, wie vorstehend definiert, konjugiert werden, so daß für eine solche VAP-1-bindende Verbindung zusätzliche Eigenschaften verbessert oder bereitgestellt werden, insbesondere Eigenschaften, welche die Fähigkeit der Verbindung steigern, die Linderung der durch VAP-1-Adhäsion vermittelten toxischen Effekte zu fördern.
Die Mengen und Schemata für die Verabreichung der VAP-1- bindenden Verbindungen, wie vorstehend definiert, können durch den Fachmann einfach bestimmt werden, der sich in der klinischen Behandlung von mit Entzündungen zusammenhängenden Leiden, wie Arthritis und Gewebeschäden, auskennt. Im allgemeinen hängt die Dosierung der Behandlung mit der VAP-1-bindenden Verbindung von bestimmten Punkten ab, wie Art der verwendeten VAP-1-bindenden Verbindung; dem Alter; dem Gesundheitszustand; den zu behandelnden medizinischen Leiden; der Art der gleichzeitigen Behandlung, sofern eine erfolgt, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der gewünschten Wirkung; dem Ausmaß der Gewebeschädigung; dem Geschlecht; davon, wie lange die Symptome vorliegen; und gegebenenfalls den Kontraindikationen sowie von anderen Variablen, und muß vom jeweiligen Arzt angepaßt werden. Eine gewünschte Dosierung kann so eingesetzt werden, daß sie in einer oder mehreren Anwendungen verabreicht wird, so daß die gewünschten Ergebnisse erhalten werden. Arzneimit tel, die die erfindungsgemäße VAP-1-bindende Verbindung enthalten, wie z. B. Anti-VAP-1-Antikörper, können in Einheitsdosierungsformen bereitgestellt werden.
Die Arzneimittel, welche die erfindungsgemäßen VAP-1-bindenden Verbindungen enthalten, können so eingesetzt werden, daß sie in einem geeigneten pharmazeutischen Träger für die Verabreichung verabreicht werden. Sie können so eingesetzt werden, daß sie in einer Form verabreicht werden, die eine prophylaktische, palliative, präventive oder heilende Wirkung auf Leiden mit VAP-1-vermittelten Vorgängen bei Menschen und Tieren hat. Zum Zweck der Definition sollen die Bezeichnung "Arzneimittel zur Behandlung" einer Krankheit und ähnliche Bezeichnungen in der Beschreibung und in den Patentansprüchen so verstanden werden, daß sie ein Arzneimittel für die Verhinderung einer solchen Krankheit umfassen.
Präparate der VAP-1-bindenden Proteine der Erfindung, wie vorstehend definiert, für die parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungsmittel, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele von nicht-wäßrigen Lösungsmitteln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliches Öl, Fischöl und injizierbare organische Ester. Wäßrige Träger umfassen Wasser, Wasser-Alkohol-Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösung, und gepufferte medizinische parenterale Träger, einschließlich Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose-Lösung, Dextrose-plus-Natriumchlorid-Lösung, Lactose enthaltende Ringer-Lösung oder nichtflüchtige Öle. Intravenöse Träger umfassen Flüssigkeits- oder Nährstoff-Ersatzlösungen, Elektrolyt-Ersatzlösungen, wie z. B. die auf Ringer-Dextrose basierenden Lösungen und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen VAP-1-bindenden Verbindungen, wie vorstehend definiert, können auch so eingesetzt werden, daß sie mittels Pumpen oder in Formen mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden, insbesondere wenn der ursprüngliche Schaden nicht akut ist, sondern eher länger andauert oder verzögert auftritt. Ein Beispiel, bei dem der ursprüngliche Schaden häufig nicht akut ist, sondern eher länger andauert oder verzögert auftritt, ist eine Infektion oder Verstauchung, wobei die Schädigung des Gewebes oder Muskels sich erst Tage nach der ursprünglichen Infektion oder Schädigung zeigt (oder fortbesteht). Die VAP-1-bindenden Moleküle der Erfindung können auch in hoher Konzentration an spezifische Organe verabreicht werden, indem Katheter an die geeignete Stelle eingeführt werden oder indem solche Moleküle als Teil eines chimären Moleküls (oder Komplexes) bereitgestellt werden, das so konstruiert ist, daß es spezifische Organe zum Ziel hat.
Die Verabreichung einer Form mit verzögerter Freisetzung ist für den Patienten angenehmer, wenn wiederholte Injektionen über längere Zeiträume indiziert sind. Z. B. ist es wünschenswert, die erfindungsgemäßen VAP-1-bindenden Proteine, wie vorstehend definiert, für die Verabreichung in einer Form mit verzögerter Freisetzung zu verwenden, wenn die Arzneimittel der Erfindung zur Behandlung einer genetischen oder chronischen entzündlichen Erkrankung eingesetzt werden, die auf einer VAP-1-betreffenden Störung beruht, so daß die Behandlung für den Patienten so angenehm wie möglich wird.
Die VAP-1-bindende Verbindung der Erfindung kann in Dosierungsformen, wie z. B. Tabletten, Kapseln, Pulvereinheiten oder flüssigen Lösungen für die orale Verabreichung eingesetzt werden, sofern die biologische Aktivität der VAP-1-bindenden Verbindung nicht durch den Verdauungsvorgang zerstört wird und die Eigenschaften der Verbindung eine Aufnahme über das Darmgewebe erlauben.
Die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung werden nach Verfahren hergestellt, die an und für sich bekannt sind, z. B. durch herkömmliches Mischen, Granulieren, Herstellen von Dragees, Lösen, Gefriertrocknen oder durch ähnliche Prozesse. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung finden Anwendung bei der Bekämpfung einer VAP-1-induzierten physiologischen Schädigung, ob sie nun chronisch oder akut ist. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beugen den körpereigenen Mechanismen zur Erkennung der VAP-1-Adhäsion bis zur maximalen Stärke vor.
Als intravenöse Dosierungsformen zeigen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen ausreichend schnellen Wirkungseintritt, so daß sie zur Akutbehandlung einer potentiellen Gewebeschädigung eingesetzt werden können.
Außerdem kann eine Version mit geringer Wirksamkeit zur Behandlung von leichten oder chronischen, mit VAP-1 zusammenhängenden Störungen verwendet werden.
Ferner stellen die Mittel der vorliegenden Erfindung die erforderlichen Reagenzien für den Labortest von VAP-1-Spiegeln im Blutkreislauf oder in extrazellulären Geweben von Menschen oder Tieren bereit.
Die VAP-1-bindenden Proteine, die im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen sind, können aus ihren natürlichen oder rekombinanten Quellen gemäß herkömmlichen Bedingungen und Techniken isoliert und gereinigt werden, die früher schon zur Isolierung solcher Proteine eingesetzt wurden, wie z. B. Extraktion, Fällung, Chromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese oder dergleichen.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung lediglich erläutern und in keiner Weise ihren Umfang einschränken.

Beispiele

Beispiel 1

Gewebeverteilung von VAP-1

Die Gewebeverteilung von VAP-1 wurde durch Immunperoxidase-Färbung von Kryostatschnitten bestimmt. Die Schnitte wurden 30 Minuten mit primären Antikörpern (1B2 und 3G6, ein Kontroll-Maus-IgG&sub1;-mAb gegen Hühner-T-Zellen) inkubiert. Nach zweimaligem Waschen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 8 g NaCl, 1,21 g K&sub2;HPO&sub4; und 0,34 g KH&sub2;PO&sub4; pro Liter, pH 7,2) wurde Peroxidase-konjugiertes Schaf-Anti-Maus-IgG (Dakopatt, Dänemark) in PBS, enthaltend 5% AB-Serum, für 30 Minuten zugegeben. Als nächstes wurde 3,3-Diaminobenzidin-Hydrochlorid in PBS, enthaltend 0,03% Wasserstoffperoxid, als Chromogen eingesetzt. Nach der Färbung wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden die 3 um-Kryostatschnitte mit den primären Antikörpern bedeckt und das FITC-konjugierte Schaf-Anti-Maus-IgG (Sigma, St. Louis) als sekundäres Reagens eingesetzt.
Die immunhistologischen Färbungen zeigten, daß der monoclonale Antikörper 1B2 HEV-artige Venolen in entzündeten Syno vialmembranen stark anfärbte (Fig. 1A). Keine Färbung wurde bei infiltrierenden Leukocyten und den Bindegewebekomponenten des Synovialstromas beobachtet. Das durch den mAb 1B2 erkannte Antigen wurde VAP-1 genannt (für Masculäres Adhäsions-Brotein- 1). In peripheren Lymphknoten und Tonsillen reagierte der mAb 1B2 mit der Mehrzahl der HEV (Fig. 1B). VAP-1 wurde an der luminalen Seite der Endothelzellen kräftig exprimiert (Fig. 1C). Eine körnige Färbung war im Cytoplasma der Endothelzellen zu sehen, und außerdem war die abluminale Oberfläche mAb-1B2-positiv. Insbesondere in Tonsillen unterschied sich die Intensität der Färbung deutlich zwischen den verschiedenen HEV, außerdem waren einzelne HEV mit einer typischen rundlichen Morphologie 1B2-negativ (Fig. 1D). Im Appendix und in der Lamina propria des Darms wurden nur wenige schwach gefärbte Venolen nachgewiesen. Eine schwache Expression von VAP-1 war auch auf Dendritenartigen Zellen in germinalen Zentren und auf glatten Muskelzellen von Arterien, Venen und Darmwand zu sehen. Im Gegensatz dazu fehlte VAP-1 auf der luminalen Oberfläche größerer Gefäße praktisch vollständig. Wie die Leukocyten in Gewebeschnitten waren die peripheren Blutlymphocyten, Monocyten, NK-Zellen, Granulocyten und isolierte Tonsillen-Leukocyten in den FACS-Analysen alle vollständig 1B2-negativ. T-Lymphoblastoid- (CCRF-CEM), B-Lyphoblastoid- (KCA, IBW-4), Monocyten- (U937) und Leukämie-Zellinien (KG-1, KG-1a, K 562) wiesen alle kein VAP-1 auf. Außerdem fehlte VAP-1 bei Endothelzellen der menschlichen Nabelvene (HUVEC) basal; ferner konnten 4- oder 20-stündige Behandlungen mit IL-1 (20, 100 U/ml), TNF-u (200 U/ml) oder LPS (0,1, 1,0 ug/ml) seine Synthese nicht induzieren. Eine Endothelzellinie (EaHy-926) war auch 1B2-negativ. Primärkulturen von glatten Muskelzellen, Fibroblasten und Keratinocyten und einer epithelartigen Zellinie (Hela) exprimierten kein VAP-l.

Beispiel 2

Intrazelluläre Lokalisierung von VAP-1

Zusätzlich zu den in Beispiel 1 beschriebenen Experimenten zur Lokalisierung im Gewebe wurde außerdem die intrazelluläre Lokalisierung von VAP-1 durch konfokale Mikroskopie dicker Schnitte (15 um), die aus Tonsillen hergestellt wurden, untersucht. Die Schnitte wurden mit den mAbs 1B2 oder 3G6 15 Minuten inkubiert, zweimal mit PBS gewaschen und weitere 15 Minuten mit FITC-konjugiertem Schaf-Anti-Maus-Ig bedeckt. Danach wurden die Proben in Glycerin eingebettet, das 10% PBS und Phenlyendiamin als Anti-Ausbleich-Mittel enthielt, und anschließend durch konfokale Mikroskopie analysiert. Bei der mikroskopischen Untersuchung war leicht zu erkennen, daß VAP-1 auf der luminalen Oberfläche von HEV und auch in einzelnen Granula innerhalb des Cytoplasmas vorliegt. Die Identität dieser Granula ist bisher noch unklar, jedoch zeigten die Granula bei den zweifarbigen Immunfluoreszenzfärbungen unter Verwendung des mAb 1B2 und des Antikörpers gegen den Faktor VIII keine gemeinsame Lokalisierung. Somit sind die VAP-1-positiven Granula keine Weibel-Palade-Körperchen von Endothelzellen, die bekanntermaßen das Endothelzellen-Adhäsionsmolekül P-Selectin umfassen.

Beispiel 3

Bestimmung des Molekulargewichts von VAP-1

Von Lymphocyten befreite Tonsillenextrakte wurden in Lysepuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-Base, 0,15 mM MgCl&sub2;, 1% NP- 40, 1 mM PMSF und 1% Aprotinin) über Nacht bei 4ºC solubilisiert. Das Lysat wurde 30 Minuten bei 10000 · g bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde vorgeklärt, indem das Lysat über eine Säule mit Sephadex CL-4B (Pharmacia, Schweden) passiert wurde. Anschließend wurde es nacheinander auf drei CNBraktivierte Sepharose-4B-Säulen (Pharmacia) aufgetragen, die mit normalem Mausserum, mit einem irrelevanten IgG&sub1;-mAb und mit dem mAb 1B2 derivatisiert waren (5 mg/ml, 5 ml Säulenvolumen). Die Säule wurde mit dem Lysepuffer gründlich gewaschen. Danach wurde das an die 1B2-Säule gebundene Material mit 50 mM Triethanolamin eluiert, gefriergetrocknet, mit SDS-PAGE (7,5%, reduziert) aufgetrennt und unter Verwendung einer Silberfärbung sichtbar gemacht.
Für die Iodmarkierung wurden die von Lymphocyten befreiten Tonsillenextrakte in RPMI 1640, enthaltend 100 U/ml Collagenase (Typ II von Clostridium histolyticum, Sigma), 10% fetales Kälberserum (FCS), Antibiotika und 10 mM Hepes, eine Stunde bei 37ºC unter schonendem Rühren gespalten. Nach der Kollagenase-Spaltung wurden die Zellen in HBSS gewaschen und unter Verwendung des Lactoperoxidase-Verfahrens mit ¹²&sup5;I Oberflächen markiert. Die iodierten Zellen wurden mit Lysepuffer lysiert und das Lysat durch Zentrifugation 15 Minuten bei 10000 · g gereinigt. Das Lysat wurden 16 Stunden bei 4ºC mit CNBraktivierter Sepharose, gekoppelt an normales Mausserum, vorgeklärt. Die Immunfällungen erfolgten mit Kügelchen CNBraktivierter Sepharose 4B, die mit den mAbs 1B2 oder 3G6 konjugiert waren. Die Proben wurden unter Verwendung einer 7,5% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (2-Mercaptoethanol) analysiert.
Zur Bestimmung des Molekulargewichts von VAP-1 wurde das durch Affinität isolierte Molekül aus dem Tonsillenstroma einer SDS-PAGE unterworfen. Die Silberfärbung des Gels zeigte unter reduzierenden Bedingungen eine Hauptbande mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 90 kd (Fig. 2). VAP-1 wanderte unter nicht-reduzierenden Bedingungen etwas langsamer (Mr 100 kd). Die Analysen der Immunpräzipitate aus den iodierten Stromazellen der Tonsillen bestätigten die Reaktivität des mAb 1B2 mit einem 90 kd-Molekül (und einem etwas kleineren Spaltprodukt) (Fig. 2). Außerdem war manchmal eine 180 bis 200 kd-Bande zu sehen.

Beispiel 4

Bindung von Lymphocyten an Tonsillen, periphere Lymphknoten (PLN), Synovial- und Appendix-HEV und Bindung von Granulocyten an Tonsilien-HEV

Die Einzelheiten dieser Technik wurden früher beschrieben (Jalkanen und Butcher, Blood 66. (1985), 577). Kurz gesagt wurden frisch geschnittene gefrorene Schnitte von menschlichen Tonsillen, Synovialis, Appendix und peripheren Lymphknoten mit 1B2- oder 3G6-Überständen unter schonender Rotation 30 Minuten bei 7ºC inkubiert. Anschließend wurden Ficoll-isolierte Lymphocyten (3 · 10&sup6;/Schnitt) in HBSS, enthaltend 5% FCS und 10 mM Hepes, zugegeben und die Inkubation weitere 30 Minuten fortgesetzt. Nach der Inkubation wurden die nicht-haftenden Zellen vorsichtig durch leichtes Klopfen entfernt und die haftenden Zellen über Nacht in kalter PBS, die 1% Glutaraldehyd enthielt, fixiert. Die an HEV gebundenen Zellen wurden an vier bis sechs Schnitten pro Gewebe pro Probe einzeln-blind gezählt (mindestens 100 HEV). Zur Bestimmung der Granulocytenbindung wurde der Test ähnlich durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Granulocyten (isoliert unter Verwendung von Histopaque 1119, Sigma) bis direkt vor dem Auftragen auf die Schnitte in Ca²&spplus;- und Mg²&spplus;-freiem HBSS gehalten wurden.
Die Gewebeverteilung von VAP-1 auf Endothelzellen in vivo legte nahe, daß es als ein spezifisches Erkennungselement für Leukocyten fungieren könnte. Deshalb wurde die funktionelle Rolle von VAP-1 bei der HEV-Bindung unter Verwendung des modifizierten Stamper-Woodruff-in vitro-Tests untersucht (Jalkanen und Butcher, Blood 65. (1985), 577). Die Vorbehandlung der gefrorenen Schnitte mit dem mAb 1B2 hemmte die Bindung von Lymphocyten an HEV (Fig. 3). Die Hemmwirkung war in Tonsillen und peripheren Lymphknoten am stärksten ausgeprägt, jedoch war auch die Bindung an Synovial-HEV signifikant reduziert. Die Bindung von Lymphocyten an Appendix-HEV und die Bindung von Granulocyten an Tonsillen-HEV wurden weniger stark beeinflußt (Fig. 3). Diese Ergebnisse zeigen, daß VAP-1 entweder die Lymphocytenerkennung von peripheren Lymphknoten-, Tonsillen- und Synovial-HEV vermittelt oder eng assoziiert ist mit Endothelzellenelementen, die diese Lymphocytenerkennung vermitteln. Um die Beteiligung von VAP-1 an der Wechselwirkung zwischen Lymphocyten und Endothelzellen direkt zu klären, wurde die Bindung von Lymphocyten an Affinität-isoliertes VAP-1 analysiert (Fig. 4). Die Lymphocyten lagerten sich wirksam an das Platten gebundene VAP-1 an. Die Bindung der Lymphocyten an VAP-1 wurde durch den mAb 1B2 spezifisch gehemmt, nicht jedoch durch den Kontroll-mAb 3G6. Der mAb 1B2 verhinderte nicht die Bindung von Lymphocyten an ein anderes, nicht-verwandtes Endothelzellenmolekül (Fig. 4).
Die Ergebnisse der Gewebeverteilung und der HEV-Bindung legen nahe, daß VAP-1 hauptsächlich an den Lymphocytenbewegungen zu den peripheren Lymphknoten, Tonsillen und Synovialis beteiligt ist. Interessanterweise kann durch das Fehlen einer VAP-1-Expression in Tonsillen ein kleinerer Anteil von postkapillaren Venolen identifiziert werden, die von den 1B2-positiven Venolen morphologisch nicht zu unterscheiden sind. Da die Tonsillen mit dem Gastrointestinaltrakt in engem Kontakt stehen, können sie HEV-Spezies sowohl vom Schleimhaut-Typ (VAP-1- negativ) als auch vom peripheren Lymphknoten-Typ (VAP-1-positiv) enthalten. Es muß noch untersucht werden, wie der phänotypische Unterschied in der VAP-1-Expression mit der Kapazität der einzelnen HEV zur Bindung von Lymphocyten zusammenhängt. Der Mangel an VAP-1 in den lymphatischen Organen der Schleimhaut bedeutet, daß dieses endotheliale Antigen in den unterschiedlichen Lymphocyten-Erkennungssystemen differenziert reguliert werden könnte. Außerdem korreliert der Grad der Entzündung in vivo mit der VAP-1-Expressionsrate.

Beispiel 5

Test der Wirkung von 1B2 auf die Bindung von Zellen an VAP-1

VAP-1 und 1E12 wurden aus Tonsillenextrakten affinitätsgereinigt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Gereinigtes VAP-1, 1E12 und Hitze-inaktiviertes BSA wurden in 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl&sub2;, 2 mM CaCl&sub2;, mit 0,01% β-Octylglucopyranosid als Detergens, verdünnt. Die Proteine wurden an Glasvertiefungen (Lab-Tek chamber slides, Nung) 16 Stunden bei 4ºC absorbiert. Nach 30 Minuten Blockierung bei Raumtemperatur in PBS, die 1 mg/ml BSA enthielt, wurden 1B2- oder 3G6-Überstände zu den Vertiefungen zugegeben und die Inkubation weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Inzwischen wurden frisch isolierte periphere Blut-mononucleäre Zellen in RPMI 1640, enthaltend 10% FCS und 10 mM Hepes, eine Stunde bei 37ºC in Gewebekulturflaschen inkubiert, um die an Kunststoff haftenden Monocyten zu entfernen. In jede Vertiefung wurden nicht-haftende Lymphocyten (1,8 · 106 Zellen pro Vertiefung) in 100 gl RPMI 1640 eingebracht. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37ºC wurden die nicht-haftenden Zellen durch eine ruckartige Bewegung entfernt. Das Obere der Vertiefungen wurde entfernt, die Objektträger wurden unter einem schonenden PBS-Strom gewaschen und in kalter PBS, die 1% Glutaraldehyd enthielt, fixiert. Danach wurden die Zellen unter Verwendung von Diff- Quick-Farbstoffen gefärbt. Die gebundenen Zellen wurden quantitativ bestimmt, indem die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung visuell ermittelt wurde (Gesamtfläche von 50 mm² pro Probe).

Beispiel 6

Partielle Aminosäuresequenz von VAP-1

Eine partielle Aminosäuresequenz des 90 kd-VAP-1-Antigens wurde bestimmt. Die partielle Aminosäuresequenz ist 20 Aminosäuren lang und stellt TEDGDMXLVNGASANEGXVE [SEQ ID NO.: 1] dar. Eine Suche in den Protein- und DNA-Sequenz-Datenbanken ergab, daß diese Sequenz in keiner anderen bekannten Sequenz enthalten ist.

Beispiel 7

Bestimmung von VAP-1 in klinischen Proben, die eine entzündliche Antwort zeigen

Die Proben von normalen Tonsillen, peripheren Lymphknoten, Darm und Herz wurden bei Operationen frisch erhalten, die Nierenproben stammten von Organspendern. Andere Gewebe kamen aus Autopsieproben. Bei allen diesen Proben wurde histopathologisch bestimmt; daß sie nicht entzündet waren. Die entzündeten Proben wurden aus Hautstanzbiopsien von Patienten erhalten, die an chronischen Dermatosen litten (Psoriasis, atopisches Ekzem, Lichen ruber planus). Außerdem wurden Kontrollbiopsien aus makroskopisch nicht betroffenen Bereichen von demselben Patienten entnommen. Entzündete Darmproben stammten von Patienten mit einer entzündlichen Darmerkrankung (Morbus Crohn, ulzerative Kolitis), die zum Zweck der Therapie operiert wurden. Die Synovialproben stammten aus Synovektomien.
Die Proben wurden mit Immunperoxidase angefärbt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Kurz gesagt wurden die mit Aceton fixierten gefrorenen Schnitte nacheinander mit primären Antikörpern (Kulturüberstände oder 50 ug/ml gereinigtes Immunglobulin) und mit geeigneten Peroxidase-konjugierten sekundären Reagenzien inkubiert, und dann wurde die Farbreaktion unter Verwendung von H&sub2;O&sub2; und Diaminobenzidin als Substrat entwickelt. Die Expression von VAP-1 in Darm- und Hautproben (normal und entzündet) wurde durch zwei unabhängige Untersucher an codierten Proben ohne Kenntnis der Diagnose bestimmt.
Wie in Beispiel 1 festgestellt, wird VAP-1 in einigen Venolen des normalen nicht-entzündeten Darms lediglich mit einer geringen Rate exprimiert (Fig. 5A). Im Gegensatz dazu zeigten Darmproben von Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen eine deutlich erhöhte Expression von VAP-1 (Fig. 5B und 5C und Tabelle I). VAP-1 wurde sowohl in den flachwandigen Venolen der Lamina propria als auch in den HEV-artigen Venolen in organisierten lymphatischen Follikeln (Peyer-Plaques) exprimiert. Auch in der Haut ging eine chronische Entzündung mit der gesteigerten Synthese von VAP-1 einher (Fig. 6A und B). Um in den Ergebnissen jegliche Effekte von Schwankungen zwischen den jeweiligen Individuen auszuschließen, wurden die Proben, eine Probe aus dem Dermatosebereich und eine Kontrollprobe aus einem nicht betroffenen Hautbereich desselben Patienten, gleichzeitig biopsiert und gefärbt. Auch in diesen Proben war die Anzahl der VAP-1-positiven Venolen in der oberen Dermis in der entzündeten Probe höher als in der Probe aus dem Kontrollbereich. Außerdem waren mit den VAP-1-positiven Gefäßen immer auffallende perivaskuläre Leukocyteninfiltrate assoziiert. Tabelle T Induktion von VAP-1 bei entzündlichen Darmerkrankungen
Die Darmproben stammten von Patienten, die wegen Morbus Crohn, ulzerativer Kolitis und Tumoren operiert worden waren (wobei der nicht betroffene Bereich der Tumorproben die "normalen" Proben darstellt). Die Anzahl der VAP-1- positiven Venolen in jeder Probe wurde von - bis ++++ eingeteilt, wie in Material und Methoden beschrieben.

Beispiel 8

VAP-1 vermittelt die Bindung an die entzündete Schleimhaut

In vitro-Tests mit gefrorenen Schnitten wurden durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Der monoclonale Antikör per 1B2 hemmte die Bindung von Lymphocyten an kleine Gefäße der Lamina propria in zwei Darmproben, die VAP-1 reichlich exprimierten, um etwa 60% (Fig. 7).
Obwohl die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte sie so verstanden werden, daß weitere Modifikationen möglich sind und daß diese Beschreibung sich auf alle Variationen, Anwendungen oder Anpassungen der Erfindung erstreckt, die im allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen und solche Abweichungen von der vorliegenden Beschreibung umfassen, die als Ergebnis einer bekannten oder herkömmlichen Praxis nach dem Stand der Technik erhalten werden, welche die Erfindung betreffen und auf die wichtigen, vorstehend beschriebenen Merkmale angewendet werden können, wie im Umfang der beigefügten Patentansprüche dargestellt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A): NAME: Jalkanen, Sirpa
(B): STRASSE: Rauvolantle
(C): STADT: PIISPANRISTI
(E): LAND: FINNLAND
(F): POSTLEITZAHL: SF-20760
(i) ANMELDER:
(A): NAME: Salmi, Marko
(B): STRASSE: Vähä-Hämeenkatu 12 A
(C): STADT: TURKU
(E): LAND: FINNLAND
(F): POSTLEITZAHL: SF-20500
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Neues Endothelzellenmolekül, das die Bindung von Lymphocyten beim Menschen vermittelt
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A): EMPFÄNGER:
Orion Corporation, ORION-FARMOS PHARMACEUTICALS, Patent-Abteilung
(B) STRASSE: Orionintie 1
(C) STADT: ESPOO
(E) LAND: FINNLAND
(F) POSTLEITZAHL: SF-02200
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: ASCII-Format
(vi) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US895354
(B) ANMELDEDATUM: 6. Juni 1992
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 1:
(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: beide
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO : 1:

Claims

1. Im wesentlichen gereinigtes und isoliertes menschliches endotheliales vaskuläres Adhäsions- Protein-1 (VAP-1), das ein durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen bestimmtes Molekulargewicht von 90 kd aufweist und das durch den monoclonalen Antikörper erkannt werden kann, der von der Hybridomzellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2041 erhältlich ist.

2. VAP-1 nach Anspruch 1, wobei das VAP-1 an Lymphocyten bindet.

3. VAP-1 nach Anspruch 1 oder 2, wobei das VAP-1 durch ein Verfahren erhältlich ist, das die Bindung des VAP-1 an den Anti-VAP-1-Antikörper umfaßt, der von der Hybridomzellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2041 erhältlich ist.

4. Anti-VAP-1-Antikörper oder Anti-VAP-1-bindendes Fragment davon, wobei der Antikörper oder das bindende Fragment für menschliches endotheliales VAP- 1 nach einem der Ansprüche 1 bis 3 spezifisch ist und wobei der Antikörper nicht an Oberflächenproteine von Endothelzellen menschlicher Nabelvenen (HUVEC) bindet.

5. Anti-VAP-1-Antikörper nach Anspruch 4, wobei der VAP- 1-Antikörper ein polyclonaler Antikörper oder ein monoclonaler Antikörper ist.

6. Anti-VAP-1-Antikörper nach Anspruch 5, welcher der monoclonale Antikörper 1B2 ist, der spezifisch an das vaskuläre Adhäsions-Protein VAP-1 bindet, wobei dieser Antikörper von der Hybridomzellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2041 erhältlich ist.

7. Hybridomzellinie, die einen Anti-VAP-1-Antikörper nach Anspruch 4 oder Anspruch 5 produziert.

8. Hybridomzellinie nach Anspruch 7, welche die Hinterlegungsnummer DSM ACC 2041 hat.

9. Zellfreie Zusammensetzung, die einen Anti-VAP-1- Antikörper oder ein Anti-VAP-1-bindendes Fragment davon nach einem der Ansprüche 4 bis 6 umfaßt.

10. Verfahren zur Antagonisierung einer VAP-1- vermittelten Bindung von Endothelzellen an Lymphocyten, wobei das Verfahren die in vitro-Hemmung der VAP-1-vermittelten Adhäsionsreaktion zwischen Lymphocyten und Endothelzellen umfaßt, indem ausreichend große Mengen eines Anti-VAP-1-Antikörpers nach einem der Ansprüche 4 bis 6 bereitgestellt werden, um die VAP-1-Stellen der Endothelzellen zu blockieren, die an der Reaktion beteiligt sind.

11. Verfahren zur Diagnose eines medizinischen Zustands bei einem Patienten, der durch eine VAP-1-vermittelte Bindung von Endothelzellen an Lymphocyten vermittelt wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(1) Entnahme von Zellen von einem Patienten, von denen man annimmt, daß sie VAP-1-positive Zellen sind;

(2) Inkontaktbringen der Zellen von Schritt (1) mit einem Anti-VAP-1-Antikörper oder einem Anti-VAP- 1-bindenden Fragment davon nach einem der Ansprüche 4 bis 6;

(3) Nachweis der Bindung des Anti-VAP-1-Antikörpers oder des Anti-VAP-1-bindenden Fragments davon an die VAP-1-positiven Zellen; und

(4) Diagnose des medizinischen Zustands aufgrund des Ausmaßes der Bindung.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der medizinische Zustand eine Erkrankung ist, die ausgewählt ist aus Entzündung (chronisch oder akut), Arthritis, rheumatoide Arthritis, Infektion, Dermatose, entzündliche Darmerkrankung und Autoimmunleiden.

13. Arzneimittel zur Verwendung für die Hemmung der VAP- 1-vermittelten Adhäsionsreaktion zwischen Lymphocyten und Endothelzellen, umfassend einen Anti-VAP-1- Antikörper oder ein Anti-VAP-1-bindendes Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 6 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

14. Diagnostische Zusammensetzung zur Verwendung für die Diagnose einer VAP-1-vermittelten Bindung von Endothelzellen an Lymphocyten bei einem Patienten, umfassend einen Anti-VAP-1-Antikörper oder ein Anti- VAP-1-bindendes Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 6 und gegebenenfalls einen Träger.