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Zur Identifizierung und quantitativen Analyse von Antigenen sind unter
Verwendung von Antikörpern, unter anderem von monoklonalen
Antikörpern, Untersuchungen durchgeführt worden. Die Antikörper sind
antigenerkennende Substanzen von B-Lymphozyten (im folgenden oft als "B-
Zellen" bezeichnet). Insbesondere sind Untersuchungen hinsichtlich eines
Tumorantigens, das von einer Tumorzelle erzeugt wird, durchgeführt
worden, um einen Antikörper gegen ein Tumorantigen zu erhalten. Solch ein
Antikörper bindet nur an ein Tumorantigen auf einer Tumorzelle. Daher
kann ein Antikörper gegen eine Tumorzelle zur klinischen Untersuchung
zur Feststellung, ob ein Patient an einem Tumor leidet, verwendet werden.
Wenn ein Cytotoxin an den Antikörper gebunden ist, wird das an den
Antikörper gebundene Cytotoxin zudem veranlaßt, spezifisch mit dem Tumor
zu reagieren, und im Ergebnis wird der Tumor durch die Einwirkung des
Cytotoxins zerstört. Das heißt, der Antikörper kann zur Behandlung eines
Tumors verwendet werden. In diesem Zusammenhang besteht unter dem
Gesichtspunkt der klinischen Untersuchung und Behandlung von Tumoren in
der Wissenschaft das Bedürfnis einen Antikörper zu erhalten, der an viele
verschiedene Tumore binden kann. Jedoch ist bisher ein solcher Antikörper
nicht erhalten worden.
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Gemäß dem Fortschritt auf dem Gebiet der Immunologie ist andererseits
gefunden worden, daß die Antigenerkennung von T-Lymphozyten (im
folgenden oft als "T-Zellen" bezeichnet) durch die Funktion eines
T-Zellenantigenrezeptors bewirkt wird. Es wird daher erwartet, daß ein
T-Zellenantigenrezeptor auch zur klinischen Untersuchung zur Feststellung, ob ein
Patient an einem Tumor leidet und zur Behandlung des Tumors verwendet
werden kann. In bezug auf den T-Zellenantigenrezeptor haben Tonegawa et
al die Grundstruktur eines T-Zellenantigenrezeptors beschrieben (S.
Tonegawa et al, Nature, 757, 309 (1984)). Nach dem Bericht von Tonegawa et
al gibt es etwa 1 Million Arten von T-Zellenantigenrezeptoren. Tonegawa et
al haben auch die Basensequenz einer DNA bestimmt, die für einen Maus-T-
Zellenantigenrezeptor codiert. Ferner haben Mak Tak et al die
Basensequenz einer DNA bestimmt, die für einen menschlichen
T-Zellenantigenrezeptor codiert (Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 0 149
548). Es ist jedoch kein T-Zellenantigenrezeptor erhalten worden, der an
viele verschiedene Tumore binden kann. Zudem ist es extrem schwierig,
eine ausreichende Menge an T-Zellenantigenrezeptoren zu erhalten, da T-
Zellen, die die Quellen von T-Zellenantigenrezeptoren sind, nicht vermehrt
werden können. Aus diesem Grund ist die Untersuchung von
T-Zellenantigenrezeptoren verzögert worden.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ausgedehnte und intensive
Untersuchungen durchgeführt, um das zuvor erwähnte Problem zu lösen,
und um einen T-Zellenantigenrezeptor zu erhalten, der an viele
verschiedene Tumore binden kann. Zu diesem Zweck haben die Erfinder der
vorliegenden Erfindung die Klonierung von cytotoxischen T-Zellen ausgeführt.
Als Ergebnis ist gefunden worden, daß es cytotoxische T-Zellen gibt, die
mit vielen verschiedenen Tumoren reagieren können und die diese
zerstören können, die jedoch nicht mit normalen Zellen reagieren und diese
zerstören. Dann haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Bemühungen
angestrengt, und es gelang ihnen, Klone von solchen cytotoxischen T-Zellen
zu erhalten. Es wurde zudem gefunden, daß die T-Zellenantigenrezeptoren,
die von den Klonen erhalten worden sind, an viele verschiedene Tumore
binden können, aber nicht an normale Zellen. Außerdem haben die Erfinder
der vorliegenden Erfindung gefunden, daß die T-Zellenantigenrezeptoren,
die Cytotoxin daran gebunden enthalten, ohne toxische Nebenwirkungen auf
normale Zellen in vorteilhafter Weise zur Zerstörung von Tumorzellen
verwendet werden können, und daß die T-Zellenantigenrezeßtoren, die einen
an sie gebundenen Marker enthalten, in vorteilhafter Weise zur
Identifizierung und quantitativen Analyse von Tumorantigenen wie Zellmembran-
bindenden Tumorantigenen und zellfreien Tumorantigenen verwendet werden
können.
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Die vorliegende Erfindung hat solche neuartigen Feststellungen gemacht.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine
geklonte T-Zelle zur Verfügung zu stellen, die viele verschiedene Tumore
erkennen kann.
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Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, einen T-
Zellelenantigenrezeptor zur Verfügung zu stellen, der an viele verschiedene
Tumore binden kann.
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Zudem liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen
Marker-gebundenen T-Zellenantigenrezeptor zur Verfügung zu stellen, der für
die klinische Untersuchung zur Feststellung, ob ein Patient an einem
Tumor leidet, in vorteilhafter Weise verwendet werden kann.
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Zudem liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen
Cytotoxin-gebundenen T-Zellenantigenrezeptor zur Verfügung zu stellen, der
in vorteilhafter Weise zur Behandlung von Tumoren verwendet werden
kann.
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Die vorstehenden und anderen Aufgaben, Merkmale und Vorteile der
vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung
ersichtlich.
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Erfindungsgemäß wird insbesondere eine geklonte T-Zelle, nämlich NCACC 85
082 201 und NCACC 85 082 202, zur Verfügung gestellt, die mehrere Arten
von Tumorzellen erkennen kann.
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Die erfindungsgemäße geklonte T-Zelle stammt von menschlichen T-Zellen
ab, da die erfindungsgemäße geklonte T-Zelle von einer cytotoxischen T-
Zelle abstammt, reagiert die geklonte T-Zelle mit Tumorzellen und tötet
Tumorzellen ab (Cytotoxizität). Das heißt, der hier verwendete Ausdruck
"Erkennen von Tumorzellen" bedeutet, daß die geklonte T-Zelle, wie
vorstehend erwähnt, Cytotoxizität aufweist.
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Die erfindungsgemäße geklonte T-Zelle kann mehrere Arten von Tumorzellen
erkennen. Jedoch weist die erfindungsgemäße geklonte T-Zelle keine
toxische Wirkung gegen normale Zellen auf. Beispielsweise können als
Tumorzellen feste Tumore genannt werden, wie menschliche Magentumorzellinien
MKN-1, MKN-7 und KATO-III, menschliche Lungentumorzellinien PC-1, PC-9,
PC-10, PC-13 und PC-14, menschliche Dickdarmtumorzellinien C-1 und
M7609, menschliche Rektaltumorzellinien CaR-1 und S-7512, eine menschliche
Blasentumorzellinie H-1, menschliche Hepatomzellinien HLE und HLF,
menschliche Gallenblasentumorzellinien NBT-2 und KU-1, eine menschliche
Kehltumorzellinie KB, menschliche Nierentumorzellinien W-2 und NRC-12,
menschliche Brusttumorzellinien HBC-4 und HBC-6, eine menschliche
Gebärmutterzellinie HeLa, menschliche Melanomzellinien HMV-1 und HMV-2,
menschliche Neuroblasttumorzellinien GOTO und SYM-I, eine menschliche
Eierstocktumorzellinie YS-K und eine menschliche Muskeltumorzellinie KYM-I.
Die erfindungsgemäße geklonte T-Zelle kann vorzugsweise mindestens zwei
Arten von Tumorzellen erkennen. Natürlich ist die geklonte T-Zelle umso
besser, je mehr Arten von Tumorzellen die geklonte T-Zelle erkennen kann.
Als spezifische Beispiele für die erfindungsgemäße geklonte T-Zelle können
die folgenden geklonten T-Zellen genannt werden.
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1) Eine geklonte T-Zelle, die mindestens zwei menschliche
Magentumorzellinien MKN-1 und KATO-III erkennen kann, jedoch normale menschliche
Lymphozyten und von Foeten abstammende Fibroblasten nicht erkennt
(diese geklonte T-Zelle scheint für Magentumore spezifisch zu sein).
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2) Eine geklonte T-Zelle, die mindestens zwei menschliche
Dickdarmtumorzellinien C-1 und M7609 erkennen kann, aber normale menschliche
Lymphozyten nicht erkennt (diese geklonte T-Zelle scheint für
Dickdarmtumore spezifisch zu sein).
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3) Eine geklonte T-Zelle, die mindestens zwei menschliche
Rektaltumorzellinien CaR-1 und S-7512 erkennen kann, aber normale menschliche
Lymphozyten nicht erkennt (diese geklonte T-Zelle scheint für Rektaltumore
spezifisch zu sein).
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4) Eine geklonte T-Zelle, die mindestens zwei menschliche
Hepatomzellinien HLE und HLF erkennen kann, aber normale menschliche Lymphozyten
nicht erkennt (diese geklonte T-Zelle scheint für Hepatome spezifisch zu
sein).
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5) Eine geklonte T-Zelle, die mindestens zwei menschliche
Gallenblasentumorzellinien NBT-2 und KU-1 erkennen kann, aber normale
menschliche Lymphozyten nicht erkennt (diese geklonte T-Zelle scheint für
Gallenblasentumore spezifisch zu sein).
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6) Eine geklonte T-Zelle, die mindestens zwei menschliche
Nierentumorzellinien W-2 und NRC-12 erkennen kann, aber normale menschliche
Lymphozyten nicht erkennt (diese geklonte T-Zelle scheint für
Nierentumore spezifisch zu sein).
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7) Eine geklonte T-Zelle, die mindestens zwei menschliche
Brusttumorzellinien HBC-4 und HBC-6 erkennen kann, aber normale menschliche
Lymphozyten nicht erkennt (diese geklonte T-Zelle scheint für Brusttumore
spezifisch zu sein).
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8) Eine geklonte T-Zelle, die mindestens fünf menschliche
Lungentumorzellinien PC-1, PC-9, PC-10, PC-13 und PC-14 erkennen kann, aber
normale menschliche Lymphozyten und von Foeten abstammende
Fibroblasten nicht erkennt (diese geklonte T-Zelle scheint für Lungentumore
spezifisch zu sein).
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9) Eine geklonte T-Zelle, die mindestens menschliche
Lungentumorzellinien PC-10 und PC-14, menschliche Magentumorzellinien MKN-1 und
KATO-III und eine menschliche Gallenblasentumorzellinie NBT-2 erkennen
kann, aber normale menschliche Lymphozyten nicht erkennt (diese geklonte
T-Zelle scheint Spezifität für verschiedene Arten von Tumoren zu haben).
Anders als natürliche T-Zellen, die nicht vermehrt werden können, kann
die erfindungsgemäße geklonte T-Zelle vermehrt werden. Die
erfindungsgemäße geklonte T-Zelle gehört zu zwei Arten von geklonten T-Zellen, nämlich
einer geklonten T-Zelle, die durch Aktivierung einer natürlichen T-Zelle mit
einem Aktivator wie Lectin und Interleukin 2 erhalten werden kann, und
einer geklonten T-Zelle, die eine aus einer T-Zelle und einem T-Lymphom
gebildete Hybridzelle ist. Die erstere benötigt Interleukin als einen
Wachstumsstimulator für ihr Wachstum, die letztere benötigt für ihr
Wachstum keinen Wachstumsstimulator.
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In dem Fall, daß die erfindungsgemäße geklonte T-Zelle eine Hybridzelle ist,
ist das T-Lymphom ein 8-Azaguanin-resistenter Stamm, der von
menschlichen T-Lymphomen, nämlich CEM, abstammt. Die Zellverschmelzung wird
später erläutert. Die vorstehend erwähnten T-Lymphome sind öffentlich
erhältlich, z. B. von Einrichtungen, die in Protein, Nucleic Acid, Enzym, 23 (6),
291-304 (1978) beschrieben sind. Das T-Lymphom CEM ist auch von der
Abteilung für chemische Toxikologität und Immunchemie, Fakultät für
pharmazeutische Wissenschaft, Universität von Tokyo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan,
erhältlich. Das T-Lymphom Jurkat ist auch von dem Deoartment für Medizin
und dem Howard Hughes Medical Institute, Universität von Kalifornien, San
Francisco, Kalifornien, 94143. U.S.A. (Arthur Weiss und John D. Stobo, J.
Exp. Med. 160, 128 (1984)) erhältlich. Die 8-Azaguanin-resistenten Stämme
können aus den vorstehend erwähnten T-Lymphomen nach dem Verfahren,
das z. B. in der japanischen offengelegten Patentveröffentlichung Nr.
57-206383 beschrieben ist, herstellt werden.
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Eine erfindungsgemäße geklonte T-Zelle, die mehrere Arten von Tumorzellen
erkennen kann, kann nach einem Verfahren hergestellt werden, das umfaßt:
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a) Aktivierung von Lymphozyten mit einem Aktivator, der ausgewählt
wird aus einer Tumorzelle, einem Lectin, Interleukin 2 und Gemischen
davon, um aktivierte Lymphozyten zu erhalten.
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b) die aktivierten Lymphozyten einer Klonierung in einem Medium, das
Interleukin 2 enthält, zu unterwerfen, um geklonte Lymphozyten zu
erhalten, und
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c) die geklonten Lymphozyten einem Screenen zu unterwerfen, um aus
den geklonten Lymphozyten eine T-Zelle zu isolieren, die mehrere Arten
von Tumorzellen erkennen kann.
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Die Lymphozyten, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet
werden, können aus peripheren Blut, der Milz oder Lymphknoten von
Säugetieren wie Menschen, Mäusen, Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen
gewonnen werden. Von peripheren Blut, Milz und Lymphknoten ist das
periphere Blut bevorzugter, da peripheres Blut von lebenden Körpern von
Säugetieren leichter erhalten werden kann als die Milz und die
Lymphknoten. Die Lymphozyten werden unter Verwendung eines Aktivators
aktiviert. Als Aktivator können eine Tumorzelle, ein Lectin, Interleukin 2 und
Gemische davon genannt werden. Davon sind ein Lectin oder Interleukin 2
bevorzugter, da durch die Verwendung von einem Lectin oder Interleukin 2
geklonte T-Zellen mit verschiedenen Spezifitäten erhalten werden können.
Als als Aktivator zu verwendende Tumorzelle können z. B. die zuvor
erwähnten humanen Tumorzellinien genannt werden. Als das Lectin können
z. B.
PHA, das von Phaseolus Valgaris abstammt, Con A, das von
Concanavalia Ensiformis abstammt, WFA, das von Wisteria aoribanba abstammt, LCH,
das von Lens culinaris abstammt, und PWM, das von Phytolacca americana
abstammt, genannt werden. Vom Gesichtspunkt der Aktivität zur
Aktivierung von T-Zellen, die Tumorzellen erkennen können, her, sind
davon PHA und PWM bevorzugter.
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Die aktivierten Lymphozyten werden einer Klonierung unterzogen. Die
Klonierung kann nach dem Verfahren, das in T. Kaieda, J. Immunol., 129, 46
(1982) beschrieben ist, durchgeführt werden.
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Zu Veranschaulichungszwecken genannt: die aktivierten Lymphozyten
werden in einem Medium suspendiert, das Interleukin 2 enthält, und die so
erhaltene Suspension wird in jede Wölbung einer Mikroplatte gegossen, so
daß jede Wölbung einen aktivierten Lymphozyten enthält. Die Mikroplatte
wird anschließend inkubiert, um jeden Lymphozyten zu vermehren. Im
Ergebnis werden geklonte Lymphozyten erhalten.
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Anschließend werden die geklonten Lymphozyten einem Screenen
unterzogen. Das Screenen wird wie folgt durchgeführt. Jeder geklonte
Lymphozyt wird zusammen mit einer Tumorzelle kultiviert. Nach der
Kultivierung wird eine Auswahl in bezug auf geklonte T-Zellen, die gegen die
Tumorzelle Cytotoxizität besitzen, getroffen. Die Verfahren zur Bestimmung
der Cytotoxizität werden später erläutert.
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Als Ergebnis werden erfindungsgemäße geklonte T-Zellen erhalten, die
Interleukin 2 als einen Wachstumsstimulator für ihr Wachstum benötigen.
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Die so erhaltene geklonte T-Zelle, nämlich NCACC 85 082 201, kann, wie
vorstehend erwähnt, mit einem T-Lymphom verschmolzen werden, um eine
Hybridzelle, nämlich NCACC 85 082 202, zu bilden, so daß die geklonte T-Zelle
ohne einem Wachstumsstimulator wachsen kann und leicht vermehrt werden
kann.
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Die Zellverschmelzung einer geklonten T-Zelle und eines T-Lymphom kann
nach einem herkömmlichen Verfahren (M. Okada, N. Yoshimura, T. Kaieda,
Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 7717 (1981)) durchgeführt werden. Zur
Veranschaulichung genannt: Die Zellverschmelzung kann in einem herkömmlichen
Medium, das einen Verschmelzungsbeschleuniger enthält, durchgeführt
werden. Als Verschmelzungsbeschleuniger können z. B. Polyethylenglykol (im
folgenden oft "PEG" genannt) etc. genannt werden. Das Mengenverhältnis
der Zellen eines T-Lymphoms zu den Zellen der geklonten T-Zelle kann im
allgemeinen etwa 1 bis 10 sein. Die Zellen der geklonten T-Zelle und des T-
Lymphoms werden in dem Medium bei Raumtemperatur vermischt. Das
resultierende Gemisch wird einer Zentrifugierung unterworfen, um das
Gemisch in Zellen und einen Überstand zu trennen. Der Überstand wird
abgegossen. Zu den Zellen wird ein Medium gegeben, das PEG enthält, das auf
37ºC erwärmt worden ist, anschließend wird gerührt, um die
Zellverschmelzung zu initiieren. Zur Fortführung der Verschmelzungsreaktion wird das
Gemisch inkubiert. Während der Inkubation wird das Medium zu einem
frischen Medium geändert, d. h., das Gemisch wird einer Zentrifugierung
unterworfen, um das Gemisch in Zellen und einen Überstand zu trennen, und
anschließend wird der Überstand abgegossen und den Zellen ein neues
Medium zugegeben. Der Wechsel des Mediums wird in festgelegten Intervallen
durchgeführt. Als Ergebnis wird eine Hybridzelle gebildet.
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Die Hybridzelle wird von den unverschmolzen bleibenden Zellen isoliert. Die
Isolierung wird durchgeführt, indem das Zellgemisch, das die Hybridzellen
und die unverschmolzen gebliebenen Zellen enthält, in einem herkömmlichen
Medium zur Hybridzellenselektion kultiviert wird. Das Medium zur
Hybridzellenselektion ist ein Medium, in dem die Hybridzelle wachsen kann,
die unverschmolzenen Zellen jedoch nicht wachsen können. Als solches
Medium kann beispielsweise ein Medium genannt werden, das Hypoxanthin,
Aminopterin und Thymidin enthält (im folgenden "HAT-Medium" genannt).
Als HAT-Medium kann z. B. ein Medium genannt werden, das 10% foetales
Kalbsserum (FCS), 2·10&supmin;&sup7; mol Aminopterin, 1·10&supmin;&sup4; mol Hypoxanthin, 1,6
·10&supmin;³ mol Thymidin und 3·10&supmin;&sup6; mol Glycin enthält. Das Kultivieren der
Zellen in einem HAT-Medium wird nach einer herkömmlichen begrenzenden
Verdünnungsmethode über einen ausreichenden Zeitraum durchgeführt, so
daß andere Zellen als die Hybridzelle absterben. Als Ergebnis können die
erwünschten Hybridzellen selektiv erhalten werden.
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Die so erhaltene Hybridzelle unterscheidet sich von dem originalen
8-Azaguanin-resistenten T-Lymphom und der originalen geklonten T-Zelle
beispielsweise hinsichtlich des Karyotyps (Anzahl der Chromosomen),
Mitogenantwort, Lymphokinproduktivität. Die Hybridzelle kann in einem
HAT-Medium, wie vorstehend erwähnt, vermehrt und gelagert werden.
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Vorzugsweise wird jedoch die Hybridzelle nach der Selektion der
Hybridzelle in einem herkömmlichen HT-Medium kultiviert, das Hypoxanthin und
Thymidin enthält, und anschließend wird die Hybridzelle in ein
herkömmliches Wachstumsmedium überführt.
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Die erfindungsgemäße Hybridzelle kann auch nach einem Verfahren
hergestellt werden, bei dem Lymphozyten mit T-Lymphomen verschmolzen
werden, um Hybridzellen zu erhalten, und anschließend werden die
Hybridzellen einem Screenen unterzogen, um eine Hybridzelle zu erhalten, die
Tumorzellen erkennen kann. Das heißt, gemäß einem anderen Aspekt der
vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer geklonten T-
Zelle zur Verfügung gestellt, die mehrere Arten von Tumorzellen erkennen
kann, das umfaßt:
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(a) Verschmelzen von Lymphozyten mit Zellen eines T-Lymphoms, um eine
Hybridzelle zu bilden, und
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(b) die Hybridzellen einem Screenen zu unterwerfen, um aus den
Hybridzellen eine T-Zelle zu isolieren, die mehrere Arten von Tumorzellen
erkennen kann.
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Als mit Zellen eines T-Lymphoms zu verschmelzende Lymphozyten können
die zuvor erwähnten Lymphozyten verwendet werden. Als das T-Lymphom,
können die zuvor erwähnten 8-Azaguanin-resistenten Stämme verwendet
werden. Die Zellverschmelzung kann auf die gleiche Art und Weise wie
zuvor erwähnt durchgeführt werden. Als Ergebnis wird ein
Hybridzellengemisch erhalten, das Hybridzellen, die Tumorzellen erkennen können, und
Hybridzellen, die Tumorzellen nicht erkennen können, enthält. Die
Hybridzellen, die Tumorzellen erkennen können, werden aus dem
Hybridzellengemisch mittels einer Screenmethode, wie vorstehend erwähnt, isoliert.
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Als Ergebnis wird die erfindungsgemäß geklonte T-Zelle in der Form einer
Hybridzelle erhalten.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein
Antigenrezeptor einer T-Zelle, nämlich NCACC 85 082 201 und NCACC 85 082 202,
zur Verfügung gestellt, der an mehrere Arten von Tumorzellen binden
kann. Der erfindungsgemäße T-Zellenantigenrezeptor ist an die Oberfläche
der T-Zelle gebunden. Der erfindungsgemäße T-Zellenantigenrezeptor wird
von der vorstehend erwähnten erfindungsgemäßen geklonten T-Zelle
erhalten. Das Verfahren zur Herstellung eines T-Zellenantigenrezeptors aus der
geklonten T-Zelle wird nachstehend erläutert.
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Zunächst werden die geklonten T-Zellen in einem herkömmlichen Medium
oder in dem Körper eines mit Röntgenstrahlen bestrahlten Tieres im großen
Maßstab kultiviert. Die geklonten T-Zellen werden gesammelt. Aus den so
gesammelten Zellen wird ein T-Zellenantigenrezeptor nach einem
herkömmlichen Verfahren (vgl. z. B. S.C. Meuer, J. Exp. Med., 157, 705 (1983)) aus der
Kultur effizient erhalten. Zur Veranschaulichung gesagt: die geklonten T-
Zellen werden in PBS (ein Phosphatpuffer, der 0,85% NaCl enthält, pH 7,2),
der 1% Triton X-100 enthält, suspendiert. Die resultierende Suspension
wird eine Stunde lang auf Eis gerührt, so daß die Membranproteine der
geklonten T-Zelle in der Suspension gelöst werden. Anschließend wird die
Suspension einer Affinitätssäulenchromatographie unter Verwendung einer
Säule, die mit Sepharose 4B (hergestellt und vertrieben durch Pharmacia
Fine Chemicals AB, Schweden) bepackt ist, an die ein monoklonaler
Antikörper für einen T-Zellenantigenrezeptor gebunden ist, unterworfen. Der
monoklonale Antikörper für einen T-Zellenantigenrezeptor kann nach einem
Verfahren wie in dem später genannten Beispiel 3 beschrieben, erhalten
werden. Als Ergebnis wird ein T-Zellenantigenrezeptor in praktisch reiner
Form erhalten.
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Der so erhaltene T-Zellenantigenrezeptor hat ein Molekulargewicht von etwa
90.000 ausgedrückt als ein Wert, der mittels
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter nicht reduzierter Bedingung gemessen worden ist. Wenn der
T-Zellenantigenrezentor einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter
reduzierter Bedingung unterworfen wird, werden jedoch auf dem Gel zwei
Banden gefunden, nämlich eine Bande, die einem Molekulargewicht von etwa
50.000 entspricht und eine Bande, die einem Molekulargewicht von etwa
45.000 entspricht. Das zeigt, daß der T-Zellenantigenrezeptor ein
Heterodimer ist, das ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000 und
daran covalent durch eine Disulfidbindung gebunden ein Protein mit einem
Molekulargewicht von etwa 45.000 enthält.
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Wenn andererseits der T-Zellenantigenrezeptor von der erfindungsgemäßen
geklonten Zelle erhalten wird, nachdem die geklonte T-Zelle mit Tunicamycin
behandelt worden ist, hat der so erhaltene T-Zellenantigenrezeptor ein
Molekulargewicht von etwa 60.000 ausgegedrückt als Wert, der mit SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese unter einer Nichtreduktionsbedingung
gemessen worden ist.
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Wenn zudem der so erhaltene T-Zellenantigenrezeptor einer
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter einer Reduktionsbedingung unterworfen
wird, ist gefunden worden, daß der T-Zellenantigenrezeptor ein Heterodimer
ist, das zwei Proteine mit jeweils einem Molekulargewicht von etwa 30.000
enthält. Diese Ergebnisse zeigen, daß der erfindungsgemäße
T-Zellenantigenrezeptor ein Heterodimer ist, das zwei Proteine enthält, die jeweils
Zucker enthalten. Die zuvor genannten Molekulargewichte des
T-Zellenantigenrezeptors stimmen mit denen eines T-Zellenantigenrezeptors überein,
über den in J. Exp. Med., 158, 1547 (1983) berichtet worden ist. Der
erfindungsgemäße T-Zellenantigenrezentor kann Zucker enthalten oder nicht.
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Die Reinheit des erfindungsgemäßen T-Zellenantigenrezeptors beträgt etwa
95% oder mehr. Die Reinheit kann bestimmt werden, indem der
T-Zellenantigenrezeptor einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließender
Densitometrie unter Verwendung eines Densitometers Model ADC-20EX
(hergestellt und vertrieben von Kayagaki Co., Ltd., Japan) unterworfen
wird.
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Der erfindungsgemäße T-Zellenantigenrezeptor kann auch über eine
herkömmliche rekombinante DNA-Technik hergestellt werden. Zur
Veranschaulichung gesagt, mRNAs werden von einer erfindungsgemäßen geklonten T-
Zelle erhalten, die den erwünschten T-Zellenantigenrezeptor enthält, und
unter Verwendung der so erhaltenen mRNAs werden cDNAs synthetisiert,
Aus der so synthetisierten cDNA wird eine cDNA mittels Klonierung isoliert,
die für den erwünschten T-Zellenantigenrezeptor codiert. Die so isolierte
cDNA wird mit einem geeigneten Expressionsvektor legiert, um eine
rekombinante DNA zu erhalten. Mit der rekombinierten DNA werden Zellen von
E. coli, einer Hefe oder eines Tiers transvektiert, um eine Transformante zu
erhalten. Die Transformante wird in einem geeigneten Medium kultiviert,
das die Transformante zur Herstellung des T-Zellenantigenrezeptors
veranlaßt.
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Der erfindungsgemäße T-Zellenantigenrezeptor kann an mehrere Arten von
Tumorzellen binden, wie vorstehend in bezug auf die geklonte T-Zelle
erwähnt. Der T-Zellenantigenrezeptor kann vorzugsweise an mindestens zwei
Arten von Tumorzellen binden. Natürlich ist der T-Zellenantigenrezeptor
umso besser, an je mehr Arten von Tumorzellen der T-Zellenantigenrezeptor
binden kann.
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Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein
Antigenrezeptor einer T-Zelle, nämlich NCACC 85 082 201 und NCACC 85 082 202,
zur Verfügung gestellt, der an mehrere Arten von Tumorzellen binden kann
und der einen daran gebundenen Marker enthält.
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Der erfindungsgemäße Marker-gebundene T-Zellenantigenrezeptor kann
erhalten werden, indem ein Marker an den T-Zellenantigenrezeptor, wie zuvor
erwähnt, gebunden wird.
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Als Marker können z. B. fluoreszierende Substanzen wie
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Rhodamin, Enzyme wie Peroxidase, β-
Galactosidase und Glukoseoxidase und Radioisotope wie ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³²S, ¹&sup4;C
und ³H genannt werden. Der Marker kann an einen T-Zellenantigenrezeptor
nach einem herkömmlichen Verfahren zur Gewinnung eines markierten
Antikörpers gebunden werden. Als derartiges Verfahren kann beispielsweise ein
Verfahren, bei dem FITC unter alkalischen Bedingungen an einen
T-Zellenantigenrezeptor gebunden wird, ein Verfahren, bei dem eine Maleimidgruppe
in ein Enzym eingeführt wird, und das resultierende Enzym über
N-Succinimidyl-3-(pyridyldithio)propionat (SPDP) an einen T-Zellenantigenrezeptor
gebunden wird, ein Verfahren, bei dem ein Enzym an eine SH-Gruppe eines
T-Zellenantigenrezeptors gebunden wird, und ein Verfahren, bei dem ein T-
Zellenantigenrezeptor mit ¹²&sup5;I über ein herkömmliches
Lactoperoxidaseverfahren
gekennzeichnet wird, erwähnt werden. Jedoch variiert das
Verfahren, mit dem ein Marker an einen T-Zellenantigenrezeptor gebunden wird,
in Abhängigkeit von der Art des Markers und daher sollte das Verfahren
nicht auf die zuvor erwähnten beschränkt werden.
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Die Menge Marker, die an den T-Zellenantigenrezeptor gebunden wird,
variiert in Abhängigkeit von der Art des Markers. Im allgemeinen kann der
Marker an den T-Zellenantigenrezeptor in einer Menge von etwa 1 bis etwa
10 Mol/Mol T-Zellenantigenrezeptor gebunden werden.
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Gemäß eines weiteren erfindungsgemäßen Aspekts wird ein Antigenrezeptor
einer T-Zelle, nämlich NCACC 85 082 201 und NCACC 85 082 202, zur
Verfügung gestellt, der an mehrere Arten von Tumorzellen binden kann und ein
Cytotoxin daran gebunden enthält.
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Der erfindungsgemäße Cytotoxin-gebundene T-Zellenantigenrezeptor kann
erhalten werden, indem ein Cytotoxin, wie zuvor erwähnt, an den
T-Zellenantigenrezeptor gebunden wird. Als das Cytotoxin können z. B.
Antikrebsheilmittel, biologische toxische Substanzen, die z. B. von Pflanzen oder
Tieren herstammen, lichtaktivierte Toxine und Radioisotope genannt werden.
Als Antikrebsheilmittel können z. B. Alkylreagenzien wie Cyclophosamide und
Stickstofflast, metabolische Antagonisten wie N&sup4;-Behenöl ara-C, Fluoruracil,
1-Franocyl-5-fluoruracil und Mercaptopurin, Antibiotika wie Bleomycin,
Mitomycin, Actinomycin D und Cycloheximid, und Hormone wie Prednison und
Prostaglandin genannt werden. Als biologische toxische Substanzen können
z. B. Toxine wie Schlangengift, Diphterietoxin und Ricin genannt werden. Als
das lichtaktivierte Toxin können z. B. Hämatoporphyrinderivate genannt
werden. Als Radioisotope können z. B. ¹²&sup5;I, &sup6;&sup0;Co, &sup9;&sup0;Sr, ³²P und ¹&sup9;²Ir
genannt werden.
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Das Cytotoxin kann an einen T-Zellenantigenrezeptor mittels eines
herkömmlichen Verfahrens gebunden werden. Als Verfahren zum Binden eines
Cytotoxins an ein T-Zellenantigenrezeptor können z. B. ein Verfahren, bei
dem die Ricin-A-Kette eines Bohnentoxins über
N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) an einen T-Zellenantigenrezeptor gebunden wird,
um einen Komplex zu bilden, ein Verfahren, bei dem ein
T-Zellenantigenrezeptor an eine Oberfläche eines Ribosoms gebunden wird, das ein
Antikrebsmittel wie Actinomycin D enthält, ein Verfahren, bei dem ein
Antikrebsmittel wie Adriamycin an einen T-Zellenantigenrezeptor gebunden
wird, wobei ein Dextran als Vernetzungsmittel verwendet wird, um z. B.
einen Komplex zu bilden, erwähnt werden. Jedoch variiert das Verfahren
zum Binden eines Cytotoxins an einen T-Zellenantigenrezeptor in
Abhängigkeit
von der Art des Cytotoxins und daher sollte das Verfahren nicht auf
die vorstehenden Verfahren beschränkt werden.
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Die Menge an Cytotoxin, die an den T-Zellenantigenrezeptor gebunden wird,
variiert in Abhängigkeit von der Art des Cytotoxins. Im allgemeinen kann
das Cytotoxin in einer Menge von etwa 1 bis etwa 100 Mol/Mol
T-Zellenantigenrezeptor an den T-Zellenantigenrezeptor gebunden sein.
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Wegen des T-Zellenantigenrezeptors an der geklonten T-Zelle kann die
erfindungsgemäße geklonte T-Zelle mehrere Arten von Tumoren erkennen,
wobei der Rezeptor an mehrere Arten von Tumoren binden kann. Im
Unterschied zu natürlichen T-Zellen kann die geklonte T-Zelle vermehrt werden.
Daher ist die erfindungsgemäße geklonte T-Zelle als ein Rohmaterial zur
Erlangung eines erfindungsgemäßen T-Zellenantigenrezeptors nützlich.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn die geklonte T-Zelle eine Hybridzelle ist,
da die geklonte T-Zelle leichter vermehrt werden kann als die geklonte T-
Zelle, die keine Hybridzelle ist. Der erfindungsgemäße
T-Zellenantigenrezeptor kann spezifisch an mehrere Arten von Tumoren binden,
er bindet jedoch nicht an normale Zellen. Daher kann der
T-Zellenantigenrezeptor vorteilhaft zur klinischen Untersuchung, um festzustellen, ob ein
Patient an einem Tumor leidet, und zur Behandlung eines Tumors,
eingesetzt werden. Zu Anschauungszwecken gesagt, wenn ein Marker an den T-
Zellenantigenrezeptor gebunden ist, kann der T-Zellenantigenrezeptor
vorteilhaft zur Identifizierung und quantitativen Analyse von Tumorantigen
auf einer Tumorzellmembran und zellfreiem Tumorantigen verwendet werden.
Wenn andererseits ein Cytotoxin an den T-Zellenantigenrezeptor gebunden
ist, kann der T-Zellenantigenrezeptor vorteilhaft zur Behandlung von
Tumoren wie Magentumor, Lungenkrebs und Brusttumor verwendet werden.
Der erfindungsgemäße T-Zellenantigenrezeptor kann auch an Antigene wie
Virusantigen, Bakterienantigen und MHC-Antigen binden. Daher kann der T-
Zellenantigenrezeptor ebenfalls vorteilhaft zur Identifizierung und
quantitativen Analyse von solchen Antigenen und zur Entfernung von bösartigen
Zellen wie virusinfizierten Zellen und Pathogenzellen in vivo verwendet
werden.
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Für die Durchführung der klinischen Untersuchung unter Verwendung des
erfindungsgemäßen Marker-gebundenen T-Zellenantigenrezeptors variiert
die zu verwendende Menge Marker-gebundenen T-Zellenantigenrezeptor in
Abhängigkeit von der Art des Markers. Im allgemeinen kann der
erfindungsgemäße Marker-gebundene T-Zellenantigenrezeptor Marker in einer
Menge von etwa 1 ng bis 10 ug pro zu untersuchende Probe (wie Serum,
Geweben etc.) eingesetzt werden.
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Für die Durchführung der Behandlung von Tumoren unter Verwendung des
erfindungsgemäßen Cytotoxin-gebundenen T-Zellenantigenrezeptors variiert
die Menge an zu verabreichendem Cytotoxin-gebundenem
T-Zellenantigenrezeptor in Abhängigkeit des Körpergewichts, Alters, Geschlechts,
etc. des zu behandelnden Patienten. Im allgemeinen wird der
Cytotoxingebundene T-Zellenantigenrezeptor einem Patienten in einer Menge von
etwa 10 ug bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht des Patienten verabreicht.
-
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die
jedoch den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken
sollen, im einzelnen beschrieben.
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Die in den folgenden Beispielen zum Screenen verwendeten Tumorzellen
sind über Einrichtungen öffentlich erhältlich, die in Protein, Nucleic Acid,
Enzym 23, 697 (1978) veröffentlicht von Kyoritsu Shuppan, Tokyo,
beschrieben sind. Von den erfindungsgemäßen geklonten T-Zellen bzw.
Hybridzellen, die in den folgenden Beispielen erhalten werden, sind die
folgenden geklonten T-Zellen bei dem Public Health Laboratory Service Center
for Applied Microbiology Research (Porton Down, Salisbury Wiltshire, SP40,
U.K.) hinterlegt worden.
geklonte T-Zelle Hinterlegungsnummer menschliche geklonte T-Zelle Klon 51 menschliche Hybridzelle
Beispiel 1
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(Schaffung von menschlichen geklonten cytotoxischen T-Zellen, die Tumore
vernichten können)
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Das Klonen von menschlichen T-Zellen und das Screenen von geklonten
cytotoxischen T-Zellen, die Tumore erkennen können, wurde wie folgt
durchgeführt.
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Zunächst wurden menschliche Lymphozyten wie folgt erhalten. Menschliches
peripheres Blut wurde einem erwachsenen Mann entnommen, zweifach mit
Hank's Lösung (hergestellt und vertrieben von Nissui Pharmaceutical Co.,
Ltd., Japan) verdünnt, auf Ficoll-Paque-Lösung überschichtet (hergestellt
und vertrieben durch Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) und 20 min
einer Zentrifugierung bei 2000 Umdrehungen pro Minute unterzogen. Es
wurde so ein Gemisch in Schichtform erhalten. Die mittlere Schicht, die die
Lymphozytenschicht ist, wurde dem Gemisch entnommen, mit Hank's Lösung
gewaschen und anschließend in einer Konzentration von 2·10&sup6; Zellen/ml
in RPMI 1640 Medium (hergestellt und vertrieben durch Nissui
Pharmaceutical Co.. Ltd., Japan) suspendiert, dem foetales Rinderserum in einer Menge
von 10 (w/v)% zugegeben worden war. Der Suspension wurde ein Lectin
PHA-P (Difco Laboratories, U.S.A.) zu einer Konzentration von 0,1%
zugegeben, und das Gemisch wurde in eine Kulturflasche gegeben und 48
Stunden bei 37ºC in Luft mit 5% CO&sub2; kultiviert. Die Lymphozyten wurden so
durch Lectin (PHA-P) aktiviert, und es wurden verschiedene cytotoxische
T-Zellen und Helfer-T-Zellen, die verschiedene menschliche Tumorzellinien
erkennen können, induziert. Die aktivierten Lymphozyten wurden einer
Klonierung nach dem Verfahren von Kaieda (T. Kaieda, Meneki Jikken
Sosaho (Experimental Methods in Immunology) XI, S. 689, herausgegeben von
Japanese Society of Immunology) unterzogen, um von jedem aktivierten
Lymphozyten eine geklonte Zelle zu erhalten. Zur Veranschaulichung
ge-Zellen/ml
in RPMI 1640 Medium suspendiert, das 20 v/v% foetales
Rinderserum und Interleukin 2 (hergestellt und vertrieben von Boehringer
Mannheim, Co., Ltd., Westdeutschland) enthielt. Der resultierenden Suspension
wurden Eigenlymphozyten zugegeben, die mit einer Lösung 45 min bei 37ºC
behandelt worden waren, die 100 ug/ml Mitomycin-C (hergestellt und
vertrieben von Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Japan) enthält, so daß die
Eigenlymphozytenkonzentration 1·10&sup5; Zellen/ml wurde. Das resultierende
Gemisch wurde in einer Menge von 200 ul in jede Wölbung einer
96-Wölbungen-Platte (Falcon Nr. 3072. hergestellt und vertrieben von Falcon,
U.S.A) gegeben und in Luft mit 5% CO&sub2; zwei Wochen lang bei 37ºC
kultiviert, um geklonte T-Zellen zu bilden. Ob diese geklonten T-Zellen
Tumorzellen erkennen, wurde festgestellt, indem die Cytotoxizität der geklonten
T-Zellen gegen Tumorzellen ermittelt wurde. Die Ermittlung der Cytotoxizität
geschieht wie folgt. Zunächst wurden verschiedene Tumorzellen mit &sup5;¹Cr
gemäß einem herkömmlichen Verfahren (R.M. Thorn et al, J. Immunol.
Methods 4, 301 (1974)) markiert, und es wurden 1·10&sup4; Zellen der
markierten Tumorzelle und 1·10&sup5; Zellen von jeder geklonten T-Zelle vermischt
und in 200 ul RPMI Medium kultiviert, das 5 v/v% foetales Rinderserum
enthielt (in Luft mit 5% CO&sub2; bei 37ºC). Anschließend wurde die Cytotoxizität
der geklonten T-Zellen bestimmt, indem die Radioaktivität von &sup5;¹Cr, die in
dem Überstand des kultivierten Gemisches freigesetzt wurde, bestimmt
wurde. Die Cytotoxizität wurde mittels der folgenden Formel berechnet.
-
Cytotoxizität (%) = [(B-C)/(A-C)]·100
-
(in der A die Radioaktivität der 1·10&sup4; Zellen der &sup5;¹Cr-markierten
Tumorzelle, B die Radioaktivität im Überstand des kultivierten Gemisches, in dem
1·10&sup4; Zellen der &sup5;¹Cr-markierten Tumorzellen und 1·10&sup5; Zellen der
geklonten Zelle kultiviert wurden, und C die Radioaktivität im Überstand
eines Mediums, in dem nur 1·10&sup4; Zellen der &sup5;¹Cr-markierten Tumorzelle
kultiviert wurde, bedeuten.)
-
Die geklonte T-Zelle, deren Cytotoxizität gegen eine Tumorzelle 10% oder
mehr war, wurde für fähig gehalten, die Tumorzelle zu erkennen.
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10.000 Zellen wurden unter den zuvor beschriebenen Bedingungen einer
Klonierung unterworfen. Im Ergebnis wurden etwa 500 Arten von geklonten
T-Zellen erhalten. Davon wiesen etwa 100 Arten der Zellen Cytotoxizität
gegen wenigstens eine Art von menschlichen Tumorzellinien auf (geklonte
menschliche cytotoxische T-Zellen). Die zuvor erwähnten
Klonierungsarbeitsweisen wurden wiederholt, um 21 geklonte menschliche cytotoxische
TZellen zu erhalten, die wenigstens zwei Arten von Tumorzellinien vernichten
können (Nr. 4, 8, 15, 19, 24, 28, 36, 49, 51, 75, 83, 90, 95, 115, 131, 138, 150,
165, 172, 188 und 5B5). Die Cytotoxizitäten der so erhaltenen Klone für
verschiedene Tumorzellen und Fibroblasten, die von einem Foetus stammen,
sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Diese Klone benötigten
Interleukin 2 für ihr Wachstum. Daher wurden die Klone in RPMI 1640 Medium
kultiviert, das 20 v/v% foetales Rinderserum und Interleukin 2 enthielt.
Alle 7 bis 10 Tage wurden das PHA-P und menschliche periphere
Blut-Eigenlymphozyten, von denen die Klone abstammten, mit Mitomycin behandelt
und der Kultur der Klone zugegeben. Diese Klone waren zur Vermehrung
fähig selbst nachdem die Klone 6 Monate kultiviert worden waren. Durch
Wiederholung der zuvor erwähnten Arbeitsweisen wurde bestätigt, daß die
geklonten menschlichen T-Zellen mit hoher Reproduzierbarkeit erhalten
wurden.
Tabelle 1 Cytotoxizität der geklonten menschlichen cytotoxischen T-Zellen gegen
verschiedene Tumorzellen
Cytotoxität von geklonten menschlichen cytotoxischen T-Zellen Klone menschliche Tumorzellinien Magentumor Lungentumor Dickdarmtumor rektaler Tumor Blasentumor Hepatom Gallenblasentumor Kehlkopftumor Nierentumor Brusttumor Gebärmuttertumor Melanom fötale Zellen Zunge Lunge Vorhaut normale Lymphozyten Cytotoxizität: - (geringer als 10%, + (10% oder höher)
Tabelle 2 Cytotoxizität von geklonten menschlichen T-Zellen gegen verschiedene Zielzellen
Klone
Magentumor Lungentumor Dickdarmtumor Blasentumor Gallenblasentumor Kehlkopftumor Nierentumor Gebärmuttertumor Melanom normale Lymphozyten Cytotoxizität: - (geringer als 10% + (10% oder höher)
Beispiel 2
(Herstellung einer Hybridzelle, die von dem Klon 51 abstammt)
-
Die Zellinie CEM-AGR wurde als 8-Azaguanin-resistentes menschliches T-
Lymphom verwendet. Die Zellinie CEM-AGR wurde gemäß dem Verfahren, das
in der japanischen offengelegten Patentanmeldung 57-206383 beschrieben
ist, hergestellt. Die Zellen der Zellinie wurden in einem RPMI 1640 Medium
suspendiert, das 20 v/v% FCS und 100 umol 8-Azaguanin enthielt. Die
resultierende Suspension wurde 2 Tage lang kultiviert, wobei das Medium
jeden Tag durch ein frisches Medium ersetzt wurde, indem das Verfahren
angewendet wurde, gemäß dem die Kultur zentrifugiert wurde, um die
Kultur in Zellen und einen Überstand aufzutrennen, und den Zellen; nachdem
der Überstand abgegossen worden war, ein frisches Medium zugesetzt
wurde. Die Zellen vermehrten sich aktiv. Dann wurden die Zellen mittels
Zentrifugation gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden in einem RPMI
1640 Medium suspendiert, das 20 v/v% FCS enthielt und einen Tag lang
stehengelassen. 6·10&sup7; Zellen der zuvor erhaltenen Zellinie CEM-AGR und 8
·10&sup5; Zellen der in Beispiel 1 erhaltenen menschlichen cytotoxischen T-Zelle
51, die eine breite Vielzahl von Tumorzellen erkennen konnte, wurden der
Zellverschmelzung unterworfen. Das heißt, beide zuvor erwähnten Zellen
wurden dreimal mit einem MEM-Medium gewaschen, das kein FCS enthielt,
und das auf 37ºC vorgewärmt worden war, und in dem MEM-Medium
suspendiert. Anschließend wurde die Zellsuspension in ein konisches 50 ml
Röhrchen gegeben, ausreichend vermischt und bei 800 Umdrehungen pro
Minute 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die
Suspension in ein Zellpellet und einen Überstand aufzutrennen. Nachdem der
Überstand entfernt worden war, wurde das resultierende Zellpellet
vorsichtig geschüttelt. Dem Zellpellet wurden 0,5 ml MEM-Lösung zugegeben,
die 45 w/v% PEG-6000 (hergestellt und vertrieben von Kochlight, England)
enthielt, wobei die Lösung auf 37ºC erwärmt worden war. Das resultierende
Gemisch wurde 30 Sekunden ausreichend geschüttelt und in einen CO&sub2;-
Gasinkubator, der mit einem Gas gefüllt war, das 5% CO&sub2; und 95% Luft
enthielt, bei 37ºC für 6 min stehengelassen.
-
Anschließend wurde dem Gemisch 12 ml eines MEM-Mediums (vorerwärmt auf
37ºC), das kein FCS enthielt, in einer Geschwindigkeit von 2 ml pro min
zugegeben, während das konische Röhrchen rotierte.
-
Anschließend wurden dem Gemisch 25 ml eines MEM-Mediums schnell
zugegeben. Das Gemisch wurde bei 800 Umdrehungen pro min bei
Raumtemperatur 10 min lang zentrifugiert, um das Gemisch in ein Zellpellet und einen
Überstand aufzutrennen, und der Überstand wurde entfernt. Das erhaltene
Pellet wurde gelockert. Anschließend wurden dem gelockerten Pellet 120 ml
eines RPMI 1640 Mediums (auf 37ºC vorerwärmt) vorsichtig zugegeben, das
30 v/v% FCS enthielt, um eine Suspension mit einer
CEM-AGR-Zellkonzentration von 5·10&sup5; Zellen/ml zu erhalten. Zu jeder der 120 Wölbungen von
fünf 24 Wölbungskulturplatten (Costar Nr. 3524, hergestellt und vertrieben
von Costar, U.S.A.) wurde 1 ml der so erhaltenen Suspension gegeben.
Nach 24 Stunden wurde jeder Wölbung 1 ml HAT-Medium [ein RPMI 1640
Medium, das 1·10&supmin;&sup4; mol Hypoxanthin (hergestellt und vertrieben von
Sigma Chemical Company, U.S.A.), 2·10&supmin;&sup7; mol Aminopterin (hergestellt und
vertrieben von Sigma Chemical Company, U.S.A.), 1,6·10&supmin;&sup5; mol Thymidin
(hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, U.S.A.) und 20
v/v% FCS enthielt] zugegeben. Die Hälfte des Überstands des
Kulturmediums in jeder Wölbung wurde entfernt, und es wurde zu jeder Wölbung alle
2 Tage 1 ml eines frischen HAT-Mediums gegeben, und die Kultivierung
wurde in einem 5% CO&sub2;-Gasinkubator 3 Wochen lang bei 37ºC
durchgeführt. Die so vermehrten Zellinien wurden dann in ein HT-Medium gegeben
(das gleiche Medium wie HAT-Medium mit der Ausnahme, daß kein
Aminopterin vorhanden ist) und eine weitere Woche kultiviert. Die Zellinien wurden
dann in ein normales Medium überführt (ein RPMI 1640 Medium, das 20
v/v% FCS aber kein HAT enthielt). Im Ergebnis wurden 6 Arten von
Hybridzellen erhalten. Die so erhaltenen Hybridzellen wurden einem Test
unterzogen, um festzustellen, ob die erhaltenen Hybridzellen
T-Zellenantigenrezeptoren entwickelt hatten oder nicht. Der Test wurde durchgeführt,
indem die Hybridzellen gemäß der sogenannten indirekten Methode unter
Verwendung eines Anti-T-Zellenantigenrezeptors als ersten Antikörper und
eines FITC-markierten Antimurin-Ig-Antikörpers (hergestellt und vertrieben
von TAGO Inc., U.S.A.) als zweiten Antikörper, gefärbt wurden. Die so
gefärbten Hybridzellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
Im Ergebnis wurde festgestellt, daß von den 6 Arten von Klonen von
Hybridzellen nur eine Klonart einen ringförmigen gefärbten Bereich hatte. Die
Ergebnisse zeigen, daß nur eine Klonart einen T-Zellenantigenrezeptor
entwickelt hat. Dieser Klon wurde H51-4 genannt. Andererseits wurde die
Elternzellinie CEM-AGR mit dieser Testmethode überhaupt nicht gefärbt. Der
Klon H51-4 enthielt sowohl Zellen, die einen deutlich gefärbten Bereich
hatten, d. h. die eine große Menge T-Zellenantigenrezeptor hatten, als auch
Zellen, die nur wenig gefärbt waren, d. h. die eine kleine Menge
T-Zellenantigenrezeptoren hatten. Um eine Hybridzelle zu erhalten, die eine große
Menge an T-Zellenantigenrezeptoren herstellen kann, wurden daher
Subklone des Klons H51-4 erhalten, indem die Klonierung gemäß der folgenden
herkömmlichen Methode durchgeführt wurde. Zunächst wurden 1·10&sup7;
Zellen der Zellinie CEM-AGR mit einem herkömmlichen Wachstumsmedium
gewaschen und in 60 ml des HAT-Mediums suspendiert. Dann wurden beide
Zellen des Klons H51-4 in dem Medium in einer Konzentration von 2,5
Zellen/ml suspendiert und dem zuvor erwähnten HAT-Medium zugefügt. In
jede der Wölbungen einer Mikroplatte mit 96 Wölbungen, die eine Kapazität
von 200 ul/Wölbung hat, (Falcon Nr. 3072, hergestellt und vertrieben von
Falcon, U.S.A.) wurden 0,2 ml des resultierenden Gemisches gegeben. Alle
zwei Wochen wurde die Hälfte des Überstands des Gemisches in jeder
Wölbung entfernt, und es wurde frisches HAT-Medium, das auf 37ºC
vorerwärmt worden war, jeder Wölbung zugegeben, um die zuvor erwähnten
Zellen am Vermehren zu halten. Auf diese Weise wurden Subklone des Klons
H51-4 erhalten. Die Zellen der so erhaltenen Subklone wurden einer
Färbung gemäß der zuvor erwähnten indirekten Methode unterworfen, um von
den zuvor erhaltenen Subklonen diejenigen auszuwählen, von denen nahezu
alle Zellen einen deutlich gefärbten Bereich hatten. Im Ergebnis wurden
zwei Subklone ausgewählt. Die so ausgewählten Subklone erzeugten einen
T-Zellenantigenrezeptor sehr stabil in großer Menge. Die ausgewählten
Subklone wurden H51-4-A2 und H51-4-D1 genannt.
Beispiel 3
(Kultivierung von geklonten menschlichen cytotoxischen T-Zellen,
¹³¹I-Markierung der Membranproteine der Zellen und Herstellung von löslichen
Membranproteinfraktionen der Zellen)
-
Der gemäß Beispiel 1 erhaltene menschliche cytotoxische T-Zellenklon 51
wurde in Gegenwart von Interleukin 2 kultiviert, um 2·10&sup9; Zellen zu
erhalten. Von diesen Zellen wurden T-Zellenantigenrezeptoren wie folgt
erhalten. Die Zellen wurden dreimal mit Hank's Lösung gewaschen, in 2 ml
PBS (das 1 mmol Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mmol EDTA und 10 mmol
NaF enthielt; pH 7,2) suspendiert, das 1% Triton X-100 enthielt, und in Eis
1 Stunde lang gerührt, so daß die Membranproteine der Zellen löslich
wurden. Das Gemisch wurde bei 10.000 g 20 min lang zentrifugiert, um die
Rückstände der Zellen von dem Gemisch zu entfernen. Es wurde so eine
lösliche Membranproteinfraktion erhalten.
(Herstellung von monoklonalen Anti-T-Zellenantigenrezeptorantikörpern)
-
Ein monoklonaler Anti-T-Zellenantigenrezeptorantikörper wurde wie folgt
erhalten. Zunächst wurden 1·10&sup8; Zellen von menschlichen peripheren
Blutlymphozyten in 100 ml RPMI-Medium (das 0,1% PHA-P enthielt),
enthaltend
10 v/v% foetales Rinderserum, suspendiert und 2 Tage lang kultiviert.
Anschließend wurde die Vermehrung der Zellen in einem Medium, das
Interleukin 2 enthielt, durchgeführt, um 1·10&sup9; Zellen aktivierter T-Zellen
zu erhalten. Die erhaltenen Zellen wurde praktisch auf die gleiche Art wie
zuvor erwähnt behandelt, um eine lösliche Membranproteinfraktion der
Zellen zu erhalten. Die Fraktion wurde dann auf Sephacryl S-200 (hergestellt
und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) gegeben und
unter Verwendung von PBS als Eluiermittel einer Gelchromatographie
unterzogen, um Fraktionen mit Molekulargewichten von 70.000 bzw. 100.000 zu
sammeln. Die Fraktionen wurden zusammengegeben und auf ein Volumen von
0,5 ml konzentriert. Das so erhaltene Konzentrat wurde mit dem gleichen
Volumen an Freund's Vollhilfsmittel vermischt. Das resultierende Gemisch
wurde einer BALB/c-Maus in das Bauchfell injiziert. Nach 10 Tagen und
nach 20 Tagen wurden der Maus zweimal 100 ul des zuvor erwähnten
Konzentrats in das Bauchfell injiziert. 10 Tage nach der letzten Injektion des
Konzentrats wurden der Maus 100 ul des Konzentrats intravenös injiziert,
um die Immunisierung der Maus zu vervollständigen. Drei Tage nach der
intravenösen Injektion wurden der immunisierten Maus Milzzellen
entnommen und mit Murinmyelom P3U1 über eine herkömmliche Methode
verschmolzen (G. Kohler & C. Milstein; Nature 256, 49 (1975)), um so Hybridzellen zu
erhalten. Die Hybridzellen wurden bezüglich der Bindungsaktivität des
Überstands, der aus der Kultur der Hybridzellen erhalten worden war, an
menschliche T-Zellen und bezüglich der Anwesenheit von Antikörpern in
dem Überstand einem Screenen unterworfen, wobei der Antikörper an ein
Peptid einer β-konstanten Region eines menschlichen
T-Zellenantigenrezeptors binden konnte, die organochemisch nach einer herkömmlichen
Festphasenmethode synthetisiert worden war, die auf der Aminosäurensequenz
eines T-Zellenantigenrezeptors basierte, die in Nature, 308, 145 (1984)
beschrieben worden war. Auf diese Weise wurde eine Hybridzelle erhalten, die
Anti-T-Zellenantigenrezeptorantikörper erzeugte. Der Überstand der
Hybridzelle wurde einer Immunpräzipitation mit der
T-Zellenmembranproteinfraktion, wie sie zuvor erhalten worden war, unterzogen und einer SDS-
Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Im Ergebnis wurden Präzipitate
gebildet, und es wurde eine Bande beobachtet, die unter nichtreduzierter
Bedingung dem Molekulargewicht von 90.000 entsprach, und zwei Banden,
die unter reduzierter Bedingung Molekulargewichten von 50.000 und 45.000
entsprachen. So wurde bestätigt, daß die erhaltene Hybridzelle monoklonale
Anti-T-Zellenantigenrezeptorantikörper erzeugte. Die Hybridzelle wurde
116-23 genannt.
(Herstellung von monoklonaler
Anti-T-Zellenantigenrezeptorantikörper-gebundener Sepharose 4B)
-
Die Hybridzelle (116-23) wurde in 1 l eines RPMI-Mediums kultiviert, das 20
v/v% foetales Rinderserum enthielt. Die Kultur wurde über eine
herkömmliche Methode mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung einer
Protein-A-Agarosesäule (T. Iwasaki, "Monoclonal antibody", herausgegeben
von Kodansha, Tokyo, S. 175-177 (1983)) gereinigt, um so 10 mg eines
monoklonalen Anti-T-Zellenantigenrezeptorantikörpers zu erhalten. 1 mg des
erhaltenen Antikörpers wurde wie folgt an 2 g CNBr-aktivierte Sepharose
48 (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden)
gebunden. Zunächst wurde 1 g CNBr-aktivierte Sepharose 4B ausreichend
mit 1 mmolarer (200 ml) HCL auf einem Glasfilter (G3) gewaschen, zudem
wurde mit 200 ml eines Kupplungspuffers (0,1 mol NaHCO&sub3;-Na&sub2;CO&sub3;-Puffer,
pH 8,3, 0,5 mol NaCl) gewaschen und getrocknet. Anschließend wurde der
Antikörper in einer solchen Mengen in dem Kupplungspuffer gelöst, daß die
resultierende Lösung eine Antikörperkonzentration von 1 mg/ml hatte. Die
getrocknete Sepharose wurde zu 4 ml der so erhaltenen Lösung gegeben,
und das Gemisch wurde zwei Stunden lang unter vorsichtigem Rühren bei
Raumtemperatur umgesetzt. Zwei Stunden später wurden 5 ml 0,2 molares
Glycin (pH 8,0) dem Reaktionsgemisch zugesetzt, und das resultierende
Reaktionsgemisch wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt, um
überschüssige aktive Gruppen zu blockieren. Das erhaltene Gemisch wurde
auf einen Glasfilter (G3) gegeben und nacheinander mit 200 ml des
Kupplungspuffers, 200 ml eines Acetatspuffers (0,1 mol Natriumacetat. pH 4, 0,5
mol NaCl) und 200 ml Phosphatpuffer (pH 7,0, 0,15 mol NaCl) gewaschen, um
Antikörper-gebundene Sepharose zu erhalten.
(Reinigung des T-Zellenantigenrezeptors mittels Affinitätschromatographie)
-
Die zuvor erhaltene lösliche Membranproteinfraktion des menschlichen
cytotoxischen T-Zellen-Klons 51 wurde auf eine Säule gegeben, die mit 3 ml
einer monoklonalen Anti-T-Zellenantigenrezeptorantikörper-gebundenen
Sepharose 4B bepackt war, um so zu bewirken, daß der
T-Zellenantigenrezeptor adsorbiert wird.
-
Anschließend wurde 200 ml PBS durch die Säule geleitet, um Unreinheiten
zu eluieren. Darauf wurden 10 ml 0,1 molare Glycin-Chlorwasserstoffsäure
(pH 3,0) zu der Säule gegeben, um den adsorbierten
T-Zellenantigenrezeptor zu eluieren. Das Eluat wurde neutralisiert und dann konzentriert, um
0,5 ml eines Konzentrats zu erhalten. Das Konzentrat wurde einer
SDSPolyacrylamid-Elektrophorese unterzogen. Im Ergebnis wurde eine Bande
festgestellt, die unter nicht-reduzierter Bedingung dem Molekulargewicht
von etwa 90.000 entsprach. Zudem wurden zwei Banden festgestellt, die
unter reduzierter Bedingung den Molekulargewichten von etwa 50.000 und
etwa 45.000 entsprachen. Auf diese Weise wurde bekräftigt, daß der Klon 51
T-Zellestantigenrezeptoren erzeugte.
(Markierung des T-Zellenantigenrezeptors mit FITC)
-
Das zuvor erhaltene Konzentrat, das 1 ug T-Zellenantigenrezeptor enthielt,
wurde einer Dialyse gegen einen Phosohatpuffer (10 mmol Natriumphosphat,
0,85% NaCl, pH 7,2) unterzogen, um 1 ml der T-Zellenantigenrezeptorlösung
zu erhalten. 1 ml der T-Zellenantigenrezeptorlösung, 0,1 ml 0,5 molarer
Kohlensäure-Dicarbonatpuffer (pH 9,3) und 10 ul einer 4 ug/ml FlTC-Lösung
(hergestellt und vertrieben von Sigma Chemical Company, U.S.A.) wurden in
ein kleines Becherglas gegeben und 5 Stunden lang bei Raumtemperatur
umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Gemisch gegen einen
Phosphatpuffer dialysiert, und 1 ml des Dialysats wurde bei -20ºC gelagert.
(Bindungsaktivität des FITC-markierten T-Zellenantigenrezeptors an
Tumorzellen)
-
0,1 ml des so erhaltenen FITC-markierten T-Zellenantigenrezeptors, der von
dem Klon 51 herstammte, wurde mit RPMI 1640-Medium vermischt, das 5
v/v% foetales Rinderserum und verschiedene Tumorzellinien, die von dem
Klon 51 (MKN-1, KATO-III, PC-10, NBT-2) erkannt wurden, darin suspendiert
in einer Konzentration von 1·10&sup6; Zellen/ml enthielt. Das Gemisch wurde 1
Stunde lang bei 0ºC gehalten. Anschließend wurde das Gemisch mit Hank's
Lösung gewaschen und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Im
Ergebnis wurde beobachtet, daß diese Tumorzellinien Fluoreszenz in
Ringgestalt ausstrahlten. Andererseits strahlten die Zellen, die nicht von dem Klon
51 erkannt wurden, keine Fluoreszenz aus. Auf diese Weise wurde
bekräftigt, daß der T-Zellenantigenrezeptor als eine Tumorzellen erkennende
Substanz agierte.
Beispiel 4
-
Von der aus dem Klon 51 herstammenden Hybridzelle H51-4-D1, die in
Beispiel 2 erhalten worden war, wurde auf praktisch dieselbe Art und Weise
wie in Beispiel 3 ein T-Zellenantigenrezeptor erhalten, und dessen
Bindungsaktivität für Tumorzellen wurde untersucht. Im Ergebnis wurde
festgestellt,
daß der Rezeptor an MKN-1, KATO-III, PC-10 und NBT-2 band, aber
nicht an Tumorzellen, die nicht von dem Klon 51 erkannt worden waren.
Beispiel 5
-
Aus dem Klon 51 wurde auf praktisch dieselbe Art und Weise wie in
Beispiel 1 ein T-Zellenantigenrezeptor hergestellt. Der T-Zellenantigenrezeptor
wurde ¹²&sup5;I-markiert über die Lactoperoxidase-Methode. Zunächst wurden zu
100 ul einer 10 ug/ml T-Zellenantigenrezeptorlösung in 0,05 molaren
Phosphatpuffer (pH 7,5) 0,1 mCi ¹²&sup5;I (hergestellt und vertrieben von New
England Nuclear Inc., England), 10 ul einer 0,2 mg/ml Lactoperoxidaselösung
(hergestellt und vertrieben von Calbiochem Inc., U.S.A.; gelöst in einem
Phosphatpuffer) und 10 ul einer 0,2 mg/ml Glukoseoxidaselösung (herstellt
und vertrieben von Calbiochem Inc., U.S.A.) gegeben. Dann wurden dem
Gemisch 2 ul einer 1 molaren Glukose zugegeben, um die Reaktion zu
starten. Die Reaktion wurde 30 min lang bei Raumtemperatur durchgeführt.
Anschließend wurden dem Reaktionsgemisch 15 ul 0,1 molares Natriumnitrid
zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Das Gemisch wurde nacheinander
gegen 0,05 molaren Phosphatpuffer, der 0,01% Natriumnitrid enthielt, und
gegen 0,05 molaren Phosphatpuffer dialysiert, um ¹²&sup5;I-markierte T-
Zellenantigenrezeptorlösung zu erhalten. Die so erhaltene Lösung wurde bei
-20º gelagert (0,2 ml, spezifische Aktivität 100.000 cpm/ug).
-
15 ul (6000 cpm) der so hergestellten ¹²&sup5;I-markierten
T-Zellenantigenrezeptorlösung wurde mit 0,2 ml RMPI 1640 Medium vermischt, das 5
v/v% foetales Rinderserum und verschiedene Tumorzellinien (MKN-1, KATO-
III, PC-10 und NBT-2) enthielt, wobei die Tumorzellinien durch den Klon 51,
der in dem Serum suspendiert war (1·10&sup7; Zellen/ml) erkannt wurden, und
eine Stunde lang bei 0ºC gehalten. Anschließend wurde das Gemisch mit
Hank's Lösung gewaschen und die Radioaktivität gemessen. Im Ergebnis
wurde gefunden, daß die Radioaktivität von MKN-1, KATO-III, PC-10 und
NBT-2 3800 cpm, 3600 cpm. 2900 cpm bzw. 3900 cpm war. Dieses Ergebnis
zeigt, daß Tumorzellenantigen auf jeder Tumorzellmembran durch den
Marker-gebundenen T-Zellenantigenrezeptor bestimmt werden kann.
Beispiel 6
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Ein zellfreies Tumorantigen wurde mit einem T-Zellenantigenrezeptor wie
folgt bestimmt.
(Abtrennung des Membranproteins von der Tumorzelle NBT-2).
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Die Tumorzellinie NBT-2, die durch den Klon 51 erkannt worden war, wurde
in einer Menge von 1·10¹&sup0; Zellen kultiviert. Die Kultur wurde praktisch
auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 behandelt, so daß die
Membranproteine der kultivierten Zellen in dem Kulturmedium gelöst wurden.
Der Überstand der Kultur wurde mittels Zentrifugation erhalten und gegen
10 mmolaren Phosphatpuffer (pH 7,2, 0,85% Nacl) dialysiert, um 10 ml einer
löslichen Membranproteinfraktion zu erhalten.
(Herstellung von Antiserum gegen NBT-2 Tumorzellmembranprotein)
-
1 ml der zuvor erhaltenen NBT-2 Membranproteinfraktion und 1 ml von
Freund's Vollhilfsmittel wurden vermischt, um eine Emulsion herzustellen.
Die Emulsion wurde einer BALB/c-Maus dreimal in Abständen von einer
Woche injiziert, um die Immunisierung der Maus zu bewirken. Drei Tage nach
der letzten Injektion wurde aus dem Herzen der Maus eine Blutprobe
entnommen und ruhig stehengelassen, so daß sich die Probe in eine
koagulierte Substanz und ein Antiserum auftrennte. Das Antiserum wurde
gesammelt. Aus der Probe wurden 2 ml Antiserum erhalten.
(Reinigung des Antiserums durch Affinitätschromatographie)
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2 ml der NBT-2 Tumorzellmembranproteinfraktion wurde mit 5 ml
CNBraktivierter Sepharose (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine
Chemicals AB, Schweden) umgesetzt, um eine Membranprotein(antikörper)
gebundene Sepharose herzustellen. Die Reaktion wurde wie folgt
durchgeführt.
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Zunächst wurde 1 g CNBr-aktivierter Sepharose 46 ausreichend mit 1
mmolarer (200 ml) HCl auf einem Glasfilter (G3) gewaschen, zudem mit 200 ml
eines Kupplungspuffers (0,1 mol NaHCO&sub3; Puffer, pH 8,3, 0,5 mol NaCl)
gewaschen und getrocknet. Dann wurde die Membranproteinfraktion in dem
Kupplungspuffer in einer solchen Menge gelöst, daß die resultierende
Lösung eine Antikörperkonzentration von 1 mg/ml hatte. Zu 4 ml der so
erhaltenen Lösung wurde die getrocknete Sepharose gegeben, und das
Gemisch wurde unter vorsichtigem Rühren zwei Stunden lang bei
Raumtemperatur umgesetzt. Zwei Stunden später wurden 5 ml 0,2 molares Glycin (pH
8,0) dem Reaktionsgemisch zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde
zwei Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt, um überschüssige aktive
Gruppen in dem Gemisch zu blockieren. Das erhaltene Gemisch wurde auf
einem Glasfilter (G3) gegeben und nacheinander mit 200 ml
Kupplungspuffer, 200 ml eines Acetatpuffers (0,1 mol Natriumacetat, pH 4, 0,5 mol NaCl)
und 200 ml eines Phosphatpuffers (pH 7,0, 0,15 mol NaCl) gewaschen, um
Membranprotein-gebundene Sepharose zu erhalten. Die Membran-gebundene
Sepharose wurde in eine Säule gepackt, um eine Affinitätssäule zu erhalten.
Nachdem die Affinitätssäule ausreichend mit dem Phosphatpuffer gewaschen
worden war, wurde auf die Säule 1 ml des Antiserums gegeben und 500 ml
Phosphatpuffer wurden durch die Säule geleitet, um Proteine, die nicht an
die Säule adsorbiert waren, auszuwaschen. Dann wurden 20 ml 0,1 molare
Glycin-Chlorwasserstoffsäure (pH 3,0) durch die Säule geleitet um den
adsorbierten Antikörper zu eluieren. Nachdem der pH des Eluats auf 7
eingestellt worden war, wurde das Eluat konzentriert und gegen den
Phosphatpuffer dialysiert, um 1 mg/ml einer gereinigten Antikörperlösung zu
erhalten.
(Herstellung der Radioimmuntestplatte)
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Die Antikörperlösung wurde auf das 100-fache auf eine Konzentration von
10 ug/ml mit dem Phosphatpuffer verdünnt, und einer Testplatte für den
Radioimmuntest (Falcon 3911, hergestellt und vertrieben von Falcon, U.S.A.)
in einer Menge von 100 ul jeder Wölbung der Platte zugegeben. Die
Antikörperlösung wurde 48 Stunden lang bei 4ºC gehalten, so daß der
Antikörper gegen das NBT-2 Membranprotein dem Boden der Platte anhaftete.
Die Testplatte wurde dann ausreichend mit einem Blockierungsmittel (einem
Phosphatpuffer, der 3% BSA enthielt) gewaschen und bei -20ºC gelagert.
(Radioimmuntest von Tumorzellenantigen mit ¹²&sup5;I-markiertem
T-Zellenantigenrezeptor)
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Die NBT-2 Tumorzellmembranproteinfraktion wurde mit dem
Blockierungsmittel verdünnt, um eine Serie von Lösungen mit verschiedenen
Konzentrationen herzustellen. Diese Lösungen wurden der Testplatte, der pro
Wölbung Anti-NBT-2-Tumorzellenproteinantikörper in einer Menge von 100 ul
anhafteten, getrennt zugegeben. Die Lösungen in der Platte wurden 2
Stunden lang bei 37ºC gehalten und ausreichend mit dem Blockierungsmittel
gewaschen. Anschließend wurden zu den Lösungen in den Wölbungen die
von dem Klon 51 herstammende, ¹²&sup5;I-markierte T-
Zellenantigenrezeptorlösung und das Blockierungsmittel in Mengen von 15 ul
(6000 cpm) bzw. 90 ul zugegeben. Die resultierenden Gemische in den
Wölbungen wurden 2 Stunden lang bei 37ºC gehalten. Anschließend wurden
die Wölbungen ausreichend mit dem Blockierungsmittel gewaschen, und jede
Wölbung der Platte wurde abgetrennt und einer Radioaktivitätsmessung
unterworfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5 Radioimmuntest mit T-Zellenantigenrezeptor
Verdünnung der Lösungen (malfache) Radioaktivität (cpm)
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Die Ergebnisse zeigen, daß ein zellfreies Antigen unter Verwendung eines
markierten T-Zellenantigenrezeptors bestimmt werden konnte.
Beispiel 7
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Der T-Zellenantigenrezeptor, der von dem Klon 51 abstammte, wurde auf
praktisch dieselbe Art wie in Beispiel 3 erhalten. An den erhaltenen
Rezeptor wurde ein Cytotoxin gebunden, und seine tumorabtötende Aktivität
wurde beurteilt.
(Anbinden eines Cytotoxins an einen T-Zellenantigenrezeptor)
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Eine Ricin-A-Kette wurde als Cytotoxin verwendet. Die Ricin-A-Kette wurde
mittels einer herkömmlichen Methode (S. Olsnes, Biochemistry, 12, 3124
(1973)) hergestellt. Die Ricin-A-Kette wurde an den T-Zellenantigenrezeptor
über die Methode gebunden, gemäß der
N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) verwendet wird (Cancer Res. 42, 5209 (1982)). Zur
Veranschaulichung gesagt, SPDP wurde zu 5 ml einer den
T-Zellenantigenrezeptor enthaltenen Lösung, die auf praktisch die gleiche Weise wie
Beispiel 3 erhalten worden war, gegeben. Das resultierende Gemisch wurde 30
min lang bei 23ºC gehalten, und anschließend wurde die Reaktion gestoppt.
Dann wurde die Ricin-A-Kette zu dem Gemisch gegeben und die Reaktion
wurde 15 Stunden lang bei 23ºC fortgesetzt, um eine Ricin-gebundene T-
Zellenantigenrezentorlösung zu erhalten.
(Beurteilung der tumorabtötenden Aktivität des Cytotoxin-gebundenen T-
Zellenantigenrezeptors)
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10 ul der zuvor hergestellten Ricin-gebundenen
T-Zellenantigenrezeptorlösung wurde zu 200 ul RPMI 1640 Medium gegeben, das 10 v/v%
foetales Rinderserum und ein 2·10&sup5; Zellen/ml Zellgemisch der
menschlichen
Gallenblasentumorzellinie NBT-2 und von menschlichen normalen
Lymphozyten darin suspendiert enthielt. Nachdem das Gemisch 24 Stunden lang
kultiviert worden war, wurde das Gemisch einer Trypanblaufärbung
unterzogen, um das Leben (ungefärbt) oder den Tod (gefärbt) der Zellen im
Gemisch festzustellen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß nur die Tumorzellen
abgetötet wurden und die normalen menschlichen Lymphozyten nicht
abgetötet wurden. Die Ergebnisse zeigten, daß der erfindungsgemäße
Cytotoxingebundene T-Zellenantigenrezeptor tumorabtötende Aktivität hatte.