JPS6210016A - 細胞毒性剤結合t細胞抗原リセプタ− - Google Patents
細胞毒性剤結合t細胞抗原リセプタ−Info
- Publication number
- JPS6210016A JPS6210016A JP60148327A JP14832785A JPS6210016A JP S6210016 A JPS6210016 A JP S6210016A JP 60148327 A JP60148327 A JP 60148327A JP 14832785 A JP14832785 A JP 14832785A JP S6210016 A JPS6210016 A JP S6210016A
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- JP
- Japan
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- cells
- cell
- tumor
- human
- antigen receptor
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、細胞膜抗原、特に腫瘍細胞と特異的に結合で
きる細胞毒性剤結合で細胞抗原リセプターに関する。
きる細胞毒性剤結合で細胞抗原リセプターに関する。
(従来の技術お・よび問題点)
従来、細胞膜抗原、特に腫瘍抗原の識別および解析は、
リンパ球の中のB細胞の抗原認識物質である抗体、特に
モノクローナル抗体を用すて活発に研究されてきた。し
かしながら、広範囲の腫瘍細胞t−認識結合し、正常細
胞とは結合しない汎用性のあるモノクローナル抗体は、
いまだ得られていなhのが現状である。最近の免疫学の
進歩により、長らく不明であつ良T細胞の抗原認識がT
細胞抗原リセプターによりなされることが明らかとなっ
た。
リンパ球の中のB細胞の抗原認識物質である抗体、特に
モノクローナル抗体を用すて活発に研究されてきた。し
かしながら、広範囲の腫瘍細胞t−認識結合し、正常細
胞とは結合しない汎用性のあるモノクローナル抗体は、
いまだ得られていなhのが現状である。最近の免疫学の
進歩により、長らく不明であつ良T細胞の抗原認識がT
細胞抗原リセプターによりなされることが明らかとなっ
た。
(問題点を解決するための手段)
本発明の目的は、上記のごとき従来技術に基づく鵜膜抗
原、特に腫瘍抗原認識物質としてのモノクローナル抗体
の問題点に鑑み、B細胞とは別種のリンパ球であり、免
疫の主役を荷うT細胞より細胞膜抗原、特に腫瘍抗原認
識物質としての機能を有する抗原リセプター物質を得て
、これに細胞毒性剤を結合し、飛躍的な有用性および汎
用性を有する癌治療薬を提供することにある。
原、特に腫瘍抗原認識物質としてのモノクローナル抗体
の問題点に鑑み、B細胞とは別種のリンパ球であり、免
疫の主役を荷うT細胞より細胞膜抗原、特に腫瘍抗原認
識物質としての機能を有する抗原リセプター物質を得て
、これに細胞毒性剤を結合し、飛躍的な有用性および汎
用性を有する癌治療薬を提供することにある。
本発明者らは、上記目的のためにヒトおよびマウスのリ
ンパ球を腫瘍細胞あるいはレクチン、もしくはリンフ才
力インの1棟であるインターロイキン2等を用いて種々
の方法でリンパ球の活性化を行い、腫瘍細胞を殺す機能
を持ったキラーT細胞を誘導し、クローニングを行って
殺腫瘍性キラーT細胞りa−ンを樹立する実験を精力的
に行った。このようKして得られたクローン化キラーT
細胞の種々の腫瘍細胞に対する上2−活性を調べたとこ
ろ%驚ろくべきことに、MHC抗原(ヒトではHLA、
マウスではH−2)にかかわシなく広範囲の@瘍細胞t
−認識して強力に殺し、正常細胞は殺さないキラーT細
胞クローンが存在することを見い出した。このような広
範囲設腫瘍性キラーT細胞クローンは、リンパ球の活性
化シよびクローニング法を一定にして行えば、再現性良
く、種々の特異性を有するクローンを樹立することがで
きた。
ンパ球を腫瘍細胞あるいはレクチン、もしくはリンフ才
力インの1棟であるインターロイキン2等を用いて種々
の方法でリンパ球の活性化を行い、腫瘍細胞を殺す機能
を持ったキラーT細胞を誘導し、クローニングを行って
殺腫瘍性キラーT細胞りa−ンを樹立する実験を精力的
に行った。このようKして得られたクローン化キラーT
細胞の種々の腫瘍細胞に対する上2−活性を調べたとこ
ろ%驚ろくべきことに、MHC抗原(ヒトではHLA、
マウスではH−2)にかかわシなく広範囲の@瘍細胞t
−認識して強力に殺し、正常細胞は殺さないキラーT細
胞クローンが存在することを見い出した。このような広
範囲設腫瘍性キラーT細胞クローンは、リンパ球の活性
化シよびクローニング法を一定にして行えば、再現性良
く、種々の特異性を有するクローンを樹立することがで
きた。
これらの殺@瘍性キラーT細胞クローンは、腫瘍細胞と
正常細胞を識別して上2−活性を発揮することから、腫
瘍抗原t−認識できる抗原リセプターを有することが考
えられたので、これらの殺腫瘍性キラーT細胞よシ抗原
すセプタ一の分離精製実験を精力的に行った。
正常細胞を識別して上2−活性を発揮することから、腫
瘍抗原t−認識できる抗原リセプターを有することが考
えられたので、これらの殺腫瘍性キラーT細胞よシ抗原
すセプタ一の分離精製実験を精力的に行った。
その結果、広範囲設腫瘍性キラーT細胞クローンよシ得
た抗原リセプターは、驚ろくべきことに1広範囲の腫瘍
細胞と結合し、正常細胞とは結合しないことを見い出し
、さらに、この抗原リセプターは、作製した抗T細胞抗
原すセブターモメクローナル抗体と特異的に結合し、報
告されているT細胞抗原リセプターの性質を有している
ことが判明した。
た抗原リセプターは、驚ろくべきことに1広範囲の腫瘍
細胞と結合し、正常細胞とは結合しないことを見い出し
、さらに、この抗原リセプターは、作製した抗T細胞抗
原すセブターモメクローナル抗体と特異的に結合し、報
告されているT細胞抗原リセプターの性質を有している
ことが判明した。
すなわち、広範囲設腫瘍性キラーT細胞クローンより得
たT細胞抗原リセプターは、広範囲の腫瘍細胞と結合し
、正常細胞とは結合しないことを見い出し、新規腫瘍細
胞認識物質としてすでに特許出願した〔特願昭60−9
2299号(腫瘍細胞を認識するクローン化T細胞およ
び該細胞よ)得たT細胞抗原リセプター〕〕。さらに1
これらのT細胞抗原リセプターは、腫瘍細胞に対する結
合性はあるが、障害性はないため、殺腫瘍性を付与する
几めに種々の方法を精力的に試みたところ、細胞毒性剤
をT細胞抗原り七ブタ−に結合されることにより、強力
な殺腫瘍能を付与することに成功し、本発明を完成する
に至った。
たT細胞抗原リセプターは、広範囲の腫瘍細胞と結合し
、正常細胞とは結合しないことを見い出し、新規腫瘍細
胞認識物質としてすでに特許出願した〔特願昭60−9
2299号(腫瘍細胞を認識するクローン化T細胞およ
び該細胞よ)得たT細胞抗原リセプター〕〕。さらに1
これらのT細胞抗原リセプターは、腫瘍細胞に対する結
合性はあるが、障害性はないため、殺腫瘍性を付与する
几めに種々の方法を精力的に試みたところ、細胞毒性剤
をT細胞抗原り七ブタ−に結合されることにより、強力
な殺腫瘍能を付与することに成功し、本発明を完成する
に至った。
すなわち、本発明は、細胞膜抗原、特に腫瘍細胞と特異
的に結合できるT細胞抗原リセプターにおいて、細胞毒
性剤が結合されていることt−特徴とするT細胞抗原リ
セプターに係る。
的に結合できるT細胞抗原リセプターにおいて、細胞毒
性剤が結合されていることt−特徴とするT細胞抗原リ
セプターに係る。
本発明ので細胞抗原リセプターが結合する@瘍細胞は、
ヒト胃癌細胞株MKN−1、KATO−m、ヒト肺癌細
胞株pc−i、PC−9、PC−10、PC−15%P
C−14%ヒト結腸癌細胞株C−1、M7609、ヒト
直腸癌細胞株CaR−1、S−7512、ヒト胆管癌細
胞株H−1、ヒト肝癌細胞株HLE。
ヒト胃癌細胞株MKN−1、KATO−m、ヒト肺癌細
胞株pc−i、PC−9、PC−10、PC−15%P
C−14%ヒト結腸癌細胞株C−1、M7609、ヒト
直腸癌細胞株CaR−1、S−7512、ヒト胆管癌細
胞株H−1、ヒト肝癌細胞株HLE。
HLF、ヒト膀胱癌細胞株NBT−2、KU−1、ヒト
咽喉癌細胞株KB、ヒト胃癌細胞株W−2、NRC−1
2、ヒト乳癌細胞株MBC−4、HBC−61ヒト子宮
癌細胞株HeLa、ヒト黒色腫細胞株HMV−1、HM
V−2(7)うち少なくとも2種以上である。結合でき
る@瘍細胞が多種であるほど汎用性は高まるので、好ま
しくは3種以上、さらに好ましくは4株以上の腫瘍細胞
と結合できるT細胞抗原リセプターが好ましい。本発明
のT細胞抗原リセプターは、MHC抗原とかかわりなく
、腫瘍抗原と結合できるが、MMC抗原が関与した抗原
を認識するT細胞抗原リセプターも本発明に含まれる。
咽喉癌細胞株KB、ヒト胃癌細胞株W−2、NRC−1
2、ヒト乳癌細胞株MBC−4、HBC−61ヒト子宮
癌細胞株HeLa、ヒト黒色腫細胞株HMV−1、HM
V−2(7)うち少なくとも2種以上である。結合でき
る@瘍細胞が多種であるほど汎用性は高まるので、好ま
しくは3種以上、さらに好ましくは4株以上の腫瘍細胞
と結合できるT細胞抗原リセプターが好ましい。本発明
のT細胞抗原リセプターは、MHC抗原とかかわりなく
、腫瘍抗原と結合できるが、MMC抗原が関与した抗原
を認識するT細胞抗原リセプターも本発明に含まれる。
本発明のT細胞抗原リセブターは、T細胞膜面上に存在
する抗原認識分子であり、約50キロダルトンの分子量
を有するポリペプチドと約45キロダルトンの分子量を
有するポリペプチドの二つのポリペプチドがジフルフイ
ド結合を介して互いに共有結合されているヘテロダイマ
ーである。
する抗原認識分子であり、約50キロダルトンの分子量
を有するポリペプチドと約45キロダルトンの分子量を
有するポリペプチドの二つのポリペプチドがジフルフイ
ド結合を介して互いに共有結合されているヘテロダイマ
ーである。
本発明のT細胞抗原リセプターは、@瘍細胞を認識し、
正常細胞を認識しないクローン化T細胞より得ることが
できる。これらのクローン化T細胞は、ヒト、マウス、
ラット、ラビット、モルモット等の哺乳動物由来のリン
パ球から得ることができる。しかしながら、医薬として
用いる場合を考えると、ヒトリンパ球から得るのが好ま
しい。
正常細胞を認識しないクローン化T細胞より得ることが
できる。これらのクローン化T細胞は、ヒト、マウス、
ラット、ラビット、モルモット等の哺乳動物由来のリン
パ球から得ることができる。しかしながら、医薬として
用いる場合を考えると、ヒトリンパ球から得るのが好ま
しい。
まfcl リンパ球は末梢血、膵臓、リンパ節から得る
ことができるが、末梢血よシ採取するのが簡便である。
ことができるが、末梢血よシ採取するのが簡便である。
また、本発明のクローン化T細胞とは、細胞表面に免疫
グロブリンの検出できないリンパ球である。よシ好まし
くはT細胞抗原(ヒトではT3、マウスではThy−1
)f有する細胞である。
グロブリンの検出できないリンパ球である。よシ好まし
くはT細胞抗原(ヒトではT3、マウスではThy−1
)f有する細胞である。
本発明において用いるクローン化T細胞は、細施膜抗原
を認識するT細胞であればよく、その機能はヘルパーT
細胞であってもよく、キ?−T細胞であって屯よい。な
訃、本発明で^うT細胞の細胞膜抗原認識とは、細胞膜
抗原と反応して種々のリンパ球機能を発現することを言
う。すなわち、T細胞が細胞膜抗原と反応して、これを
殺すキラー作用あるいは細胞膜抗原と反応してリンフ才
力イン産生等のヘルパー作用を発現することを言う。
を認識するT細胞であればよく、その機能はヘルパーT
細胞であってもよく、キ?−T細胞であって屯よい。な
訃、本発明で^うT細胞の細胞膜抗原認識とは、細胞膜
抗原と反応して種々のリンパ球機能を発現することを言
う。すなわち、T細胞が細胞膜抗原と反応して、これを
殺すキラー作用あるいは細胞膜抗原と反応してリンフ才
力イン産生等のヘルパー作用を発現することを言う。
本発明にシいて用いるクローン七T細胞を得る方法には
、次の二つの方法がある。第1の方法は、インターロイ
キン2t−用いる方法である。すなわち、まずリンパ球
を細胞膜抗原、レクチン、インターロイキン2等で刺激
する。この場合、レクチンあるいはインターロイキン2
を用いると、種々の特異性の異なるクローン化T細胞が
得られるので好ましい。レクチンとしてはファセオラス
・ブルガリス(Phaseolus vulgaris
)由来の7カインゲンマメレクチン(PHA)、コン
カナバリア・エンラフオルミス(Concanaval
ia ensiformis )由来のコンカナバリ;
/ A (Con A ) 、ウイステリァφアオリバ
ンダ(Wisteria aoribanda )由来
のノダクヅマメレクチン(WFA)、レンズ・キュリナ
リス(Lens culinaris )由来のレンズ
マメレクチン(LCH)%フィトラッカ・アメリカーナ
(Phytolacca americana )由来
のアメリカヤマゴボウレクチン(PWM)を使用する。
、次の二つの方法がある。第1の方法は、インターロイ
キン2t−用いる方法である。すなわち、まずリンパ球
を細胞膜抗原、レクチン、インターロイキン2等で刺激
する。この場合、レクチンあるいはインターロイキン2
を用いると、種々の特異性の異なるクローン化T細胞が
得られるので好ましい。レクチンとしてはファセオラス
・ブルガリス(Phaseolus vulgaris
)由来の7カインゲンマメレクチン(PHA)、コン
カナバリア・エンラフオルミス(Concanaval
ia ensiformis )由来のコンカナバリ;
/ A (Con A ) 、ウイステリァφアオリバ
ンダ(Wisteria aoribanda )由来
のノダクヅマメレクチン(WFA)、レンズ・キュリナ
リス(Lens culinaris )由来のレンズ
マメレクチン(LCH)%フィトラッカ・アメリカーナ
(Phytolacca americana )由来
のアメリカヤマゴボウレクチン(PWM)を使用する。
これらのレクチンの中でも、PHA、PWMは腫瘍認識
性T細胞を得る場合には1強く活性化するので好ましい
。
性T細胞を得る場合には1強く活性化するので好ましい
。
刺激活性化したリンパ球をインターロイキン2含有培地
に浮遊させ、マイクロウェルプレートの各ウェルに細胞
が1個ずつ入るように分注した後、培養を行ってクロー
ニングし、〔海江田豪児(T。
に浮遊させ、マイクロウェルプレートの各ウェルに細胞
が1個ずつ入るように分注した後、培養を行ってクロー
ニングし、〔海江田豪児(T。
Kaieda ) ;ジャーナル・オプΦイムノロシイ
(J。
(J。
Immunol、)、上29 .46(’82 ))ク
ローン化T細胞を得る。第2の方法は、リンパ球を細胞
膜抗原あるいはレクチン等で刺激もしくは刺激せずKそ
のまま、腫瘍細胞株と公知の方法〔開田、吉村、海江田
(M。
ローン化T細胞を得る。第2の方法は、リンパ球を細胞
膜抗原あるいはレクチン等で刺激もしくは刺激せずKそ
のまま、腫瘍細胞株と公知の方法〔開田、吉村、海江田
(M。
0kada、 N、Yoshimura、 T、Kai
eda ) 、プロシーディング拳ナショナル・アカデ
ミ−・サイアンス(PrOClNatl、Acad、S
ci、 )、 78 、7717 (’81 ) )で
融合させて融合細胞株とした後、クローニングを行い、
クローン化融合T細胞を得る方法である。このような方
法で得られた多くのクローン化T細胞の中から、腫瘍細
胞を認識するものをスクリーニングする。スクリーニン
グは、クローン化T細胞と細胞膜抗原を有する細胞を混
合培養し、該細胞を認識して殺すか(キラー活性)、あ
るいは該細胞を認識してなんらかのリンフ才力イン(イ
ンターロイキン2、インターフェロン等)t−産生ずる
(ヘルパー活性)かで該細胞に対する認識性を評価する
ことKよシ行う。
eda ) 、プロシーディング拳ナショナル・アカデ
ミ−・サイアンス(PrOClNatl、Acad、S
ci、 )、 78 、7717 (’81 ) )で
融合させて融合細胞株とした後、クローニングを行い、
クローン化融合T細胞を得る方法である。このような方
法で得られた多くのクローン化T細胞の中から、腫瘍細
胞を認識するものをスクリーニングする。スクリーニン
グは、クローン化T細胞と細胞膜抗原を有する細胞を混
合培養し、該細胞を認識して殺すか(キラー活性)、あ
るいは該細胞を認識してなんらかのリンフ才力イン(イ
ンターロイキン2、インターフェロン等)t−産生ずる
(ヘルパー活性)かで該細胞に対する認識性を評価する
ことKよシ行う。
本発明において、クローン七T細胞が認識する対象抗原
が腫瘍細胞%に固型筋(充実性線gs)である場合には
、その認識する細胞は、ヒト胃癌細胞株MKN−1,K
ATO−111、ヒト肺癌細胞株PC−1、PC−9、
P C−10%PC−15、PC−14、ヒト結腸癌細
胞株C−1,M76Q9、ヒト直腸癌細胞株CaR−1
、S−7512、ヒト胆管癌細胞味H−1、ヒト肝癌細
胞株HLI。
が腫瘍細胞%に固型筋(充実性線gs)である場合には
、その認識する細胞は、ヒト胃癌細胞株MKN−1,K
ATO−111、ヒト肺癌細胞株PC−1、PC−9、
P C−10%PC−15、PC−14、ヒト結腸癌細
胞株C−1,M76Q9、ヒト直腸癌細胞株CaR−1
、S−7512、ヒト胆管癌細胞味H−1、ヒト肝癌細
胞株HLI。
HLF、ヒト膀胱癌細胞株NBT−2、KU−1、ヒト
咽喉癌細胞株KB、ヒト腎癌細胞株W−2、NRC−1
2,ヒト乳癌細胞株HBC−4、HBC“−6、ヒト子
宮癌細胞株1(eLa、ヒト黒色腫細胞株HMV−1、
HMV−2のうち少なくとも2種以上であシ、認識しな
い正常細胞は、健常人リンパ球、健常人赤血球、ヒト胎
児由来繊維芽細胞株HIT%HEL%−MRHFのうち
少なくとも1種以上である。なお、クローン化T細胞が
腫瘍細胞t−認識するかどうかは、認識性を中2−活性
で評価する場合 11c、標識法を用い、E/T比(ク
ローン七T細胞と腫瘍細胞の混合比)10で4時間%
37C培養を行い、10チ以上のキラー活性を示すもの
を認識するとする。
咽喉癌細胞株KB、ヒト腎癌細胞株W−2、NRC−1
2,ヒト乳癌細胞株HBC−4、HBC“−6、ヒト子
宮癌細胞株1(eLa、ヒト黒色腫細胞株HMV−1、
HMV−2のうち少なくとも2種以上であシ、認識しな
い正常細胞は、健常人リンパ球、健常人赤血球、ヒト胎
児由来繊維芽細胞株HIT%HEL%−MRHFのうち
少なくとも1種以上である。なお、クローン化T細胞が
腫瘍細胞t−認識するかどうかは、認識性を中2−活性
で評価する場合 11c、標識法を用い、E/T比(ク
ローン七T細胞と腫瘍細胞の混合比)10で4時間%
37C培養を行い、10チ以上のキラー活性を示すもの
を認識するとする。
本発明で述べたリンパ球の刺激、クローニング、スクリ
ーニング法により、種々の特異性を有する腫@認識性り
ローン化T細胞を得ることができる。
ーニング法により、種々の特異性を有する腫@認識性り
ローン化T細胞を得ることができる。
すなわち、少なくともヒト胃癌細胞株MKN−1、KA
TO−Ul’に殺し、健常人リンパ球、旭光由来繊維芽
細胞HILは、殺さない胃癌に特異的と考えられるクロ
ーン化ヒトキラーで細胞が得られた。また、少なくとも
ヒト肺癌細胞株PC−1、PC−9、PC−10、PC
−13、PC−14を殺し、健常人リンパ球、胎児由来
繊維芽細胞HETは殺さず、肺癌特異的と考えられるク
ローン化とトキラーT細胞が得られた。さらに、少なく
ともヒト肺癌細胞株PC−10、PC−14、ヒト胃癌
細胞株MKN−1、KATO−III、ヒト膀胱癌細胞
株NBT−2を殺し、健常人リンパ球は殺さない汎、腫
瘍特異的と考えられるクローン化ヒトキラーT細胞が得
られた。
TO−Ul’に殺し、健常人リンパ球、旭光由来繊維芽
細胞HILは、殺さない胃癌に特異的と考えられるクロ
ーン化ヒトキラーで細胞が得られた。また、少なくとも
ヒト肺癌細胞株PC−1、PC−9、PC−10、PC
−13、PC−14を殺し、健常人リンパ球、胎児由来
繊維芽細胞HETは殺さず、肺癌特異的と考えられるク
ローン化とトキラーT細胞が得られた。さらに、少なく
ともヒト肺癌細胞株PC−10、PC−14、ヒト胃癌
細胞株MKN−1、KATO−III、ヒト膀胱癌細胞
株NBT−2を殺し、健常人リンパ球は殺さない汎、腫
瘍特異的と考えられるクローン化ヒトキラーT細胞が得
られた。
T細胞抗原リセプターは次の方法により、これらのクロ
ーン化T細胞より効率良く分離することができる。すな
わち、クローン化T細胞t−11Triton X −
100を含むP B S (0,85*NaC1含有リ
ン酸緩衝液、p H7,2)中に浮遊させ、水中にて1
時間攪拌することにより膜たんばくを溶出させ、これ′
ftT細胞抗細胞抗原リープターるモノクローナル抗体
を結合しfc 5epharose 4 Bでアフイニ
テイ梢製を行う。精選しgT細胞抗原リすプターをSO
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動Kかけると、非還元
条件では分子量約9万の位置に1本のバンドが検出され
、還元条件では分子量約5万および分子量約4万5千に
2本のバンドが検出される。さらに、クローン化Tm胞
’にチュニカマイシン処理して糖部分のないT細胞抗原
リセブターを得ると、それぞれ分子量約3万の二つの蛋
白質成分がジスルフィド結合を介して互すに共有結合し
ている分子量約6万のへテロダイマーが得られる。すな
わち、本発明のT細胞抗原リセプターは、糖の結合した
ものシよび糖の結合していないものの両者を含むもので
るる。
ーン化T細胞より効率良く分離することができる。すな
わち、クローン化T細胞t−11Triton X −
100を含むP B S (0,85*NaC1含有リ
ン酸緩衝液、p H7,2)中に浮遊させ、水中にて1
時間攪拌することにより膜たんばくを溶出させ、これ′
ftT細胞抗細胞抗原リープターるモノクローナル抗体
を結合しfc 5epharose 4 Bでアフイニ
テイ梢製を行う。精選しgT細胞抗原リすプターをSO
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動Kかけると、非還元
条件では分子量約9万の位置に1本のバンドが検出され
、還元条件では分子量約5万および分子量約4万5千に
2本のバンドが検出される。さらに、クローン化Tm胞
’にチュニカマイシン処理して糖部分のないT細胞抗原
リセブターを得ると、それぞれ分子量約3万の二つの蛋
白質成分がジスルフィド結合を介して互すに共有結合し
ている分子量約6万のへテロダイマーが得られる。すな
わち、本発明のT細胞抗原リセプターは、糖の結合した
ものシよび糖の結合していないものの両者を含むもので
るる。
本発明において、T細胞抗原リセブターに結合する細胞
毒性剤としては極々あるが、化学療法剤としては、シク
ロフォスフアミド、ナイロジエンマスタード等のアルキ
ル化剤、N4−ペヘノイルアラC%フルオロウラシル(
FU)、1−7ラノンルー5FU、メルカプトプリン等
の代謝拮抗物質、プレオマイシン、マイトマイシン、ア
ドリアマイシンD、シクロヘキシミド等の抗生物質、プ
レドニゾン、プロスタグランジン等のホルモン剤等が例
示できる。生物学的毒素としては、植物、動物由来の毒
素があるが、ヘビ毒、ジフテリア毒素、アブリン、リシ
ン等が例示できる。光活性化毒性剤としては、ヘマトポ
ルフィリン誘導体、放射性物質としては、j宜5 I、
ao co、 so Sr %31! p 、 te
a Ir等が例示できる。
毒性剤としては極々あるが、化学療法剤としては、シク
ロフォスフアミド、ナイロジエンマスタード等のアルキ
ル化剤、N4−ペヘノイルアラC%フルオロウラシル(
FU)、1−7ラノンルー5FU、メルカプトプリン等
の代謝拮抗物質、プレオマイシン、マイトマイシン、ア
ドリアマイシンD、シクロヘキシミド等の抗生物質、プ
レドニゾン、プロスタグランジン等のホルモン剤等が例
示できる。生物学的毒素としては、植物、動物由来の毒
素があるが、ヘビ毒、ジフテリア毒素、アブリン、リシ
ン等が例示できる。光活性化毒性剤としては、ヘマトポ
ルフィリン誘導体、放射性物質としては、j宜5 I、
ao co、 so Sr %31! p 、 te
a Ir等が例示できる。
T細胞抗原リセプターに細胞毒性剤を結合させる方法は
種々あるが、たとえば、マメ毒のりシンA鎖f S P
D P [N −succinimidyl 5−(
2−pyridyldithio ) propion
ate ]を介してi細胞抗原リセプターとの複合体全
作製する方法、あるいはアドリアマイシンD等の制癌剤
を含有するりボゾームの表面にT細胞抗原リセプターを
結合させる方ffi、、もしくはT細胞抗原リセプター
にデキストラン−橋剤としてアドリアマイシン等の制癌
剤を結合させた複合体を作製する方法等を例示すること
ができる。
種々あるが、たとえば、マメ毒のりシンA鎖f S P
D P [N −succinimidyl 5−(
2−pyridyldithio ) propion
ate ]を介してi細胞抗原リセプターとの複合体全
作製する方法、あるいはアドリアマイシンD等の制癌剤
を含有するりボゾームの表面にT細胞抗原リセプターを
結合させる方ffi、、もしくはT細胞抗原リセプター
にデキストラン−橋剤としてアドリアマイシン等の制癌
剤を結合させた複合体を作製する方法等を例示すること
ができる。
(発明の効果)
以上述べた方法を用いて、腫瘍認識性クローン化T細胞
より得たT細胞抗原リセプターに細胞毒性剤を結合させ
た複合体を腫瘍細胞に作用式せたところ、強力に腫瘍細
胞が殺され、細胞毒性側結合T細胞抗原リセプターが、
きわめて高い殺腫瘍細胞能を有することを見い出した。
より得たT細胞抗原リセプターに細胞毒性剤を結合させ
た複合体を腫瘍細胞に作用式せたところ、強力に腫瘍細
胞が殺され、細胞毒性側結合T細胞抗原リセプターが、
きわめて高い殺腫瘍細胞能を有することを見い出した。
本発明の細胞毒性側結合T細胞抗原リセプターは、きわ
めて高い@瘍細胞識別能を有する新規な癌治療薬として
、胃癌、肺癌、乳癌等の癌患者治療に用いることができ
る。なお、本発明は、上記例示に限定されるものではな
い。T細胞クローンおよびT細胞抗原リセブターを選択
し、これに細胞毒性剤を結合すれば、腫瘍細胞のみなら
ず、ビールス感染細胞、病原細胞等の生体内の悪性細胞
除去だ有効に用いることができる。
めて高い@瘍細胞識別能を有する新規な癌治療薬として
、胃癌、肺癌、乳癌等の癌患者治療に用いることができ
る。なお、本発明は、上記例示に限定されるものではな
い。T細胞クローンおよびT細胞抗原リセブターを選択
し、これに細胞毒性剤を結合すれば、腫瘍細胞のみなら
ず、ビールス感染細胞、病原細胞等の生体内の悪性細胞
除去だ有効に用いることができる。
(実施例)
以下実施例によシ、本発明の実施の態様をより詳細に説
明する。
明する。
実施例1
(殺腫瘍性ヒトクローン化キ?−T細胞のスクリーニン
グ) EトT細胞のクローニングおよび腫瘍認識性クローン化
キラーT細胞のスクリーニングは、以下のようKして行
った。 ゛ 辷トリンパ球は次のようにして得た。すなわち、採血し
たヘパリン加ヒト末梢血を71ンクス液にッスイ)で2
倍希釈し、フィコールパーク液(ファルマシア社製)に
重層し、20GOrpmで20分間遠心分離を行った。
グ) EトT細胞のクローニングおよび腫瘍認識性クローン化
キラーT細胞のスクリーニングは、以下のようKして行
った。 ゛ 辷トリンパ球は次のようにして得た。すなわち、採血し
たヘパリン加ヒト末梢血を71ンクス液にッスイ)で2
倍希釈し、フィコールパーク液(ファルマシア社製)に
重層し、20GOrpmで20分間遠心分離を行った。
中間層のリンパ球層を採取して、これをハンクス液で洗
った後、牛胎児血清を10チ添加したRPMI 164
G培地にツスイ)K2X10@個/wt細胞濃度で浮遊
させた。これKPHA−P(ディ7:7#)t−0,1
%(Da&で添加し、培養びんに移して、S7C,5%
CO,中で48時間培養を行った。リンパ球はレクチン
(PHA−P)によって活性化され、種々のヒト腫瘍細
胞株をg識する椙々のキラーT細胞、ヘルパーT細胞が
誘導された。このポリクローナルな活性化リンパ球をモ
ノクローナルにするために、公知の方法(海江田豪児;
免疫実験操作法xr、P、5689、日本免疫学合繊)
Kてクローニングを行った。すなわち、活性化リンパ球
を市販のインターロイキン2(ペーリンガー・マンハイ
ム社Jllり含有RPMI 1640培地(20チ牛脂
児血清含有)Ic 5 cells/―の細胞濃度で浮
遊させ、この細胞浮遊培地にマイ、トマイシンC(協和
醗酵製)処理(100μt/d、37C,45分)した
自己リンパ球t−I X 10S個/ll1tの細胞濃
度で加えた後、200μtずつ96穴200μを容マイ
クロウェルプレート(ファルコンム3072 )K分注
し、57c、s*co、中で培養を行った。約2週間で
クロ □−ン化T細胞が増殖した。このクローン化
T細胞 □が腫瘍細胞認識性を持つかどうかは、次
のように腫瘍細胞に対してキラー活性を有するかどうか
で評価し次。すなわち、各種腫瘍細胞’k ” Crで
公知の方法〔アール中エム・トーンら(R,M、Tho
rnet al )、ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソウド(J、Immunol、 Methods
)s 4 、501 □(’74))で標識
し% I X 104個の標識腫瘍細胞とI X 10
”@のクローン七T細胞を、200μtのRPMI培地
(5チ牛脂児血清含有)中で4時間混合培養(57C,
5%CO,)した後、上清に遊離される1ICrの放射
活性をカウントして、キラー活性を有するかどうかを評
価した。
った後、牛胎児血清を10チ添加したRPMI 164
G培地にツスイ)K2X10@個/wt細胞濃度で浮遊
させた。これKPHA−P(ディ7:7#)t−0,1
%(Da&で添加し、培養びんに移して、S7C,5%
CO,中で48時間培養を行った。リンパ球はレクチン
(PHA−P)によって活性化され、種々のヒト腫瘍細
胞株をg識する椙々のキラーT細胞、ヘルパーT細胞が
誘導された。このポリクローナルな活性化リンパ球をモ
ノクローナルにするために、公知の方法(海江田豪児;
免疫実験操作法xr、P、5689、日本免疫学合繊)
Kてクローニングを行った。すなわち、活性化リンパ球
を市販のインターロイキン2(ペーリンガー・マンハイ
ム社Jllり含有RPMI 1640培地(20チ牛脂
児血清含有)Ic 5 cells/―の細胞濃度で浮
遊させ、この細胞浮遊培地にマイ、トマイシンC(協和
醗酵製)処理(100μt/d、37C,45分)した
自己リンパ球t−I X 10S個/ll1tの細胞濃
度で加えた後、200μtずつ96穴200μを容マイ
クロウェルプレート(ファルコンム3072 )K分注
し、57c、s*co、中で培養を行った。約2週間で
クロ □−ン化T細胞が増殖した。このクローン化
T細胞 □が腫瘍細胞認識性を持つかどうかは、次
のように腫瘍細胞に対してキラー活性を有するかどうか
で評価し次。すなわち、各種腫瘍細胞’k ” Crで
公知の方法〔アール中エム・トーンら(R,M、Tho
rnet al )、ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソウド(J、Immunol、 Methods
)s 4 、501 □(’74))で標識
し% I X 104個の標識腫瘍細胞とI X 10
”@のクローン七T細胞を、200μtのRPMI培地
(5チ牛脂児血清含有)中で4時間混合培養(57C,
5%CO,)した後、上清に遊離される1ICrの放射
活性をカウントして、キラー活性を有するかどうかを評
価した。
キラー活性は次式により算定した。
中2−活性=((B−C)/(A−c))X100A=
標識a!!細胞lX104個の放射活性B:襟識腫瘍細
胞f X 104個とクローンfヒT細胞lX101@
を混合培養した場合の上清中の放射活性 C:標識腫瘍細胞lX104個だけを培養した場合の上
清中の放射活性 1万個の活性化リンパ球を上記条件下でクローニングし
た結果、クローン化T細胞が約500個得られた。この
内、各種ヒト腫瘍細胞株の少なくとも1種に対してキラ
ー活性を有するヒトクローン化キラーT細胞が約100
個存在した。この上うにしてクローニング実験をくりか
えして得たヒ □トクローン化キラーT細胞の中で
、典型的なりロ :−ンの各種腫瘍細胞および胎児
由来繊維芽細胞に対するキラー活性を表1に示す。これ
らのクロー ;ンは培養にインターロイキン2を必
要とし、長期を 間培養維持するためKは、インターロイキン2を含有す
るRPMI 1440培地(20俤牛脂児血清含有)で
培養を行う。さらに、7〜10日に一度、 :PHA
−Pおよびこれらのクローンが由来するヒ □トの
自己末梢血、リンパ球をマイトマイシン処理した後培養
に添加する。このような条件下で培養を行うことによ)
%66万以上の長期培養維持が □可能であった。ま
た、このような@瘍細胞認識性 □ヒトキ?−T細胞
クローンは、上記と同じ条件でヒト末梢血リンパ球のレ
クチン刺激、クローニング、スクリーニングを行えば、
再現性良く得るこ ゛とができた。
標識a!!細胞lX104個の放射活性B:襟識腫瘍細
胞f X 104個とクローンfヒT細胞lX101@
を混合培養した場合の上清中の放射活性 C:標識腫瘍細胞lX104個だけを培養した場合の上
清中の放射活性 1万個の活性化リンパ球を上記条件下でクローニングし
た結果、クローン化T細胞が約500個得られた。この
内、各種ヒト腫瘍細胞株の少なくとも1種に対してキラ
ー活性を有するヒトクローン化キラーT細胞が約100
個存在した。この上うにしてクローニング実験をくりか
えして得たヒ □トクローン化キラーT細胞の中で
、典型的なりロ :−ンの各種腫瘍細胞および胎児
由来繊維芽細胞に対するキラー活性を表1に示す。これ
らのクロー ;ンは培養にインターロイキン2を必
要とし、長期を 間培養維持するためKは、インターロイキン2を含有す
るRPMI 1440培地(20俤牛脂児血清含有)で
培養を行う。さらに、7〜10日に一度、 :PHA
−Pおよびこれらのクローンが由来するヒ □トの
自己末梢血、リンパ球をマイトマイシン処理した後培養
に添加する。このような条件下で培養を行うことによ)
%66万以上の長期培養維持が □可能であった。ま
た、このような@瘍細胞認識性 □ヒトキ?−T細胞
クローンは、上記と同じ条件でヒト末梢血リンパ球のレ
クチン刺激、クローニング、スクリーニングを行えば、
再現性良く得るこ ゛とができた。
表1 ヒトキラーT 胞クローンの各種 的細胞に・す
るキラー′キラー粘性ニー(10%以上)、+(10%
以上)(広範囲腫W、認識性ヒトキラーT細胞クローン
よりT細胞抗原リセブターの精製) 表1で示した広範囲@瘍認識性ヒトキラーT細胞クロー
ン51をインターロイキン2で培養し、1×10・個の
細胞を得た。この細胞よりT細胞抗原リセプターを次の
ようにして分離した。
るキラー′キラー粘性ニー(10%以上)、+(10%
以上)(広範囲腫W、認識性ヒトキラーT細胞クローン
よりT細胞抗原リセブターの精製) 表1で示した広範囲@瘍認識性ヒトキラーT細胞クロー
ン51をインターロイキン2で培養し、1×10・個の
細胞を得た。この細胞よりT細胞抗原リセプターを次の
ようにして分離した。
細胞をハ7クス液で5回使い、1 % Triton
X −100含有PBS (1mMフェニルメチルスル
フオニイk 7 k オ;Fイド、 1 mM EDT
A 、 10 mMNaF含有、pH7,2)2mに浮
遊させ、水中で1時間攪拌して膜次んばくを可溶化した
。可溶化物を10000 t%20分間遠心分離し、細
胞のデブリスを除去し、可溶化膜たんばくの分画を得た
、この膜たんばく可溶化分画を、抗T細胞抗原リセプタ
ーモノクローナル抗体結合セファロース4BSdを充填
し九カラムにのせ、T細胞抗原リセブターを吸収させた
後、PBS200sdを流し、不純物を溶出させた。次
に、0.1Mグリシン−塩酸(pH3,0)10−を添
加し、吸着し7’cT細胞抗原リセプターを溶出させた
。溶出液を中和した後、濃縮し、濃縮液0.5vItを
得た。この濃縮液t−8DSポリアクリルアミド電気泳
動Kかけたところ、非還元条件下で分子量約9万のバン
ドが検出され、還元条件下では分子量5万および4万5
千の二つのバンドが検出された。
X −100含有PBS (1mMフェニルメチルスル
フオニイk 7 k オ;Fイド、 1 mM EDT
A 、 10 mMNaF含有、pH7,2)2mに浮
遊させ、水中で1時間攪拌して膜次んばくを可溶化した
。可溶化物を10000 t%20分間遠心分離し、細
胞のデブリスを除去し、可溶化膜たんばくの分画を得た
、この膜たんばく可溶化分画を、抗T細胞抗原リセプタ
ーモノクローナル抗体結合セファロース4BSdを充填
し九カラムにのせ、T細胞抗原リセブターを吸収させた
後、PBS200sdを流し、不純物を溶出させた。次
に、0.1Mグリシン−塩酸(pH3,0)10−を添
加し、吸着し7’cT細胞抗原リセプターを溶出させた
。溶出液を中和した後、濃縮し、濃縮液0.5vItを
得た。この濃縮液t−8DSポリアクリルアミド電気泳
動Kかけたところ、非還元条件下で分子量約9万のバン
ドが検出され、還元条件下では分子量5万および4万5
千の二つのバンドが検出された。
(T細胞抗原リセプターと細胞毒性剤の結合)細胞毒性
剤としては、マメ毒のりシンA鎖を公知の方法〔ニス・
オルスン(S、 01snes )eバイオケミストリ
ー(Biochemistry )s 12 、 51
21(’73 ) )にて調製して使用した。リシンA
鎖とT細胞抗原リセプターの結合はN−サクシニミデイ
ル3−(2−ピリディルジチオ)ピロピオネイト(5P
DP)を使用する方法〔カンサー・リサーチ(Canc
er Res、42 、520?(’82)]を用イf
c−0すなわち、上記方法で得たT細胞抗原リセプター
含有液に5PDPを添加して、温度25Cで30分間保
持した後5反応を停止させた。次に、リシンA鎖を添加
して、23Cで15時間反応させて、リシン結合T細胞
抗原リセプターを得た。
剤としては、マメ毒のりシンA鎖を公知の方法〔ニス・
オルスン(S、 01snes )eバイオケミストリ
ー(Biochemistry )s 12 、 51
21(’73 ) )にて調製して使用した。リシンA
鎖とT細胞抗原リセプターの結合はN−サクシニミデイ
ル3−(2−ピリディルジチオ)ピロピオネイト(5P
DP)を使用する方法〔カンサー・リサーチ(Canc
er Res、42 、520?(’82)]を用イf
c−0すなわち、上記方法で得たT細胞抗原リセプター
含有液に5PDPを添加して、温度25Cで30分間保
持した後5反応を停止させた。次に、リシンA鎖を添加
して、23Cで15時間反応させて、リシン結合T細胞
抗原リセプターを得た。
(細胞毒性側結合T細胞抗原すセブターの殺腫瘍能の評
価) 作製したりシン結合T細胞抗原リセプター分画10μt
を、ヒト膀胱癌細胞株NBT−2およびヒト正常リンパ
球の混合細胞浮遊培地(2X 10’/−110%牛脂
児血清添加RPM1164G培地)200μtに添加し
、24時間培養後、トリバンプルーで生死を判定したと
ころ、腫瘍細胞のみ障害され、ヒト正常リンパ球は障害
されなかった。
価) 作製したりシン結合T細胞抗原リセプター分画10μt
を、ヒト膀胱癌細胞株NBT−2およびヒト正常リンパ
球の混合細胞浮遊培地(2X 10’/−110%牛脂
児血清添加RPM1164G培地)200μtに添加し
、24時間培養後、トリバンプルーで生死を判定したと
ころ、腫瘍細胞のみ障害され、ヒト正常リンパ球は障害
されなかった。
Claims (1)
- 細胞膜抗原と特異的に結合できるT細胞抗原リセプター
に、細胞毒性剤が結合していることを特徴とする細胞毒
性剤結合T細胞抗原リセプター。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60148327A JPS6210016A (ja) | 1985-07-08 | 1985-07-08 | 細胞毒性剤結合t細胞抗原リセプタ− |
EP19860105916 EP0203403B1 (en) | 1985-05-01 | 1986-04-29 | A cloned t cell capable of recognizing tumors and a t cell antigen receptor |
DE19863687014 DE3687014T2 (de) | 1985-05-01 | 1986-04-29 | Zum erkennen von tumoren faehige klonierte t-zelle und ein t-zellen-antigenrezeptor. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60148327A JPS6210016A (ja) | 1985-07-08 | 1985-07-08 | 細胞毒性剤結合t細胞抗原リセプタ− |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6210016A true JPS6210016A (ja) | 1987-01-19 |
Family
ID=15450296
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60148327A Pending JPS6210016A (ja) | 1985-05-01 | 1985-07-08 | 細胞毒性剤結合t細胞抗原リセプタ− |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6210016A (ja) |
-
1985
- 1985-07-08 JP JP60148327A patent/JPS6210016A/ja active Pending
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