JPS6212718A - 標識ｔ細胞抗原リセプタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗原と特異的に結合できる標識剤結合Ｔ細胞
抗原リセプターに関する。

（従来の技術および問題点） 従来、＠瘍抗原等の抗原の識別定量および解析は、リン
パ球の中のＢ細胞の抗原認識物質である抗体、特にモノ
クローナル抗体を用いて活発に研究されてきた。しかし
ながら、腫瘍抗原に関しては広範囲の腫瘍細胞を認識結
合し、正常細胞とは結合しない汎用性のあるモノクロー
ナル抗体は、いまだ得られていないのが現状である。最
近の免疫学の進歩により、長らく不明であつ７′ｃＴ細
胞の抗原認識がＴ細胞抗原リセブターによりなされるこ
とが明らかとなった。

（問題点を解決するための手段） 本発明の目的は、上記のごとき従来技術に基づく抗原認
識物質としてのモノクローナル抗体の問題点に鑑み、Ｂ
細胞とは刈株のリンパ球であシ、免疫の主役を荷うＴ細
胞より、抗原認識物質としての機能を有する抗原リセブ
ター物質を得て、飛躍的な有用性および汎用性を有する
抗原の定性および定量試薬を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を実現するために１臘瘍抗原に
対する抗原リセプター物質を得ることを目的として、と
トシよびマウスのリンパ球を腫瘍細胞あるいはレクチン
、もしくはリンフ才力インの１種であるインターロイキ
ン２等を用いて、１１々の方法でリンパ球の活性化を行
い、腫瘍細胞を殺す機能を持ったキラーＴ細胞を誘導し
、クロー　　　゛ニングを行って殺腫瘍性キラーＴ細胞
クローンｔ−□樹立する実験を精力的に行った。このよ
うにして得られ友りローン化キ２−Ｔ細胞の種々の腫瘍
細胞に対するキラー活性を調べたところ、驚ろくべきこ
とに％ＭＨＣ抗原（ヒトではＨＬＡ、マウスではＨ−２
）にかかわりなく、広範囲の腫瘍細胞を認識して強力に
殺し、正常細胞は殺さないキラーＴ細胞クローンが存在
することを見い出した。

このような広範囲殺腫瘍性キラーＴ細胞クローンは、リ
ンパ球の活性化およびクローニング法ｔ−一定にして行
えば、再現性良く、種々の特異性を有するクローンを樹
立することができた。

これらの殺腫瘍性キラーＴ細胞クローンは、腫瘍細胞と
正常細胞とを識別してキラー活性を発揮することから、
腫瘍抗原を認識できる抗原リセプターを有することが考
えられ友の゛で、これらの殺腫瘍性キラーＴ細胞より、
抗原リセプターを分離精製し、同定することを精力的に
行った。

その結果、広範囲殺＠膓性キ、Ｆ−Ｔ細胞クローンよシ
得た抗原リセプターは、驚ろくべきことに、広範囲の腫
瘍細胞と結合し、正常細胞とは結合しないことを見い出
し、さらに、この抗原リセプターは、炸裂した抗Ｔ細胞
抗原リセプターモノクローナル抗体と特異的に結合し、
報告されているＴ細胞抗原リセプターの性質を有してい
ることが判明した。

すなわち、広範囲殺腫瘍性キラーＴ細胞クローンより得
たＴ細胞抗原リセブターは、広範囲の腫瘍細胞と結合し
、正常細胞とは結合しないことを見い出し、新規＠筋細
胞認識物質としてすでに特許出願した〔特願昭６０−９
２２９９号（＠筋細胞を認識するクローン化Ｔ細胞およ
び該細胞よシ得ｆｃＴ細胞抗原リセプター）〕。さらに
、これらのＴ細胞抗原リセすターに標識物を結合するこ
とにより、膜結合腫瘍抗原および遊離＠膓抗原の定性、
定量を鋭敏かつ簡便に行なえることを見い出し、本発明
を完成するに至った。

すなわち、本発明は、抗原と特異的に結合でき　　　□
るＴ細胞抗原リセブターに、標識剤が結合していること
を特徴とする標識Ｔ細胞抗原すセブタ−Ｋ　　　′係る
。

本発明で言う抗原は、遊離抗原もしくは細胞膜結合抗原
であり、例えば、遊離＠瘍抗原もしくは腫瘍細胞膜表面
上の腫瘍抗原である。本発明のＴ細胞抗原リセブターは
、ＭＭＣ抗原とかかわりなく、＠瘍抗原と結合できるが
、ＭＭＣ抗原が関与した抗原ｔ−認識するＴ細胞抗原リ
セプターも本発明に含まれる。

本発明で言うＴ細胞抗原リセプターは、Ｔ細胞膜面上に
存在する抗原認識分子であり、約５０キロダルトンの分
子量を有するポリペプチドと約４５キロダルトンの分子
量を有するポリペプチドの二つのポリペプチドがジスル
フィド結合を介して互いに共有結合されているヘテロダ
イマーである。

Ｔ細胞抗原リセプターは、Ｔ細胞膜たんばくを可溶化し
て得られるが、用いるＴ細胞は、クローン化Ｔ細胞であ
ることが望ましい。このようなりローン化Ｔ細胞は、イ
ンターリューキン２を用いて、Ｔ細胞をクローニングし
て得られるが、Ｔ細胞をＴ＠瘍細胞株と融合させて、Ｔ
−ハイブリドーマを作成しても得られる。

本発明において用いるクローン化Ｔ細胞は、ヒト、マウ
ス、ラット、ラビット、モルモット等の哺乳動物由来の
リンパ球から得ることができる。

しかしながら、ヒト抗原に対するＴ細胞抗原リセブター
を得ることを考えると、ヒトリンパ球から　　　得るの
が好ましい。また、リンパ球は末梢血、肺臓、リンパ節
から得ることができるが、末梢血よシ採取するのが簡便
である。また、本発明のクローン化で細胞とは細胞表面
に免疫グロブリンを検出できないリンパ球である。よシ
好ましくは、Ｔ　　　゛細胞抗原（ヒトではＴ３．マウ
スではＴｈｙ−１）　　　　゛を有する細胞である。

本発明において用いるクローン化Ｔ細胞は、抗原を特異
的にＭ識するＴ細胞であればよく、その機能はヘルパー
Ｔ細胞であってもよく１キラーＴ細胞であってもよい−
なお、本発明でいうＴ細胞　　　゛の抗原認識とは、抗
原と反応して種々のリンパ球機能を発現することを言う
。すなわち、Ｔ細胞が　　　′抗原と反応して、これを
殺すキラー作用あるいは抗原と反応して、す／フオカイ
ン産生等のヘルパ　　　゛−作用を発現することを言う
。

本発明において用いるクローン化Ｔ細胞を得る方法には
、次の二つの方法がある。第１の方法は、インターロイ
キン２を用いる方法である。すなわち、まずリンパ球を
細胞膜抗原、レクチン、インターロイキン２等で刺激す
る。この場合、レクチンある込はインターロイキン２１
に用いると、種々の特異性の異なるクローン化ＴＭＥ胞
が得られるので好ましい。レクチンとしてはファセ第２
ス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉ
ｓ　）由来の７カインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）、コ
ンカナバリアーｘ７ツフオルミス（Ｃｏｎｃａｎａｖａ
ｌｉａ　ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ　）由来のフンカナバリ
ンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ　）　、ウイステリ７−７．ｔリバ
ンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ａｏｒｉｂａｎｄａ　）由来
のノダクヅマメレクチン（ＷＦＡ）、レンズ・キュリナ
リ、ｘ、　（Ｌｅｎｓ　ｃｕｌｉｒ、ａｒｉｓ　）由来
のレンズマメレクチン（ＬＣＨ）、フィト２ツカ・アメ
リカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ
　）由来のアメリカヤマゴボウレクチン（ＰＷＭ）２ｉ
使用する。仁れらのレクチンの中でも、ＰＨＡ％ｐＷＭ
は腫瘍認識性Ｔ細胞を得る場合には、強く活性化するの
で好ましい。

刺激活性化したリンパ球をインターロイキン２含有培地
に浮遊させ、マイクロウェルプレートの各ウェルに細胞
が１個ずつ入るように分注した後、培養を行ってクロー
ニングし、〔海江田豪児（Ｔ。

Ｋａｉｅｄａ　）ｓジャーナル・オプ・イムノロシイ（
Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　、　１２９．４６（’８２））
クローン化Ｔ細胞を得る。第２の方法は、リンパ球を細
胞膜抗原あるいはレクチン等で刺激もしくは刺激せずに
そのまま腫傷細胞株と公知の方法〔開田、吉村。

海江田（Ｍ、０ｋａｄａ、　Ｎ、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ、
　Ｔ、Ｋａｉｅｄａ　）、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミ−・サイアンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　）、　７８　、７７１７（’８ｉ
））で融合させて融合細胞株とした後、クローニング全
行い、クローン化融合Ｔ細胞を得る方法である。このよ
うな方法で得られ次多くのクローン化Ｔ細胞の中から、
抗原を認識するものをスクリーニンクスル。スクリーニ
ングは、クローン化Ｔ細胞と抗原を混合培養し、抗原を
認識して殺すか（キラー活性）、あるいは抗原を認識し
てなんらかのリンフ才力イン（インターロイキン２、イ
ンターフェロン等）を産生ずる（ヘルパー活性）かで、
抗原に対する認識性を評価することにより行う。

本発明において、クローン化Ｔ細胞が認識する抗原が腫
瘍細胞膜抗原である場合には、認識腫瘍細胞は少なくと
も固聾癌（充実性＠瘍）であシ、ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ
−１、ＫＡＴＯ−１［、ヒト肺癌細胞株ＰＣ−１，ＰＣ
−９，ＰＣ−１０、ＰＣ−１３％ＰＣ−１４、ヒト結腸
癌細胞株Ｃ−１、Ｍ７６０９、ヒト直腸癌細胞株ＣａＲ
−１，Ｓ−７５１２、ヒト胆管癌細胞法Ｈ−１％ヒト肝
癌細胞株ＨＬＥ、ＨＬＦ、ヒト膀胱癌細胞株ＮＢＴ−２
、ＫＵ−１，ヒト咽喉障細胞株ＫＢ、ヒト胃癌細胞株Ｗ
−２、ＮＲＣ−１２％ヒト乳癌細胞株ＨＢＣ−４、ＭＢ
Ｃ−６、ヒト子宮癌細胞株ＨｅＬａ。

ヒト黒色腫細胞株ＨＭＶ−１，ＨＭＶ−２のうち少なく
とも２種以上であシ、認識しない正常細胞は、健常人リ
ンパ球、健常人赤血球、ヒト胎児由来繊維芽細胞株ＨＥ
Ｔ％ＨＥＬ％ＭＲＨＦのうち　　　□少なくとも１種以
上である。なお、クローン化Ｔ　　　：細胞が腫瘍細胞
を認識するかどうかは、認識性をや、−□−，，ＦＦヶ
ヶ、。１１，０．。□□い、　　（■ Ｅ／Ｔ比（クローン化Ｔ細胞と腫瘍細胞の混合比）ｊｌ
ｏで４時間、３７Ｃ培養を行い、１０チ以上の　　　１
、、、、−活性オオすも。を認識す、とする。　　　　
　　１１本発明で述べたリンパ球の刺激、クローニング
、ニスクリーニング法により、株々の特異性を有する　
　２腫瘍認識性クローン化Ｔ細胞を得ることができる。

Ｊ。

すなわち、少なくともヒト胃癌細胞株ＭＫＮ−１゜ＫＡ
ＴＯ−１［を殺し、健常人リンパ球、胎児由来Ｍ、ｊ維
芽細胞ＨＥＬは殺さなり胃癌に特異的と考えら　　：れ
るクローン化ヒトキ２−Ｔ細胞が得られ友。また、少な
くともヒト肺癌細胞株ＰＣ−１、ｐｃ−“９、ＰＣ−１
０，ＰＣ−１３、ＰＣ−１４を殺し、　　　□健常人リ
ンパ球、胎児由来繊維芽細胞Ｊ（ＥＴＦｉ殺　　−さず
、肺癌特異的と考えられるクローン化ヒトキ７−Ｔ細胞
が得られた。さらに、少なくともヒト肺癌細胞株ＰＣ−
１０、ＰＣ−１４、ヒト胃癌側　　　′胞株ＭＫＮ−１
、ＫＡＴＯ−Ｉｆ、ヒト膀胱癌細胞株ＮＥＴ−２を殺し
、健常人リンパ球は殺さない汎腫瘍特異的と考えられる
クローン化ヒトキラーＴ細胞が得られた。

Ｔ細胞抗原リセプターは、次の方法により、これらのク
ローン化Ｔ細胞より効率良く分離することができる。す
なわち、クローン化Ｔ細胞を１チＴｒｉｔｏｎ　ｘ　−
１ｏ　ｏを含むＰ　Ｂ　Ｓ　（０，８５Ｔｏ　ＮａＣＬ
含有リン酸緩衝液、ｐＨ７，２）中に浮遊させ、水中に
て１時間攪拌することにより、膜たんばくを溶出させ、
これをＴ細胞抗原リセプターに対するモノクローナル抗
体を結合した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂでアフイニテ
イ稽袈を行う。精製したＴ細胞抗原リセプターｔ−８Ｄ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動Ｋかけると、非還元
条件では分子量約９万の位置に１本のバンドが検出され
、還元条件では分子量約５万および分子量約４万５千に
２本のバンドが検出される。さらに１クローン化Ｔ細胞
をチュニカマイシン処理して糖部分のないＴ細胞抗原リ
セプターを得ると、それぞれ分子量約３万の二つの蛋白
質成分がジスルフィド結合を介して互いに共有結合して
いる分子量約６万のへテロダイマーが得られる。すなわ
ち、本発明のＴ細胞抗原リセプターは、糖の結合したも
のおよび糖の結合していないものの両者を含むものであ
る。

標識Ｔ細胞抗原リセプターを得る方法は種々ある。たと
えば、螢光色素としてＦＩＴＣ（フルオレセインインチ
オシアネート）、ローダミン等ｉＴ細胞抗原リセプター
に結合させる方法、あるいはパーオキシダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素をＴ
細胞抗原リセブターに結合させる方法、もしくは放射性
物質、たとえば、１１ｓＩ、凰１１１．　ａ２Ｓ、　１
４０．　ＳＨ等を用イテＴ細胞抗原リセプターを放射能
で標識する方法等が例示できる。

これらの標識剤をＴ細胞抗原リセプターに結合させる方
法としては、標識抗体を作製する公知の方法が使用でき
るが、たとえば、ＦＩＴＣをアルカリ条件下でＴ細胞抗
原リセプターに結合する方法、酵素にマレイミド基を導
入し、５ＰＤＰ　ｌ：Ｎ−ｓｕｃＮ−５ｕｃｃｉｎｉ　
　３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉ
ｏｎａｔを介してＴ細胞抗原リセプターと結合させる方
法、もしくはＴ細胞抗原リセプターのＳＨ基と結合させ
る方法、あるいは２クトベルオキシダーゼ法により　ｔ
ｔｓ　１でＴ細胞抗原リセプターを標識する方法等が例
示できる。

（発明の効果） 以上述べた方法を用いて、＠易認識性りローン化Ｔ細胞
より得たＴ細胞抗原リセプターに標識剤を結合させた複
合体を腫瘍細胞に添加することにより、腫瘍細胞膜面上
の腫瘍抗原を同定することができた。さらに、標識剤結
合Ｔ細胞抗原リセプターを用いてラジオイミノアッセイ
を行なった結果、遊ｉｌＩ腫瘍抗原を鋭敏かつ簡便に定
量することができ、このような標識剤結合Ｔ細胞抗原リ
セプターは、簡便できわめて鋭匣な特異性の高い新規な
抗原の定性足置法に使用できることを見い出した。

本発明の標識剤結合Ｔａ胞抗原リすブターは、巳〕　き
わめて鋭便かつ簡便で特異性の高いイムノアッセイ用の
試薬として、腫瘍抗原等の抗原の定性定量の用途に用す
ることができる。なか、本発明で対象とする抗原は、腫
瘍抗原ばかりでなく、ビールス抗原、細菌抗原、組織適
合抗原等の抗原の定性定量にも有効に適用できる。

（実施例） 以下、実施例により本発明の実施の態様を詳細に説明す
る。

実施例１ （殺腫鼾性ヒトクローン化キラーＴ細胞のスクリーニン
グ〕 ヒ）Ｔ細胞のクローニングおよび腫躬認識性りローン化
キラーＴ細胞のスクリーニングは、以下のよう比して行
った。

ヒトリンパ球は次のようＫして得た。すなわち、採血し
たヘパリン加ヒト末梢血をハンクス液（二ッスイ）で２
倍希釈し、フィコールパーク液（ファルマシア社製）に
重層し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行つ九。

中間層のリンパ球層を採取して、これをハンクス液で洗
った後、牛胎児血清を１０チ添加し７ｔＲＰＭＩ　１６
４０培地にツスイ）Ｋ２Ｘ１０’個／Ｎｔ細胞濃度で浮
遊させた。これにＰＨＡ−Ｐ（ディフコ製）を０．１チ
の濃度で添加し、培養びんに移して、３７Ｃ，５％ＣＯ
，中で４８時間培養を行った。リンパ球はレクチン（Ｐ
ＨＡ−Ｐ　）によって活性化され、ｍ々のヒト＠場細胞
株を認識する種々のキラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞が誘
導された。このポリクローナルな活性化リンパ球をモノ
クローナルにするために、公知の方法（海江田赦児；免
役実験操作法ＸＩ。

Ｐ、３６８９、日本免疫学会機）にてクローニングを行
った。すなわち、活性化リンパ球を市販のインターロイ
キン２（ペーリンガー・マンハイム社４＆り含有ＲＰＭ
Ｉ　１６４０培地（２０％牛脂児血清含有）に５ｃｅｌ
ｌｓ／−の細胞濃度で浮遊させ、この細胞浮遊培地にマ
イトマイシンＣ（ｍ和醗酵製）処理（１００μｒ／Ｎｔ
、３７０％　４５分）した自己リンパ球ｆ　Ｉ　Ｘ　１
０’　ｊ（５／−の細胞濃度で加えた後、２００μｔず
つ９６穴２００μを容マイクロウェルプレート（ファル
コン＆５０７２　）に分注し、５７Ｃ，５％ＣＯ，中で
培養を行った。約２週間でクロー化Ｔ細胞が増殖した。

このクローン化Ｔ細胞が＠瘍細胞認識性を持つかどうか
は、次のようＩ／ｃ腫瘍細胞に対してキラー活性を有す
るかどうかで評価した。すなわち、各種腫瘍細胞を５Ｉ
Ｃｒで公知の方法（７−／Ｌ’　・ｘム−）−ｙら（Ｒ
，Ｍ、Ｔｈｏｒｎ　ｅｔａｔ）、ジャーナル・オプ・イ
ムノロジカル・メソウド（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　）、　４　、３０１　（’７４））で標識し
、Ｉ　Ｘ　１０４個の標識腫瘍細胞とｌＸ１０１個のク
ローン化Ｔ　、ｌｉＢ胞を２００μＬのＲＰＭＩ培地（
５％牛脂児血清含有）中で４時間混合培養（３７Ｃ１５
チＣ０１）しｔ後、上清に遊離されるＳ　Ｉ　Ｃｒの放
射活性をカウントしてキラー活性を有するかどうかを評
価した。

キラー活性は次式圧より算定した。

キラー活性＝　［：　（Ｂ−Ｃ）／（Ａ−Ｃ）　］　ｘ
　１ｏ　。

Ａ：襟識腫膓細胞ｌＸ１０’個の放射活性Ｂ：標識腫瘍
細胞ＩＸＩＧ’個とクローン化・Ｔ細胞Ｉ　Ｘ　１０’
個を混合培養した場合の上清中の放射活性 Ｃ：標識＠瘍細胞Ｉ　Ｘ　１０４個だけを培養した場合
の上清中の放射活性 １万個の活性化リンパ球を上記条件下でクローニングし
た結果、クローン化Ｔ細胞が約５００個得られた。この
内、各種ヒト腫瘍細胞株の少なくとも１ｓに対してキラ
ー活性を有するヒトクローン化キ？−Ｔ細胞が約１００
ｍ存在した。このようにしてクローニング実験全く力か
えして得たヒトクローン化キラーＴ細胞の中で、典型的
なりローンの各種腫瘍細胞および胎児由来繊維芽細胞に
対するキラー活性を表１に示す。これらのクローンは、
培養にインターロイキン２を必要とし、長期間培養維持
するためＫは、インターロイキン２を含有するＲＰＭ１
１６４Ｇ培地（２０−牛胎児血清含有）で培養を行う。

さらに７〜１０日に一度。

ＰＨＡ−Ｐおよびこれらのクローンが由来するヒトの自
己末梢血、リンパ球をマイトマイシン処理した後培養に
添加する。このような条件下で培養を行うことにより、
６チ月以上の長期培養維持が　　　□可能であった。ま
た、このような腫瘍細胞認識性−ヒトキラーＴ細胞クロ
ーンは、上記と同じ条件でヒト末梢血リンパ球のレクチ
ン刺激、クロー二ンク、スクリーニングを行えば、再現
性良く得ると　　　′□とができた。

表１１ｈキ之二工栂胞り見二之の各種襟的狽胞に対する
キラー活性（広範囲＠瘍認識性ヒトキラーＴ細胞クロー
ンよりＴ細胞抗原リセプターの精製） 表１で示した広範囲腫Ｆａｇ識性ヒトキラーＴ細胞クロ
ーン５１をインターロイキン２で培養し、Ｉ　Ｘ　Ｉ　
Ｇ＠個の細胞を得た。この細胞よりＴ細胞抗原リセプタ
ーを、次のようにして分離した。

細胞をハンクス液で５回使い、１９＆　Ｔｒｉｔｏｎ　
Ｘ−１００含有ＰＢＳ（１ｍＭフェニルメチルスルフ；
ｔニイに７にオフイド、　１ｍＭ　ＫＤＴＡ　、　１０
ｍＭ　ＮａＦ含有、　ｐＨ７，２）　２ｍ１ＩＣ浮遊さ
せ、水中で１時間攪拌して膜たんばくを可溶化した。可
溶化物ｔ−１００００ｒ、２０分間遠心分離し、細胞の
デブリスを除去し、可溶化膜たんばくの分画を得た。こ
の膜几んばく可溶化分画を、抗Ｔ細胞抗原リセプターモ
ノクローナル抗体結合セファロース４ＢＡｔｌｔを充填
したカラムにのせ％Ｔ細細胞抗原リップター吸収させた
後、ＰＢＳ２ＱＱｄｉ流し、不純物を溶出させた。次に
、０．１Ｍグリシ／−塩酸（ｐＨ５，０）１０−を添加
し、吸着したＴ細胞抗原リセプターを溶出させた。溶出
液を中和した後％濃縮し、濃縮液０．５−を得た。この
濃縮液を８Ｄ８ポリアクリルアミド電気泳動Ｋかけたと
ころ、非還元条件下で分子量約９万のバンドが検出され
、還元条件下では分子量５万および４万５千の二つのバ
ンドが検出され穴。

（Ｔ細胞抗原リセプターのＦＩＴＣ標識）上記方法で得
たＴ細胞抗原リセプタ−１μｆをリン酸バッファー（１
０ｍＭ　、　０．８５　％ＮａＣ１。

ｐ　Ｈ７，２）で透析し、最終的に１ｄの容量とした。

小さなビーカーＫＴ細胞抗原リセプター溶液ＩＭｔ。

０．５Ｍ炭酸、重炭酸バッファー（ｐ　Ｈ９，５）　０
，１−１４μｆ／ｍｔＦＩＴｃ溶液１０μｔを入れ、室
温で６時間反応を行なった。反応後、リン酸バッファー
に対して透析を行なった後、−２００で保存する（１−
）。

（ＦＩＴＣ標識結合Ｔ細胞抗原リセプす−による腫瘍細
胞上の腫瘍抗原の同定） このようにして得たクローン５１由来のＦＩＴＣＩＩ繊
Ｔ細胞抗原リセブターす液０．１１１１ｔヲクローン５
１がｇ識する各種腫瘍細胞株（ＭＫＮ−１゜ＫＡＴＯ−
Ｌｌｉ、ＰＣ−１０、ＮＥＴ−２）を浮遊させた培地（
ＩＸｌｏ・／ｍ／、５’ｊ牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　１
６４０培地）０，２ｍｇ１Ｃ混合し、ＯＣで１時間保持
した後、ハンクス液で洗浄し、螢光顕微鏡で観察し友と
ころ、これらの腫瘍細胞株は、リング状に螢光を発する
のが観察された。

実施例２ 実施例１と同様に％クローン５１よ）Ｔ細胞抗原リセブ
ターの調製を行なった。Ｔ細胞抗原リセプターへの”Ｉ
標識は、２クトベルオキシダーゼ法により行なった。す
なわち、１０μｍ／−Ｔ細胞抗原リセプター溶す（０，
０５Ｍリン酸バッファー。

ｐ　Ｈ７，５）　１００　μｔＫ　Ｏ，１ｍｃｉの”’
Ｉ　（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社表）全
添加し、さらに０．２ｍ９／−２クトベルオキシダーゼ
溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社袈、リン酸バッファーに
溶解〕１０μ／、、　　０．２〜／−グルコースオキシ
ダーゼ溶ｆｆ！ｉ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製。

リン酸バッファーに溶解）１０μｔを添加する。最後に
、１Ｍブドウ糖を２βを添加して反応全開如し、室温で
３０分間反応させた。次に、０．１Ｍ窒化すトリウム１
に１５μを添加シテ反ｒ５ｆｔ止メ、０．０１チ窒化ナ
トリウムを含む０．０５　Ｍリン酸バッファーに対し透
析し、さらに、０．０５Ｍリン酸バッファーに対して透
析した。透析後、−２００で保存する（　０．２　ｄ　
、比活性１０万Ｃｐｍ　／　ｐｆ　）。

このようにして作製したクローン５１由来の１２５Ｉ標
識Ｔ細胞抗原リセプター溶液１０μｔ（５４ｃｐｍ　）
をクローン５１が認識する各種腫傷細胞株（ＭＫＮ−１
、ＫＡＴＯ−［［、ＰＣ−１０，ＮＢＴ−２）を浮遊さ
せた培地（ＩＸｌ　０”／＋ｄ、５チ牛脂児血清含有Ｒ
ＰＭＩ　１６４０培地）０，２Ｎｔに混合し。

ＯＣで１時間保持した後、ハンクス液で洗浄後、放射活
性の測定を行なつ友。その結果、ＭＫＮ−１は３８００
　ｃｐｍ％ＫＡＴＯ−ＩＩ［は５６００　ｃｐｍ。

ＰＣ−１０は２９００　ｃｐｍ、　ＮＢＴ−２は３９０
０ｃｐｍとなり、それぞれの腫瘍細胞膜面上の腫瘍抗原
が定量できた。

実施例３ Ｔ細胞抗原リセプターによる遊Ｍｌｌｌ＆瘍抗原の定量
全以下のようにして行なった。

（ＮＢＴ−２腫瘍より膜たんばくの分離）クローン５１
が認識する腫瘍であるＮＥＴ−２をＩ　Ｘ　１　Ｇ１０
個培養し、これから実施例１と同様にして膜たんばくの
可溶化を行ない、　　１０　ｍＭ　ＩＪン酸バフ７７−
（ｐＨ７，２、０，８５’４ＮａＣ１）Ｋ対して透析し
て、１０−の可溶化膜たんば〈分画を得た。

（ＮＢＴ−２＠賜膜たんばくに対する抗血清の作製） ＮＢＴ−２腫瘍膜たんば〈１ｗｔとフロイントコンプリ
ートアジュバント１ＭＩｔヲ混合し、エマルジョンを作
製し、これをＢＡＬＢ／Ｃマウスに１週間毎に３回免疫
した。最終免疫の３日後に、マウス心臓より採血を行な
り１凝固させ、抗血清２ｗｔを得た。

（抗血清のアフィニティー絹製） ＮＢＴ−２＠瘍膜几んば（２１１１ｔｔ−ＣＮＢｒ−活
性化セファロース（ファルマシア社製）　ｓ　ｇ１ｔＩ
ｔＣ結合させ、アフィニティーカラムを作製した。結合
は　　　□ＣＮＢ　ｒ−活性化セファロースに添付の方
法により行なつ友。アフィニティーカラムをリン酸バッ
ファーでよく洗浄した後、抗血清１−をのせ、リン酸バ
ッファー５００ｄを流し、非吸着たんばくを洗い出した
。その後、０，１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ３，０）　２
０ｓｔｊｔ−流し、吸着抗体を溶出させ、１Ｍトリスで
ｐＨｔ−７にもどした後、濃縮およびリン酸バッファー
に対する透析を行ない、アフィニティー精製抗体ｌｌｌ
９（１ｄ）ｔ−得た。

（ラジオイムノアッセイプレートの作製）ラジオイムノ
アッセイ用プレート（Ｆａｌｃｏｎ３９１１）にリン酸
バッファーで１００倍希釈した抗体液（１０μｆ／ｓｇ
）ｔ−１００μｔずつ加え。

４８時間、４Ｃで保持して、ＮＢＴ−２膜たんばくに対
する抗体をプレート底面に付着させた。アッセイプレー
トは５％ＢＳＡ含有リン酸バッファー（ブロッキング剤
）でよく洗浄した後、−２０Ｃで保存した。

（ＩＩＩＳ工標識Ｔ細胞抗原リセプす−たよる腫瘍抗原
のラジオイムノアッセイ） ＮＢＴ−２腫瘍膜たんばく分画をブロッキング剤で希釈
した系列を作製し、これらをそれぞれ１００μｔずつ、
抗ＮＢＴ−２腫瘍膜たんばく抗体を付着させたアッセイ
プレートの各穴に添加し、３７Ｃで２時間保持した後、
ブロッキング剤でよく洗浄した。その後、実施例２で作
興し友クローン５１の１２！ｉ標識Ｔ細胞抗原リセプタ
ー溶液をそ　　　□れぞれに１０μｍ　（５４ｃｐｍ　
）ずつ添加し、さらに、ブロッキング剤を９０μｔずつ
加えて、３７Ｃで２時間保持した。その後、ブロッキン
グ剤でよく洗浄し、各穴を切シはなし放射活性を測定し
た。結　　　果を表２に示した。

表２　　Ｔ細胞抗原リセプターによるラジオイムノアッ
セイ蓼

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 抗原と特異的に結合できるＴ細胞抗原リセプターに、標
   識剤が結合していることを特徴とする標識Ｔ細胞抗原リ
   セプター。