JP3158119B2 - ヒトｔリンパ球のｌｆａ‐１抗原の新規なエピトープに特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

ヒトｔリンパ球のｌｆａ‐１抗原の新規なエピトープに特異的なモノクローナル抗体

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Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明はモノクローナル抗体、特にヒトT8リンパ球集
団中のキラーエフェクター細胞とサプレッサーエフェク
ター細胞とを区別することができるリンパ球作用関連抗
原（LFA−１）における新規なエピトープに特異的なモ
ノクローナル抗体に関するものである。
（背景技術） ハイブリドーマ技術の発達はヒトの免疫応答系の作用
の仕方を一層良く理解するのに貢献している。人体に導
入された抗原は免疫応答系を刺激し、これによりリンパ
球細胞は抗原における抗原決定基に結合することができ
る抗体分子を合成する。抗体のカクテルが抗血清中に生
成する。抗血清は複雑であり、組成が変わりやすく、受
溶菌に投与した際に異なる作用を行うことができる。ハ
イブリドーマ技術は予め決定された特異性を有するモノ
クローナル抗体を再生することができる雑種細胞系を製
造することを可能にした（コーラー（kohler）およびミ
ルスティン（Milstein）、「ネーチャー」256,495〜597
（1975））。この技術によって製造されたモノクローナ
ル抗体はヒトにおける免疫応答の調節におけるＴリンパ
球およびＢリンパ球の作用を研究するのに使用されてい
る。この研究において、ヒトＴリンパ球の副集団（subp
opulation）の作用が一層良く認識された。
ヒトＴリンパ球は特異的抗原を認識することができ、
インデューサー作用およびサプレッサー作用を行い、実
際上すべての細胞および体液の免疫応答のタイプおよび
強さを調節する。独特な調節作用およびエフェクター作
用を有する２種のヒトの主Ｔ細胞サブセットが、これら
のサブセットによって発現される個々の細胞表面の糖類
タンパク質に基づいてT4サブセットおよびT8サブセット
として同定されている。T4サブセットはインデューサー
／ヘルパー作用を行い、T8サブセットは抑制モード作用
をすることが明らかにされている。また、Ｔ細胞の作用
の異なるT4集団とT8集団とに分けることができるモノク
ローナル抗体も得られている。また、T4集団およびT8集
団はそれぞれクラスの異なる抗原を優先的に認識する。
森本等「ジャーナル・オブ・イムノロジィ（J.Immuno
l.）」134:1508〜1515（1985）。
モノクローナル抗体を使用して行った研究の結果、T4
細胞は主要な組織適合性複合体（MHC）のクラスII抗原
を認識し、T8細胞はクラスIMHC抗原を認識することが明
らかになった。ミュアー（Meuer）等「プロシーティン
グス・オブ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエン
シス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイト・オブ・アメ
リカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）」79:4395〜4399（198
2）。T4細胞およびT8細胞のサブセット内にかなり大き
い作用上ならびに表現型上の不均一性が存在することが
分かっている。T8＋（CD8＋）集団はプリシトトキシッ
ク（precytotoxic）、プリサプレッサーおよびサプレッ
サーエフェクターＴ細胞を含んでいるが、このような差
異は作用についてのアッセイ（functional assay）を使
用して行った多数の測定に基づくものである。クレメン
ト（Clement）等「ジャーナル・オブ・イムノロジィ」1
33:2461〜2468（1984）はモノクローナル抗体を使用し
て免疫系のキラー細胞のCD8＋の前駆体を明らかにしよ
うとする試みに関するものである。積極的で有用に正確
であるフェノタイピング（phenotyping）手段、すなわ
ちモノクローナル抗体を使用してCD8クラス細胞におい
て細胞障害性エフェクター細胞とサプレッサーエフェク
ター細胞とを区別する従来の試みは成功していないか、
あるいは区別を容易に行うことは不可能であった。竹内
等「セルラー・イムノロジィ（Cellular Immunol.）」
（印刷中）には、CD8＋CD11（T8＋Mo1−）サブセットは
サプレッサーエフェクター細胞および細胞障害性エフェ
クター細胞の両方を含んでいるが、T8＋Mo1＋サブセッ
トはNK細胞を含んでいることが示されている。従って、
T8＋Mo1−サブセットに認められる抑制は、抑制のイン
ジューサーすなわちT4＋2H4＋を必要とするという従来
のサプレッサー系の特性を有する。抑制作用を行うT8＋
Mo1＋（CD11）サブセット細胞はサプレッサーインデュ
ーサー細胞を必要とせず、NK細胞として作用する。従っ
て、竹内等は、T8＋CD11−サブセットをサプレッサー細
胞およびエフェクター細胞の両方を含んでいることを示
している。この研究から、CD8＋CD11−サブセットがサ
プレッサーエフェクター細胞および細胞障害性エフェク
ター細胞に正確に分けるために使用できるモノクローナ
ル抗体が存在しないことが明らかである。
細胞溶解性のＴリンパ球性キリング（T lymphocyte m
ediated killing）の研究において、リンパ球作用関連
抗原（LFA−１）が重要であることが見出された。サン
チェズ−マドリッド（Sanchez−Madrid）等「ジャーナ
ル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Me
d.）158:1758〜1803（1983）。ヒトLFA−１は非共有結
合しているαおよびβポリペプチド鎖を有する高分子量
表面抗原である。αユニットは分子量177,000ドルトン
であり、βユニットは分子量95,000ドルトンであること
が測定されている。
LFA−１はエフェクター細胞と標的細胞との間の接着
を強化する作用を行う分子である。LFA−１はヒト細胞
溶解性のＴリンパ球（CTL）性（mediated）キリングに
おいて抗原レセプターと一緒になって作用することが見
出されている。LFA−１分子はＢリンパ球およびＴリン
パ球の両方に存在し、定量的発現の異なる副集団を特徴
づける。ヒトＴリンパ球性（mediated）細胞溶解と関連
する３種の異なる抗原を認識して、抗原認識および標的
細胞に対する細胞溶解性Ｔリンパ球（CTL）の接着を包
含するプロセスを理解する際の複雑さを示唆し、標的と
なった細胞を溶解させるために、モノクローナル抗体が
開発された。これらの抗原はLFA−1,LFA−２およびLFA
−３として同定されている。サンチェズ・マドリッド等
「プローシーティングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ィ・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ス
ティト・オブ・アメリカ」79:7489 37493（1982）。ま
た、細胞性（cell mediated）リンパ球溶解におけるヒ
トLFA−１の関与に関する議論について述べているヒル
ドレス（Hildreth）等「ユーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・イムノロジィ（Eur.J.Immunol.）」13:202〜208（1
982）を参照されたい。CD8＋細胞内の作用集団間におい
て一層正確な区別が望ましいのは明らかである。
ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の産生の一
般的体系はこの実行段階においてよく知られているが、
培養においてハイブリドーマ細胞を分離および維持する
際に多大の注意を払う必要がある。分離されたクローン
はクローンによって異なる問題の抗原（subject antige
n）に対する抗体を産生すること、およびこれは異なる
細胞によって産生される抗体が同一分子における異なる
抗原決定基と反応することができるからであることが知
られている。生成した抗体あるいは抗体を含有する媒
質、血清または腹水（ascitic fluid）について適当な
試験を行うことが不可欠である。診断用および治療用の
両方に利用することができるモノクローナル抗体を産生
する際の複雑さの原因になる各クローンの抗体を特徴づ
けることが必要である。
所要のモノクローナル抗体を開発するに当たっては、
特異的抗体を顕在化する抗原決定基を同定し、位置決め
して特異的抗体と結合させる必要がある。あるいは、こ
れとは反対に、融合を行って数百のハイブリドーマクロ
ーンを作り出し、かつ所望の結合特異性を有する抗体を
産生するクローンを同定および決定する際に正常組織、
非正常組織および異なる抗原に対してハイブリドーマク
ローンを徹底的に選別する必要がある。
本発明の目的はヒトT8（CD8）細胞の表面において発
現されている特定の抗原決定基に結合し、このＴ細胞集
団内においてこのような作用集団を決定することができ
るモノクローナル抗体を産生することにある。CD8クラ
スの細胞を一層精密にフェノタイピング（phenotypin
g）することにより前記細胞クラス内において細胞障害
性エフェクター細胞とサプレッサーエフェクター細胞と
を区別することができる抗体が提供される。
（発明の開示） 本発明においては、CD8リンパ球集団においてキラー
エフェクター細胞とサプレッサーエフェクター細胞とを
区別することができるモノクローナル抗体が開発され
た。このモノクローナル抗体が特異的である表面抗原す
なわち抗原決定基は180,000ドルトンおよび95,000ドル
トンの糖タンパク質からなる。この抗原を「S6F1」と称
する。このモノクローナル抗体がLFA−１抗原における
新規なエピトープを認識することが明らかにされた。
S6F1抗原はリンパ球のT8＋副集団において優先的に発
現されるが、未分画のＴ細胞およびT4＋リンパ球の研究
の際にモノクローナル抗体によって極めて小さい程度認
識された。S6F1抗原に対するこのような特異性は、モノ
クローナル抗体を使用してヒト末梢血リンパ球（periph
eral blood lymphocyte）試料におけるT8＋集団をさら
に細分し、これらの細胞の作用上の不均一性を評価する
ことを可能にする。従来知られていない細胞毒性プロセ
スにおいて、このモノクローナル抗体を使用してLFA−
１抗原およびその作用を決めることができる。
（図面の簡単な説明） 第1A図および第1B図は本発明のモノクローナル抗体の
一例および既知のモノクローナル抗体2F12と、あるＴリ
ンパ球との反応性を示す螢光グラフである。
第2A図および第2B図は細胞障害性エフェクター細胞が
分類されるリンパ球副集団を同定するために作られたグ
ラフである。CD8標準対照細胞は白丸印の間に引いた線
で示し、CD8＋S6F1−サブセット細胞は黒四角印の間に
引いた線で示し、CD8＋S6F1−サブセット細胞は黒四角
印の間に引いた線で示し、CD8＋S6F1＋サブセット細胞
は黒丸印の間に引いた線で示す。
第3A図および第3B図はサプレーサーエフェクター活性
とS6F1抗原を有するT8細胞集団との関係を示すために作
られたグラフである。
第4A図および第4B図はS6F1抗原およびLFA−１抗原の
免疫沈降分析データを示すために作られたグラフであ
る。
（発明を実施する最良の方法） モノクローナル抗体の生成 ヘルペスウイルス・サイミリ（Herpesvirus saimir
i）を感染させた唇の白いタマリンから、標準ハイブリ
ドーマ法を使用して得た不死化脾臓細胞（immortalized
splenocyte）集団である細胞系1670を使用してバルブ
（Balb）/Cマウスに免疫を付与した。マウスの脾臓を採
取し、ポリエチレングリコール中でP3/NS1/1−AG4−１
骨髄腫細胞と融合させた。前記細胞集団をHAT培地で培
養してハイブリドーマ細胞を得、この細胞をクローン化
し、モノクローナル抗体産生のためにアッセイを行い、
モノクローナル抗体を産生させ、スクリーニングおよび
特異性の選定を行った。
健康な提供者から得た血液試料から、フィコールハイ
パック（Ficoll−Hypaque）密度勾配遠心分離法によっ
て末梢血液リンパ球を分離した。このリンパ球をミュア
ー（Meuer）等の前記刊行物に記載されているヒツジの
赤血球によるＥロゼット形成によりＴ細胞集団と非Ｔ細
胞集団とに分離した。最初に、モノクローナル抗体をＴ
細胞との反応性に関して選別して特異的細胞結合パター
ンを識別した。T4リンパ球細胞およびT8リンパ球細胞は
それぞれ、T4モノクローナル抗体およびT8モノクローナ
ル抗体による補体性（complement−mediated）溶解を行
い、次いでモノクローナル抗体との反応性を米国フロリ
ダ州ヒアリア（Hialeah）所在のクールタ（Coulter）社
によって市販されている機器エピクス （EPICS,商品
名）を使用して細胞選別法により分析することより得
た。本発明のモノクローナル抗体の一例は、未分画のＴ
細胞、T4細胞およびT8細胞との反応性について解析した
後に確かめられ、T8細胞と優先的に反応しかつここに
「抗S6F1」として同定されている抗原に特異的に結合す
るとして特徴づけられた。モノクローナル抗体すなわち
S6F1抗体はT8リンパ球集団においてキラーエフェクター
細胞とサプレッサーエフェクター細胞とを区別すること
ができる。モノクローナル抗体は分子量180,000ドルト
ンおよび95,000ドルトンの糖タンパク質からなる細胞表
面構造を決定する。次の免疫沈降研究および二次元ゲル
分析は、十分に説明するように、S6F1モノクローナル抗
体がLFA−１抗原における新規なエピトープを認識する
ことを示す。
第1A図および第1B図には、S6F1モノクローナル抗体
と、あるＴリンパ球との反応性を確認するためのデータ
を示す。第1A図は10人の提供者からの正常なヒトの血液
から得た未分画Ｔリンパ球、CD4＋リンパ球およびCD8＋
リンパ球の細胞フルオログラフィー分析結果を示す。各
Ｔリンパ球集団の１×106個の細胞を1:1000の比におけ
るS6F1モノクローナル抗体との反応性について、米国フ
ロリダ州ヒアリア所在のクールタ社から市販されている
エピクス Ｃ流動細胞計における間接免疫螢光法によっ
て分析した。使用した細胞の調整および染色法は従来の
もので、細胞選別技術においてよく知られている。各ヒ
ストグラムは横軸すなわちＸ軸における螢光強度に対し
て縦軸における細胞数を示す。
上述のＴリンパ球におけるS6F1抗原の発現に関する螢
光プロフィルスを示すこの代表的な研究において、S6F1
抗体は未分画Ｔ細胞の17％、CD＋４リンパ球の14％、お
よびCD8＋細胞の58％と反応性を示した。従って、S6F1
抗原はリンパ球のCD8＋集団において優先的に発現され
た。この研究において、S6F1抗体はヌル細胞、顆粒球お
よびＴ細胞系HSBの70％より多くと反応した。しかし、S
6F1抗体は実施した他の試験から得たマクロファージ、
Ｂ細胞、Ｂ細胞系、すなわち、Raji,Ramos,Nalms−1,EB
ウイルス形質転換細胞系，造血系Ｕ−937,K−562または
Ｔ細胞系Molt4,CEMおよびJMの集団中の細胞の10％のみ
と反応した。
第1B図は正常な提供者からのCD4リンパ球およびCD8リ
ンパ球と、LFA−１抗原を認識する種々の希釈度の既知
モノクローナル抗体2F12との反応性を研究した結果を示
す。分析はエピクス Ｃ細胞選別器を使用して間接免疫
螢光法によって行った。各ヒストグラムは螢光強度に対
する細胞数を示す。1:100の希釈度において抗−LFA−１
抗体を使用したヒストグラムａおよびｄでは、細胞の反
応性は98％であった。1:1000の希釈度において前記モノ
クローナル抗体を使用したヒストグラムｂおよびｅで
は、細胞の反応性は98％であった。希釈度1:10000にお
いて前記抗体を使用したヒストグラムｃおよびｆでは、
CD4細胞の反応性は52％であり、CD8細胞の反応性は58％
であった。この分析結果は、LFA−１抗原に特異的なモ
ノクローナル抗体2F12によるCD4およびCD8の両方のリン
パ球集団の染色パターンにおける変化に反映しており、
他方S6F1モノクローナル抗体はCD8＋リンパ球と優先的
に結合することが明らかになった。
S6F1抗体はCD8＋リンパ球のかなり大きい集団と反応
することが認められたので、この抗体を使用して末梢血
リンパ球のCD8＋集団をさらに細分してこれらの細胞の
作用上の不均一性を評価した。アロ反応性（alloreacti
ve）の細胞障害性Ｔリンパ球の前駆体またはエフェクタ
ー細胞をS6F1モノクローナル抗体によってCD8＋サプレ
ッサー細胞から分離できるかどうかを研究するために試
験計画を実行した。アロ抗原に特異的な細胞障害性Ｔ細
胞の前駆体がCD8＋細胞のS6F1＋集団またはS6F1−集団
のいずれに属するかどうかを決めるために、CD8＋細胞
のサブセットによって特異的細胞性リンパ球溶解（CM
L）を調べた。
既知方法を使用してCD8＋細胞を新たに単離し、S6F1
抗体で標識し、フルオレセイン共役（conjugated）Ｆ
（ab′）２ゴートアンチマウス（goat anti−mouse）Ｆ
（ab′）２（Tago）を使用してデベロプメントを行っ
た。森本等「ジャーナル・オブ・イムノロジィ」134:15
08〜1515（1985）に記載されているように、エピクス
Ｃ細胞選別器を使用して標識CD8細胞を選別した。次い
で、補体性（mediatad）溶解によって得た１×106個/ml
のCD4＋細胞を、この系においてキラーインテューサー
作用を生じさせるために添加し、１×106個/mlの未分画
CD8＋細胞選別されたCD8＋S6F1＋細胞またはCD8＋S6F1
−細胞と共に、同数の照射された同種刺激因子（alloge
nic stimulator）細胞、すなわちＥ細胞の存在下に、37
℃において５％CO2の湿った雰囲気中で、多数のくぼみ
（well）のある培養プレートにおいて培養した。６日間
培養した後にCD4＋細胞の補体性溶解を行うことにより
培地からCD4細胞を取り出した。ミュアー等「プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サ
ィエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・スティト・オブ
・アメリカ」79:4395〜4399（1982）に記載されている
ように、細胞を４時間温置（incubation）した後に、CD
8細胞のサブセットによる51Cr標識リィリーズ（releas
e）細胞性リンパ球溶解を測定した。
第2A図には、グラフは横軸にとった標的のE/Tと縦軸
にとった特異的溶解％との関係を詳細に示す。１対の実
験による試験を第2A図に示すように行った。特異的標的
細胞に対し細胞障害性Ｔ細胞の大部分はCD8＋S6F1−サ
ブセットに残るが、CD8＋S6F1＋サブセットには小部分
が存在することが明らかになった。
第2B図において、図示したデータは、細胞障害性エフ
ェクターＴ細胞は混合リンパ球反応（MLR）活性化CD8＋
S6F1＋細胞に属するが、CD8＋S6F1−細胞には属さない
ことを明瞭に示す。この測定結果を達成するために行っ
た試験計画は次の通りである:1×106個/mlの未分画Ｔ細
胞を、最終PRMI1640培地（10％のプールされたヒトAB血
清−ペルフリーズ（Pel Freeze））、4mMLのグルタミ
ン、25mMのヘペス緩衝剤（微生物協会）、0.5％の重炭
酸ナトリウムおよび10％のペニシリン−ストレプトマイ
シン中の同数の照射（5000ラド）同種（Ｅ−）刺激因子
細胞によって、25cm2フラスコ内で、37℃において５％C
O2で湿らせた雰囲気中で６日間感作させた。このように
して同種Ｅ細胞によって感作された未分画Ｔ細胞をエピ
ック Ｃ細胞選別器によってCD8＋S6F1＋およびCD8＋S6
F1−の細胞サブセットに分離した。未分画CD8＋細胞お
よび分画CD8＋細胞の両方を、細胞性リンパ球溶解にお
いて、食塩溶液（1m Ci/ml、ニューイングランドヌーク
レア（New England Nuclear）中の0.2mlクロム酸ナトリ
ウム中で、37℃において約10〜12時間にわたって培養
し、１時間温置した同種（Ｅ−）細胞を解凍し低温保存
したものである51Cr標識標的細胞に対して分析した。標
的細胞すなわち51Cr標的細胞を洗浄し、最終培地中に10
5個/mlで再懸濁させた。培養プレートのＶ形底のくぼみ
を使用して、標準の４回の細胞毒性アッセイを行った。
１対の実験を第2B図に図示するように行った。
第2A図に示すデータとは異なり、CD8＋S6F1＋リンパ
球集団は未分画CD8＋集団より大きいアロスペシフィッ
ク（allospecific）キラーエフェクター活性を示した。
実際に、CD8＋S6F1−リンパ球集団ではキラーエフェク
ター活性は認められなかった。これらの実験から得られ
たがここに記載しなかった他のデータは、ミュアー等
「上同」、サンチェズ−マドリッド等「ジャーナル・オ
ブ・イクスペリメンタル・メディシン」158:1785〜1803
（1983）；サンチェズ−マドリッド等「プロシーティン
グス・オブ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエン
シス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイト・オブ・アメ
リカ」79:7489〜7493記載されているように、S6F1モノ
クローナル抗体はエフェクター作用を妨害しないが、ア
ンチ−MHCクラスＩおよびアンチ−LFA−１モノクローナ
ル抗体はキラーエフェクター作用を妨害することを示し
た。このデータは、キラー前駆体Ｔ細胞は細胞のCD8＋S
6F1−サブセットに見出されるが、キラーエフェクター
活性はCD8＋S6F1＋サブセットに属することが分かる。
これらの試験で得たデータは、S6F1抗原が一次MLR反
応中にS6F1ネガティブCD8＋細胞集団に発現されるよう
になることができることを示唆する。S6F1抗原の発現を
評価するために、CD8＋S6F1−とCD4＋細胞およびＴリン
パ球とを併用して一次MLRを開始させた。３回の別個の
実験を行い、これらの実験で得たデータから、MLR活性
化後にCD8＋S6F1−細胞の44〜55％がその細胞表面上にS
6F1抗原を発現させることが分かった。これらの結果
は、S6F1抗原の発現がCD8＋細胞のS6F1ネガティブ集団
上に起こることを示す。
CD8＋細胞のどのサブセットが活性化されてサブプレ
ッサーエフェクター細胞になるかを測定するために、第
３図に示すデータを得た。新たに単離した未分画Ｔ細胞
を、上述の技術およびエピックス Ｃ細胞選別器を使用
して、CD8＋S6F1＋サブセットおよびCD8＋S6F1−サブセ
ットに分離した。丸底で多数のくぼみを有する微量培養
プレートにおいて、ボックウィードマイトジェン（Pock
eweed mitogen）（PWM）で刺激された５×104個のＢ細
胞および２×104個のCD4＋細胞に添加数を変えてCD8細
胞を添加し、７日培養後に全IgG免疫グロブリン産生量
を測定した。ミュアー等「上同」に記載されているよう
に、IgG分泌について培養上澄液をラジオイムノアッセ
イによって測定した。
第3A図に示すように、未分画CD8＋細胞の添加数を増
加した場合には、PWM刺激IgG分泌はＢ細胞によって添加
数に従って抑制された。CD4細胞およびＢ細胞に対するC
D8＋S6F1−細胞の添加数を増加した場合には、一層大き
いIgG分泌抑制度が認められた。これに対し、Ｂ細胞とC
D4＋細胞との混合物にCD8＋S6F1＋細胞を添加した場合
には、IgG分泌が僅か減少したにすぎなかった。これら
の結果から、CD8サプレッサー細胞は細胞のCD8＋S6F1−
サブセットに属することが分かる。
アロ抗原刺激IgG合成系においてMLR活性化後にCD8＋
細胞のサブセットのサプレッサー作用を調べることによ
り、CD8＋S6F1＋集団にＴ細胞サプレッサー活性が認め
られるかどうかを測定するためにデータを得た。調製し
たＴ細胞をMLRにおいてアロ抗原に対して６日間活性化
し、アロ活性化Ｔ細胞をエピックス 細胞選別器でCD8
＋S6F1＋細胞およびCD8＋S6F1−細胞に分離した。未分
離CD8およびCD8＋細胞のサブセットを、MLRで使用した
照射アロ抗原の存在下に自己由来の末梢血リンパ球（PB
L）に添加し、アロ抗原刺激IgG合成の作用をアッセイし
た。IgG合成の抑制率％をアッセイした。IgG合成の抑制
率％は次式によって計算した； 第3B図に示すように、アロ活性化未分画CD8＋細胞は
アロ抗原刺激IgG合成を添加数に従って抑制した。アロ
抗原で活性化されたCD8＋S6F1−集団はこの系において
未分画CD8＋細胞より大きいサプレッサー活性を示し
た。しかし、アロ抗体活性化CD8＋S6F1＋リンパ球は、
極めて多数の細胞をこれらの培地に添加した場合にの
み、最小サプレッサー活性を示した。これらの結果は、
サプレッサー前駆体細胞およびサプレッサーエフェクタ
ー細胞は両方ともCD8＋S6F1−リンパ球集団に属するこ
とを示す。さらに重要なのは、抑制はおそらく細胞毒性
の発現にとどまらないことを上述の結果が意味している
ことである。
細胞障害性エフェクターＴ細胞を同定する際における
S6F1抗原の有効性を考慮して、アンチ−2F12を使用して
S6F1抗原およびLFA−１抗原に免疫沈降法を適用するこ
とにより、抗原の構造を分析した。分析データを第4A
図、第4B図および第4C図に示す。
Ｔ細胞富化（enriched）細胞（Ｅ＋細胞95％）からの
細胞をコンカナバリンＡ（Con A）（20μg/ml）によっ
て３日間活性化し、ラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素
化〔ハバート（Hubbard）等「バイオケミカル・アナリ
シス・オブ・メンブラン」マディ，エーエッチ（Maddy,
AH）編、427〜501頁（チャブマン・アンド・ホール（Ch
apman and Hall）,1976参照）〕によって125Iで標識
し、洗浄し、次いで溶解（lysis）緩衝液（NaCl 150mM,
EDTA 1mMおよびフッ化フェニルメチル（スルフォニル）
を含有する20mMトリス−HCl緩衝液pH8.0中の１％w/vの
ノニデット（Nonidet）Ｐ−40）中で可溶化した。次い
で、溶解液（５×107個の細胞に相当する）を、個々の
抗体を含有する５マイクロリットルの腹水と共に４℃に
おいて一夜温置し、しかる後に50マイクロリットルの10
％w/vのプロテインA:セファロース（Sepharose,商品
名）によって沈降させた。次いで、免疫沈降物を、0.1
％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する
溶解緩衝液中で１回洗浄し、次いで溶解緩衝液のみによ
って２回洗浄し、しかる後にレェムリ（Laemli）「ネイ
チャー」（ロンドン）227:680〜684（1970）に記載され
ているように、SDS−PAGEによって分析した。標識末梢
血リンパ球からの溶解液を、４回の免疫沈降のために、
TS1/18抗体によって予め清澄にし、しかる後にS6F1抗体
で沈降させた。溶解液を上述のように標識し、調製し、
しかる後に等電点泳動試料緩衝液（尿素9.2M,ノンディ
エットＰ−40 2％，アンホリン（am−pholine）２％,pH
範囲２〜11（セルバ（Serva））中で50℃において30分
間温置することによりビーズから免疫複合体（immue co
mplex）を溶離させた。二次元NEGPHE/SDS−PAGE分析
を、既にオー′ファレル（O'Farrell）等の「セル（Cel
l）」12:1133〜1142（1977）；ラッド（Rudd）等「ジャ
ーナル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリィ」20
0:1927〜1936（1985）に記載されているようにして行っ
た。
第４図のデータはS6F1モノクローナル抗体およびCon
A活性化Ｔ細胞からLFA−１抗原を認識する2F12モノクロ
ーナル抗体によって沈降させたポリペプチドの複合パタ
ーンを示す、第4A図は２個のカラムすなわちレーン（la
ne）１および２を示し、レーン１はS6F1モノクローナル
抗体に関するものであり、レーン２は2F12モノクローナ
ル抗体に関するものである。レーン１はS6F1抗体が180,
000ドルトン（分子量）および95,000ドルトン（分子
量）において２個の主バンドを沈降させたことを示す。
レーン２は2F12抗体がそれぞれLFA−１抗原のαサブユ
ニットおよびβサブユニットに相当すると思われるバン
ドからなるパターンを沈降させたことを示す。
第4B図のデータは逐次の免疫消耗（immuno−depletio
n）および二次元非平衡ゲル分析（NEPHGE/SDS−PAGE）
によってなされたS6F1抗原の同一性の直接的証明に関す
る実験から得たものである。レーン１はS6F1抗体に関す
るもので、レーン２は2F12抗体に関するものである。第
4B図のデータは、LFA−１抗原に対する2F12抗体が、S6F
1と反応する物質を完全に消耗させたことを示す。注目
すべきは、モノクロナール抗体TS1/18がLFA−１抗原の
βサブユニットと反応することが分ったことである。サ
ンチェズ−マドリッド等の上述の両刊行物を参照のこ
と。
第4C図はS6F1抗体およびLFA−１抗体の２−D NEPHGE/
SDS−PAGEによる分析から得たデータを示す。このデー
タは、S6F1抗原およびLFA−１抗原が、それぞれpH5.3お
よび5.7のほぼ等電点において焦点的に分離された180,0
00ドルトンおよび95,000ドルトンの２種ポリペプチドを
沈降させたことを示す。第4C図のデータはS6F1モノクロ
ーナル抗体がLFA−１抗原と結合するという実験結果を
支持する。
S6F1モノクローナル抗体および2F12モノクローナル抗
体は同じ構造のものを免疫沈降させるが、これらのモノ
クローナル抗体と作用的に異なる細胞サブセットとの反
応性は異なると思われる。第1A図および第1B図に図示し
たデータは、S6F1モノクローナル抗体は選択的にCD8＋
リンパ球を優先的に染色（stain）し、他方2F12抗体は
またCD4＋リンパ球との反応性を示したことを示す。CD8
＋リンパ球とS6F1抗体との反応性はLFA−１抗原の構造
自体に対するこの抗体の低い親和性を単純に反映するも
のではないと考られる。
本発明者等はS6F1モノクローナル抗体を使用して行っ
た分析結果から、この抗体によって認識される実際のエ
ピトープは細胞毒性のプロセスに関与していないと思わ
れると決論した。その理由は、この抗体がこの作用を妨
害できなかったからである。しかし、LFA−１抗原に対
する他の既知のモノクローナル抗体はこの細胞毒性のプ
ロセスを効果的に妨害することができた。サンチェズ−
マドリッド等の上記刊行物を参照のこと。さらに、S6F1
抗原は主としてCD8＋細胞、ヌル細胞、ならびに小画分
のマクロファージおよびＢ細胞に発現されることが分っ
た。得られたデータから、S6F1抗体によって認識された
LFA−１抗原におけるエピトープは、標的細胞に対する
接着作用に関与するLFA−１抗原における結合位置の生
成によって、分子上に遠回りに（dislantly）形成する
ことが分る。
従って、S6F1モノクローナル抗体は、LFA−１抗原に
おける新規なエピトープを認識することにより、CD8リ
ンパ球集団において細胞障害性エフェクター細胞とサプ
レッサーエフェクター細胞とを区別することができる。
S6F1抗体のこのような独特な特性はCD8細胞障害性エフ
ェクター細胞を診断し、明確にする際に有用であり、こ
の特性はCD8細胞障害性エフェクター細胞をサプレッサ
ーエフェクター細胞から、特にフローシトメトリー法に
よって、また他の既知アッセイ法によって、区別できる
ことにある。例えば、CD8細胞障害性エフェクター細胞
はヒトにおける移植片拒絶、例えば、腎臓および他の移
植片の拒絶において重要な役割を演ずる。CD8＋S6F1細
胞障害性エフェクター細胞に対してS6F1抗体はこれらの
エフェクター細胞を選択的に同定することができ、従っ
て同種異系型移植片拒絶を消失させる点でサプレッサー
細胞集団の作用を治療上価値あるものにすることができ
るようにするのに有用である。従って、S6F1モノクロー
ナル抗体の特異性が進行中の移植片拒絶を治療する上で
有用であることがある。
CD8細胞クラス内のS6F1モノクローナル抗体のこのよ
うな特異性は、CD8細胞クラスにおいてサプレーサーエ
フェクター細胞を細胞障害性エフェクター細胞から区別
するためのこのような積極的で一層正確なフェノタイプ
手段を提供できる抗体は従来入手できなかったのである
から、特に独特でありかつ有用である。モノクローナル
抗体がヒトの免疫系における細胞障害性細胞のCD8前駆
体を明確にすることについてはクレメント等「ジャーナ
ル・オブ・イムノロジィ」133:2461〜2468（1984）に議
論されているが、本発明のS6F1モノクローナル抗体を使
用した場合に達成可能な結果は達成されていない。
（寄託） 本発明のS6F1モノクローナル抗体を産生する細胞系
は、本特許出願の出願前の1987年10月30日にアメリカ合
衆国メリーランド州20852ロックヴィル所在のアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されてい
る。この細胞系の受託番号はエイティシーシーHB9579で
ある。
本発明のモノクローナル抗体の完全な診断上の適用お
よび可能な治療上の適用は決められていない。本発明の
モノクローナル抗体は単独において、あるいは放射性同
位元素、薬剤または毒素と結合させた場合に、本発明の
モノクローナル抗体の上述の特性に密接に関係のある治
療上の利益をヒトの器官の移植法において得ることがで
きる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ａ６１Ｐ 37/06 // Ａ６１Ｐ 37/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 モリモト チカオ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02192 ニーダム グレート プレイン アベニュー 329 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．，Ｖｏｌ．79（1982）ｐ．7489− 7493 Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ22 ［７］（1985）ｐ．757−764 ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ，Ｖｏｌ．２［４ ］（1983）ｐ．423−437 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/06 - 15/08 A61K 39/395 C12N 5/16 - 5/28 C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】LFA−１抗原として同定した180,000ダルト
    ンおよび95,000ダルトンの糖蛋白質からなる抗原（以
    下、S6F1抗原という。）におけるエピトープ（以下、S6
    F1エピトープという。）として同定したエピトープに特
    異的に結合し、ヒトCD8リンパ球集団における細胞障害
    性エフェクター細胞とサブレッサーエフェクター細胞と
    の区別を可能にするモノクローナル抗体を産生するハイ
    ブリドーマ法によって得たハイブリッド細胞系。
  2. 【請求項２】前記ハイブリッド細胞系が、ヘルペスウイ
    ルス・サイミリイに感染した唇の白いタマリンから得た
    不死化脾臓細胞集団によって免疫が付与されているマウ
    ス脾臓細胞から産生されたものである請求項１記載のハ
    イブリッド細胞系。
  3. 【請求項３】S6F1エピトープに対してマウスIgGイソタ
    イプ抗体を産生する請求項２記載のハイブリッド細胞
    系。
  4. 【請求項４】前記モノクローナル抗体を産生する細胞は
    ネズミ細胞から得られたものである請求項１記載のハイ
    ブリッド細胞系。
  5. 【請求項５】マウス骨髄腫細胞と融合させることによっ
    て得た請求項１記載のハイブリッド細胞系。
  6. 【請求項６】アメリカ合衆国メリーランド州ロックビル
    所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
    にエイティシーシーHB9579という受託番号で寄託されて
    いる細胞系の同定特性を有するハイブリドーマ法によっ
    て得たハイブリッド細胞系。
  7. 【請求項７】（ａ）CD8細胞障害性エフェクター細胞に
    おいては検出できかつCD8サプレッサーエフェクター細
    胞においては本質的に検出できず、かつ（ｂ）分子量18
    0,000ドルトンおよび95,000ドルトンの糖タンパク質か
    らなる細胞表面構造を決定する抗原に、Ｔリンパ球集団
    のサブセットの表面において特異的に結合するモノクロ
    ーナル抗体。
  8. 【請求項８】LFA−１抗原におけるエピトープと結合す
    る請求項７記載のモノクローナル抗体。
  9. 【請求項９】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
    ションにエイティシーシーHB9579という受託番号で寄託
    されている試料の同定特性を有する細胞系によって産生
    され、マウスイソタイプIgGを有する請求項７記載のモ
    ノクローナル抗体。
  10. 【請求項１０】ヒト末梢血中のＴリンパ球のLFA−１抗
    原として同定した180,000ダルトンおよび95,000ダルト
    ンの糖蛋白質からなる抗原（以下、S6F1抗原という。）
    におけるエピトープ（以下、S6F1エピトープという。）
    に特異的に結合し、さらに末梢血リンパ球中のCD8細胞
    障害性エフェクター細胞およびCD8サプレッサー細胞の
    集団中に存在するCD8細胞障害性エフェクター細胞に優
    先的に結合するモノクローナル抗体。
  11. 【請求項１１】S6F1エピトープと結合する請求項10記載
    のモノクローナル抗体。
  12. 【請求項１２】ヒトCD8リンパ球集団の試料中の細胞障
    害性エフェクター細胞とサプレッサーエフェクター細胞
    とを区別するに当り、 前記試料とS6F1モノクローナル抗体として同定したモノ
    クローナル抗体とを前記S6F1モノクローナル抗体とCD8
    細胞障害性エフェクター細胞との間に免疫複合体が形成
    するのに十分な条件下に前記免疫複合体が形成するのに
    十分な時間の間接触させ、次いで 前記モノクローナル抗体と前記試料中の細胞との間の前
    記接触によって生成する前記免疫複合体を検出し、前記
    モノクローナル抗体と複合体を形成する前記試料中の細
    胞をCD8細胞障害性エフェクター細胞とすることを特徴
    とするヒトCD8リンパ球集団の試料中の細胞を区別する
    方法。
  13. 【請求項１３】前記試料と前記モノクローナル抗体とを
    接触させる前に、前記免疫複合体が検出可能な化合物に
    よって標識されるように、前記モノクローナル抗体を前
    記検出可能な化合物によって標識し、前記試料と前記標
    識モノクローナル抗体とを接触させた際に前記免疫複合
    体が形成される請求項12記載の方法。
  14. 【請求項１４】検出された免疫複合体を細胞選別フロー
    サイトメトリー法によって分離する請求項12記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】前記検出可能な化合物が蛍光化合物であ
    る請求項13記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記検出可能な化合物が基質反応を検出
    できる化合物を産生することができる酵素である請求項
    13記載の方法。
  17. 【請求項１７】末梢血リンパ球中のCD8細胞障害性エフ
    ェクター細胞の表面に存在する180,000ダルトンおよび9
    5,000ダルトンの糖蛋白質からなるS6F1抗原のエピトー
    プ（以下、S6F1エピトープという。）として同定したエ
    ピトープに特異的なマウスIgGイソタイプのネズミ属モ
    ノクローナル抗体。
  18. 【請求項１８】検出できるように標識した形態である請
    求項17記載のモノクローナル抗体。
  19. 【請求項１９】前記標識が色素、蛍光化合物、放射性元
    素および電子密度の大きい元素からなる群から選定され
    ている請求項18記載のモノクローナル抗体。
  20. 【請求項２０】前記モノクローナル抗体が、ヒト治療用
    放射性同位元素、薬剤およびケモトキシンからなる群か
    ら選定したものに結合している請求項17記載のモノクロ
    ーナル抗体。
  21. 【請求項２１】液状生体試料中において、CD8クラスの
    リンパ球内のCD8細胞障害性リンパ球の表面における、1
    80,000ダルトン及び95,000ダルトンの糖蛋白質からなる
    S6F1抗原（以下、S6F1抗原という。）を検出および測定
    するに当り、 前記試料と、蛍光化合物、放射性元素および酵素からな
    る群から選定した検出可能な標識に共役させたS6F1抗体
    とを接触させ； 前記共役させた抗体を前記表面抗原に係合させ、 次いで、前記結合し共役させた抗体を検出および測定す
    ることを特徴とするS6F1抗原の検出および測定方法。
  22. 【請求項２２】前記共役モノクローナル抗体によって結
    合させたCD8細胞障害性リンパ球の細胞選別をフローサ
    イトメトリーにより行う請求項21記載の方法。
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