JPH026754A

JPH026754A - Ｎｋ細胞および細胞障害性ｔリンパ球の同定

Info

Publication number: JPH026754A
Application number: JP64001139A
Authority: JP
Inventors: Lewis L Lanier; ルイス・エル・ラニアー; Joseph H Phillips; ジョセフ・エッチ・フィリップス; Anne L Jackson; アン・エル・ジャクソン
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1988-01-06
Filing date: 1989-01-06
Publication date: 1990-01-10
Anticipated expiration: 2012-08-25
Also published as: US4895796A; EP0337586B1; EP0337586A3; DE68914016D1; ATE103391T1; ES2053967T3; JP2644029B2; DE68914016T2; EP0337586A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は免疫学および細胞分析の分野に関し、特にヒト
−リンパ球のクラス間の識別をするだめの技術を目的と
している。

（従来の技術）リンパ球は白血球（自制細胞）のサブセットである。リ
ンパ球集団の中には、自己由来の悪性細胞、自己由来の
ウィルス感染細胞、および非自己由来の細胞を含む他の
細胞を溶解しうる異なる細胞型が少なくとも２種類同定
されている。これら２種類の主要細胞障害性リンパ球と
は、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラル
キラー（ＮＫ）細胞である。

ＣＴＴ−を含むすべてのＴリンパ球は、原形質股上およ
び／または細胞質内に、種々のＴ細胞亜をと関連する多
数の他の抗原と共にＣＤ３と呼はれる抗原を持つ、Ｃｌ
＞３は、Ｔ細胞抗原受容体（即ち抗原認識反応のための
構造）と非共有結きて結合する少な・くとち３種類の２
０〜３０ＫＤの蛋白質で構成される。ａｎｔｉ　−Ｌｅ
ｕ　−４モノクロ一ナル抗体（ヘク［・ン　ディキンソ
ン　モノクローナル・センター株式会社（ＢｅｃＬｏｎ
　Ｄ　１ｃｋｉｎｓｏｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ（：　Ｌ
！ｎ　１．　ｅ　ｒ、Ｔｎｃ）より入手可能）を含む多
数のＣＤ３に対する抗体か作られている。もし標的細胞
が同系主要組織適合（ＭＨＣ）抗原を発現するならば、
大多数のＣ：　Ｔ　Ｌは標的細胞を溶解する。それゆえ
、そのような細胞はＭ　ＨＣ制限を受ける。

大多数のＮ　Ｋ　市ｌＩ胞は、ＣＦ）３抗原又はＴ細胞
抗原受容体のともらかを発現しない（ラニエル（Ｌａｎ
ｉｅｒ）ら、す゛　ジャーナル・オフ　イミュノロジー
（Ｊ　、　　Ｉ　＋ｏｍｕｎｏ１．＞１９８６年　第１
３７巻　２７３５頁参照）という点て、Ｎ　Ｋ細胞はＴ
リンパ球と異なる。また、Ｎ　Ｋ細胞はある種の腫ｇＳ
細胞およびウィルス感染細胞を溶解しつるか、Ｍ　Ｉ−
Ｉ　Ｃ制限ではない。

ＴＲＩ胞がｎｎ１．ｉ　−Ｃ，、Ｄ　３抗体との反応性
によって容易に同定できるのに対して、単一の標識試薬
を使ってＮ　Ｋ細胞を同定あるいはその数をカウントす
る簡単で感度の良い方法はない。大多数のＮ　Ｋ細胞は
ＣＤ１６抗原を発現することがよく知られている。ＣＤ
１６はＩ）ＨＧ受容体と結きする５０〜７０ＫＤの糖蛋
白質である。ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１１ａ、ＶＥＰ１３
、Ｂ７３．１、Ｌ２３およびその他の多数の抗体がＣＤ
１６に対して調整されている。（ラニエル（Ｌａｍｉｅ
ｒ）ら、ザ・ジャーナル・オフ・イミュノロジー（Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ　、）１９８３年、第１３１巻、　１７
８９頁：ペルシア（Ｐ　ｅｒｕｓｓｉａ）ら、ザ・ジャ
ーナル・オフ・イミュノロジー、１９８３年、第１３０
巻、　２１３３頁；ペルシアら、ザ・ジャーナル・オフ
・イミュノロジー、１９８３年、第１３０巻、　２１４
２頁：ラムボンド（Ｒｕｍｐｏｌｄ）ら、ザ・ジャーナ
ル・オフ・イミュノロジー、１９８２年。

第１２９巻、　１４５８頁：　ラニエルら、ザ・ジャー
ナル・オフ・イミュノロジー、１９８６年、第１３６巻
。

４４８０頁）。しかしながら、ＣＤ１６はすべてのＮ　
Ｋ細胞で検出されることはなく、特に、培養によって活
性化されたＮ　Ｋ細胞では検出されないことが示されて
いる。さらに、ある環境においてはＣＤ１６はＴリンパ
球上で発現する（ラニエルら、ザ・ジャーナル・オフ・
エキスペリ、メンタル・メディジン←、Ｔ　　影則、　
Ｍｅｄ、）、１９８５年　第１６２巻、　２０８９頁）
。大多数のＮＫａ胞は、原形質膜上にａ＋＋ｔｉＬｅｕ
−１９モノクロ一ナル抗体によって同定される別の糖蛋
白質を発現する。このａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１９モノク
ロ一ナル抗体は、ヘクＩ−ン・デイキンソン・モノクロ
ーナル・センター株式会社より商品として入手可能であ
る。ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１９は、Ｎ　Ｋ　Ｈ１１モノ
クロ一ナル抗によっても認識される約１６０ＫＤの糖蛋
白質（ＧＦ’１６０）を認識するくラニエルら、ザ・ジ
ャーナル−オフ・イミュノロジー１９８６年、第１３６
巻、　４４８０頁）。しかしながら、旧１ｔＬｅｕ−１
９およびＮ　Ｋ　Ｈ−１共にＮ　Ｋ細胞とのみ反応する
のではなく、他の非リンパ球細胞型とも反応する（ラニ
エルら、ザ・ジャーナル・オフ・イミュ、ノロジー、１
９８７年、第１３８巻、　２０１９頁）。また、ａｎｔ
ｉ　−１−ｅｕ−１９はＴリンパ球のユニークな副サブ
セットとも反応し、少なくともサブセットのあるものは
Ｍ　Ｈｃ制限なしに死ぬ（ラニエルら、ザ　ジャーナル
・オフ　イミコーノロシー、１９８６年。

第１３６巻、　４４８０頁）。結局、ａｎｔ、ｉ　−Ｌ
ｅｕ−１９によって詔、識されるＮ　Ｋ細胞の原形質膜
」二の抗原量は時として低く、そのことか血流あるいは
他の組織といったような混合細胞集団の中からＮ　Ｋ細
胞の数を正確に同定し、数えることを困難にしている。

最近、インビボでのインターロイキン−２（ＩＬ２）薬
物療法とインビ１へ口てＩ　Ｌ　−２て活性化した患者
の自己由来リンパ球の投与とを併用する新しい癌治療方
法が開発された。この治療法をリンホカイン活性化キラ
ー（ＬＡＩＯ細胞およびＩ　Ｌ２治療と呼ぶこともある
（ローゼンヘルク（Ｒ。

３　ｅ　ＩＩ　Ｉ）ｅ　ｒ　Ｂ　）ら、ザ°ニューイン
グランド・ジャーナル・オフ　メディジン（ｙ−１則睦
、　Ｊ、　Ｍｅｄ、）、１９８５年　第３１３巻、　１
４８５頁）。細胞障害性エフェクター細胞が主要Ｎ　Ｋ
細胞であることは明らかである（フィリップス（Ｐｌ＋
１ｌｌｉｐｓ）およびラニエル（Ｌａｎｉｅｒ）、ザジ
ャーナル・オフ・エクスペリメンタル・メディジン（Ｊ
　、　脱圧、　Ｍｅｄ、）、１９８６年。

第１６４巻、８１４頁）。このように、このタイプの治
療ては、免疫システムの活性化あるいは抑制の評価のた
めの他の医療的状況と同様に、Ｎ　Ｋ細胞や１９７６球
のレベルを同定し、その数を数え、監視する方法が明ら
かに必要である。

本研究より以前には、単一アッセイを使ってＮ　Ｋ細胞
と１９７６球を明確にかつ同時に同定することは不可能
であった。従って、Ｎ　Ｋ細胞とＴ細胞とを単純な技術
て、そして好適な実施態様においては自動化可能な技術
で識別する必要性が残される。

（発明の構成）本発明はＮＫｍ胞と細胞障害性Ｔリンパ球を識別する方
法を提供する。その方法は、ａｎｔｉ−ＣＤ３および第
一検出用標識からなる第−試薬並びに第二検出用標識で
両方とも標識したａｎｔｉ　−ＣＤ　１６およびａｎｔ
ｉ　−Ｇ　Ｆ’　１６０の混合物からなる第二試薬をリ
ンパ球を含有する試料と接触させること、および第二試
薬と反応する細胞から第一試薬と反応する細胞群を識別
することからなり、それによって第一試薬とのみ反応す
る細胞を１９７６球と同定し、第二試薬とのみ反応する
細胞をＮ　Ｋ細胞と同定する。両試薬と反応するリンパ
球は１９７６球のユニーク副集団と同定され、副集団の
あるものはＭ　ＨＣに制限されない細胞溶解と媒介する
ことができる。好適な実施態様では、二つの試薬は異な
る蛍光団と結合しており、細胞は顕微鏡あるいはフロー
サイトメトリーで検出される。

本発明は特定の実施態様である以下の詳細な記載を参考
にし、本明細書の一部を形成する図面を自わせて考慮る
ることによって、より良く理解されるであろう。

図面は、Ｐ　Ｅ　−ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１９（Ｇ　Ｐ
　１６０）とＰＥａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１１ｃ（ＣＤ　
１６）て標識した細胞の蛍光に対するＦ　Ｉ　Ｔ　Ｃ−
ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ　−４（ＣＤ　３　）で標識した細
胞の蛍光を示すグラフである。

本発明によって、Ｎ　Ｋ細胞と細胞障害性Ｔ細胞とを互
いに細胞表面抗原に基づいて識別することができる。こ
れらの細胞表面抗原は、これらの抗原に対して特異的な
標識化抗体の細胞表面に結合する能力によって認識され
る。リンパ球を含有する細胞群の未知の混合物を本発明
の試薬混合物と接触させると、二つの試薬が細胞と結き
する方法の違いによって、１９７６球、Ｎ　Ｋ細胞およ
びある種の他の細胞集団を認識することがてきる。第一
試薬はａｎｔｉ−ＣＤ　３からなり、一方第二試薬は抗
体輸ｎｔｉ−ＣＤ１６およびａｎｔｉ　−Ｇ　Ｐ　１６
０）の混合物からなる。二種類の試薬を区別するために
、これら二種類の試薬を異なる検出用標識で標識する。

第一試薬と反応する細胞を１９７６球と同定し、第二試
薬とのみ反応する細胞をＮ　Ｋ細胞と同定し、そして両
方の試薬と反応する細胞を１９７６球のサブセットと同
定する。このサブセットのあるものは、Ｍ　Ｉ−１ｃに
制限されない細胞障害性機能を媒介する。

リンパ球およびＮ　Ｋ細胞の細胞表面抗原は数種の命名
体系を用いて同定されている。例えば、この明細書てＬ
ｅｕ−４と同定されている抗原は、分化抗原に対するＣ
Ｄ命名法によればＣＤ　３抗原として知られている。同
様に、Ｌｅｕ−１１抗原はＣＤ１６として知られている
。ａｎｔｉ−Ｌｅｕ−１９として認知されている抗原と
ＣＤクラスター抗原との関連については確立されていな
いが、Ｌｅｕ−１９抗原はＮ　Ｋ　Ｈ−１抗体によって
同定される抗原と同一であると考えられている。本出願
の目的に従って、二の第三の抗原性物質をＧ　Ｐ　１６
０と名付ける。このＣＤおよびＧ　Ｐ　１６０の名称は
抗原全体に関連し、Ｌｅｕの名称より一般的に用いられ
る。このＬｅｕの名称は、抗原上の特異な決定基を認識
する一連のモノクローナル抗体に由来するものである。

本発明の説明中のある例においては、Ｌｅｕ名称に参照
を付ける場合もあるが、他の場合はより一般的なＣＤお
よびＧＰ１６０名称を用いる。−船釣な名称を意味する
か、特定の名称を意味するが、前後関係より明らかにな
る場きもあるが、多くの場合、二つの用語は交換できる
ように使われる。

Ｌ、ｅｕシステム命名法は、細胞表面に存在する個々の
抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体の使用から
生まれな。Ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−４はＣＤ３と反応し、
このＣＤ３は少なくとも３種類の２０〜３０ＫＤの蛋白
質複自体である（カン（Ｋａｎ）ら、ザジャーナル・オ
フ・イミュノロジー、１９８３年。

第１３１巻　５３６頁；ポルスト（Ｂ　ｏｒｓｔ）ら、
ザ・ジャーナル・オフ・イミュノロジー、１９８２年　
第１２８巻、　１５６０頁）。ＣＤ１６はＮ　Ｋ細胞お
よび好中球に存在するＴｇＧに対するＦｃ受容体と結合
する５０．０００〜７０，０００タルトンの蛋白質であ
る。抗原およびその反応性に関する詳細な論文ととして
は、例えば、ラニエルら、ザ　ジャーナル　オフ・イミ
ュノロジー４９８３年　第１３１巻　１７８９頁：ペル
ッジア（Ｆ’　ｅｒｕｓｓ　ｉａ）ら、ザ　ジャーナル
・オフ・イミュノロジー、１９８３年　第１３０巻、　
２１３３頁：ペルッジアら、ザ・ジャーナル・オフ　イ
ミュノロジー１９８３年、第１３０巻、　２１４２頁：
ラノ＼ボルド（Ｒｕｍｐｏｌｄ）ら、ザ・ジャーナル・
オフ、イミュノロシー、１９８２年、第１２９巻、　１
４５８頁：およびペルッシアら、ザ・ジャーナル　オフ
・イミュノロジー、１９８４年。

第１３３巻　１８０頁を参照されたい、Ａｎｌ、ｉ　−
Ｌｅｕ−１９を認、識する抗原であるＧＰＩ６０は、約
１６０，０００ダルトンの分子量をもつ糖蛋白質である
か、その機能は未知である。これらの性質および反応性
に関す１する詳細な記述は、例えば、ラニエルら、ザ・ジャーナル
・オフ・イミュノロジー、１９８６年、第１３６巻、　
４４８０頁：グリッツイン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）ら、ザ。

ジャーナル・オフ・イミュ、ノロジー、１９８３年、第
１３０巻、　２９４７頁、およびヘルシエンド（Ｈｅｒ
ｃｅｎｄ）、ザ・ジャーナル・オフ・クリニカルインへ
ステイゲイション（Ｊ　、　ＣＩｉｎ、　　Ｉ　ｎｖｅ
ｓｔ、）、１９８５年、第７５巻、９３２頁を参照され
たい。ＧＰ１６０には、また世界健康機構の白血球分化
抗原ワークショップ委員会によってＣＤ名が与えられて
いない。前報告では分子量を大きく評価したが、より最
近の研究では、相対移動度よりおよそ１６０．０００１
（Ｄであることがわかっている。

本発明の実施に有用なモノクローナル抗体は、以下に述
べる標準的な技術によって調製される。

Ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１１は、マウスをヒト末梢血液、
低浮遊密度リンパ球、あるいは顆粒細胞で免疫すること
、および免疫肺細胞を骨髄腫細胞系と融きすることによ
って調製することができる。その結果得られたハイブリ
ドーマのＬｅｕ−１１に対する抗原特異性は、競合結き
試験およびＣＤ１６抗原の免疫沈降によって決定するこ
とができる。Ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ１９はマウスをＫ　Ｇ
　ｌ　ａ細胞系て免疫すること（コエッフラー（Ｋ　ｏ
ｅｆｆ　Ｉｅｒ）ら、ブルード（Ｂ　１ｏｏｄ）、１９
８０年　第６１巻　１２２２頁）、免疫肺細胞を骨髄腫
細胞系と融きすること、およびＮ　Ｋ　Ｈ−１抗原と反
応する抗体を生産する細胞を選択することによって、同
様の方法て調製される６Ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ　−４は、
マウスをヒｌ〜胸腺細胞あるいは末梢Ｔリンパ球て免疫
すること、免疫肺細胞を骨髄腫細胞系と融合すること、
およびＣＤ３と反応する抗体を生産する細胞を選択する
ことによって調製される。

抗原特異性は、競合結合試験およびＣＤ３抗原との免疫
沈降によって決定することができるくベベルレイ（Ｂ　
ｅｖｅｒｌｅｙ）およびカルラード（Ｃａｌｌａｒｄ）
、ヨーロピアン・ジャーナル・オフ・イミュノロジ−（
Ｅｕｒ、　、■、　　Ｔ　＋ｎｍｕｎｏ１．）、１９８
１年　第１１巻、３２９頁、クング（ＫｕＢ）ら、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９７９年、第２０６巻、
３４７頁）。

−こに示す特異的モノクローナル抗体あるいはそれと同
等のものは、本発明の実施において用いることができる
。モノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｔ
ｇＧ（ヒトではサブクラス１−４；ネスミでは１．２ａ
、２１〕、３〉あるいはＩｇＭを含む抗体のクラスある
いはサブクラスのいずれかに属する。Ｆａｌ＋、Ｆ　（
ａｂ′）２もしくはその類似物のような抗体の活性な結
合フラグメントを使用することができる。モノクローナ
ル抗体は、抗体サブユニットあるいはＦｖをコードする
Ｂ−リンパ球遺伝子の不滅化を提供するいかなる慣用的
手段、例えば感作リンパ球と骨髄腫融合パートナ−との
間の融合；形質転換、たとえばＥＢＶによる形質転換：
あるいは他の不滅化技術：によって調製することがてき
る。別法として、遺伝子を抗体を発現するリンパ球宿主
細胞から分離し、既知の遺伝子工学技術によって発現さ
せるためにより便利な宿主に移入することもできる。

抗体は手近にいるを髄動物、例えばげっ歯動物（例えば
マウス、ラット）、霊長類（例えばヒト）、うさぎ類、
牛、羊、馬、豚等、より得ることができる。時には既知
の技術に従って、宿主の脾臓あるいは地組織の細胞を骨
髄腫細胞と融きすること、又は細胞を不滅化するために
肺臓細胞を適切な形質転換ノ＼クターを用いて形質転換
することによって抗体を調製する。細胞を選択培地で培
養し、目的とする抗原と結合する抗体を選択するために
スクリーニングする。

診断アンセイのために、抗体を標準的な技術で標識化す
る。検出可能なシグナルを提供する標識として、多種類
の標識が知られている。標識の例としてラジオアイソト
ープ、例えば３Ｈ１″５■、３１Ｊおよび１４Ｃ：蛍光
団、例えばフルオレセイン、フィコビリ蛋白質、希−ヒ
類のキレート、およびローダミン、酵素グ）基質および
阻害剤；西洋わさびのペルオキシダーゼ、タルコースオ
キシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
、β−ガラクトジターセ、およびアセチルコリンエステ
ラーゼといった酵素、又は粒子、例えばデキストラン、
アガロース、金属粒子、炭素、磁気粒子、あるいはポリ
スチレン粒子；がある。蛋白質との結合標識の方法は、
文献に多く記載されている（例えば、合衆国特許第３，
８１７，８３７号、第４゜１３４．７９２号、および第
４，２２０，７２２号を参照されたい）。

用いる標識化方法は、慣用の技術に従って行ない、また
抗体あたりの標識数は標識の性質、希望するシグナルの
感度等に応じて変化させる。多種多様な分析物を検出す
るために抗体と共に使用する多数の分析方法が開発され
ており、ここでそれらを適用することができる。例えば
、自衆国特許第３，７９１．９３２号、第３，８１７，
８３７号、第４，１３４，７９２号、第４，１７４，３
８４号、第４，２７５，１４９号、および第４　、２９
９　。

９１６号を参照されたい。これらは参照により本明細書
に含まれる。

本発明の方法で使用する第一標識および第二標識として
二種類の異なる蛍光標識を用いることが特に好ましい。

異なる蛍光標識の使用は自動化された装置を用いたのフ
ローサイトメトリーによる容易な検出や細胞の識別を可
能にする。蛍光標識の好適な組合わせは、フルオレセイ
ン（イソチオシアネートて結きさせる（ＦＩＴＣ）とフ
ィコエリｔ・リン（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＩ）Ｐ）で抗体
と結きする）である。蛍光団を抗体に付けるために、こ
れ以外の３廖切なりロスリンカ−やカップリング技術を
用いることもてきる。フルオレセインとフィコエリトリ
ンは、一方を旧＋ｔｉ−Ｌｅｕ　　４の標識として使用
し、かつ他方をａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１１とａｎｔｉＬ
ｅｕ−］９両方の標識として使用する限りにおいてはど
ちらを第一・検出用標識として用いても、第二検出用標
識として用いてもよい。

標識試薬がてきると、標識試薬をリンパ球と接触させる
。リンパ球の型は、抗体結きを行なうことのできる反応
媒体中で決定される。−船釣に、反応媒体は細胞の懸濁
液であり、個々の細胞型を分析するために、溶液のパラ
メータ（例えば温度ｐ　＋−１および容量モル浸透圧濃
度）を生理学上許容てきる範囲に維持するための緩衝液
を含んている。

Ｔリンパ球およびＮ　Ｋ細胞は二種類の試薬との結合能
力によって識別される。　ａｎｌ、ｉ　−Ｌｅｕ−１１
および５、／またはａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１９とも反応
するがしないかにかかわらず、ａｎｔｉ−Ｌｅｕ−４と
反応する細胞はずｌ＼てＴリンパ球と同定される。

試薬１のａｎｔｉ　−Ｌｅｕ　−４および試薬２のａ　
ｎ　１．１Ｌｅｕ−１９あるいはａｎｔ、ｉ　−Ｌｅｕ
−１１の両方と反応する細胞はＴリンパ球のサブセット
を形成し、この中のある種のサブセットはＭＨＣに制限
されない細胞障害性機能を媒介する。試薬２のａｎ　Ｌ
　ｉ　−１−ｅｕｌｌおよび／またはａｎｔｉ　−Ｌｅ
ｕ−１９と反応し、試薬１のａｎｔｉ　−Ｌｅｕ　−４
とは反応しないリンパ球様細胞をＮ　Ｋ細胞と同定する
。

二種類の細胞型の違いを検出するために使われる方法は
、使用される標識のタイプにより当然異なる。例えば異
なる放射性標識は差異放射線検出器（例えば放射スペク
トルを基準として同位体を識別する能力をもつガンマ線
計測装置）を使用することによって識別することかでき
る。蛍光標識は細胞を検出可能にし、さらに必要であれ
ばフローサイｌ−メトリーを使って細胞を自動的に識別
することを可能にするので、二種類の異なる蛍光標識を
使用することは特に好ましい。蛍光活性化細胞選別器（
ＦＡＣ３）は商品として入手可能なフローサイｌ＝　、
メーターであり、」二連の方法で標識した細胞を識別す
ることかてきる。

ある場き、異なる細胞の検出の目的は診断であることも
ある。例えば、新しい癌治療の方法が開発されカニか、
この治療方法はインビボでのインターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２＞薬物治療およびインビトロてＩＬ−２で活性化
した患者の自己由来リンパ球を再注入することとの１井
川からなり、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞
および■Ｉ−−２治療と呼ばれる（ローセンハーグ（Ｒ
，ｏ　ｓ　ｅ　ｎ　ｂ　ｅ　ｒ　Ｂ　）ら、エヌ・エン
ク・ジエイ　メト（Ｎ　、　ＥＩＩｇ、Ｊ　、Ｍｅｄ、
）（］９８５）３］３：］４８５）、　＠胞障害性エフ
ェクター細胞は主にＮ　Ｋ細胞であることは明らかであ
る。（フィリ・ソプスＪしよひラニエル、ザ・ジャーナ
ル−オフ・エクスペリメンタル　メティシン、１９８６
年　第１６４巻　８１４頁）。このように、この種Ｊ）
治療では、Ｎ　Ｋ　Ｒ（ｎ胞およびＴリンパ球のしｌ＼
ルを同定し、定量し、監視する方法が明らかに必要であ
る。この場合、本発明による単純なアンセイ方法を用い
ると好都合であることは明らかである。ＦＩＴＣａｎｔ
ｉ−ＣＤ　３と共にＰＥ結合ａｎｔｉ　−ＣＤ　１６お
よびａｎｔ　ｉ−Ｇ　Ｐ　１６０の両方を組合わせて使
用することによって、本発明は、Ｆ’　Ｅ染料で染色さ
れるかＦＴＴＣ染料ては染色されない実質的にずへての
Ｎ　Ｋ細胞を同定することを可能にする。また、本発明
はＦＩＴＣて染色されるかＰＥては染色されない細胞と
して同定されるＴリンパ球の同定と、（１）ＣＤ３なら
びに（２）ＣＤ１６および／′またはＧＰ１６０の両方
と結きするユニークＴ細胞の同定を同時に行なうことが
できる。後者はＭ　ＨＣ：に制限されない細胞障害性を
媒介するＴ細胞の集団を含んでいる。また、本発明は患
者の免疫状態を決定するのに有用であり、Ｎ　Ｋ細胞と
Ｔ細胞の総数および百分率を同時に決定することができ
る。１ｚ）られた値を正常値と比較することによって、
ある種の病状においてこれらの細胞型の割合あるいは絶
対数が正常か異常であるかを決定することがてきる。本
ア・ソセイの他の応用としては、（１）Ｃｒ’）３と（
２＞ｃ、、　Ｄ　１６および、・′またはＧＰ１６０を
発現するユニーク１゛細胞集団か正常値以」−に明らか
に増加するリンパ球増殖障害を検出てきる可能性がある
（レイノル１へ（トｊ、ｅｙｎｏｌｄｓ）およびメータ
（Ｆｏｏｎ）、ブロード（Ｂ　ｆｏｏｄ）、１９８４年
　第６４巻、　１１４６頁）以」二、本発明を一般的に
述べてきたが、本発明は次の実施例を参照することによ
ってより良く理解をされるてあろう。また次の実施例は
例示を目的とするものてあって、特定されていないこと
を理由に本発明を限定するものてはない。

ＡｎＬｉ−−Ｌｅｕ−Ｉｌｄモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ）はＬ２３として同定されるハイフリ１ヘーマ細胞系
て生産された。、Ｌ２３は、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマ
ウスをヒト末梢血低浮遊密度リンパ球で免疫するとおよ
び、免疫胛細胞を５Ｐ２１０骨髄腫細胞系と融きする二
とによ−）て得′／：二〇Ｌ２３ハイフリドーマは、■
ｇＧ］、Ｋ　Ｍ　Ａ　ｂを生産する。Ｌ２３１〕と命名
されたＩｇＧ２ａアインタイプ−スイッヂ変異型は、フ
ルオレセインイソチオジアネ−１−（Ｆ　Ｉ　１”　Ｃ
）結合のヤギ抗マウスＴｇＧ２．ａ特異的抗血清（サザ
ンバイオテツク（Ｓｏｕ目＋ｅｒｎ　Ｂ　１ｏｔｅｃｈ
）、ハーミンカム（１３ｉｒｍｉＢ１＋　ａ　ｍ　）、
ＡＬ）を使用して蛍光活性化細胞分別により選択した。

Ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１１ｄの抗原特異性は競合結合試
験およびＣＤ、Ｊ６抗体の免疫沈降によって決定した。

Ａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１９、ＩｇＧ１、Ｋ　Ｍ　Ａ　ｌ
］はＭｙ３１ハイブリトーマ細胞系で生産された。Ｍ　
ｙ３１はＣ５７Ｂ　Ｌ　／　６　Ｘ　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　
／　ｃのＦ、マウスをＫＧｌａｆｆ［胞系て免疫するこ
と（コエツフラー（Ｋ　ｏｅｆ　ｆ　Ｉｅｒ）ら、フロ
ート（Ｂ　ｆｏｏｄ）、１９８０年、第６１巻、　１２
２２頁）、免疫牌細胞をＳ　Ｐ　２１０骨髄腫細胞系と
融きすること、及び指定抗原（Ｌｅｕ　　１９）を使っ
て抗原特異性で選択することによって得た。

Ａｎｔ、ｉ　−Ｌｅｕ−４はＳ　Ｋ　７ハイフリドーマ
細胞系によって生産された６ＳＫ７はＢ　Ａ　Ｉ−Ｂ　
／　ｃマウスをヒトの胸腺細胞て免疫すること、免疫牌
細胞をＮ５−１骨髄腫細胞系と融合すること、およびＴ
リンパ球と反応する抗体について選択することによって
得た。

訳読３ｉ町以下に述Ｉ＼る一般的方法を使用して、フルオレセイン
イゾチオシアネ・−１・を抗体に結合させた。

通常、精製した抗体は抗細菌剤としてのアザイド存在下
で保存される３力ツプリンク反応を妨害するアザイトを
除去するなめに、約１ａｇ、−’ｒ１抗体濃度の抗体を
炭酸水素酸／炭酸塩緩衝液１）　Ｉ−１９、０〜９５中
で十分透析した。得られた溶液をよく混ぜ、９０〜９５
の範囲にりＨを保−）ように１〕Ｉ（を制御した。

ＦＩＴＣの原料溶液（ストンクツリュージョン）を新し
て調製した。このＦＩＴＣ溶液は、標識される抗体のミ
リグラム総量および必要とされる蛋白質ミリクラムに対
するＦＩＴＣミリグラムの割きく典型的には］　ＯＯＪ
４　ｙ　７’　１１りＡ１〕）に基′）＜量の蛍光団を
含んでいる。ｒＩＴｃは最初ジメチルスルポキジト（Ｄ
ＭＳＯ＞に溶解した。ここて用いるＤ　Ｍ　Ｓ　Ｏは、
カッブリンク操作で蛋白質溶液に最初に加えるＦ　Ｔ　
Ｔ　Ｃ：溶液中のＤＭＳＯＯ量が容量の５％以下になる
ようにしなければならない。

Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏに溶解したＦＩＴＣを、Ｆ丁ＴＣＲ終濃
度が約１．００μｙＦ　ＩＴＣ／ｘ９Ａｂに達するまて
抗体溶液に撹拌しながら滴下した。

試薬を混合した後、反応管を金属箔てお・うか暗中に保
つかして室温て２時間保温した。２時間後、反応混合物
を脱塩カラムに通して、抗体と結きしていないＦＩＴＣ
から結合抗体を分離した。。

脱塩ゲルには、１×ＰＢＳで室温で平衡化したセファデ
ックスＧ−２５メチイウムを使用した。ゲル容量は、反
応混合物容量の約５〜１０倍とした。

結合した抗体は最初に色のついた帯となって容量する。

この帯をずべて集め、プールした。プールした抗体は光
をさえぎった状態で、それぞれの抗体にあった緩衝液中
で少なくとも１０４倍容量変化するまで透析した。最終
濃度が保存溶液の０１％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓになるように十
分量のＮ　ｎ　Ｎ　３を加えた。

上述の方法を、以下に述べるアッセイに使用するａｎｔ
ｉ−Ｌｅｕ　　４に対して用いた。

フィコエリトリンとモノクローナル抗体の結＆はハルデ
イ−（）ｌａｒｄｙ）が述べている標準的な方法（フロ
ーサイト、メトリーに使用するための蛍光蛋白質の精製
およびカップリンク、「実験免疫学パン１ヘフ・Ｉン」
、第４版、第１巻、第３１章、ヘルゼンヘルク（Ｌ　、
　Ａ　、　ｌ（ｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）他編集、ブラック
ウエルサイエンティフィック（Ｂ　１ａｃｋ…ｅｌｆ　
５ｃｃｎＬｉｆｉｃ）出版、オツクスフォート英国、１
９８６）に従って行なうことかできた。

筬打１コー欠土無作為抽出の正常トナーからのヒト末梢血は血液銀行よ
り調達した。単核細胞は標準技術によるフィコール／ヒ
バク（Ｆ　１ｃｏｌｌ／ｌ−１ｙｐａｑｕｅ）を用いて
単離した。

免疫蛍光を測定し、標準的技術を用いてフローサイ１−
メトリーを行なつｔコ。この方法は、例えは、ラニエル
（Ｌａｎｉｅｒ）ら、ザ・ジャーナル・オフ・イミュ、
ノロジー（Ｊ、　　Ｉ　ｍ＋ｎｕｎｏｌ）１９８３年　
第１３１巻。

１７８９頁およびパークス（Ｆ’ａｒｋｓ）ら、「フロ
ーサイ■・メｌ−リーと蛍光活性化細胞分別（ＦＡ（：
’：Ｓ）Ｊ実験免疫学ハントフック、第４版、ウェール
（Ｗｅｉｒ）ら編、フラソクウエル出版社、ニシンハー
ク、英国、１９８６年に４　ｔ＼られている。

Ｎ　Ｋ細胞からＴ細胞を識別する本発明の第一試薬およ
び第二試薬の能力を、Ｔ細胞およびＮ　Ｋ細胞を検出す
るための慣用的な方法を使用した場合と比較した。本発
明は、Ｔ細胞とＮ　Ｋ細胞との数を数える慣用的な方法
に比べて、さまざまな利点をもつ：１、　ある種のＴ細胞はＬｅｕ−１９を発現するため、
単一にａｎｔｉ−Ｌｅｕ−１９（ＧＰ１６０）試薬のみ
を使用すると、Ｎ　Ｋ細胞の割合を過大評価することに
なる。Ｐ　Ｅ　　ａｎｔｉ−Ｌｅｕ−１９とＦ　Ｉ　Ｔ
　Ｃ、ａｎｔｉＬｅｕ　−４ＣＣＤ　３　）を併用する
ことによって、ＣＤ　３とＪ−ｅｕ−１９の両方を発現
するユニークＴ細胞の同定か可能になり、さらに、ＰＥ
ａｎｔｉＬｅｕ−１９て染色されるがＦ　Ｉ　Ｔ　Ｃａ
ｎｔｉ　−（：　Ｉ）３では染色されないＮ　Ｋ細胞を
より正確に定量することがてきる。

２、　　ＰＥａｎｔｉ−ＣＤ１６（Ｌｅｕ−１１＞試薬
を単一に使用した場合も集団中のＮ　Ｋ細胞の割合を過
大評価する可能性がある。個々の細胞のうち、ある種の
Ｔ細胞はＣＤ１６を発現する。Ｆ’Ｅａｎｔｉ１（！１
１−１１とＦ　Ｉ　ｌ”　Ｃ，ａｎｔｉ−　−Ｌｅｕ−
４との併用によって、ＣＤ３とＩ−ｅ　ｕ　　１］の両
方を発現するユニークＴ細胞び）同定か可能になり、さ
らにＰＥａｎｔ、１−１−、ｅｕ−］］で染色され、Ｆ
　Ｉ　Ｔ　Ｃａｎｔ（”　７）−３では染色されないＮ
　Ｋ細胞をより正確（こ定量する。二とかできる、３　また、Ｐ　ｒｉ：　ａｎｔｉ−−ＣＤ　１６（１−
ｅｕ　−１１）試薬を甲−て使用した場合、集団中のＮ
　Ｋ　ＣＩ胞の割合を過少評価する可能性かある。正常
血液中のＮ　Ｋ　ＩｔＪｌ胞の集団は、ある種の活性化
Ｎ　Ｋ　、ｌ（［１胞と同様に、Ｃ：　Ｄ　１６を発現
しない。しかしながら、これらの（−、〕ＩＩ　］　６
陰性ＮＫＩｔ（ＩＩ胞はＬｅｕ　　１９を発現すること
が示されている。それ故、ＦＩＥ結１ａｎｔｉ−Ｌｅｕ
−ＩＩとＦ’　Ｅａｎｔｉ　−Ｌｅ、ｕ−１９を４．＃
する１ことおよびＦ　Ｉ　Ｔ　Ｃａ＋＋Ｌｉ−ＣＩ）［
）　３と共に混合ｐ　Ｅ結き抗体を用いることによって
、Ｃｒ）１６Ｌｃｕ−］９＋およびＣＤ１６＋、］−ｅ
ｕ−１９１−のＮ　Ｋ細胞の両名゛を含む実質的にずｌ
（てのＮ　Ｋ細胞を同定することがてきる９さらにこび
）新しい試薬の組６わぜを使用することによって、全Ｔ
細胞（ＣＤ　３＋細胞）、ＣＤ１６および／またはＬｅ
ｕ１９を発現するユニークＴ細胞、およびＮ　Ｋ細胞全
体（ＣＤ　３−１Ｌｅｕ−１９モおよび／またはＣＤ１
６＋細胞）を同時に同定し、その数を測定することがで
きる。

４、本発明のこれ以外の主な利点は、Ｎ　Ｋ細胞検出の
感度に関する。正常な組織に存在するＮ　Ｋ細胞の大部
分はＣＤ１６とＬ　ｅｕ　−１，９の両方を発現する。

両方のＰＥ結合抗体を組自わせて使用すると、大部分の
Ｎ　Ｋ細胞の原形質膜上に両方の抗体が結きする結果と
なる。この結果、ＮＫ細胞の大部分はより明るく染色さ
れ、アッセイの感度か良くなる。

本発明の第一試薬（ＦＩＴＣ結＠　ａｎ　Ｌ　ｉ　−１
，、（！１１４　（ＣＤ　１６））および本発明の第二
試薬くＰＥ結ｉ：ａｎｔｉ−Ｌｅｕ−１１（ＣＤ１６）
およびＰ　Ｅ結合のａｎｔｉ　−Ｌｅｕ−１９の混合物
よりなる）で染色した末梢血液単核細胞の例を図に示す
。試料はフローサイトメトリーを用いて分析し、単ＨＩ
ａ胞のリンパ球画分の相関蛍光をカウンター（ｃｏｎｔ
ｏｕｒ）ブロワ１〜て示ず。画面は四象限に分割した。

非染色細胞（非Ｔ細胞、非Ｎ　Ｋ細胞）は左下の象限に
あり、ＮＫ相胞は左上の象限（Ｐ　Ｅａｎｔｉ　−Ｌｅ
ｕｌｌおよび７″またはＬｅｕ−１９で染色されるかＦ
　Ｉ　Ｔ　（：ｕｎｔＩ−Ｌｅｕ−１４ては染色されな
い）にあり、Ｔ４佃胞は右下象限（Ｆ　Ｉ　′ｒＣａｎ
ｔｉ　−Ｌｅｕ４て染色されるがＰＥａｎｔｉ　−Ｌｅ
ｕ−１１あるいはＬｅｕ−１９ては染色されない）にあ
り、ユニークなＬｅｕ−１１および／゛′またはＬｅｕ
−１９陽性Ｔ細胞は右−１−象限（Ｆ　Ｉ　ＴＣとＰＥ
染料の両方に染色される）にある、。

本明Ｉｔ４］ｌ書に記載しかずハ＼ての出版物および特
許出願は、本発明に関係する当業者の技術程度を示して
いる。この中のすへての文献および特許出願は、それぞ
れの個／Ｚの出版物あるいは特許出願が参照によって特
別にかつ個別的に含まれるように、本明細書の範囲に参
照により含まれる。

ここに、本発明を十分に記述することで、本発明は特許
請求の範囲の思想あるいは視点から離れることなくそれ
に多くの改良や修正を加えることができることはこの分
野の普通の技術者にとって明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

図面は、Ｆ’Ｅ　　Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ−１９（ＧＰ１６
０）とト）Ｅ−Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ−１１ｃ（ＣＤ１６）
で標識した細胞の蛍光に対するＦ　Ｉ　ＴＣ−ＡｎＬｉ
−Ｌｅｕ−４，（Ｃ，Ｉ）　３）で標識した細胞の蛍光
を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１、リンパ球を含む試料をａｎｔｉ−ＣＤ３および第一
検出用標識からなる第一試薬、ならびに第二検出用標識
で両方とも標識されたａｎｔｉ−ＣＤ１６およびａｎｔ
ｉ−ＧＰ１６０の混合物からなる第二試薬と接触させる
こと；および前記第一試薬と反応する細胞がＴリンパ球と同定され、
および前記第二試薬と反応するが前記第一試薬とは反応
しない細胞がＮＫ細胞と同定される、前記試薬と反応す
る細胞を、同定すること；からなるＮＫ細胞とＴリンパ
球を識別する方法。２、前記第一試薬と前記第二試薬の両方と反応する細胞
を、主要組織適合複合体非制限の細胞溶解を媒介する細
胞からなるＴリンパ球のサブセットと同定する、請求項
１記載の方法。３、前記第一検出用標識が蛍光標識であり、且つ前記第
二検出用標識が前記第一検出用標識の標識と識別可能な
放出スペクトルを持つ異なった蛍光標識である、請求項
１記載の方法。４、前記同定がフローサイトメーターの使用により前記
細胞を電子的に検出することからなる、請求項３記載の
方法。５、試料が血液、赤血球を除去した全血液、全血液の単
核細胞画分、胸腺組織、リンパ節組織および脾臓組織と
いったような固体リンパ様組織、骨髄細胞または腫瘍に
浸潤するリンパ線細胞からなる、請求項１記載の方法。６、同一の第一検出用標識で標識したａｎｔｉ−ＣＤ１
６およびａｎｔｉ−ＧＰ１６０からなる試薬混合物。７、前記混合物が、前記第一検出用標識とは識別可能な
第二検出用標識で標識されているａｎｔｉ−ＣＤ３から
なる、請求項６記載の試薬混合物。８、前記検出用標識が蛍光団である、請求項７記載の試
薬混合物。９、前記検出用標識がフルオレセインおよびフィコエリ
トリンである、請求項８記載の試薬混合物。１０、前記ａｎｔｉ−ＣＤ１６がモノクローナルａｎｔ
ｉ−Ｌｅｕ−１１であり、前記ａｎｔｉ−ＧＰ１６０が
ａｎｔｉ−Ｌｅｕ−１９であり、且つａｎｔｉ−ＣＤ３
がａｎｔｉ−Ｌｅｕ−４である、請求項６記載の試薬混
合物。