JP2644029B2 - Ｎｋ細胞および細胞障害性ｔリンパ球の同定 - Google Patents

Ｎｋ細胞および細胞障害性ｔリンパ球の同定

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫学および細胞分析の分野に関し、特にヒ
ト−リンパ球のクラス間の識別をするための技術を目的
としている。
（従来の技術） リンパ球は白血球（白血細胞）のサブセットである。
リンパ球集団の中には、自己由来の悪性細胞、自己由来
のウイルス感染細胞、および非自己由来の細胞を含む他
の細胞を溶解しうる異なる細胞型が少なくとも２種類同
定されている。これら２種類の主要細胞障害性リンパ球
とは、細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）およびナチュラル
キラー（NK）細胞である。
CTLを含むすべてのＴリンパ球は、原形質膜上および
／または細胞質内に、種々のＴ細胞亜型と関連する多数
の他の抗原と共にCD3と呼ばれる抗原を持つ。CD3は、Ｔ
細胞抗原受容体（即ち抗原認識反応のための構造）と非
共有結合で結合する少なくとも３種類の20〜30KDの蛋白
質で構成される。anti−Leu−４モノクローナル抗体
（ベクトン・ディキンソン・モノクローナル・センター
株式会社（Becton Dickinson Monoclonal Canter、In
c）より入手可能）を含む多数のCD3に対する抗体が作ら
れている。もし標的細胞が同系主要組織適合（MNC）抗
原を発現するならば、大多数のCTLは標的細胞を溶解す
る。それゆえ、そのような細胞はMHC制限を受ける。
大多数のNK細胞は、CD3抗原又はＴ細胞抗体受容体の
どちらかを発現しない（ラニエル（Lanier）ら、ザ・ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｊ．Immunol．）198
6年．第137巻、2735頁参照）という点で、NK細胞はＴリ
ンパ球と異なる。また、NK細胞はある種の腫瘍細胞およ
びウイルス感染細胞を溶解しうるが、MHC制限ではな
い。
Ｔ細胞がanti−CD3抗体との反応性によって容易に同
定できるのに対して、単一の標識試薬を使ってNK細胞を
同定あるいはその数をカウントする簡単で感度の良い方
法はない。大多数のNK細胞はCD16抗原を発現することが
よく知られている。CD16はIgG受容体と結合する50〜70K
Dの糖蛋白質である。anti−Leu−11a、VEP13、B73.1、L
23およびその他の多数の抗体がCD16に対して調整されて
いる。（ラニエル（Lamier）ら、ザ・ジャーナル・オブ
・イミュノロジー（Ｊ．Immunol．）1983年、第131巻、
1789頁；ペルシア（Perussia）ら、ザ・ジャーナル・オ
ブ・イミュノロジー、1983年、第130巻、2133頁；ペル
シアら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジー、1983
年．第130巻、2142頁；ラムポンド（Rumpold）ら、ザ・
ジャーナル・オブ・イミュノロジー、1982年．第129巻.
1458頁；ラニエルら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノ
ロジー、1986年．第136巻.4480頁）。しかしながら、CD
16はすべてのNK細胞で検出されることはなく、特に、培
養によって活性化されたNK細胞では検出されないことが
示されている。さらに、ある環境においてはCD16はＴリ
ンパ球上で発現する（ラニエルら、ザ・ジャーナル・オ
ブ・エキスペリメンタル・メディシン（（Ｊ．Exp．Me
d．）、1985年．第162巻.2089頁）。大多数のNK細胞
は、原形質膜上にanti−Leu−19モノクローナル抗体に
よって同定される別の糖蛋白質を発現する。このanti−
Leu−19モノクローナル抗体は、ベクトル・ディキンソ
ン・モノクローナル・センター株式会社より商品として
入手可能である。anti−Leu−19は、NKH−１モノクロー
ナル抗体によっても認識される約160KDの糖蛋白質（GP1
60）を認識する（ラニエルら、ザ・ジャーナル・オブ・
イミュノロジー、1986年．第136巻.4480頁）。しかしな
がら、anti−Leu−19およびNHK−１共にNK細胞とのみ反
応するのではなく、他の非リンパ球細胞型とも反応する
（ラニエルら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジ
ー、1987年．第138巻.2019頁）。また、anti−Leu−19
はＴリンパ球のユニークな副サブセットとも反応し、少
なくともサブセットのあるものはMHC制限なしに死ぬ
（ラニエルら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジ
ー、1986年．第136巻.4480頁）。結局、anti−Leu−19
によって認識されるNK細胞の原形質膜上の抗原量は時と
して低く、そのことが血流あるいは他の組織といったよ
うな混合細胞集団の中からNK細胞の数を正確に同定し、
数えることを困難にしている。
最近、インヒボでのインターロイキン−２（IL−２）
薬物療法とインビトロでIL−２で活性化した患者の自己
由来リンパ球の投与とを併用する新しい癌治療方法が開
発された。この治療法をリンホカイン活性化キラー（LA
K）細胞およびIL−２治療と呼ぶこともある（ローゼン
ベルグ（Rosenberg）ら、ザ・ニューイングランド・ジ
ャーナル・オブ・メディジン（Ｎ．Eng．Ｊ．Med．）、
1985年．第313巻.1485頁）。細胞障害性エフェクター細
胞が主要NK細胞であることは明らかである（フィリップ
ス（Phillips）およびラニエル（Lanier）、ザ・ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディジン（Ｊ．Ex
p．Med．）、1986年．第164巻.814頁）。このように、
このタイプの治療では、免疫システムの活性化あるいは
抑制の評価のための他の医療的状況と同様に、NK細胞や
Ｔリンパ球のレベルを同定し、その数を数え、監視する
方法が明からに必要である。
本研究より以前には、単一アッセイを使ってNK細胞と
Ｔリンパ球を明確にかつ同時に同定することは不可能で
あった。従って、NK細胞とＴ細胞とを単純な技術で、そ
して好適な実施態様においては自動化可能な技術で識別
する必要性が残される。
（発明の構成） 本発明はNK細胞と細胞障害性Ｔリンパ球を識別する方
法を提供する。その方法は、anti−CD3および第一検出
用標識からなる第一試薬並びに第二検出用標識で両方と
も標識したanti−CD16およびanti−GP160の混合物から
なる第二試薬をリンパ球を含有する試料と接触させるこ
と、および第二試薬と反応する細胞から第一試薬と反応
する細胞群を識別することからなり、それによって第一
試薬とのみ反応する細胞をＴリンパ球と同定し、第二試
薬とのみ反応する細胞をNK細胞と同定する。両試薬と反
応するリンパ球はＴリンパ球のユニーク副集団と同定さ
れ、副集団のあるものはMHCに制限されない細胞溶解と
媒介することができる。好適な実施態様では、二つの試
薬は異なる蛍光団と結合しており、細胞は顕微鏡あるい
はフローサイトメトリーで検出される。
本発明は特定の実施態様である以下の詳細な記載を参
考にし、本明細書の一部を形成する図面を合わせて考慮
るることによって、より良く理解されるであろう。
図面は、PE−anti−Leu−19（GP160）とPE−anti−Le
u−11c（CD16）で標識した細胞の蛍光に対するFITC−an
ti−Leu−４（CD3）で標識した細胞の蛍光を示すグラフ
である。
本発明によって、NK細胞と細胞障害性Ｔ細胞とを互い
に細胞表面抗原に基づいて識別することができる。これ
らの細胞表面抗原は、これらの抗原に対して特異的な標
識化抗体の細胞表面に結合する能力によって認識され
る。リンパ球を含有する細胞群の未知の混合物を本発明
の試薬混合物と接触させると、二つの試薬が細胞と結合
する方法の違いによって、Ｔリンパ球、NK細胞およびあ
る種の他の細胞集団を認識することができる。第一試薬
はanti−CD3からなり、一方第二試薬は抗体（anti−CD1
6およびanti−GP160）の混合物からなる。二種類の試薬
を区別するために、これら二種類の試薬を異なる検出用
標識で標識する。第一試薬と反応する細胞をＴリンパ球
と同定し、第二試薬とのみ反応する細胞をNK細胞と同定
し、そして両方の試薬と反応する細胞をＴリンパ球のサ
ブセットと同定する。このサブセットのあるものは、MH
Cに制限されない細胞障害性機能を媒介する。
リンパ球およびNK細胞の細胞表面抗原は数種の命名体
系を用いて同定されている。例えば、この明細書でLeu
−４と同定されている抗原は、分化抗原に対するCD命名
法によればCD3抗原として知られている。同様に、Leu−
11抗原はCD16として知られている。anti−Leu−19とし
て認知されている抗原とCDクラスター抗原との関連につ
いては確立されていないが、Leu−19抗原はNKH−１抗体
によって同定されている抗原と同一であると考えられて
いる。本出願の目的に従って、この第三の抗原性物質を
GP160と名付ける。このCDおよびGP160の名称は抗原全体
に関連し、Leuの名称より一般的に用いられる。このLeu
の名称は、抗原上の特異な決定基を認識する一連のモノ
クローナル抗体に由来するものである。本発明の説明中
のある例においては、Leu名称に参照を付ける場合もあ
るが、他の場合はより一般的なCDおよびGP160名称を用
いる。一般的な名称を意味するか、特定の名称を意味す
るか、前後関係より明らかになる場合もあるが、多くの
場合、二つの用語は交換できるように使われる。
Leuシステム命名法は、細胞表面に存在する個々の抗
原と特異的に反応するモノクローナル抗体の使用から生
まれた。Auti−Leu−４はCD3と反応し、このCD3は少な
くとも３種類の20〜30KDの蛋白質複合体である（カン
（Kan）ら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジー、1
983年．第131巻.536頁；ボルスト（Borst）ら、ザ・ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー、1982年．第128巻.15
60頁）。CD16はNK細胞および好中球に存在するIgGに対
するFc受容体と結合する50,000〜70,000ダルトンの蛋白
質である。抗原およびその反応性に関する詳細な論文と
としては、例えば、ラニエルら、ザ・ジャーナル・オブ
・イミュノロジー、1983年．第131巻.1789頁；ペルッシ
ア（Perussia）ら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロ
ジー、1983年．第130巻.2133頁；ペルッシアら、ザ・ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー、1983年．第130巻.21
42頁；ラムポルド（Rumpold）ら、ザ・ジャーナル・オ
ブ・イミュノロジー、1982年．第129巻.1458頁；および
ペルッシアら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジ
ー、1984年．第133巻.180頁を参照されない。Auti−Leu
−19を認識する抗原であるGP160は、約160,000ダルトン
の分子量をもつ糖蛋白質であるが、その機能は未知であ
る。これらの性質および反応性に関する詳細な記述は、
例えば、ラニエルら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノ
ロジー、1986年．第136巻.4480頁；グリッフィン（Grif
fin）ら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジー、198
3年．第130巻.2947頁；およびヘルシエンド（Hercen
d）、ザ・ジャーナル・オブ・クリニカルインベスティ
ゲイション（Ｊ．Clin．Invest．）、1985年．第75巻.9
32頁を参照されたい。GP160には、まだ世界健康機構の
白血球分化抗原ワークショップ委員会によってCD名が与
えられていない。前報告では分子量を大きく評価した
が、より最近の研究では、相対移動度よりおよそ160,00
0KDであることがわかっている。
本発明の実施に有用なモノクローナル抗体は、以下に
述べる標準的な技術によって調製される。Auti−Leu−1
1は、マウスをヒト末梢血液、低遊離密度リンパ球、あ
るいは顆粒細胞で免疫すること、および免疫脾細胞を骨
髄腫細胞系と融合することによって調製することができ
る。その結果得られたハイブリドーマのLeu−11に対す
る抗原特異性は、競合結合試験およびCD16抗原の免疫沈
降によって決定することができる。Auti−Leu−19はマ
ウスをKG1a細胞系で免疫すること（コエッフラー（Koef
fler）ら、ブルード（Blood）、1980年．第61巻.1222
頁）、免疫脾細胞を骨髄腫細胞系と融合すること、およ
びNKH−１抗原と反応する抗体を生産する細胞を選択す
ることによって、同様の方法で調製される。Auti−Leu
−４は、マウスをヒト胸腺細胞あるいは末梢Ｔリンパ球
で免疫すること、免疫脾細胞を骨髄腫細胞系と融合する
こと、およびCD3と反応する抗体を生産する細胞を選択
することによって調製される。抗原特異性は、競合結合
試験およびCD3抗原との免疫沈降によって決定すること
ができる（ベベルレイ（Beverley）およびカルラード
（Callard）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミ
ュノロジー（Eur．Ｊ．Immunol．）、1981年．第11巻.3
29頁；クング（Kung）ら、サイエンス（Science）、197
9年．第206巻.347頁）。
ここに示す特異的モノクローナル抗体あるいはそれと
同等のものは、本発明の実施において用いることができ
る。モノクローナル抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG（ヒト
ではサブクラス１−4;ネズミでは１、2a、2b、３）ある
いはIgMを含む抗体のクラスあるいはサブクラスのいず
れかに属する。Fab、Ｆ（ab′）２もしくはその類似物
のような抗体の活性な結合フラグメントを使用すること
ができる。モノクローナル抗体は、抗体サブユニットあ
るいはFvをコードするＢ−リンパ球遺伝子の不滅化を提
供するいかなる慣用的手段、例えば感作リンパ球と骨髄
腫融合パートナーとの間の融合；形質転換、たとえばEB
Vによる形質転換；あるいは他の不滅化技術；によって
調製することができる。別法として、遺伝子を抗体を発
現するリンパ球宿主細胞から分離し、既知の遺伝子工学
技術によって発現させるためにより便利な宿主に移入す
ることもできる。
抗体は手近にいる脊髄動物、例えばげっ歯動物（例え
ばマウス、ラット）、霊長類（例えばヒト）、うさぎ
類、牛、羊、馬、豚等、より得ることができる。時には
既知の技術に従って、宿主の脾臓あるいは他組織の細胞
を骨髄腫細胞と融合すること、又は細胞を不滅化するた
めに脾臓細胞を適切な形質転換ベクターを用いて形質転
換することによって抗体を調製する。細胞を選択培地で
培養し、目的とする抗原と結合する抗体を選択するため
にスクリーニングする。
診断アッセイのために、抗体を標準的な技術で標識化
する。検出可能なシグナルを提供する標識として、多種
類の標識が知られている。標識の例としてラジオアイソ
トープ、例えば3H、125I、131Iおよび14C;蛍光団、例え
ばフルオレセイン、フィコビリ蛋白質、希上類のキレー
ト、およびローダミン；酵素の基質および阻害剤；西洋
わさびのペルオキシダーゼ、グルコールオキシダーゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼといっ
た酵素；又は粒子、例えばデキストラン、アガロース、
金属粒子、炭素、磁気粒子、あるいはポリスチレン粒
子；がある。蛋白質との結合標識の方法は、文献に多く
記載されている（例えば、合衆国特許第3,817,837号、
第4,134,792号、および第4,220,722号を参照された
い）。
用いる標識化方法は、慣用の技術に従って行ない、ま
た抗体あたりの標識数は標識の性質、希望するシグナル
の感度等に応じて変化させる。多種多様な分析物を検出
するために抗体と共に使用する多数の分析方法が開発さ
れており、ここでそれらを適用することができる。例え
ば、合衆国特許第3,791,932号、第3,817,837号、第4,13
4,792号、第4,174,384号、第4,275,149号、および第4,2
99,916号を参照されたい。これらは参照により本明細書
に含まれる。
本発明の方法で使用する第一標識および第二標識とし
て二種類の異なる蛍光標識を用いることが特に好まし
い。異なる蛍光標識の使用は自動化された装置を用いた
のフローサイトメトリーによる容易な検出や細胞の識別
を可能にする。蛍光標識の好適な組合わせは、フルオレ
セイン（イソチオシアネートで結合させる（FITC）とフ
イコエリトリン（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピ
リジンジチオ）プロピオン酸塩（SPDP）で抗体と結合す
る）である。蛍光団を抗体に付けるために、これ以外の
適切なクロスリンカーやカップリング技術を用いること
もできる。フルオレセインとフィコエリトリンは、一方
をanti−Leu−４の標識として使用し、かつ他方をanti
−Leu−11とanti−Leu−19両方の標識として使用する限
りにおいてはどちらを第一検出用標識として用いても、
第二検出用標識として用いてもよい。
標識試薬ができると、標識試薬をリンパ球と接触させ
る。リンパ球の型は、抗体結合を行なうことのできる反
応媒体中で決定される。一般的に、反応媒体は細胞の懸
濁液であり、個々の細胞型を分析するために、溶液のパ
ラメータ（例えば温度pHおよび容量モル浸透圧濃度）を
生理学上許容できる範囲に維持するための緩衝液を含ん
でいる。
Ｔリンパ球およびNK細胞は二種類の試薬との結合能力
によって識別される。anti−Leu−11および／またはant
i−Leu−19とも反応するかしないかにかかわらず、anti
−Leu−４と反応する細胞はすべてＴリンパ球と同定さ
れる。
試薬１のanti−Leu−４および試薬２のanti−Leu−19
あるいはanti−Leu−11の両方と反応する細胞はＴリン
パ球のサブセットを形成し、この中のある種のサブセッ
トはMHCに制限されない細胞障害性機能を媒介する。試
薬２のanti−Leu−11および／またはanti−Leu−19と反
応し、試薬１のanti−Leu−４とは反応しないリンパ球
様細胞をNK細胞と同定する。
二種類の細胞型の違いを検出するために使われる方法
は、使用される標識のタイプにより当然異なる。例えば
異なる放射性標識は差異放射線検出器（例えば放射スペ
クトルを基準として同位体を識別する能力をもつガンマ
線計測装置）を使用することによって識別することがで
きる。蛍光標識は細胞を検出可能にし、さらに必要であ
ればフローサイトメトリーを使って細胞を自動的に識別
することを可能にするので、二種類の異なる蛍光標識を
使用することは特に好ましい。蛍光活性化細胞選別器
（FACS）は商品として入手可能なフローサイトメーター
であり、上述の方法で標識した細胞を識別することがで
きる。
ある場合、異なる細胞の検出の目的は診断であること
もある。例えば、新しい癌治療の方法が開発されたが、
この治療方法はインビホでのインターロイキン２（IL−
２）薬物治療およびインビトロでIL−２で活性化した患
者の自己由来リンパ球を再注入することとの併用からな
り、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞およびIL−
２治療と呼ばれる（ローゼンバーグ（Rosenberg）ら、
エヌ・エング・ジョイ・メド（N.Eng.J.Med.）（1985）
313:1485）。細胞障害性エフェクター細胞は主にNK細胞
であることは明らかである。（フィリップスおよびラニ
エル、ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メ
ディシン、1986年．第164間.814頁）。このように、こ
の種の治療では、NK細胞およびＴリンパ球のレベルを同
定し、定量し、監視する方法が明らかに必要である。こ
の場合、本発明による単純なアッセイ方法を用いると好
都合であることは明らかである。FITC anti−CD3と共に
PE結合anti−CD16およびanti−GP160の両方を組合わせ
て使用することによって、本発明は、PE染料で染色され
るがFITC染料では染色されない実質的にすべてのNK細胞
を同定することを可能にする。また、本発明はFITCで染
色されるがPEでは染色されない細胞として同定されるＴ
リンパ球の同定と、（１）CD3ならび（２）CD16および
／またはGP160の両方と結合するユニークＴ細胞の同定
を同時に行なうことができる。後者はMHCに制限されな
い細胞障害性を媒介するＴ細胞の集団を含んでいる。ま
た、本発明は患者の免疫状態を決定するのに有用であ
り、NK細胞とＴ細胞の総数および百分率を同時に決定す
ることができる。得られた値を正常値と比較することに
よって、ある種の病状においてこれらの細胞型の割合あ
るいは絶対数が正常か異常であるかを決定することがで
きる。本アッセイの他の応用としては、（１）CD3と
（２）CD16および／またはGP160を発現するユニークＴ
細胞集団が正常値以上に明らかに増加するリンパ球増殖
障害を検出できる可能性がある（レイノルド（Reynold
s）およびフーン（Foon）、ブロード（Blood）、1984
年．第64巻.1146頁） 以上、本発明を一般的に述べてきたが、本発明は次の
実施例を参照することによってより良く理解をされるで
あろう。また次の実施例は例示を目的とするものであっ
て、特定されていないことを理由に本発明を限定するも
のではない。
実施例１ モノクローナル抗体の調製 Anti−Leu−11dモノクローナル抗体（MAb）はL23とし
て同定されるハイブリドーマ細胞系で生産された。L23
は、BALB/cマウスをヒト末梢血低浮遊密度リンパ球で免
疫するとおよび、免疫脾細胞をSP2/0骨髄腫細胞系と融
合することによって得た。L23ハイブリドーマは、IgG
1、KMAbを生産する。L23bと命名されたIgG2aアイソタイ
プ−スイッチ変異型は、フルオレセインイソチオシアネ
ート（FITC）結合のヤギ抗マウスIgG2a特異的抗血清
（サザンバイオテック（Southern Biotech）、バーミン
ガム（Birmingham）、AL）を使用して蛍光活性化細胞分
別により選択した、Anti−Leu−11dの抗原特異性は競合
結合試験およびCD16抗体の免疫沈降によって決定した。
Anti−Leu−19、IgG1、KMAbはMy31ハイブリドーマ細
胞系で生産された。My31はC57BL/6×BALB/cのF1マウス
をKG1a細胞系で免疫すること（コエッフラー（Koeffle
r）ら、ブロード（Blood）、1980年．第61巻.1222
頁）、免疫脾細胞をSP2/0骨髄腫細胞系と融合するこ
と、及び指定抗原（Leu−19）を使って抗原特異性で選
択することによって得た。
Auti−Leu−４はSK7ハイブリドーマ細胞系によって生
産された。SK7はBALB/cマイスをヒトの胸腺細胞で免疫
すること、免疫脾細胞をNS−１骨髄腫細胞系と融合する
こと、およびＴリンパ球と反応する抗体について選択す
ることによって得た。
蛍光標識付 以下に述べる一般的方法を使用して、フルオレセイン
イソチオシアネートを抗体に結合させた。
通常、精製した抗体は抗細胞剤としてのアザイド存在
下で保存される。カツプリング反応を妨害するアザイド
を除去するために、約1mg/ml抗体濃度の抗体を炭酸水素
酸／炭酸塩緩衝液pH9.0〜9.5中で十分透析した。得られ
た溶液をよく混ぜ、9.0〜9.5の範囲にpHを保つようにpH
を制御した。FITCの原料溶液（ストックソリューショ
ン）を新しく調製した。このFITC溶液は、標識される抗
体のミリグラム総量および必要とされる蛋白質ミリグラ
ムに対するFITCミリグラムの割合（典型的には100μg/m
gAb）に基づく量の蛍光団を含んでいる。FITCは最初ジ
メチルスルホキシド（DMSO）に溶解した。ここで用いる
DMSOは、カップリング操作で蛋白質溶液に最初に加える
FITC溶液中のDMSOの量が容量の５％以下になるようにし
なければならない。
DMSOに溶解したFITCを、FITC最終濃度が約100μgFITC
/mgAbに達するまで抗体溶液に攪拌しながら滴下した。
試薬を混合した後、反応管を金属箔でおゝうか暗中に
保つかして室温で２時間保温した。２時間後、反応混合
物を脱塩カラムに通して、抗体と結合していないFITCか
ら結合抗体を分離した。脱塩ゲルには、１×PBSで室温
で平衡化したセファデックスＧ−25メディウムを使用し
た。ゲル容量は、反応混合物容量の約５〜10倍とした。
係合した抗体は最初に色のついた帯となって容出す
る。この帯をすべて集め、プールした。プールした抗体
は光をさえぎった状態で、それぞれの抗体にあった緩衝
液中で少なくとも104倍容量変化するまで透析した。最
終濃度が保存溶液の0.1％NaN3になるように十分量のNaN
3を加えた。
上述の方法を、以下に述べるアッセイに使用するanti
−Leu−４に対して用いた。
フィコエリトリンとモノクローナル抗体の結合はハル
ディー（Hardy）が述べている標準的な方法（フローサ
イトメトリーに使用するための蛍光蛋白質の精製および
カップリング、「実験免疫学ハンドブック」、第４版、
第１巻、第31章、ヘルゼンベルグ（L.A.Herzenberg）他
編集、ブラックウエルサイエンティフィック（Blackwel
l Scientific）出版、オックスフォード英国、1986）に
従って行なうことができた。
試料アッセイ 無作為抽出の正常ドナーからのヒト末梢血は血液銀行
より調達した。単核細胞は標準技術によるフィコール／
ヒパク（Ficoll/Hypaque）を用いて単離した。
免疫蛍光を測定し、標準的技術を用いてフローサイト
メトリーを行なった。この方法は、例えば、ラニエル
（Lanier）ら、ザ・ジャーナル・オブ・イミュノロジー
（Ｊ．Immunol）1983年、第131巻.1789頁およびパーク
ス（Parks）ら、「フローサイトメトリーと蛍光活性化
細胞分別（FACS）」実験免疫学ハンドブック、第４版、
ウェール（Weir）ら編、ブラックウェル出版社、エジン
バーク、英国、1986年に述べられている。
NK細胞からＴ細胞を識別する本発明の第一試薬および
第二試薬の能力を、Ｔ細胞およびNK細胞を検出するため
の慣用的な方法を使用した場合と比較した。本発明は、
Ｔ細胞とNK細胞との数を数える慣用的な方法に比べて、
さまざまな利点をもつ： 1. ある腫のＴ細胞はLeu−19を発現するため、単一にa
nti−Leu−19（GP160）試薬のみを使用すると、NK細胞
の割合を過大評価することになる。PE anti−Leu−19と
FITC anti−Leu−４（CD3）を併用することによって、C
D3とLeu−19の両方を発現するユニークＴ細胞の同定が
可能になり、さらに、PE anti−Leu−19で染色されるが
FITC anti−CD3では染色されないNK細胞をより正確に定
量することができる。
2. PE anti−CD16（Leu−11）試薬を単一に使用した場
合も集団中のNK細胞の割合を過大評価する可能性があ
る。個々の細胞のうち、ある種のＴ細胞はCD16を発現す
る。PE anti−Leu−11とFITC anti−Leu−４との併用に
よって、CD3とLeu−11の両方を発現するユニークＴ細胞
の同定が可能になり、さらにPE anti−Leu−11で染色さ
れ、FITC anti−CD−３では染色されないNK細胞をより
正確に定量することができる。
3. また、PE anti−CD16（Leu−11）試薬を単一で使用
した場合、集団中のNK細胞の割合を過少評価する可能性
がある。正常血液中のNK細胞の集団は、ある種の活性化
NK細胞と同様に、CD16を発現しない。しかしながら、こ
れのCD16陰性NK細胞はLeu−19を発現することが示され
ている。それ故、PE結合anti−Leu−11とPE anti−Leu
−19を混合することおよびFITC anti−CD3と共に混合PE
結合抗体を用いることによって、CD16−、Leu-19＋およ
びCD16＋、Leu-19＋のNK細胞の両者を含む実質的にすべ
てのNK細胞を同定することができる。さらにこの新しい
試薬の組合わせを使用することによって、全Ｔ細胞（CD
3+細胞）、CD16および／またはLeu19を発現するユニー
クＴ細胞、およびNK細胞全体（CD3−、Leu-19＋および
／またはCD16＋細胞）を同時に同定し、その数を測定す
ることができる。
4. 本発明のこれ以外の主な利点は、NK細胞検出の感度
に関する。正常な組織に存在するNK細胞の大部分はCD16
とLeu−19の両方を発現する。両方のPE結合抗体を組合
わせて使用すると、大部分のNK細胞の原形質膜上に両方
の抗体が結合する結果となる。この結果、NK細胞の大部
分はより明るく染色され、アッセイの感度が良くなる。
本発明の第一試薬（FITC結合anti−Leu−４（CD1
6））および本発明の第二試薬（PE結合anti−Leu−11
（CD16）およびPE結合のanti−Leu−19の混合物よりな
る）で染色した末梢血液単核細胞の例を図に示す。試料
はフローサイトメトリーを用いて分析し、単細細胞のリ
ンパ球画分の相関蛍光をカウンター（contour）プロッ
トで示す。画面は四象限に分割した。非染色細胞（非Ｔ
細胞、非NK細胞）は左下の象限にあり、NK細胞は左上の
象限（PE anti−Leu−11および／またはLeu−19で染色
されるがFITC anti−Leu−４では染色されない）にあ
り、Ｔ細胞は右下象限（FITC anti−Leu−４で染色され
るがPE anti−Leu−11あるいはLeu−19では染色されな
い）にあり、ユニークなLeu−11および／またはLeu−19
陽性Ｔ細胞は右上象限（FITCとPE染料の両方に染色され
る）にある。
本明細書に記載したすべての出版物および特許出願
は、本明細書に関係する当業者の技術程度を示してい
る。この中のすべての文献および特許出願は、それぞれ
の個々の出版物あるいは特許出願が参照によって特別に
かつ個別的に含まれるように、本明細書の範囲に参照に
より含まれる。
ここに、本発明を十分に記述することで、本発明は特
許請求の範囲の思想あるいは視点から離れることなくそ
れに多くの改良や修正を加えることができることはこの
分野の普通の技術者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図面は、PE−Anti−Leu−19（GP160）とPE−Anti−Leu
−11c（CD16）で標識した細胞の蛍光に対するFITC−Ant
i−Leu−４（CD3）で標識した細胞の蛍光を示すグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジョセフ・エッチ・フィリップス アメリカ合衆国カリフォルニア州94403, サン・マテオ，アルマデン・ウェイ 305 (72)発明者 アン・エル・ジャクソン アメリカ合衆国カリフォルニア州94086, サニーヴェール，ヘンダーソン・アベニ ュー 900 ナンバー 33 (56)参考文献 特開 昭61−195358（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−76666（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−274260（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−16872（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リンパ球を含む試料をanti−CD3および第
    一検出用標識からなる第一試薬、ならびに第二検出用標
    識で両方とも標識されたanti−CD16およびanti−GP160
    の混合物からなる第二試薬と接触させ；そして 前記第一試薬と反応する細胞をＴリンパ球と同定し、そ
    して前記第二試薬と反応するが前記第一試薬とは反応し
    ない細胞をNK細胞と同定する、 ことを含むNK細胞とＴリンパ球を識別する方法。
  2. 【請求項２】前記第一試薬と前記第二試薬の両方と反応
    する細胞を、主要組織適合複合体非制限の細胞溶解を媒
    介する細胞からなるＴリンパ球のサブセットと同定す
    る、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】前記第一検出用標識が蛍光標識であり、且
    つ前記第二検出用標識が前記第一検出用標識の標識と識
    別可能な放出スペクトルを持つ異なった蛍光標識であ
    る、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】前記同定がフローサイトメーターの使用に
    より前記細胞を電子的に検出することを含む、請求項３
    記載の方法。
  5. 【請求項５】試料が血液、赤血球を除去した全血液、全
    血液の単核細胞画分、胸腺組織、リンパ節組織および脾
    臓組織といったような固体リンパ様組織、骨髄細胞また
    は腫瘍に浸潤するリンパ腺細胞を含む、請求項１記載の
    方法。
  6. 【請求項６】同一の第一検出用標識で標識したanti−CD
    16およびanti−GP160を含む試薬混合物。
  7. 【請求項７】前記混合物が、前記第一検出用標識とは識
    別可能な第二検出用標識で標識されているanti−CD3を
    さらに含む、請求項６記載の試薬混合物。
  8. 【請求項８】前記検出用標識が蛍光団である、請求項７
    記載の試薬混合物。
  9. 【請求項９】前記検出用標識がフルオレセインおよびフ
    ィコエリトリンである、請求項８記載の試薬混合物。
  10. 【請求項１０】前記anti−CD16がモノクローナルanti−
    Leu−11であり、前記anti−GP160がモノクローナルanti
    −Leu−19であり、且つ前記anti−CD3がモノクローナル
    anti−Leu−４である、請求項７記載の試薬混合物。
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