JPH09503582A - 固形非リンパ性腫瘍およびその転移の診断、予測および治療方法 - Google Patents

固形非リンパ性腫瘍およびその転移の診断、予測および治療方法

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JPH09503582A
JPH09503582A JP7508772A JP50877295A JPH09503582A JP H09503582 A JPH09503582 A JP H09503582A JP 7508772 A JP7508772 A JP 7508772A JP 50877295 A JP50877295 A JP 50877295A JP H09503582 A JPH09503582 A JP H09503582A
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Abstract

(57)【要約】 この発明は、固形非リンパ性腫瘍における細胞関連インターロイキン−２レセプターα(IL-2Rα)の発現の測定、並びにこの測定を腫瘍の転移ポテンシャルの予測、非リンパ性腫瘍の転移位置の診断、および非リンパ性腫瘍の転移細胞に対する抗がん治療の効力のモニターの補助に使用することに向けられる。非リンパ性腫瘍の転移細胞に対する抗がん治療を細胞が発達する転移予測域に直接的中させる方法を提供する。この方法は抗がん治療に使用される複合剤の標的としてIL−2Rαを用いる。この発明はまた非リンパ性腫瘍に対する抗がん治療の効力のモニターにおいてＴ細胞レセプター（腫瘍特異的TCRβイディオタイプ）を使用すること、および、これら腫瘍に対する抗がん治療に使用される複合剤の標的として腫瘍特異的TCRβイディオタイプを使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 固形非リンパ性腫瘍およびその転移の診断、予測および治療方法 発明の分野 本発明は、非リンパ性腫瘍(non-lymphoid tumors)の転移の確率(probability of metastasis)(転移ポテンシャル：metastatic po-tential)とインターロイキ ン−２レセプターアルファ(Interleukin-2receptor alpha: IL−2Rα)の発現(ex pression)の相関関係を含む新規な方法に関するもので、腫瘍細胞によって発現 されたIL−2Rαの測定を、転移の予後ないし予測(prognosis)の確立、転移位置 診断の補助、転移予測域における標的治療処置(target therapeutic treatment) 、および、腫瘍、特に転移腫瘍細胞または高い転移確率をもつ腫瘍細胞の治療処 置の効力のモニターに使用できる。本発明は、また、Ｔ細胞レセプターβ鎖（T- cell receptor β chain:TCRβ）またはその腫瘍特異的変異体の固形非リンパ性 腫瘍による発現、治療処置を目標付ける方法、およびこれらの腫瘍の治療処置の 効力をモニターする方法に関する。 発明の背景 １．転移 転移(metastasis)とは、悪性腫瘍がその原発ないし一次腫瘍から離れた二次的 部位に広がることである。転移は次の理由によりがんの臨床医に悪性腫瘍の診断 と治療における困難を提起する。（ａ）転移は１個または数個の少ない細胞から なり、近代的技術をもってしても臨床診断を逃れる。（ｂ）患者が悪性非リンパ 性腫瘍と診断されたときには、しばしばすでに転移が行われてしまっている(Sil verberg et al.，1989，CACancer J．Clin．39: 3-21)。（ｃ）処置は原発性腫 瘍の単純な外科的切除よりも複雑である。（ｄ）腎細胞がんのような転移性非リ ンパ性腫瘍の全身的治療(Rosenberg et al.，1985，N．Engl．J．Med．313: 148 5-1492)は効果がなく生存要因が少ない。（ｅ）すべての悪性腫瘍が同 じ転移ポテンシャルを有しているわけではなく、どの特定の非リンパ性腫瘍が転 移するかどうかを決定する直接の関係が確立されていない。 ２．Ｔ細胞表面分子、インターロイキン−２およびIL-2レセプター モノクローナル抗体は、ヒトの白血球抗原の分化抗原群(clusters ofdifferen tiation: CD)のようなＴ細胞表面分子を特徴づけ分類するために使用されている 。Ｔ細胞レセプター(TCR)は、ＣＤ３と非共有的に関連された二硫化物結合ヘテ ロ二量体(disulfide linked heterodimer)として生じ、Ｔリンパ球表面に発現す る一体的膜タンパク質(integralmembrane protein)である。抗TCR 抗体(anti-TC R antibody)は自己免疫病の治療に対して治療ポテンシャルを示したので、TCRは 自己免疫病に関連づけられている(Basi et al.，1992，J．Immunol．Methods 15 5: 175-191)。Ｔ細胞表面分子について、小児の血清中の可溶性ＣＤ８の濃度の 増加と非ホジキンリンパ腫(non-Hodgkin's lymphoma)の相関関係がKung等により 開示されている（米国特許第５００６４５９号）。ＣＤ８の増加レベルはリンパ 腫の段階と治療に対する応答性に関係するように思われる。 IL-2とIL-2レセプター(IL-2R)は、Ｔ細胞免疫応答の制御において相互に作用 する。IL-2RはIL-2に対する結合親和性および二つの結合タンパク質（αおよび β鎖）の異なる組合せによって分類される三つの形態で存在する。高親和性IL-2 Rはαおよびβ鎖の両方を含み、中親和性IL-2Rはβ鎖を含み、低親和性IL-2Rは α鎖を含む(Leonard et al.,1990,Prog．Clin．Biol．Res．352: 179-187)。IL- 2Rαは活性化Ｔ細胞上にのみ発現され、IL-2はそのＴ細胞増殖促進効果をα鎖の 刺激を介して発揮することが示された。上記Kung等は白血病やリンパ腫のような 活動リンパがんをもつ患者において血清IL-2レセプター(IL-2R)が上昇すること 、さらに、可溶性IL-2Rの濃度はリンパがんの激しさと予後に直接関係を有する ことを開示している。彼らは、また、可溶性IL-2Rレセプターは一般に非リンパ 性がんをもつ患者において高くないことも開示している。加えて、可溶性IL-2R のレベルはIL-2Rを担う白血球の循環数 との相関関係が薄い。 リンホカイン(lymphokines)による免疫療法は、腫瘍細胞に対する宿主の免疫 応答を刺激する試みにおける抗がん治療法の全身形態として使用されている。IL -2の種々の構造が次の文献に記述されている。例えば、Grimm等の米国特許第５ ２２９１０９号は、低毒性IL-2類似体(an-alogue)を、Nitecki等の米国特許第５ ０８９２６１号は免疫原性を低下させ、可溶性と循環半減期を高めるためにポリ マーに結合されたIL-2を、Wiltrout等の米国特許第５０６１４８８号および第５ １２６１２９号はフラボン−８−酢酸(flavone-8-acetic acid)と組換えIL-2(re -combinant IL-2)との組合せを含む組成物および方法を、Zimmerman等の米国特 許第５０９８７０２号は腫瘍細胞に対するIL-2および／またはインターフェロン βと腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)の組合せを、McGrogan等の米国特許 第４９３９０９３号はヒトIL-2様ポリペプチドの産生方法を、そしてYoshimoto 等の米国特許第４７８９６５８号はヒトIL-2の産生および腫瘍(neoplasma)を含 む病気に対するその使用について開示している。さらにRosenbergの米国特許第 ４６９０９１５号は免疫細胞、リンホカイン活性化リンパ球をもつ患者をIL-2免 疫療法で処置することを含む養子免疫療法を開示している。 このように、背景技術および関連技術は、IL-2Rαの存在の開示あるいはその 存在を固形非リンパ性腫瘍(solid non-lympoid tumor)の転移または転移ポテン シャルと関連づけていない。さらに、非リンパ性腫瘍の転移ポテンシャルの予知 の確立、または、その転移の診断もしくは転移への抗がん剤の的中にIL−2Rαの 存在を利用する公知の方法は存在しない。また、背景技術および関連技術は、非 リンパ性転移細胞に対する抗がん治療を、慣行の全身的施与よりも、転移が発生 する器官の領域（転移予測域(prometastatic territories)）に直接に施与する 方法を開示していない。さらに加えて、TCRβが非リンパ性腫瘍上に発現される こと、および TCRβが TCRβを発現する腫瘍に向けられた抗がん療法のための標 的(target)を表すことは開示されていない。本発明の方法 は、非リンパ性腫瘍、その転移または高い転移確率をもつ非リンパ性腫瘍をもつ 個人の診断および抗がん療法を非常に容易ならしめるであろう。 発明の要約 本発明の主たる目的は、IL-2Rαの腫瘍細胞関連発現(tumor cell-associated expression)を決定することによって非リンパ性腫瘍の転移ポテンシャルを決定 する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、非リンパ性腫瘍その転移または高い転移確率を有する非 リンパ性腫瘍に抗がん剤を的中させる方法を提供することである。 本発明の関連する目的は、転移細胞に対する抗がん治療を感染器官の転移予測 域に的中させる方法および混合剤ないし複合剤（compound）を提供することであ る。 本発明のさらに他の目的は、非リンパ性腫瘍、その転移または高い転移確率を 有する腫瘍に対する抗がん治療の効力をモニターする方法を提供することである 。 図面の簡単な説明 第１図はメラノーマ(melanoma)細胞当たりの平均蛍光強度(IL-2Rα発現)に対 する転移病巣頻度(metastatic foci frequency)をプロットした図で、丸印Ａ、 Ｂ、Ｄ、Ｅは異なる前処理群の細胞および各群の細胞を受けた動物の転移を示す 。 第２図は(IL-2Rαの発現に関する)全サンプルの平均強度に対する肝臓内の転 移病巣の数をプロットした図で、丸印Ａ〜Ｅは異なる前処理群の細胞および各群 の細胞を受けた動物の転移を示す。 第３図はIL-2Rαを発現する細胞のパーセンテージに対する肝臓内の転移病巣 の数をプロットした図で、丸印Ａ〜Ｅは異なる前処理群の細胞と各群の細胞を受 けた動物の転移を示す。 第４図は肝臓構造の他の領域（暗い区域）に対する転移予測域（明るいゾーン ）におけるタイプ１内皮細胞に対する、ローダミンで標識した 小麦胚凝集素の結合特異性(binding specificity)を示す肝臓断面の写真である 。 第５図はIL-2に対する細胞増殖応答(cell growth response)を示し、第５Ａ図 はIL-2の濃度に対するB16F10細胞の増殖率をプロットし、第５Ｂ図はIL-2の濃度 に対してCTLL-2細胞の増殖率をプロットしたものである。 発明の詳細な説明 本発明は非リンパ性腫瘍細胞によって発現されたTCRβもしくはその腫瘍特異 的変異体(turmoral-specific variants)、および／またはIL−2Rαの測定に向け られている。IL−2Rαの測定は固形非リンパ性腫瘍の転移の診断の補助、その転 移ポテンシャルの決定に使用できる。IL-2RαまたはTCRβの測定は、各レセプタ ーを発現する非リンパ性腫瘍に抗がん剤を的中させること；およびそのレセプタ ーを発現するこの種の腫瘍の抗がん治療の効力をモニターすることに使用できる 。本発明は三つの分類に集約された処理要素からなる。 １．転移の確率と転移部位を予測する方法。 ２．転移コロニー形成細胞および休眠転移腫瘍細胞を標的として複合剤を指向 させ、転移予測域に局限する抗がん療法およびその治療効果のモニター。 ３．TCRβまたは腫瘍特異的β鎖変異体を発現する非リンパ性腫瘍細胞に向け られた抗がん療法による治療。 １．転移の確率（転移ポテンシャル）の予知および転移部位の診断方法。 1.1．IL-2Rαの発現と転移確率の関係 本発明は固形非リンパ性腫瘍によって発現されたIL-2Rαを測定する方法を提 供する。本発明の一つの実施例においては、IL-2Rαの細胞関連発現(cell-assoc iated expression)が固形非リンパ性腫瘍上または内で測定される。実験は、非 リンパ性腫瘍上のヒトおよび実験転移細胞がその転移ポテンシャルに関係してIL -2Rαを発現することを示した。ま た、得られた転移の数はIL-2Rαを発現する腫瘍細胞のパーセントに正比例する 。以下の節ＡからＥにおける例は、蛍光顕微鏡検査法（表面IL-2Rαを測定する ）、ウェスタンブロット(Western blot)分析（内部および膜IL-2Rα画分を測定 する）、mRNAノーザンおよびスロットブロット(Northern and slot blot)分析（ IL-2Rα mRNA発現を測定する）、mRNAの酵素増幅および分析(IL-2Rα mRNA発現 を測定する)、および蛍光標示式細胞選別(fluorescence activated cell sortin g:FACS)分析（表面IL-2Rαを測定する）からなる群から選ばれた一またはそれ以 上の方法を用いて、ヒトおよび実験的腫瘍における細胞関連IL-2Rαの検出を説 明する。 ヒトおよび実験的腫瘍は以下によって得た。B16F10メラノーマ細胞はMF Poupo n博士（パリ）によって供与された。結腸51Bおよび結腸51Blim 10細胞はR．Bres alier博士（米国）によって供与された。MCA-26細胞はI．Fidler博士（米国）に よって供与された。MMC-7489細胞はJ．Vaageand博士（米国）によって供与され た。SW480,SW480E，SW480RおよびSW620はI.B.Weistein博士によって供与された 。ヒト生検標本はAlonso博士およびPellin博士（スペイン）によって供与された 。すべての腫瘍細胞系は５％CO2を含む空気の湿った雰囲気において、プラスチ ックＴフラスコ内で、１０％FBSで補完されペニシリンとストレプトマイシンを 含む十分な培地で増殖させられた。 Ａ．IL-2Rαの蛍光顕微鏡検査 非リンパ性腫瘍の生検または外科試料を分解させ蛍光分析のための標本を直接 調製することができる。あるいはまた、腫瘍細胞を８−ウェル・スライド・プレ ートで４８時間培養し、それから上澄みを除いて、ウェルをPBSで穏やかに洗いC arnoy固定剤で固定することもできる。PBSで３回洗った後に、細胞を４μl/mlの FITC−ラット抗マウス−IL−2RαIgG2モノクローナル抗体(clone AMT，Boehring er Manheim)を含むPBS溶液中において３７℃で３０分間温置(incubate)した。温 置後、ウェルをPBSで２回洗った。対照標本はFITC−ラット抗マウス−IgG2モノ クロ ーナル抗体(Boehringer Manheim)のみで調製した。細胞はレーザー走査蛍光顕微 鏡で観察した。 Ｂ．IL−2Rαに対するウェスタンーブロット法 ウェスタン−ブロット分析のために５ｘ１０6の腫瘍細胞および対照細胞(ConA 活性化脾細胞およびCTLL-2細胞)を１mM PMSFを含むPBS中に集めた。洗浄後、細 胞を0.25Mショ糖、１mM MgCl2、５mM CaCl2、およびプロテアーゼインヒビター( protease inhibitor)の混合物を含む10mM Tris-HCL緩衝液pH 7.4内でダウンス(D ounce)ホモジナイザーの50ストロークを用い氷中で破壊した。核をペレット化(p elleting)した(600×ｇで10分間)後、後核(post-nuclear)上澄みを100,000×ｇ で１時間遠心して、細胞質ゾル画分と粗い膜画分とを生成した。ポリアクリルア ミドゲル電気泳動を行った。タンパク質を２時間40Vの電気泳動によりニトロセ ルロースフィルターに移した。このフィルタをTTBSで３回洗って、３％正常血清 を含むアビジン(avidin)Ｄブロッキング溶液中に温置した。モノクローナル抗体 抗マウスインターロイキン−２レセプター(monoclonal antibody anti-mouse in terleukin-2 receptor)をTTBS中１：40の希釈でTTBSに加えて２時間温置した。 ３回洗浄後、ビオチンで標識された(biotinylated)ラビット−抗ラットIgGを1:2 00の希釈で加えて１時間静置した。TTBSで３回洗浄後、ブロットをアビジンDHと 、ビオチンで標識されたホースラディッシュ(horseradish)ペルオキシダーゼＨ とで30分温置した。それからブロットをDABで温置すると、抗体の結合部位は褐 色の沈殿物で表された。分子量（MW）マーカータンパク質は、ベーターガラクト シダーゼ(116kd),うしアルブミン(66kd)、卵アルブミン(45kd)およびカルボニッ クアンヒドラーゼ(29kd)であった。 非リンパ性細胞によって発現された細胞関連IL-2Rαの存在は、また、かかる 細胞の膜画分または細胞質ゾル抽出物から、IL-2Rαを抗原として利用するアッ セイにおいて、決定することもできる。かかるアッセイは当該技術において公知 のいかなるイムノアッセイ法でもよく、例えば、以下に限定されないが、ラジオ イムノアッセイ、酵素結合免疫吸 収アッセイ(enzyme-linked immunosorbent assays:ELISA)、「サンドイッチ」ア ッセイ（"sandwich" assays）、沈降反応(precipitin reac-tions)、凝集アッセ イ、および蛍光イムノアッセイである。 Ｃ．mRNAノーザンおよびスロット−ブロット分析 mRNAは、脾細胞、ConA活性化脾細胞および腫瘍細胞から得た。腫瘍細胞は未処 理のまま、および試験管内で(in vitro)前処理して試験した。腫瘍細胞の前処理 は５％CO2中で125U/ml IL-2を含む正常培地、10U/mlIL-1βを含む培地、または ５μg/ml ConAを含む培地において24時間細胞を温置して行なった。細胞は0.1％ トリプシン＋２mM EDTAに短時間露呈して分離し、５％CO2でDMEM＋１０％FBSを 含むスピナーフラスコ中に４８時間温置した。 （0.7％アガロースゲル電気泳動によって無傷(intact)であることが示された ）mRNAの抽出と定量化の後に、全量20μｇの純化RNAを2.2Mホルムアルデヒドを 含む１．２％アガロースゲル上で分離した。電気泳動は８０Ｖで行なった。標準 分子サイズを含むトラックをゲルから切り取って、移動距離を測定した。ゲルは 洗浄してニトロセルロースフィルターに移した。あるいはまた、スロットブロッ ト装置を用いて、RNA試料を１０ｘSSCに予め浸漬させたニトロセルロースフィル ター上にブロット(blot)した。２μｇのmRNAを10×SSC−ホルムアルデヒドで100 μlの最終容積に希釈し、ブロッティング前に１０分間６５℃の加熱により変性 させた。mRNAはＵＶ照射でニトロセルロースフィルターにクロスリンク(cross-l inked)させた。ブロットを6×ssc、0.5SDS、5×Denhardt液、１０mM EDTA、50μ g/ml破砕サケ精子DNA、および50μg/ml E.coli tRNA中４５℃で４時間プレハイ ブリダイズ(prehybridized)させた。同時に、マウスまたはヒトのIL-2Rαおよび IL-2に対する５ピコモルのDNAプローブ(probe)(Amgen Biologicals)を、標準プ ロトコールに従い、ガンマー−32P ATPでオリゴヌクレオチドプローブの５’末 端標識によって標識した。100μｇのヒトベーターアクチンDNAプローブ(Clontec h)をランダム初回免疫(random priming)によって標識した。放 射性標識された(radiolabelled)プローブ(2×109cpm/μl比放射能)を４５℃で２ ４時間mRNAブロットのハイブリダイゼーシヨン(hy-bridization)のために使用し た。それからブロットをハイブリダイゼーション温度で２０分間５×SSC-0.1 SD Sで洗った。このブロットを−７０℃で種々の時間の間増強スクリーンを用いて Ｘ線フィルムに露呈させた。プローブを１００℃の滅菌水中に１０分間温置する ことによりフィルターから除いた。フィルターは他のプローブで再びハイブリダ イズした。１０枚のオートラジオグラムの定量分析をビデオデンシトメータで行 なった。 Ｄ．腫瘍細胞mRNAの酵素増幅(enzymatic amplification) IL−2Rα mRNAの発現は非リンパ性腫瘍細胞からmRNAを抽出純化し、この純化 したmRNAを酵素増幅して分析と検出に充分な量を得ることによって検出すること ができる。使用することができる酵素増幅技術は、PCRTM（polymerase chain re action）、QBレプリカーゼ（QB replicase）、およびNASBA(核酸配列依存増幅： nucleic acid sequence-based amplification)のように当該技術において知られ るものを含む。増幅された核酸の検出は、以下に限られないが、アガロースゲル 電気泳動、ノーザンブロッティング、蛍光依存ハイブリダイゼーションアッセイ (fluorescence-based hybridization assays)、化学光依存ハイブリダイゼーシ ョンアッセイ（chemiluminescence-based hybridization assays）および捕獲ハ イブリダイゼーションマイクロタイターアッセイ(capture hybridization micro titer assays)として当該技術において公知の技術によって行う。オリゴヌクレ オチドプライマー(primer)およびプローブはIL-2Rα遺伝子の核酸配列から合成 することができる(Leonard et al.，1984，Nature 311:626-631)。プローブは非 アイソトープまたはアイソトープ標識を組み込む当業者に公知の方法で合成する ことができる。あるいはまた、この標識は増幅された産生物に直接組み込んでも よい。 本例においては、抽出された腫瘍細胞mRNAからの逆転写(reverse transcription)によって得られた一本鎖(single-stranded)cDNAは、市販のIL−2 RおよびIL−2Rαの遺伝子のプライマーを使用してPCRTMによって増幅した。増幅 された産生物は1.2%アガロースゲル上で分離され、正および負の対照試料(posit ive and negative controls)とともに、シュウ化エチジウムで染色した。定量は Photoquant SystemTM（BAF,スペイン）で行なった。 Ｅ．FACS分析 腫瘍細胞を２４ウェルプレートで４８時間培養し、それから上澄みを除いて、 ウェルをPBSで穏やかに洗ってから細胞を繊維培養プレートから穏やかにかき取 り、１μg/mlラット抗マウス−IL−２Rαモノクローナル抗体を含むPBS溶液中で ４℃で３０分間温置した。細胞を洗ってから、20μg/ml FITC−ラビット抗ラッ トIg抗体を含む溶液中で４℃で３０分間温置し、１％パラホルムアルデヒドで固 定し、FACS装置(Coulter)を使用して４８時間以内に分析した。すべての場合に おいて、対照試料は２次抗体のみで調製した。脾細胞を抗原発現の負対照として 、また、ConA活性化脾細胞をその正対照として使用した。腫瘍細胞上のIL-2Rα 発現の定量分析は蛍光標示式細胞分取器を用いて行なった。 表１はヒトおよび実験的非リンパ性腫瘍において転移ポテンシャルをその細胞 関連IL-2Rα発現と比較したものである。ヒト腫瘍のin vivo転移ポテンシャルは 臨床観察で決定した。実験的腫瘍の転移ポテンシャルはin vivo腫瘍細胞増殖お よび転移効率分析で決定した（後述1.1 Ｆ節）。 表１はIL-2Rαの細胞関連発現が実験的およびヒトの非リンパ性腫瘍の決定さ れた転移ポテンシャルとよく相関することを示す。 Ｆ．細胞関連IL−2Rαを発現する腫瘍細胞のパーセンテージに対する転移数 この実施例を説明するために、B15F10メラノーマ細胞を異なる条件で処理し、 転移病巣の数をIL-2Rαを発現する転移細胞の強度ないしパーセンテージと対比 させた。この試験管内(in vitro)での前処理は、異なるグループの細胞を５％CO2 中３７℃で次の溶液中で温置することによった。すなわち、Ａ）正常増殖培地 で２４時間（対照）、Ｂ)125U/mlIL-2を含む培地で２４時間（転移細胞の増殖を 活性化）、Ｃ）10U/mlIL-lβを含む培地で２４時間（細胞増殖を活性化）、Ｄ） ５μg/mlConAを含む培地で２４時間（細胞増殖を活性化）、またはＥ）0.1%トリ プシン＋2mM EDTAに短時間さらし、それからDMEM＋10％FBSを含むスピナーフラ スコ中で細胞を４８時間温置（細胞増殖を増加）することによ って細胞を分離。 in vitroでの前処理後に、五つのグループのそれぞれを代表する細胞を含むプ レートのあるものから上澄みを除き、細胞をPBSで穏やかに洗った。組織培養プ レートから付着している細胞を穏やかにかき取った。それから、細胞を１μg/ml ラット抗マウスIL−2Rαモノクローナル抗体を含むPBS溶液中で４℃で３０分間 温置した。細胞を洗った後、これを２０μg/ml FITC-ラビット抗ラットIg抗体を 含むPBS溶液中で４℃で３０分間温置した。それから細胞を１％パラホルムアル デヒドで固定し、４８時間以内にFACSでIL-2Rα発現を定量分析した。抗原の発 現のために、脾細胞を負対照として、また、ConA活性化脾細胞を正対照として使 用した。 五つの異なる前処理グループの各々からの５ｘ１０5の全生存腫瘍細胞を0.05m lの容積で、麻酔をかけたマウスの脾臓の上極に注射した。各異なる前処理を受 けた細胞を１グループ２０匹のマウスに注射して、５分後に脾切除術を施した。 腫瘍細胞の注射後７日に各グループ２０匹の動物を剄部脱臼によって殺し、その 肺臓および肝臓を取り出して液体窒素で冷凍した。クリオスタットによる１０お よび４０μmの肝臓の切片を200μmの間隔で切断した。これらの切片をコハク酸 デヒドロゲナーゼ染色(SDH−染色)し、−２０℃で４５秒間アセトンに浸漬し、 それからPBS中で５分間２回洗った。切片を画像解析装置を備えた顕微鏡で検査 した。画像は透過光によって各視野から得た(SDH−染色)。個々の病巣は肝臓組 織の非SDH染色域として明確に表された。各肝臓における個々の病巣の頻度およ び容積並びに全腫瘍容積を、記述された立体基準(Aherne & Dunnill，Morphomet ry ，ed．Edward Arnold，ロンドン，1982)に従い、特別に修正されたソフトウェ ア(DPLAN，スペイン)を用いてイメージ解析データから計算した。 その結果を第１図、第２図に示す。第１図は、各異なる前処理グループの細胞 (10,000個の細胞の平均)当りのIL-2Rα発現量に対してプロットした転移病巣の 頻度を示すが、IL-2Rαの細胞発現の増加が転移病 巣の頻度の増加と相関することを示す。例えば、細胞当り発現されたIL-2Rαレ セプターの最大数はConAにさらされた細胞に生じた。ConA活性化メラノーマ細胞 は転移病巣の頻度が最大であった細胞グループ（第１図、丸Ｄ）でもあった。第 ２図は、全試料におけるIL-2Rαの発現(ELISAによって測定されるものと類似） に対してプロットされた肝臓内の転移病巣の数を示すが、IL-2Rαの発現の平均 強度を示す試料が肝臓内で発見された転移病巣の数に対応することを示す。例え ば、IL−2Rαの発現の最高の強度を有するメラノーマ細胞、ConAにさらされた細 胞の試料が転移病巣の最大数を生じた細胞の試料でもあった（第２図、丸Ｄ）。 1.2 非リンパ性腫瘍によるIL-2Rαの細胞関連発現測定の臨床適用 Ａ．転移予測の決定 転移が非リンパ性腫瘍の診断と治療に関して提起する問題のために、転移の予 測を決定する方法が望まれる。転移の予測を決定する一実施例は次の工程からな る。 （ａ）原発生腫瘍の試料を得る（術前または術中バイオプシー） （ｂ）上述の1.1節Ａ〜Ｅに記述された方法の一つまたは組合せを用いてIL-2R αをもつ非リンパ性細胞のパーセントを確定する。非リンパ性腫瘍バイオプシー と腫瘍のタイプは、その試料におけるIL-2Rαの細胞関連発現を決定するのに最 適の方法の選択に影響するであろう。例えば、蛍光顕微鏡検査を行なうための試 薬からなる臨床診断キットは、冷凍した非リンパ性腫瘍組織の組織切片における IL−2Rαの細胞関連発現、または、固定埋設された腫瘍組織の組織切片に最適で ある。隔離された非リンパ性腫瘍組織細胞におけるIL-2Rαの細胞関連発現を決 定する臨床診断キットは、ELISA用試薬およびマイクロタイタープレート（micro titer plate）、ラジオイムノアッセイ用試薬および反応容器、FACS分析用試薬 、または、PCRTM分析用の特異的プライマーおよびプローブを含む試薬からなる ことができる。臨床診断用キットは二つの基本的要素を含んでいる。すなわち、 （１）フルオロクロム(fluorochrome) 、発色団(chromophore)または酵素のような環境指示化合物(reportercompound) と結合された抗IL-2Rα抗体。かかる化合物の例としては、アルカリ（性）ホス ファターゼ(alkaline phosphatase)、フルオレセイン−５−イソチオシアネート (fluorescein-5-isothiocyanate)、ペルオキシダーゼ(peroxidase)、フィコエリ トリン(phycoerythrin)およびローダミン(rhodamine)がある。（２）特定タイプ の腫瘍に関連することが当業者に公知の腫瘍細胞マーカー(TCM)に対する抗体。 本発明の方法に従って使用できる特定のタイプの腫瘍に関連する腫瘍マーカーに 対する抗体は、以下の表２に掲げたものを含むが、これらに限定されない。 抗TCM抗体は、抗IL−2Rα抗体が結合されるのとは別異のフルオロク ロム、発色団または酵素と結合される。 転移の確率を決定するために、非リンパ性腫瘍に対する二つのパーセンテージ が決定される。第１のパーセンテージは、両抗原を示す腫瘍細胞または細胞組織 表面(IL-2Rα+、TCM+細胞)のパーセンテージを測定することによって計算される 。第２のパーセンテージは、表現型(pheno-type)（サイズ、形態の特徴、フロー サイトメトリによる前角光散乱(flow cytometry forward angle light scatter: FALSを含む)によって同定可能であり、かつ、IL-2Rαポジティブである腫瘍細胞 （腫瘍細胞表現型+、IL-2Rα+）のパーセンテージを計算することによって計算 される。二つのパーセンテージの和は転移コロニー形成細胞の係数(Met-CFC係数 )である。Met-CFC係数は転移確率に比例し、実験的に以下の通りである。 Met-CFC係数 転移確率 ０％ ０％ ＜１０％ ＜３０％ ＞４５％ １００％ Ｔ細胞は純化腫瘍において除かれるので、IL-2Rαの発現自体は転移を決定す るために実験的に使用できることに注目されたい。しかし、腫瘍バイオプシー試 料からＴ細胞IL-2Rα発現を除くために、抗TCMおよび腫瘍表現型がIL-2Rαと同 時に使用される。 本実施例を説明するために、IL-2Rα発現のみに基づいて、B16F10メラノーマ 細胞を異なる条件で処理して転移効率をIL-2Rα発現と対照させた。B16F10は以 下の点を除いて前述の節Ｆにおけるようにin vitroで予め処理した。すなわち、 前処理は異なるグループの細胞を次の溶液に温置した。Ａ）正常増殖培地で２４ 時間（対照試料）、Ｂ）125U/mlIL-2を含む培地で２４時間（転移細胞の増殖を 活性化）、Ｃ）10U/mlIL-4を含む培地で２４時間（IL-2Rαの発現を阻止）、Ｄ ）5μg/mlConAを含む培地で２４時間（細胞増殖を活性化）、または、Ｅ）0.1% ト リプシン＋2mM EDTAに短時間さらして細胞を分離し、スピナーフラスコのDMEM+1 0% FBS中に４８時間細胞を温置（細胞増殖を増進）。IL−2R発現のFACSによる分 析、in vivo腫瘍細胞増殖および転移効率分析は節Ｆに前述したようにして行な った。ただし、各グループのマウスは２０匹ではなく６匹であった。表３に示す その結果は、次のことを示す。すなわち、１０％以下の細胞がIL-2Rαを発現し た場合、約３０％のマウスに転移が生じた（B16F10、無処理およびIL-2処理細胞 ）。いかなる細胞もIL-2Rαを発現しなかった場合、転移はどのマウスにも生じ なかった（０％マウス、IL-4で処理した細胞）。35％の細胞がIL-2Rαを発現し た場合、転移が80％よりも多くのマウスに生じた（サスペンション中で増殖した B16F10）。50％より多くの細胞がIL-2Rαを発現した場合は、転移は100％のマウ スに生じた（ConAで処理したB16F10）。 高い係数が、ここに転移予測域(prometastatic territories)と名付ける領域 に対する選好または全面的転移に関係することが判明した。 ２．転移コロニー形成細胞および休眠転移腫瘍細胞を標的として化合物を指向 させることからなる、転移予測域に局限する抗がん療法による治療およびその治 療効果のモニター 2.1 転移予測域 白血病およびリンパ腫を含む血液の悪性腫瘍は、高親和性IL-2レセプ ターを担った細胞に選択的に結合して中毒させるIL-2融合毒素（IL-2fusion tox in）によって(LeMaistre et al.，1992，Immunol-Res.，11，42-53;およびWaldm ann et al.,1992，Ann Intern Med.116: 148-160)、また、高親和性IL-2レセプ ター(hIL-2R)に対するヒト化抗体(humani-zed antibodies)、または、毒素もし くは放射性核種と結合された抗hIL-2Rによって(Waldmann et al.，1992，同上) 効果的に治療された。固形非リンパ性腫瘍の転移および高い転移確率をもつ固形 非リンパ性腫瘍を治療する本発明の方法は、いくつかの重要な点において異なる 。血液の悪性腫瘍は、IL-2および抗hIL-2Rによって効率的に結合されるhIL-2R（ αおよびβ鎖の両者からなる）を発現させる。さらに、悪性腫瘍の性質によって 、IL-2毒素または抗hIL-2R毒素または抗hIL-2Rでの処置は全身的注入からなる。 本発明は、固形非リンパ性腫瘍の転移ポテンシャルとIL-2Rαの発現の相関関係 を示しているので、かかるIL-2Rαを発現する非リンパ性腫瘍はIL-2毒素または 抗hIL-2R毒素または抗hIL-2Rに対して低い親和性結合力を有する。従って、本発 明の固形非リンパ性腫瘍の転移および高い転移確率をもつ固形非リンパ性腫瘍に 対する抗がん治療の一方法は、毒素、放射性核腫または化学治療剤に結合された 分子の治療的に有効な量を投与することからなる。この分子はヒト化抗IL-2Rα 抗体(humanized anti-IL-2Rα antibody)のように、IL-2Rαに対して特異的であ る（すなわち、高い親和性結合力を有している）。 IL-2に対するIL-2Rαの低親和性にもかかわらず、転移予測域に集中された比 較的少量のIL-2の投与は休止中の転移腫瘍細胞を活性化させ、これらを抗腫瘍薬 剤(antineoplastic drug)によって一層影響されやすくする。したがって、本発 明による転移コロニー形成細胞および休眠転移細胞を処置する他の方法は、IL-2 および抗腫瘍薬を転移予測域に同時に伝達することからなる。本発明のこの実施 例による抗がん治療法は全身的施与ではなく、治療が転移予測域を直接標的とす ることからなる点に注目されたい。 本発明の抗がん治療法によって標的とされる転移予測域はその脈管構 造、末端糖濃度、および当該域内に含まれる細胞の表面に発現された細胞外接着 分子(extracellular adhesion molecules:ICAMs)の濃度によって同定される。固 形非リンパ性腫瘍の転移細胞は、肝臓や肺のような標的器官の独特の毛細管域か らなる予測可能位置に転移病巣を発達させる（コロニーを作る）(Barbera- Guil lem et al.，1989,Cancer Research49: 4003-4010; Barbera-Guillem et al.， 1992，Int.J．Cancer Res．52: 974-977; Barbera-Guillem et al.，1993，Int ．J．Cancer 53:298-301; Barbera-Guillemetal.，1993，Int．J．Cancer 54:88 0-884)。例えば、肝臓において、転移予測域は門脈から肝静脈へ延長する類洞の 第１半部（一次的には当該半部の第２四分の一部(second guadrant)）に位置す る。類洞のこの区域は類洞の門脈周囲分節としても知られている。肺においては 、転移予測域は末端前肺胞細静脈(terminal prealve-olar venules)および胸膜 末端毛細管(pleural terminal capillaries)中に存在している。同様の区域が副 腎を含む他の器官内にも示されている。 すべての特徴的転移予測域の共通因子はこの域内の毛細管が「タイプ１内皮細 胞(type 1 endothelial cell)」と呼ばれる内皮細胞の特異な副次集団(subpopul ation)を含んでいることである(Vidal-Vanachlochaet al.,1993，Hepatology 18 :328-339)。タイプ１内皮細胞は、高濃度の特定の末端糖(N-アセチルガラクトサ ミン(N-acetyl galactosamine)；Gal NAC)をもつオリゴ糖からなる細胞表面上の 同定特徴を発揮する。その濃度は毛細管ゾーンの他の部分におけるよりも６倍か ら１０倍高い(Barbera-Guillem et al.,1991，Hepatology 14:131-139;Vidal-Va na-chlocha et al.，1993，同上)。これらの特定の糖の高い発現の結果、これら の糖に特異的に結合するレクチン(lectin)が転移予測域の直前の循環位置に注入 されると、レクチンによるタイプ１内皮細胞への選好的結合が生じる。かくて、 小麦胚アグルチニン(wheat germ agglutinin:WGA)のような注入されたレクチン は、転移予測域に捕獲され実質上アブダクト(abducted)される。このことは第４ 図に示される。すなわち、腫 瘍細胞がコロニーを作って発達しない肝臓のゾーンはローダミンで標識されたWG Aがなく（暗い区域）、転移予測域を構成する毛管タイプ１内皮細胞はローダミ ンで標識されたWGAによって結合される（明るい区域）。かくしてレクチン蛍光 分子のアブダクション(abduction)は腫瘍細胞がコロニーを形成し転移を起こす 肝臓の標的域に起こる。転移予測域を構成する毛管に含まれるレクチンの高濃度 は、この領域の毛管タイプ１内皮細胞の高い末端糖(Gal NAC)濃度を反映する。 肝臓の転移予測域における内皮細胞も比較的高いICAMs濃度を含んでいる。か くして、そのICAMに対する結合特異性をもつリガンドまたは抗体はこの細胞副次 集団に対して特異的な標的指向剤(targeting agent)として使用できる。肺の転 移予測域もまた高濃度のICAMsを含む内皮細胞からなる(Zhu etal.，1993，Int． J．Cancer 53: 628-633: Zhu et al.，1992, J.Clin.Invest．89: 1718-1724)、 そしてそのICAMに対する結合特異性を有するリガンドまたは抗体は、この細胞副 次集団に対して特異的な標的指向剤として使用できる。 転移予測域に滞留する転移細胞はＮＫ細胞および抗腫瘍薬に対し高い抵抗性の ある休眠状態または低速増殖状態（擬似休止状態）に入ることができる。これら の細胞はIL-2およびIL-1の低局所濃度の影響の下にこの状態から脱する。転移芽 細胞の増殖が始まると、それらは抗腫瘍薬およびＮＫ細胞に一層敏感となる。 サイトカイン濃度(cytokine concentration)とその非リンパ性腫瘍細胞への効 果との相関関係を示すために、B16F10メラノーマ細胞を異なる濃度のIL-1および IL-2にさらし、その結果の増殖応答性を記録した。B16F10メラノーマ細胞増殖に 対するIL-2の効果の測定のために、104の生がん細胞を96ウェルプレートの各ウ ェルに加え、培養細胞を、１０から200U/mlの濃度のマウス組換えIL-2、または ２０、１２５もしくは２５０Ｕのヒト組換えIL-2(hrIL-2)を含む無血清(serum-f ree)もしくは１０％FBS補足正常培地内で４８時間５％CO2で温置した。それから 各ウェルを１μCiの[3H]−チミジン(thymidine)でパルス(pulsed)し、６時間 後に収穫して放射能を測定した。B16F10メラノーマ細胞増殖に対するIL-1の効果 測定のプロトコールは、次の通りであった。１０4の生がん細胞を９６ウェルプ レートの各ウェルに加え、培養細胞を、１、１０もしくは２０U/mlのマウスIL-1 βを含む無血清または１０％FBS補足正常培地で48時間５％CO2で温置した。ある 場合には、抗IL-2Rα抗体(anti-IL−2Rα antibody)をIL-1βと同時に加えた。 各ウェルを１μCiの[3H]-チミジンでパルスし、６時間後に採取して放射能を測 定した。 第５図は、高濃度(75U/mlを越える)のIL-2は死または芽細胞の増殖停止を誘起 するが、擬似休止状態のB16F10の転移細胞に影響を与えないことを示す。治療的 に重要なことは、75U/mlを越えるIL-2濃度は転移細胞の増殖に抑制効果を有し、 75U/mlと100U/ml間の濃度は類似の方法で調製されたリンパ球（第５図、CTLL-2 で表される）に対して毒性がないことである。表４は低濃度のIL-2およびIL-1は 擬似休止から発芽への前進と芽細胞の増殖を誘起することを示す。 かくして、本発明の固形非リンパ性腫瘍の転移の治療方法は、転移予測域を標 的とする抗がん治療からなる。この方法の利点は、抗がん治療が特定器官におけ る転移予測域を直接標的とし、これによって非リンパ性腫瘍の転移が局在する区 域において抗腫瘍薬または毒性剤の治療濃度を確立し、免疫および造血系への侵 害を最小にする点にある。 2.2 転移予測域へ向けられた抗がん治療 本発明による抗がん治療は、次の実施例の一つまたはそれ以上からなる。 実施例（Ａ）、治療的に有効な量のIL-2またはIL-1と抗腫瘍薬（化学治療剤） からなる混合剤ないし複合剤(compound)を転移予測域に指向させ幼若がん細胞に 対するIL-2の細胞増殖抑止効果(cytostatic effect)を避け、擬似休止転移細胞 を活性化させてその抵抗を回避し、転移細胞の死をもたらすのに充分な抗腫瘍薬 の濃度と摂取を可能にする。 この実施例において、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第５２８４９３ ４号）を用いて、IL-1またはIL-2はレクチン分子に結合させてもよいし、また、 抗腫瘍薬はレクチン分子、例えば、WGAに結合させてもよい。これらの成分を治 療的に有効な割合で混合して、抗がん治療の標的である転移予測域に対するより 高い親和性を有する複合剤を提供する。あるいはまた、抗ICAM抗体をIL-1または IL-2に結合させ、また、同抗体を抗腫瘍薬に結合させ、これらの成分を治療的に 有効な割合で混合して転移予測域に対するより高い親和性を有する複合剤を提供 する。か かる複合剤は当業者に公知の方法を用いて、キャリヤーリポソーム(carrier lip osome)に結合させて、転移予測域における当複合剤の保持時間を増大させること ができる。この実施例を調査するために、ローダミンを内包し、表面にWGAを組 み込んで、リポソームを構成した。これらのリポソームを肝臓の門脈に注入した 結果、第４図に示したのと同じ蛍光分布を生じた。加えて、タイプ１内皮細胞は このレクチン−リポソームを取り込まずに、それを近隣の転移細胞に露呈したま まにした。しかし、制限的なことは、蛍光解析によってクッパー細胞(Kupffer c ell)がレクチン−リポソーム組成物の小部分を貧食したようにみえることである 。 実施例（Ｂ）．毒素、放射性核種また化学治療剤に結合させた分子の治療的に 有効な量からなる複合剤であって、その分子がヒト化された抗IL-2Rα抗体のよ うにIL-2Rαに対して特異的であるものを転移予測ゾーンに投与して、そこに存 在する転移細胞に結合させて転移細胞の死をもたらす。 実施例（Ａ）および（Ｂ）共において、その複合剤はカテーテルを通して投与 され、転移予測域に直接経管アクセスさせられる。また両実施例において、治療 の効力は、1.1 節Ａ〜Ｅにおいて前述した方法の一つまたは組合せを用いて、IL -2Rαの細胞関連発現を測定することによってモニターできる。すなわち、治療 開始前の細胞関連IL- 2Rαを発現する転移細胞に対して、細胞関連IL-2Rαを発 現する非リンパ性腫瘍の転移細胞の数の減少は治療による抗がん効果を示す。 ３．TCRβまたは腫瘍特異的β鎖変異体を発現する非リンパ性腫瘍細胞に向け られた抗がん治療法による処置 3.1 TCRβ発現と非リンパ性腫瘍の関係 本発明のこの実施例においては、非リンパ性腫瘍の抗がん治療は、これらの腫 瘍によるＴ細胞レセプターβ(TCRβ)および／またはβ鎖変異体の発現に依存す る。基本的に、腫瘍細胞はTCRのβ鎖の数個の可変部(大方 Vβ8)を発現する。こ の可変部は組織および／または腫瘍特異性 を表す超可変部(hypervariable region)の候補となる。しかしながら、そのリン パ球TCRとの機能的類似性の故に、これらの配列はその組織に対して特異的であ っても免疫性(immunogenic)でありあえない。その上それらは免疫抑制またはア レルギーの誘導素子のように振る舞うことができる。かくして、本発明による方 法は、抗がん治療をTCRβを発現する非リンパ性腫瘍に的中させることである。 本発明の一実施例においては、TCRβの細胞関連発現は固形非リンパ性腫瘍上 で測定される。実験はヒトおよび実験的非リンパ性腫瘍はTCRβを発現すること を示した。以下の節ＡからＤの例は、次のグループから選ばれた一つまたはそれ 以上の方法を用いてヒトまたは実験的腫瘍における細胞関連TCRβの検出を示す 。すなわち、蛍光顕微鏡検査法（表面TCRβの測定）、mRNAノーザンおよびスロ ットブロット分析(TCRβ mRNA発現の測定)、mRNAの酵素増幅および分析(TCRβ m RNA発現の測定)、および定量蛍光分析（表面TCRβの測定）である。ヒトおよび 実験的腫瘍は次のようにして得られた。すなわち、B16F10メラノーマ細胞はMF P oupon博士（パリ）によって供与された。結腸51Bおよび結腸51B Lim10細胞はR.B resalier博士（米国）によって供与された。MCA-26細胞はI．Fidler博士（米国 ）によって供与された。MMC-7489細胞はJ.Vaageand博士（米国）によって供与さ れた。SW480、SW480E、SW480RおよびSW620はI.B．Weinstein博士によって供与さ れた。ヒトのバイオプシー試料はAlonso博士およびPellin博士（スペイン）によ って供与された。他の腫瘍細胞系はATCCから得た。全ての腫瘍細胞系は、空気中 ５％CO2の湿った雰囲気におけるプラスチックＴフラスコ内において10％FBSで補 足されペニシリンとストレプトマイシンを含む充分な培地で増殖させた。ヒトの 腫瘍細胞試料のリンパ球汚染の可能性を除くために、標本は次のようにして調製 した。腫瘍試料を外科的条件下で患者から採取し、ペニシリンとストレプトマイ シンを含む媒体で洗って粉砕し、0.02％プロナーゼＥ(PronaseE:Sigma,米国)と0 .05% タイプＩコラゲナーゼ(Type I Collagenase)を含む２０ml GBSS pH7.4中で 37℃で １０分間攪拌した。その細胞懸濁液をナイロンガーゼでこし、250ｘｇ１０分間 ２回遠心した。分離された細胞をヌードマウスの皮下に注射移植した。腫瘍増殖 の２１日後、TCRβの発現調査のため腫瘍細胞のサンプルを採取した。 Ａ．TCRβの蛍光顕微鏡検査 非リンパ性腫瘍を含む腫瘍バイオプシーまたは外科試料を分解し蛍光分析用標 本を直接調製した。あるいはまた、腫瘍細胞を８ウェルスライドプレート（Biot ek）で４８時間培養してから、上澄みを除きウェルをPBSで穏やかに洗ってCarno y固定剤で固定した。PBSで３回洗浄後、細胞を４μl/mlのFITCラット抗ヒトTCR β（定常部および可変部）モノクローナル抗体(Genzyme，Boehringer Manheim) を含むPBS溶液中で３７℃で３０分間温置した。温置後、ウェルをPBSで２回洗っ た。対照標本はFITCラット抗マウスIgG2モノクローナル抗体(Boehringer Manhei m)のみで調製した。細胞はレーザー走査蛍光顕微鏡で観察した。 Ｂ．mRNAノーザンおよびスロットブロット分析 mRNAは脾細胞、ConA活性化脾細胞および腫瘍細胞から得た。（0.7％アガロー スゲル電気泳動によって無傷（intact）であることが示された）mRNAの抽出と定 量化の後、総量２０μｇの純化RNAを2.2Mホルムアルデヒドを含む1.2％アガロー スゲル上で分離した。電気泳動は８０Ｖで行なった。標準分子サイズを含むトラ ックをゲルから切り取り、移動距離を測定した。ゲルを洗ってニトロセルロース フィルターに移した。２μｇのmRNAを10 x SSC- ホルムアルデヒドで最終容積10 0μｌに希釈し、ブロッティングの前に１０分間６５℃の加熱によって変性させ た。mRNAはＵＶ照射でニトロセルロースフィルターにクロスリンクさせた。ブロ ットは６ｘSSC、0.5 SDS、５ｘデンハート液、１０mM EDTA、５０μg/ml破砕サ ケ精子DNA、および５０μg/mlのE.coli tRNA中４５℃で４時間プレハイブリダイ ズ(prehybridize)した。これと同時に、マウスまたはヒトTCRβに対する５ピコ モルのDNAプローブを、標準プロトコールに従って、ガンマー−32P ATPによりオ リゴヌクレオチドプローブの ５’末端標識によって標識した。１００μｇのヒトベータアクチンDNAプローブ( Clontech)をランダム初回免疫(randompriming)によって標識した。放射性標識さ れたプローブ(2x109 cpm／μｌ比放射能)を４５℃で２４時間mRNAブロットのハ イブリダイゼーション（hybrdization）のために使用した。それからこのブロッ トをハイブリダイゼーション温度で２０分間５ｘSSC-0.1SDSで洗った。このブロ ットを強化スクリーンを用いて−７０℃で異なる時間の間Ｘ線フィルムに露光さ せた。そしてプローブを１００℃で１０分間滅菌水中で温置してフィルターから 除き、このフィルターは他のプローブで再びハイブダイズさせた。１０枚のオー トラジオグラムの定量分析をビデオデンシトメータで行なった。 Ｃ．腫瘍細胞mRNAの酵素増幅 TCRβ mRNAの発現は、非リンパ性腫瘍からmRNAを抽出純化し、純化されたmRNA を酵素増幅して分析と検出に充分な量を得ることによって、検出することができ る。使用できる酵素増幅技術は、PCRTM(poly-merase chain reaction)、QBレプ リカーゼおよびNASBA(核酸配列依存増幅：nucleic acid sequence-based amplif ication)のような当該技術において公知の技術を含む。増幅された核酸の検出は 、以下に限定されないが、アガロースゲル電気泳動およびノーザンブロッティン グ、蛍光依存ハイブリダイゼーションアッセイ、化学光依存ハイブリダイゼーシ ョンアッセイ、および捕獲ハイブリダイゼーションマイクロタイターアッセイを 含む当該技術分野で公知の技術によって行なう。オリゴヌクレオチドプライマー およびプローブは、当該技術において明らかにされているように、TCRβ遺伝子 の核酸配列から合成することができる(Waterset al.，1992，Diabetes 41: 308- 312)。プローブは非アイソトープまたはアイソトープ標識を組み込む当業者に 公知の方法によって合成することができる。あるいはまた、この標識は増幅され た産生物に直接組み込むこともできる。 本実施例において、抽出された腫瘍細胞のmRNAからの逆転写によって得られた １本鎖cDNAは、市販のTCRβ遺伝子用プライマーを利用して PCRTMによって増幅した。増幅産生物を１．２％アガロースゲル上で分離し、正 および負の対照試料と平行してシュウ化エチジウムで染色した。定量はPhotoqua nt SystemTM(BAF、スペイン)で行った。 Ｄ．定量蛍光分析 腫瘍細胞は２４ウェルプレート内で４８時間培養し、上澄みを除き、ウェルを PBSで穏やかに洗ってから、細胞を繊維培養プレートから穏やかにかき取り、１ μg/mlラットFITC結合抗マウスTCRβモノクローナル抗体を含むPBS溶液中に４℃ で３０分間温置し、それから１％パラホルムアルデヒドで固定し、４８時間以内 にマイクロ蛍光定量計(micro-fluorimeter)を用いて分析した。すべての場合に 、対照試料は２次抗体のみで調製した。脾細胞を抗原発現の負対照として、また 、ConA活性化脾細胞をその正対照として用いた。腫瘍細胞上のTCRβの発現の定 量分析は、特別のソフトウェア(Image I; 米国およびPhooquant,スペイン)を用 いて行った。 表５はTCRβの細胞関連発現がヒトの非リンパ性腫瘍とよく相関していること を示す。 3.2.ヒトの固形非リンパ性腫瘍によるTCRβの細胞関連発現の臨床適用 3.2.1.免疫調節(immune modulation) 本発明は転移コロニー形成細胞および休眠転移腫瘍細胞を標的として複合剤を TCRβ特異性を介して指向させる方法を提供する。ブドウ球菌腸管毒（Staphyloc occal enterotoxin：SEA、SWBなど）が腫瘍細胞のTCR可変β鎖を抗原提示細胞の CMH IIに結合させ、その結果、免疫系および腫瘍細胞の共調節(comodulation)が 行われる。これらの反応は、大 方の腫瘍に対する免疫応答の不存在、および、原発腫瘍の根除後何年も経過した 後でさえ、腫瘍細胞が偶発的炎症環境のもとで復帰可能な休眠状態に移行するこ とと関係する。 コロニー形成転移細胞、休眠細胞および一般のガン細胞に向けられた本発明に よるTCRβ標的方法(TCRβ-targeted method)は、以下の実施例に記述された免疫 調節を含む。 実施例（Ａ）．免疫応答の調節方法は、それぞれ特定の発生源（器官、組織、 細胞群など）の腫瘍細胞のTCRβ特異的配列（TCRβ-specific sequences）を同 定できる分子を供給することによって達成され、所望の免疫過程相互作用を指示 する免疫系細胞によって認識されうる。これらの分子はブドウ球菌腸管毒、また は、IL-1もしくはIL-2に結合された抗TCRβイディオタイプ(anti- TCR β idiot ype)を含む。 実施例（Ｂ）．腫瘍増殖調節方法は、それぞれ特定の発生源の腫瘍細胞のTCR β特異的配列を同定できる分子を供給することによって達成され、所望の免疫過 程相互作用によって認識されうる。 免疫調節または腫瘍増殖調節は、診断および薬理的使用のために、腫瘍の器官 特異性に基づき、異なるグループの非リンパ性腫瘍細胞に対する抗TCRβイディ オタイプモノクローナル抗体(anti-TCRβ idiotype monoclonal antibodies)を 産生することによって達成できる。 あるいはまた、特定の非リンパ性腫瘍から分離されたヒトの可溶性TCRβに対 する抗体はBasiほかの方法によって作ることができる(1992，J．of Immunol．Me thods．155: 175-191)。すなわち、この産生された抗体はその非リンパ性腫瘍に よって発現された細胞表面TCR上の多数のエピトープ(epitope)を認識する。当業 者に公知の方法を使用して、抗TCRβイディオタイプ抗体に結合されたIL-2また はIL-1の治療的に有効な量からなる複合剤は、免疫調節を実現する性質を備える 。かかる複合剤は当業者に公知の方法を用いてキャリヤーリポソームに含まれた IL-2またはIL-1、およびリポソーム表面に組み込まれた抗TCRβイディオタイプ 抗体からなることができる。この複合剤は全身的に投与することが できる。 3.2.2．TCRβ標的抗腫瘍薬治療 特に、本発明によるTCRβ標的腫瘍薬治療は、毒素、放射性核種または化学治 療剤に結合された分子の治療的に有効な量からなる複合剤からなり、その分子は ヒト化された(humanized)抗TCRβイディオタイプ抗体であり全身的に投与される 。かかる複合剤は、当業者に公知の方法を用いて、キャリヤーリポソームに含ま れた化学治療剤とリポソーム表面に組み込まれた抗TCRβイディオタイプ抗体と からなる。治療の効力は、3.1 節Ａ〜Ｄに上述された方法の一つまたはその組合 せを用いてTCRβの細胞関連発現を測定することによって、または、抗TCRβイデ ィオタイプ抗体によるイムノアッセイからなる臨床診断キットを使用することに よってモニターすることができる。この場合、治療開始前のTCRβを発現する非 リンパ性腫瘍細胞の数に対する細胞関連TCRβを発現する非リンパ性腫瘍細胞の 数の減少が治療による抗がん効果を示す。 腫瘍細胞の抗TCRβイディオタイプに対応するペプチドは、その薬理的使用の ためにAPCのMHC II構造に組み込むことができる。 薬剤をTCRβに的中結合させる場合、β鎖の腫瘍特異的変異体のために、患者 から腫瘍細胞を分離して、その腫瘍変異体に対する特異的抗TCRβイディオタイ プ抗体を産生し、あるいはその変異体の核酸配列を決定して対応するペプチドを 合成することが必要であろう。 本発明を明確さと理解のために図および例によって詳細に記述したが、先の記 述および図から種々の変形が当業者にとって明らかになるであろう。かかる変形 例は本願の精神および添付の請求の範囲に含まれるべきものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 33/53 0276−2Ｊ Ｍ 0276−2Ｊ 33/566 33/566 0276−2Ｊ 33/574 Ａ 33/574 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 コーエン，ステファン エイ アメリカ合衆国、ニューヨーク 14051、 イースト アムハースト、ワゴン ホイー ル ドライヴ 24

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）腫瘍の試料から細胞関連IL−2Rαを測定し、およびその腫瘍のタイ プに特異的な腫瘍細胞マーカーを別個に測定する工程と、 （ｂ）IL−2Rαおよび前記腫瘍マーカーの存在を示す腫瘍細胞または腫瘍組織 表面からなる第１のパーセンテージを計算する工程と； （ｃ）サイズ、形状特徴、FALSからなる群から選ばれた一またはそれ以上の特 徴を用いる表現型によって同定可能であり、IL−2Rαの存在を示す腫瘍細胞から なる第２のパーセンテージを計算する工程と； （ｄ）第１のパーセンテージを第２のパーセンテージに加えて、 Met-CFC 係数 転移ポテンシャル ０％ ０％ ＜１０％ ＜３０％ ＞４５％ １００％ の関係で転移ポテンシャルの予測に比例する転移コロニー形成細胞(Met-CFC)係 数を得る工程と； からなる固形非リンパ性腫瘍の転移ポテンシャルの予測を決定する方法。 ２．細胞関連IL−2Rαが蛍光顕微鏡検査法、ウェスタンブロット分析、mRNAノ ーザンおよびスロットブロット分析、mRNAの酵素増幅および分析、蛍光標示式細 胞分取法、並びにイムノアッセイからなる群から選ばれた方法によって測定され る請求項１の方法。 ３．前記腫瘍細胞タイプに特異的な腫瘍細胞マーカーが、この腫瘍マーカーに 結合特異性をもつ抗体の使用によって測定され、前記抗体が表２の群から選ばれ る請求項１の方法。 ４．治療を標的器官の転移予測域に指向させ、この転移予測域を、 ａ）擬似休止転移細胞を活性化する治療的に有効な量のIL-2またはIL-1からな る第１の成分と、治療的に有効な量の抗腫瘍薬からなる第２の成分との組合せで あって、標的器官の転移予測域においてタイプ１内 皮細胞によって高濃度に発現された分子に対する結合特異性を有する標的指向剤 であって、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンに対し て結合特異性を有するレクチン分子と、抗ICAM抗体とからなる群から選ばれた標 的指向剤に結合されたものと、 ｂ）毒素、放射性核種または化学治療薬に結合された治療的に有効な量の抗IL −2Rα抗体と、 からなる群から選ばれた複合剤で処理して転移細胞の死をもたらすようにした 固形非リンパ性腫瘍の転移腫瘍細胞または休眠転移腫瘍細胞の抗がん療法。 ５．タイプ１内皮細胞によって高濃度に発現された分子がＮ−アセチルガラク トサミンであり、標的指向剤が小麦胚アグルチニンである請求項４の方法。 ６．複合剤をカテーテルを通して投与し、この複合剤を転移予測域へ直接経管 アクセスさせる請求項４の方法。 ７．転移によって発現された細胞関連IL−2Rαを測定することからなり、処置 前に見出された細胞関連IL−2Rαを発現する細胞の数に対する治療後に見出され た細胞関連IL−2Rαを発現する非リンパ性腫瘍の転移細胞の数の減少が、治療に よる抗がん効力を示すようにした標的器官の転移予測域に指向された固形非リン パ性腫瘍の転移の抗がん治療の効力をモニターする方法。 ８．細胞関連IL-2Rαが、蛍光顕微鏡検査法、ウェスタンブロット分析、mRNA ノーザンおよびスロットブロット分析、mRNAの酵素増幅および分析、蛍光表示式 細胞分取法、並びにイムノアッセイからなる群から選ばれた方法によって測定さ れる請求項７の方法。 ９．腫瘍特異性を有する標的指向剤に結合された治療的に有効な量のIL-2また はIL-1からなる複合剤を全身的に投与することからなり、その標的指向剤が抗TC Rβイディオタイプ抗体およびブドウ球菌腸管毒からなる群から選ばれる固形非 リンパ性腫瘍細胞の免疫療法。 １０．毒素、放射性核種、化学治療剤に結合された治療的に有効な量 の分子からなる複合剤を全身的に投与することからなり、この分子が腫瘍特異的 TCRβイディオタイプに対し結合特異性を有している固形非リンパ性腫瘍の抗が ん療法。 １１．腫瘍特異的TCRβイディオタイプに対し結合特異性をもつ分子が抗 TCR βイディオタイプ抗体である請求項１０の方法。 １２．腫瘍特異的TCRβイディオタイプに対し結合特異性をもつ分子がブドウ 球菌腸管毒である請求項１０の方法。 １３．固形非リンパ性腫瘍の試料から細胞関連IL−2Rαを測定する試薬と、そ の腫瘍タイプに対して特異的な腫瘍細胞マーカーを別個に測定する試薬とからな る、固形非リンパ性腫瘍の転移ポテンシャルの予測の決定を補助する臨床診断用 キット。 １４．細胞関連IL−2Rαの測定に使用される試薬が、蛍光顕微鏡検査法、ウェ スタンブロット分析、蛍光標示式細胞分取法、およびイムノアッセイからなる群 から選ばれた検出方法に有用な抗IL−2Rα抗体、または、mRNAノーザンおよびス ロットブロット分析、並びにmRNA酵素増幅および分析からなる群から選ばれた検 出方法に有用なIL−2Rα特異的オリゴヌクレオチドからなるIL−2Rα特異的試薬 からなる請求項１３のキット。 １５．腫瘍細胞タイプに対して特異的な腫瘍細胞マーカーを測定する試薬が、 その腫瘍細胞マーカーに対して結合特異性をもつ抗体からなり、この抗体が表２ の群から選ばれたもの、または、それらの組合せである請求項１３のキット。 １６．細胞関連IL−2Rαを測定する試薬と細胞関連腫瘍特異的TCRβイディオ タイプを測定する試薬とからなる群から選ばれた試薬、または、それらの組合せ からなる、固形非リンパ性腫瘍の転移細胞の抗がん治療の効力のモニターを補助 する臨床診断用キット。 １７．細胞関連IL−2Rαの測定に使用される試薬が、蛍光顕微鏡検査法、ウェ スタンブロット分析、蛍光標示式細胞分取法、およびイムノアッセイからなる群 から選ばれた検出方法に有用な抗IL−2Rα抗体、また は、mRNAノーザンおよびスロットブロット分析、並びにmRNAの酵素増幅および分 析からなる群から選ばれた検出方法に有用なIL−2Rα特異的オリゴヌクレオチド からなるIL−2Rα特異的試薬からなる請求項１６のキット。 １８．細胞関連腫瘍特異的TCRβイディオタイプの測定に使用される試薬が、 蛍光顕微鏡検査法、定量蛍光分析およびイムノアッセイからなる群から選ばれた 検出方法に有用な抗 TCRβイディオタイプ抗体、または、mRNAノーザンおよびス ロットブロット分析、並びにmRNAの酵素増幅および分析からなる群から選ばれた 検出方法に有用なTCRβイディオタイプ特異的オリゴヌクレオチドからなるTCRβ イディオタイプ特異的試薬からなる請求項１６のキット。 １９．細胞関連IL−2Rαを測定する試薬からなる、固形非リンパ性腫瘍の転移 の抗がん治療の効力のモニターを補助する臨床診断用キット。 ２０．細胞関連IL−2Rαの測定に使用される試薬が、蛍光顕微鏡検査法、ウェ スタンブロット分析、蛍光標示式細胞分取法、およびイムノアッセイからなる群 から選ばれた検出方法に有用な抗IL−2Rα抗体、または、mRNAノーザンおよびス ロットブロット分析、並びにmRNAの酵素増幅および分析からなる群から選ばれた 検出方法に有用なIL−2Rα特異的オリゴヌクレオチドからなるIL−2Rα特異的試 薬からなる請求項１９のキット。 ２１．治療的に有効な量のIL-2またはIL-1からなる第１の成分と、これに組み 合わされた治療的に有効な量の抗腫瘍剤からなる第２の成分とからなり、第１成 分および第２成分が、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびＮ−アセチルグルコサ ミンに対して結合特異性を有するレクチンと、細胞外接着分子に対して結合特異 性を有する抗体とからなる群から選ばれた標的指向剤に結合されている、転移予 測域に抗がん治療を的中させるのに有用な複合剤。 ２２．さらに、表面にレクチンまたは抗体が組み込まれたリポソームからなり 、このリポソーム内に前記第１および第２の成分が組み込まれ た請求項２１の複合剤。 ２３．レクチンが小麦胚アグルチニンである請求項２１の複合剤。 ２４．細胞関連IL−2Rαを発現する固形非リンパ性腫瘍またはその転移からな るがん細胞に抗がん治療を的中させるのに有用な複合剤であって、毒素、放射性 核種または化学治療剤からなる群から選ばれた第２成分に結合された抗IL−2Rα 抗体からなる第１成分からなる複合剤。
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