CN1130944A - 实体非淋巴瘤及转移瘤的诊断、预测和治疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对实体非淋巴肿瘤中细胞相关性白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)表达的测定，及其在预测肿瘤转移可能性、诊断非淋巴肿瘤转移位置和监测抗非淋巴肿瘤转移细胞的抗癌疗法效果的应用。提供了将上述抗癌疗法直接靶作用于产生转移灶的前转移区的方法，包括用IL-2Rα作为抗癌疗法中所用化合物的靶试剂。本发明还涉及使用T-细胞受体(肿瘤特异性TCRβ基因型)监测抗癌疗法对抗非淋巴肿瘤的效果，及将其作为所用化合物的靶试剂。

Description

实体非淋巴瘤及转移瘤的诊断、预测和治疗法
本发明的领域
本发明涉及一种新的方法，以表明白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)的表达与非淋巴肿瘤转移瘤(转移可能性)发生可能性之间的关系，该方法中利用对肿瘤细胞所表达的IL-2Rα的测定以建立一种对转移瘤的预测方法；有助于转移位置的诊断；对转移前区域施以治疗措施，并对肿瘤，特别是转移肿瘤细胞，或具有高度转移可能性的肿瘤细胞的治疗效果进行监测。本发明还涉及由实体非淋巴肿瘤表达T-细胞受体β链(TcRβ)或其肿特异性变异体，以及治疗措施的实施方法，和对这些肿瘤治疗效果的监测方法。本发明的技术背景1.肿瘤转移
肿瘤转移是指恶性肿瘤向远离原发灶的第二部位的扩散。肿瘤转移给肿瘤科临床医带来了诊断和治疗恶性肿瘤的困难，因为(a)转移瘤可以是非常少的细胞甚至是一个细胞，从而在临床上即使是用现代技术也可能出现漏诊；(b)通常在病人被诊断为是一种恶性非淋巴肿瘤的同时已经接种了转移灶(Silverberg et al.，1989，CA Cancer  J.Clin.39：3-21)；(c)在治疗上比原发肿瘤的简单外科切除更为复杂；(d)对于转移性非淋巴肿瘤，如肾细胞癌(Rosenberg et al.，1985，N.Engl.J.Med.313：1485-1492)，的系统性治疗效果不佳，存活率很低；和(e)不是所有的恶性肿瘤具有相同的转移可能性，并且尚没有建立起确定任何特定非淋巴瘤会发生转移的直接联系。2.T-细胞表面分子，白细胞介素-2，和IL-2受体
已经利用单克隆抗体对T细胞表面分子如人白细胞抗原分化簇(CD)进行了特征化和分类。T细胞受体(TCR)是在T淋巴细胞表面上表达的一种完整膜蛋白，表现为一种连接与CD3非共价相连的杂二聚体的二硫键。TCR被认为与自身免疫性疾病相关，因为抗TCR抗体表现出对自身免疫性疾病有治疗效果(Basiet al.，1992，J.Immunol.Methods 155：175-191)。在T细胞表面分子中，Kung等人公开了儿童血清中可溶性CD8浓度的增加与非何杰金氏(Hodgkins)淋巴瘤相关(美国专利No.5,006,459)。CD8含量水平的升高表明与淋巴瘤的发生及对治疗的反应相关。
IL-2和IL-2受体(IL-2R)相互作用调节T细胞免疫反应。IL-2R的存在根据其对IL-2的结合亲和力及两种结合蛋白(α和β链)的不同组合而分为三种类型。高亲和性IL-2R含有α和β链，中等亲和性的IL-2R含有β链，而低亲和性的IL-2R含有α链(Leonard等人，1990，Prog.Clir.Biol.Res.，352：179-187)。IL-2Rα只在活化T细胞上被表达，已经表明IL-2通过刺激α链而表现出其T细胞生长促进效果。Kung等人(如前所述)公开了患有活性淋巴癌如白血病和淋巴癌的病人血清IL-2受体(IL2R)的升高；并且可溶性ILR2的浓度代表了与淋巴癌的严重程度及预防的直接关系。他们还公开了患有非淋巴性肿瘤的病人一般可溶性ILR2受体不升高。另外，可溶性ILR2的含量水平与循环的带有IL-2R的淋巴细胞数量相关性不太大。
利用淋巴激活素的免疫疗法已被用来作为一种系统性的抗癌疗法以试图激活宿主抗肿瘤细胞的免疫反应。已公开了各种不同的含有IL-2的组合物，包括：Grimm等人的美国专利No.5,229,109公开了低活性IL-2类似物；Nitecki等人的美国专利No.5,089,261公开了与一种聚合物共轭结合的IL-2以降低致免疫性和增加可溶性及循环半衰期；Wiltrout等人的美国专利No.5,061,488和5,126,129描述了黄酮-8-乙酸和重组IL-2的组合物及结合方法；Zimmerman等人的美国专利No.5,098,702公开了一种IL-2和/或干扰素-β与抗肿瘤细胞的肿瘤坏死因子的组合物；McGrogan等人的美国专利No.4,939,093公开了制备人IL-2样多肽的方法；和Yoshimoto等人的美国专利No.4,789,658公开了人IL-2的生产及在治疗疾病包括肿瘤在内方面的应用。Rosenberg的美国专利No.4,690,915公开了惯用的免疫疗法，包括用免疫细胞，淋巴激活素激活的淋巴细胞，和IL-2免疫疗法一起治疗病人。
因此，技术背景和相关现有技术中并没有公开IL-2Rα的存在与实体非淋巴瘤的转移或转移可能性之间的相关性。而且，并没有已知的方法来利用IL-2Rα的存在建立对非淋巴肿瘤转移可能性的预测方法；或用于诊断或将抗癌药输送作用于其转移灶。除了惯用的系统给药方法之外，背景技术和相关现有技术中并没有公开将抗非淋巴转移瘤细胞的抗癌治疗药直接给药到器官发生转移的区域中(转移前区域)的方法。另外，一直没有公开在非淋巴瘤上表达TCRβ及TCRβ代表在抗能表达TCRβ的肿瘤方面直接抗肿瘤疗法的靶器官。本发明方法一般有助于对患有非淋巴肿瘤及其转移瘤或具有高度转移可能性的非淋巴瘤的诊断和抗癌方法。本发明的概述
本发明的一个基本目的是提供一种通过测定IL-2Rα的肿瘤细胞相关表达来确定非淋巴肿瘤转移可能性的方法。
本发明的另一个目的是提供了一种将抗癌药物靶作用到非淋巴肿瘤及其转移灶或具有高度转移可能性的非淋巴肿瘤的方法。本发明的相关目的是提供了将抗癌转移细胞的抗癌疗法靶作用于受累器官前转移区域的方法和化合物。
本发明的另一个目的是提供一种对抗非淋巴瘤及其转移灶或具有高度转移可能性的肿瘤的抗癌疗法有效性的监测方法。附图的简要说明
图1是一种表示转移灶次数与每个黑素瘤细胞平均荧光强度(IL-2Rα表达)关系曲线的坐标图，其中圆圈A、B、D和E代表不同治疗前组别的细胞和接受该相关组细胞的动物转移灶。
图2是一种表示肝脏中转移灶的数目与整个样本的平均强度(与IL-2Rα的表达相关)关系曲线的坐标图，其中圆A-E代表不同治疗前组别的细胞及接受该相关组别细胞的动物的转移灶。
图3是一种表示肝脏中转移灶的数目与表达IL-2Rα的细胞百分率相关曲线的坐标图，其中圆圈A-E代表不同治疗前组别的细胞，和接受该相关组别细胞的动物的转移瘤。
图4是一种表示用若丹明标记的小麦胚凝集素对前转移区(亮区)中1型内皮细胞结合亲和力与肝脏其他结构(暗区)的肝脏切片照片。
图5表示对应于IL-2的细胞生长。
图5A是B16F10细胞增殖与IL-2浓度的相关曲线图。
图5B是CTLL-2细胞增殖与IL-2浓度相关曲线图。本发明的详细说明
本发明涉及对TCRβ，或其保瘤特异性变异体，和/或由非淋巴癌细胞表达的IL-2Rα的测定。利用对IL-2Rα的测定可有助于诊断转移肿瘤和确定实体非淋巴肿瘤的转移可能性。利用对IL-2Rα或TCRβ的测定可以将抗癌药靶作用于表达该相关受体的非淋巴肿瘤；和对能表达该受体的这种肿瘤的抗癌疗法效果的监测。本发明由分为三组的前述成份组成：
1.肿瘤转移可能性的预测方法及转移肿瘤的定位方法。
2.用抗癌治疗剂对前转移区域局部治疗的方法，包括将化合物直接靶作用于肿瘤转移集落形成细胞并使转移的肿瘤细胞处于不活动状态，和监测该治疗的效果。
3.用抗癌疗法直接治疗表达TCRβ的非淋巴肿瘤细胞，或肿瘤一特异性β链变异体。1.肿瘤转移可能性(肿瘤转移的潜在危险)的预测方法和转移肿瘤位置的诊断1.1 IL-2Rα表达与肿瘤转移可能性之间的关系。
本发明提供了检测由实体、非淋巴肿瘤表达的IL-2Rα的方法。在本发明的一个实施方案中，在实体，非淋巴肿瘤上/中测定IL-2Rα的细胞相关性表达。实验表明人和实验性非淋巴肿瘤上的转移肿瘤细胞表达的IL-2Rα与其肿瘤转移的潜在可能性相关。而且，所获得的转移肿瘤的数目与表达IL-2Rα的肿瘤细胞百分率直接成比例关系。下的的A至E章节中的实施例表述了使用选自下列一组方法中的一种或几种方法对人和实验性肿瘤中的细胞相关性IL-2Rα的检测：荧光显微技术(测定表面IL-2Rα)，Western印迹分析(测定内部和膜IL-2Rα部分)，mRNA Northern和狭槽(Slot)印迹分析(测定IL-2Rα m-RNA表达)，mRNA的酶放大和分析(测定IL-2Rα m-RNA表达)，和荧光激活细胞分类(FACS，测定表面IL-2Rα)分析方法。按下述获得人和实验性肿瘤：由Dr.MF Poupon(Pairs)提供B16F10黑素瘤细胞。结肠51B和结肠51B Lim10细胞由Dr.R.Bresalier(美国)提供。MCA-26细胞由Dr.I.Fidler(美国)提供。MMC-7489和细胞由Dr.J.Vaageard(美国)提供。SW480，SW480E，SW480R和SW620由Dr.I.B.Weinstein提供。人活组织检查由Dr.Alonso和Dr.Pellin(西班牙)提供。所有肿瘤细胞系在塑料T型瓶中生长，T型瓶置于5％CO2潮湿空气中，在足够的培养基中补充10％FBS，并含有青霉素和链霉素。A. IL-2Rα的荧光显微检查
使含有非淋巴肿瘤的肿瘤活体组织或外科样本分解，并制备得适用于荧光分析。或者，将肿瘤细胞培养在8孔载玻片(Bitek)中培养48小时，然后除去上清液，用PBS轻轻冲洗培养孔，并在Carnoy在固定液中固定。三次PBS冲洗之后，在含有4μl/ml FITC-鼠抗小鼠-IL-2RαIgG2单克隆抗体(AMT克隆，Boehringer Manheim)的PBS溶液中将该细胞于37℃下培养30分钟。孵化培养之后，用PBS冲洗培养孔两次。只用FITC鼠抗小鼠-IgG2单克隆抗体(Boehringer Manheim)制备对照样本。用激光扫描荧光显微镜观察细胞。B.对IL-2Rα进行Western印迹分析
为了进行Westen印迹分析，将5×106肿瘤细胞和对照组细胞(ConA激活的脾细胞和CTLL-2细胞)收集在含有/1mM PMSF的PBS中。冲洗之后，使用一种50次冲击(Stroks)的Dounce均浆器在含有0.25M蔗糖，1mM MgCl2，5mM CaCl2和蛋白酶抑制剂混合物的10m Tris-HC pH7.4缓冲液中将该细胞于冰上均浆。离心沉淀细胞(以6000xg离心10分钟)之后，将除去细胞核的上清液再以100,000xg离心1小时得到细胞质部分和粗制细胞膜部分。进行聚丙烯酰胺凝胺电泳。通过在40V下进行电泳迁移2小时将蛋白迁移到硝化纤维素滤纸上。然后将滤纸在含有3％普通血清的抗生物素蛋白D阻过溶液中孵育，之后用TTBS洗涤三次。以1∶40的稀释度向TTBS中加入单克隆抗体抗小鼠白细胞介素-2受体，并孵育2小时。洗涤三次之后，以1∶200的稀释度向TTBS中加入生物素化的兔抗鼠IgG保持1小时。用TTBS洗涤三次之后，将印迹与抗生物蛋白DH和生物素化的辣根过氧化酶H一起保温孵育30分钟。然后将印迹与DAB一起孵化，棕色沉淀表明抗体结合部位。分子量(MW)标记物蛋白是：β-半乳糖苷酶(116Kd)，牛血清(66Kd)，蛋血清(45Kd)和碳酸酐酶(29Kd)。
也可以通过使用IL-2Rα作为抗原的检测方法检测这种细胞的膜部分或细胞质提取物中由非淋巴细胞表达的细胞相关IL-2Rα的物理存在。这种检测包括现有技术中已知的任何免疫检测系统，包括，但不限于，放射免疫测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)，″夹层(Sandwich)″检测，沉淀素反应，凝集作用检测，和荧光免疫测定。C.mRNA Northern和狭槽(slot)印迹分析
由脾细胞，ConA活化的脾细胞和肿瘤细胞获得mRNA。对未处理的和体外预处理的肿瘤细胞进行检查。将癌细胞在常规的含有125U/ml IL-2培养基中于5％CO2中，或在含有10U/ml IL-1β的培养基中，或含有5μg/ml ConA的培养基中孵育24小时来完成对肿瘤细胞的预处理。通过将细胞简单地暴露于0.1％胰蛋白酶和2mMEDTA，然后在加有10％FBS的DMEM中于离心瓶中在5％CO2下孵育48小时，对细胞进行分离。
在对mRNA进行提取和定量之后(通过0.7％琼脂糖凝胶电泳表明是完整未受损的)，在含有2.2M甲醛的1.2％琼脂凝胶上分离到总量为20μg的纯化RNA。在80V下进行电泳。从凝胶上切下含有标准分子量的泳道，并测定迁移距离。洗涤凝胶并转移到硝化纤维素滤纸上。或者，用狭槽(Slot)印迹设备将RNA样本印迹到预选用10×SSC浸透的硝化纤维素滤纸上。将2微克的mRNA稀释于最终体积为100μl的10×SSC-甲醛中，并在印迹反应之前在65℃下加热10分钟使其变性。用UV辐射将mRNA交联到硝化纤维素滤纸上。将印迹在6×SSC，0.5SDS，5×Denhardt’s，10mMEDTA，50μg/ml剪切的鲑精子DNA，和50μg/ml的大肠杆菌tRNA中于45℃进行预杂交4小时。同时根据常规方法对5毫纤摩尔的鼠或人IL-2Rα和IL-2的DNA探针(Amgen Biologicals)通过用γ-32P ATP5’末端标记寡聚核苷酸探针的方法进行标记。通过随机引导对100μg的人β-肌动蛋白DNA探针(Clontech)进行标记。使用放射性标记的探针(2×109cpm/μl特异性放射活性)在45℃下进行mRNA印迹杂交反应24小时。然后在杂交温度下用5×SSC-0.1SDS洗涤印迹20分钟。将印迹暴光于X线胶片上并在-70℃下对各种不同阶段进行强度扫描筛选。通过在100℃的无菌水中将滤纸孵化10分钟从滤纸上除去探针，并将该滤纸与其他探针再杂交。用图像密度测定法对10个放射自显影照片进行定量分析。D.肿瘤细胞mRNA的酶放大反应
通过从非淋巴肿瘤细胞中提取和纯化mRNA，并将纯化的mRNA进行酶放大反应获得足够量的用于分析和检测的mRNA以检测IL-2RαmRNA的表达。可以使用的酶放大技术包括本领域中已知的那些方法，如PCRTM(聚合物酶链反应)，QB复制酶(replicase)，和NASBA(核酸序列基础性放大)。对放大的核酸的检测方法包括本领域中已知的技术，包括，但不限于，琼脂糖凝胶电泳和Northern印迹反应；荧光基础性杂交反应检测，和捕获性杂交反应微效价检测。可以由IL-2Rα基因的核酸序列合成寡聚核苷酸引物和探针(Leonard等人，1984，Nature 311：626-631)。可以用本领域中熟练技术人员已知的方法合成探针，并结合上非同位素或同位素标记物。或者，可以将标记物直接结合到放大产物上。
在这个实施例中，使用从商业上买到的IL-2R和IL-2Rα基因的引物通过PCRTM对由提取的肿瘤细胞mRNA通过反转录而获得的单链cDNA进行放大。在1.2％琼脂凝胶上分离放大产物，并用溴化乙锭对阳性和阴性对照进行染色。用Photoquant Sys-temTM(BAF，Spain)进行定量测定。E.FACS分析
将肿瘤细胞在24孔培养板上培养48小时，然后除去上清液，用PBS轻轻洗涤各培养孔，并从组织培养板上轻轻刮下细胞，在含有1μg/ml鼠抗小鼠-IL-2Rα单克隆抗体的PBS溶液中于4℃下孵育30分钟。洗涤之后，将细胞在含有20μg/ml FITC-兔抗鼠Ig抗体的PBS溶液中于4℃孵育30分钟，用1％对甲醛固定，并用FACS(Coulter)在48小时内分析。在所有情况下，只用第二种抗体制备对照组。用脾细胞作为阴性对照，用ConA活化的脾细胞作为抗原表达的阳性对照。用荧光活化细胞分类仪对肿瘤细胞上IL-2Rα表达进行定量分析。
表1包括了人和实验性非淋巴肿瘤中癌转移可能性与其细胞相关性IL-2Rα表达的比较。通过临床观察测定人肿瘤的体内转移可能性。通过体内肿瘤细胞生长和转移效率分析确定实验性肿瘤的转移可能性(在下面1.1，F章节进行了描述)。
表1表明了IL-2Rα细胞相关性表达与已确定了转移可能性的实验和人非淋巴肿瘤的癌转移可能性有良好的相关性。
                  表1
    非淋巴肿瘤细胞的IL-2Rα表达与转移可能性肿瘤        描述         转移      mRNA  表面  内部
                    可能性    IL-2α IL-2Rα IL-2Rα小鼠肿瘤3LLp100     Lewis肺癌     低        无    -     无MMC4908     乳腺癌        低        ND    -    10％*MMC7849     乳腺癌        高        ND    +    100％*MCA26       结肠癌        高        ND    +    100％*MCA38       结肠癌        低        ND    -    75％*51B         结肠癌        低(1)     ND    -    10％*51B-Lim10   结肠癌        高(1)     ND    +    100％*B16F10      黑素瘤        高        高    +    100％*B16F10LM(B) 肝转移小病灶  转移瘤    ND    ND   100％*
        黑素瘤人肿瘤SW480E        结肠癌        低(2)    低    -    ＜1％*
          原发癌(CL)SW480         结肠癌        低(2)    低    +    10％*
          原发癌(CL)SW480R        结肠癌        高(2)    高    +    100％*
          原发癌(CL)SW620         结肠癌        高(2)    高    +    100％*
          转移瘤(CL)PC3           前列腺癌(CL)  ND       ND    +    75％*MCF7          乳腺癌(CL)    ND       ND    -    50％*A549          肝癌(CL)      ND       ND    -    50％*HepG2         肝癌(CL)      ND       ND    -    75％*LS174T        结肠癌(CL)    ND       ND    -    50％*VA59P(B)      骨肉瘤        原发癌   低    NDVA59M(B)      淋巴非转移癌  转移     高    ND
          (VA59P)BICO5P(B)     结肠癌        原发癌   ND    ND   5％**BIC52MH(B)    肝转移癌      转移     ND    ND   75％**
          (BIO5P)BIM01MG(B)    淋巴非转移癌  转移     ND    ND   75％**
          黑素瘤BIM02MG(B)    淋巴非转移癌  转移     ND    ND   75％**
          黑素瘤(CL)培养的细胞系(B)从病人身上获得的组织样本*    以非常显著量(荧光强度大于阴性对照强度的10倍)表达
IL-2Rα的肿瘤细胞百分率。**  以定量荧光显微技术测定的肿瘤组织切片中由阳性细胞
覆盖的表面区域的百分率。(1) Bresalier等人，1987，Cancer Research 47：1389-1406(2) Tomita等人，1992，Cancer Research 52：6480-6487F.转移灶数目与表达细胞相关性IL-2Rα的肿瘤细胞百分率的
相关性
为了说明这个实施方案，在不同条件下处理B16F10黑素瘤细胞，以便将转移灶数目与表达IL-2Rα的转移瘤细胞的密度或百分率进行比较。体外预处理包括在下述溶液中于37℃5％CO2中孵育不同组的细胞：A)在常规生长培养其中保温24小时(对照)；B)在含有125U/ml IL-2的培养基中保温24小时(激活转移瘤细胞的生长)；C)在含有10U/ml IL-1β的培养基中保温24小时(激活细胞生长)；D)在含有5μg/ml ConA的培养基中保温24小时(激活细胞生长)；或E)通过大致暴露于0.1％胰蛋白酶和2mM EDTA中来分离细胞，并在离心(Spinner)瓶中的DMEM加10％FBS中孵育细胞48小时(加强细胞生长)。
在体外预处理之后，从含有代表5个组中每个组的细胞的平板中除去上清液；用PBS轻轻洗涤细胞；从组织培养平板上轻轻刮下附着的细胞；将该细胞在含有1μg/ml鼠抗小鼠IL-2Rα单克隆抗体的PBS溶液中于4℃下保温30分钟。洗涤之后，将细胞在含有20μg/ml FITC-兔抗-鼠Ig抗体的PBS溶液中于4℃下保温30分钟。然后用1％对甲醛固定细胞，并在48小时通过FACS对IL-2Rα表达进行定量分析。为了进行抗原表达，用脾细胞作为阴性对照，用ConA活化的脾细胞作为阴性对照。
将体积为0.05毫知的来源于5个不同预处理组中每个组的总量为5×105的存活癌细胞注射到麻醉小鼠脾脏的上段。将来源于每个不同预处理组的细胞注射到一组20个小鼠中。5分钟后对动物进行脾切除。在肿瘤细胞注射7天之后颈脱位处死一组件的20个动物；取出其肺脏和肝脏，并冷冻在液态氮中。以200μm的间隔用恒冷切片机切下10和40μm肝脏连续切片。对这些切片进行琥珀酸脱氢酶染色(SDH-染色)；于-20℃下在丙酮中浸45秒钟，然后在PBS中洗涤2次5分钟。用带有成像分析设备的显微镜检查切片。通过透射光(SDH-染色)获得每个区域的成像。单个病灶被清楚地描述为肝脏组织的非SDH染色区。根据所述的立体学判断标准(Aherne & Dunnill，Morphometry，ed.Edward Arnold，London，1982)，使用特别修改的软件(DPLAN，Spain)由成像分析数据计算每个肝脏中的单个病灶的出现频率和体积以及总瘤体积。
图1和2描述了结果。图1表示的是每个不同预处理组中细胞的转移灶数目与每个细胞(10,000个细胞的平均数)表达的IL-2Rα数量的相关曲线，结果表明IL-2Rα细胞表达的增加与转移灶数目的增加呈相关性。例如，在暴露于ConA的那些细胞中发现每个细胞表达出最大量的IL-2Rα受体。ConA活化的黑素瘤细胞也是一组转移灶数目最大的细胞(图1，圆圈D)。图2表示的是肝脏中转移灶的数量与整个样本中IL-2Rα表达(与由LISA测定的表达相似)的相关曲线，结果表明显示出IL-2Rα表达平均强度的样本与肝脏中转移灶数目相对应。例如，具有最高IL-2Rα表达强度的黑素瘤细胞样本，暴露于ConA的细胞，也是产生最高数量转移灶的细胞样本(图2，圆圈D)。1.2非淋巴肿瘤IL-2Rα细胞相关性表达的测定在临床上的
应用A.确定肿瘤转移的预后
由于在非淋巴肿瘤的诊断和治疗方面存在转移的问题，希望有一种确定癌转移预后的方法。用于确定癌转移预后的一种方案包括下列步骤：
(a)获得原发肿瘤的样本(手术前活组织检查或手术中活组织检查)
(b)使用在上面1.1 A-E章节中所述的任何一种方法或它们的组合获得具有IL-2Rα的非淋巴细胞百分率。非淋巴肿瘤活组织检查及肿瘤类型将影响适合于确定该样本中IL-2Rα细胞相关性表达的最佳方法选择。例如，包括有进行荧光显微方法试剂的临床诊断药盒最适合于测定冷冻非淋巴肿瘤组织的组织学切片或固定和包埋肿瘤组织的组织学切片中的IL-2Rα细胞相关性表达。用于测定分离的非淋巴肿瘤组织细胞中IL-2Rα细胞相关性表达的临床诊断试剂盒可以含有用于ELISA的试剂和微滴定板；用于FACS分析的试剂，或用于PCRTM分析的试剂，包括特定的引物和探针。临床诊断药盒一般基本上含有两种成份：(1)偶合到一种报告化合物如荧光色素、发色团或酶上的抗IL-2Rα抗体。这类化合物的例子包括碱性磷酸酶，荧光素-5-异硫氰酸盐，过氧化物酶，藻红蛋白，和若丹明；(2)本领域熟练技术人员已知的抗与特定肿瘤类型相关的癌细胞标记物(TCM)的抗体。可以用于本发明方法的抗与特定肿瘤类型相关的癌细胞标记物的抗体包括但不限于下述表2中所列举的那些。
                  表2抗-TCM抗体                             特定肿瘤类型HEA 125 MAb，HT29-15 MAb或B72.3 MAb    结肠直肠癌BCD-B4 MAb或NCRC-11 MAb                乳腺癌抗PSA抗体或PD41 MAb                    前列腺癌ALT-04 MAb                             肺癌B72.3 MAb，HMD4 MAb或COC183B2          卵巢癌HEA-125 MAb，MM46 MAb，或9.2.27MAb     黑素癌MGb 2 MAb，或ZCE 025 MAb               胃癌BW494 MAb                              胰腺癌CEB9 MAb                               宫颈癌HSAN 1.2 MAb                           成神经细胞瘤HISL-19 MAb                            神经内分泌瘤TRA-1-60 MAb                           精原细胞瘤MAb-单克隆抗体
使抗-TCM抗体偶合到一种可以与偶合到抗IL-2Rα抗体上的荧光色素、发色团或酶区分开的荧光色素、发色团或酶。
为了确定肿瘤转移的可能性，对非淋巴肿瘤测定两种百分率。第一种百分率是测定表示两种抗原(IL-2Rα+，TCM+细胞)的肿瘤细胞百分率或肿瘤组织表面的百分率。第二种百分率是测定可通过表型(包括大小、形状特征、流动血细胞计数前角光散射(FACS))识别的，并且是IL-2Rα阳性(肿瘤细胞表型+，IL-2Rα)的肿瘤细胞的百分率。两种百分率之和是转移集落形成细胞的系数(Met-CFC系数)。Met-CFC系数与肿瘤转移可能性成比例关系。实验性测定如下：
Met-CFC系数    转移可能性
    0％            0％
 ＜10％         ＜30％
 ＞45％          100％
注意IL-2Rα表达本身可以用来实验性确定肿瘤转移，因为T细胞被排除在纯化肿瘤之外。尽管如此，为了从肿瘤活组织查中排除T细胞IL-2Rα表达，要将抗TCM和肿瘤表型与IL-2Rα同时使用。
为了说明这个实施方案，并且只以IL-2Rα表达为依据，在不同条件下处理B16F10黑素瘤细胞以对比肿瘤转移效率和IL-2Rα表达。按照上面F章节所述体外预处理B16F10细胞，不同的是预处理包括在下列溶液中孵育不同组的细胞：A)在常规生长培养基中孵育24小时(对照)；B)在含有125U/ml IL-2的培养基中孵育24小时(激活肿瘤转移细胞的生长)；C)在含有10U/mlIL-4的培养基中孵育24小时(阻过IL-2Rα的表达)；D)在含有5μg/ml ConA的培养基中孵育24小时(激活细胞生长)；或E)通过大致暴露于0.1％胰蛋白酶和2mM EDTA来分离细胞，然后在Spinner瓶中的DMEM和10％ FBS中将细胞孵育48小时(加强细胞生长)。按照上面F部分所述进行FACS分析以分析IL-2表达和体内肿瘤细胞生成，以及进行肿瘤转移效率分析，不同的是每组由6个小鼠组成而不是20只。结果表示在表3中，结果显示如果细胞表达IL-2Rα小于10％，大约30％的小鼠发生肿瘤转移(B16F10，未处理的；和IL-2处理的细胞)；如果没有细胞表达IL-2Rα，任何鼠中都没有出现肿瘤转移(0％小鼠，用IL-4处理的细胸)；如果35％的细胞表达IL-2Rα，发生肿瘤转移的小鼠大于80％(生长在混悬液中的B16F10)；而如果大于50％的细胞表达IL-2Rα，则有100％的小鼠出现肿瘤转移(用ConA处理的B16F10)。
                表3预处理            细胞的表面IL-2Rα            肿瘤转移小鼠数B16F10(未处理)        7.4±5.7                2/6B16F10+IL-4           0                       0/6B16F10+IL-2           9.8±6.3                2/6B16F10+ConA           59.5±4.8               6/6混悬液中的B16F10      35.4±2.2               5/6
已发现高的原数与本文所述的″前转移区域″优先相关，或甚至表明有全部肿瘤转移。2.对前转移区域局部使用抗癌疗法治疗，包括将化合物直接靶作用于转移集落形成细胞，并使转移肿瘤细胞处于非活化状态，和监测该疗法的效果2.1前转移区域
用IL-2融合毒素有效地处理血液恶性肿瘤，包括白血病和淋巴癌，该毒素可选择性地结合带有高亲合性IL-2受体的细胞，并使其中毒(LeMaistre等人，1992，Immunol-Res.，11，42-53；和Waldmann等人，1992，Ann Intern Med.116：148-160)；和用抗高亲和力IL-2受体的人抗体(hIL-2R)或用连接有毒素或放射核素(Waldmann等人，1992，如前所述)的抗-hIL-2R处理该血液恶性肿瘤。本发明在治疗实体非淋巴肿瘤的转移灶和冶疗具有高度转移可能性的实体非淋巴肿瘤方面，其治疗方法在几个重要方面有所不同。血液恶性肿瘤表达能够被IL-2和抗-hIL-2R有效结合的hIL-2R(含有α和β链)。而且，根据恶性肿瘤的性质，用IL-2-毒素或抗-hIL-2R-毒素或抗-hIL-2R的治疗包括系统性输注。由于本发明已表明在实体非淋巴肿瘤的转移潜在危险性与IL-2-毒素或抗-hIL-2R-毒素或抗-hIL-2R的结合亲合力较低。因此，本发明用于治疗实体非淋巴肿瘤的转移灶和具有高度转移可能性的实体非淋巴肿瘤的抗癌疗法之一是包括给药一种有效治疗量的连接有毒素、放射性核素，或化疗药的分子，其中该分子对IL-2Rα有特异性(即，具有高度的结合亲和力)，如人抗-IL-2Rα抗体。
尽管IL-2Rα对IL-2的亲和力较低，在前转移区域聚集相对小剂量的IL-2可以激活休止的转移肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物更敏感。因此，根据本发明，用于治疗转移集落形成细胞和休止转移肿瘤细胞的另一种方法包括对前转移区域同时给药IL-2和抗肿瘤药物。注意根据本发明此实施方案的抗癌疗法不包括系统性给药，但还包括将治疗药物直接靶作用于前转移区域。
可以通过区域的血管系统、末端糖浓度、和从该区域中获得的细胞表面表达的细胞外粘性分子(ICAMS)的浓度来识别本发明抗癌药物靶作用的前转移区域。实体非淋巴肿瘤的转移肿瘤细胞只在含有靶器官如肝脏和肺脏独特毛细血管区的权预测部位发展成为转移灶核(″聚集″)(Barbera-Guillem等人，1989，Cancer Research 49：4003-4010；Barbera-Guillem等人，1992，Int.J.Cancer 53：298-301；Barbera-Guillem等人，1993，Int.J.Cancer 54：880-884)。例如，在肝脏中，前转移区位于肝静脉的门静脉延伸的第一半(基本上在该半区的第二个四分之一区处)窦状区。肝窦的这个区域也被称作是窦状门静脉周区。在肺脏中，前转移区位于末端前肺泡小静脉和胸膜末端毛细血管。在其他器官包括肾上腺中也表现出了类似区域。
所有特征前转移区的共同要素是该区域内的毛细血管含有特定亚群的内皮细胞，称作″1型内皮细胞″(Vidal-Vanachlocha等人，1993，Hepatology 18：328-339)。1型细胞在其细胞表面表现出一种鉴别性特征，它含有带高浓度特定末端糖(N-乙酰基半乳糖胺；Gal NAC)的低聚糖，它比其他毛细血管区中的细胞高6-10倍(Barbera-Guillem)等人，1991，Hepatology 14：131-139；Vidal-Vanachlocha等人，1993，如前所述)。这些特定糖的较高表达其结果是当在前转移区的前循环部位注射植物血凝素时，能够与这些糖特异性结合的植物血凝素优先与1型内皮细胞结合。因此，注射的植物血凝素，如小麦胚凝集素(WGA)，在前转移区被捕获，并且被布散开。这在图4中表示出，其中肿瘤细胞没有聚集和发展的肝脏区域则没有若丹明标记的WGA(暗区)；而含有前转移区域的毛细血管1型内皮细胞被若丹明标记的WGA所结合(亮区)。因此，在肿瘤细胞聚集和发生转移的肝脏靶区域中出现植物血凝素荧光分子的布散。在含有前转移区的毛细血管区中所含较高浓度的植物血凝素反映了在这些区域中有较高末端糖(Gal NAC)浓度的毛细血管1型内皮细胞。
在前转移区域中的肝脏内皮细胞也含有较高浓度的ICAMs。因此，可用对ICAM有特异结合性的配体或抗体作为对这些细胞亚群有特异性靶试剂。肺前转移区也含有含较高浓度ICAMs的内皮细胞(Zhu等人，1993，Int.J.Cancer 53：628-633；Zhu等人，1992，J.Clin.Invest.89：1718-1724)，并且，可以用对ICAM有结合特异性的配体或抗体作为对这些细胞亚群有特异性的靶试剂。
捕获在前转移区的癌转移细胞进入一种休止状态，或处于一种低增殖状态(假休止)，该状态对NK细胞和抗癌药物具有高度抵抗性。在局部低浓度的IL-2和IL-1影响下这些细胞脱离这种状态。当激发引起肿瘤转移细胞的未成熟细胞增殖时，这些细胞则变得对抗肿瘤药和NK细胞更为敏感。
为了说明细胞激动素(Cytokine)浓度与对非淋巴肿瘤细胞生长所产生的效果之间的相关性，将B16F10黑素瘤细胞暴露于不同浓度的IL-L和IL-2，并记录所带来的生长反应。为了测定IL-2对B16F10黑素瘤细胞生长的作用，将104个成活的癌细胞加入到96孔培养板的每个孔中，在不含血清或含有浓度范围为10～200U/ml的小鼠重组IL-2；或20，125或250U人重组IL-2(hrIL-2)的10％FBS补充常规培养基中于5％CO2下将培养物孵育48小时。然后，每孔中加入1μCi的[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，6小时之后收集，并接着测定其中的放射活性。测定IL-1对B16F10黑素瘤细胞生长的作用的技术方案是，将104个成活的癌细胞加入到96孔培养板的每个孔中，在不含血清或含有1.10或20U/ml小鼠IL-1β的10％FBS补充常规培养基中于5％CO2下将培养物孵育48小时。在某些情况下，与IL-1β一起同时加入抗IL-2Rα抗体。每孔中加入1μCi的[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，6小时之后收集，并接着测定其中的放射活性。图5显示高浓度(大于75U/ml)的IL-2诱导死亡或未成熟细胞的细胞生长抑制，但对假休止状态的B16F10癌转移细胞没有影响。在治疗方面重要的是要注意到IL-2浓度大于75U/ml对癌转移细胞的细胞生长具有抑制作用，而浓度在75U/ml和100U/ml之间时对以类似方法制备的淋巴细胞(图5，由CTLL-2代表)没有毒性。表4显示了低浓度的IL-2和IL-1诱导出从假休止到未成熟的步骤，并诱导未成熟细胞的增殖。
                表4细胞激动素/浓度     B16F10反应(平均值，cpm)对照组              60.12±28.5抗-IL-2Rα抗体      40.60±7.9小鼠IL-2(10U/ml)    2057.40±540.7小鼠IL-2(20U/ml)    3619.60±116.2IL-1(1U/ml)         61.85±20.5IL-1(10U/ml)               1083.30±70.5IL-1(20U/ml)               2045.60±448.2IL-1(10U/ml)+抗-IL-2Rα抗体(1μg/ml)    571.19±78.2IL-1(10U/ml)+抗-IL-2Rα抗体(4μg/ml)    98.64±16.8FCS(10％)对照              1594.30±301.3抗-IL-2Rα抗体(4μg/ml)    565.40±66.9小鼠IL-2(20U/ml)           2556.60±566.2FCS(10％)对照              2135.32±245.5hrIL-2(20U/ml)             2012.52±347.2hrIL-2(125U/ml)            2452.22±298.3hrIL-2(250U/ml)            3181.62±231.6
因此，本发明治疗实体非淋巴肿瘤转移灶的方法包括直接对前转移区域施以抗癌疗法。这种方法的优点包括该抗癌疗法是直接靶作用于特定器官的前转移区中的细胞，从而将治疗浓度的抗肿瘤药或毒性剂输送到实体非淋巴肿瘤细胞转移灶所在区域，而尽可减少对免疫和造血系统的损害。2.2直接针对前转移区的抗癌疗法
特别是，根据本发明的抗癌疗法包括一种或几种下列实施方案：
方案(A)将一种含有治疗有效量IL-2或IL-1的化合物，和抗肿瘤药(化疗药)给药到前转移区以避免IL-2对未成熟癌细胞的细胞生长抑制作用，并活化假休止态的肿瘤转移细胞以避免其抗药性，提供足够浓度的抗肿瘤药物使前转移区摄取以达到使转移肿瘤细胞死亡。
在这个实施方案中，可以使用本领域中熟练技术人员已知的方法(如美国专利No.5,284,934)将IL-1或IL-2连接到植物血凝素分子上，也可以将抗肿瘤药物连接到一种植物血凝素分子上，如WGA，并且将这些成分以治疗有效比率混合，提供一种对抗癌疗法的靶部位前转移区域具有高度亲和性的化合物。或者，也可以将抗-ICAM抗体连接到IL-1或IL-2上，以及将相同抗体连接到抗肿瘤药物上，并使这些成份以治疗有效的比例混合，提供一种对前转移区域具有高度亲和力的化合物。可以使用本领域中熟练技术人员已知的方法将这些化合物结合到载体脂质体上以增加该化合物在前转移区的滞留时间。为了实施这个技术方案，构建一种脂质体使其在内部含有若丹明，并在表面结合WGA。向肝门静脉注射这些脂质体可以引起如图4所示的相同荧光分布。另外还注意到1型内皮细胞并不在植物血凝素脂质体中，使它们暴露于相近的肿瘤转移细胞。尽管如此，但是有一种可能的限制因素是通过荧光分析似乎枯否细胞吞噬一小部分植物血凝素脂质体组合物。实施方案(B)向前转移区给药一种化合物，该化合物含有一种连接到毒素、放射性核素、或化疗药上的治疗有效量的分子，该分子对IL-2Rα具有特异性，如人抗-IL-2Rα抗体，从而使所给药的化合物结合被聚集在该区中的转移肿瘤细胞，导致转移肿瘤细胞死亡。
在(A)和(B)两个实施方案中，通过一种导管给药该化合物，以便将该化合物直接导入前转移区的血管途径。也可以在两种实施方案中使用上体1.1章节A-E中所述的任何一种方法或其方法组合，测定IL-2Rα的细胞相关性表达，以监测治疗效果，与治疗开始之前表达细胞相关性IL-2Rα的转移肿瘤细胞数目相比，如果表达细胞相关性IL-2Rα的非淋巴肿瘤的转移癌细胞数目减少，则表明了该抗癌疗法的效果。3.对表示TCRβ，或肿瘤特异性β链变异体的非淋巴肿瘤细胞直接施以抗癌疗法。3.1 TCRβ表达与非淋巴肿瘤之间的关系。
在本发明的这个实施方案中，对于非淋巴肿瘤的抗癌疗法取决于这些肿瘤对T-细胞受体β(TCRβ)和/或β链变异体的表达。
基本上，肿瘤细胞可以表达TCRβ链的几种可变区(最多见的是Vβ8)，它表现出一种高可变性区域成分以表达一种组织和/或肿瘤特异性。不管怎样，由于它与淋巴细胞TCR的功能相似性，即使这些序列具有组织特异性，也不具有致免疫性。但是，它们表现为免疫抑制或无反应性的诱导体成分。因此，根据本发明的一种方法是将抗癌疗法靶作用于表达TCRβ的非淋巴肿瘤细胞。
在本发明的一个实施方案中，测定实体，非淋巴肿瘤上的TCRβ细胞相关性表达。该实验表明，人和实验性非淋巴肿瘤表达TCRβ。在下面A至D部分中的实施例中，描述了使用选自下列一组方法中的一种或几种对人和实验性肿瘤中细胞相关性TCRβ的检测，这些方法包括荧光显微技术(测定表面TCRβ)，mRNA Northern和狭槽印迹分析(测定TCRβm-RNA表达)，mRNA的酶放大和分析(测定TCRβ m-RNA表达)，和定量荧光分析(测定表面TCRβ)。按如下所述获得人和实验性肿瘤：B16F10黑素瘤细胞由Dr.MF Poupon(巴黎)提供。结肠51B和结肠51Blim 10细胞由Dr.R.Bresalier(美国)提供。MCA-26细胞由Dr.I.Fidler(美国)提供。MMC-7489和细胞由Dr.J.Vaageand(美国)提供。SW480，8W480E，SW480R和SW620由Dr.I.B.Weinstein提供。人活组织检查由Dr.Alonso和Dr.Pellin(西班牙)提供。其他的肿瘤细胞系从ATCC获得。使所有肿瘤细胞系在塑料T型瓶中的足量10％ FBS补充培养基中于5％CO2的潮湿空气中生长，该培养基还含有素霉素和链霉素。为了消除人肿瘤细胞样本的可能性淋巴细胞污染，按如下制备样本。在手术条件下从病人身上切下肿瘤样本；在含有青霉素和链霉素的培养基中洗涤；在含有0.02％链霉蛋白酶E(Sigma，美国)和0.05％I型胶原酶的20ml GBSS中于37℃pH为7.4条件下绞碎并搅拌10分钟。然后通过尼龙沙布过滤细胞混悬液，以250xg离心两次10分钟。将分离的细胞皮下植入裸鼠中。肿瘤生长21天之后，取肿瘤细胞样本以进行TCRβ表达研究。A.TCRβ的荧光显微检测
将含有非淋巴肿瘤的肿瘤活检组织或外科样本分解，并直接制备成可用于荧光分析的样本。或者，将肿瘤细胞在8孔的载玻片(Biotek)培养48小时，然后除去上清液，用PBS轻轻洗涤培养孔，并用Carnoy氏固定液固定。三次PBS洗涤之后，将细胞在含有4μl/ml FITC-鼠抗-人-TCRβ(不变区和可变区)单克隆抗体(Genzyme，Boehringer Manheim)的PBS溶液中于37℃下保温30分钟。保温之后，用PBS洗涤培养孔两次。只用FITC鼠抗-鼠-IgG2单克隆抗体(Boehringer Manheim)制备对照组。用激光扫描荧光显微镜观察细胞。B.mRNA Northern和狭槽(Slot)-印迹分析
从脾细胞，ConA-活化的脾细胞，和肿瘤细胞中获得mRNA。在提取mRNA并定量之后(通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分析表明是完整未受损的)，在含有2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上制备总量为20μg的纯化RNA。在80V下进行电泳。从凝胶上切下含有分子大小标准的泳道，并测定迁移距离。洗涤凝胶，并转移到硝化纤维素滤纸上。将2μg的mRNA稀释在最终体积为100μl的10xSSC-甲醛中，并在印迹点样之前于65℃下加热10分钟使其变性。用UV辐射将mRNA交联到硝化纤维素滤纸上。将印迹在6xSSC，0.5SDS，5x Denhardt’s，10mM EDTA，50μg/ml 剪切的鲑精子DNA和50μg/ml的大肠杆菌tRNA中于45℃下预杂交4小时。同时用γ-32P APT根据常规方法通过5’端标记寡聚核苷酸探针来标记鼠或人TCRβ(Clontech)的5微微摩尔DNA探针。通过随机引导来标记100μg的人β-肌动蛋白DNA探针(Clontech)。用放射性标记的探针(2×109cpm/μl特异性放射活性)与m RNA印迹在45℃下杂交24小时。然后在杂交温度下用5xSSC-0.1 SDS洗涤印迹20分钟。将印迹在x-光胶片上曝光，并于-70℃下对各不同阶段进行强度扫度。在100℃的无菌水中保温10分钟从滤纸上除去探针，使滤纸与其他探针再杂交。用影像密度测定仪对10个放射自显影照片进行定量分析。C.肿瘤细胞mRNA的酶放大反应。
通过从非淋巴肿瘤细胞中提取和纯化的mRNA，并将纯化的mRNA进行酶放大反应以获得足够量用于分析和检测，可以对TCRβ mRNA的表达进行检测。可以使用的酶放大反应技术包括本领域中已知的那些方法，如TCRTM(聚合酶链反应)，QB复制酶技术，和NASBA(核酸序列基础性放大反应)。对放大核酸的检测方法包括本领域中已知的方法，包括但不局限于，琼脂糖凝胶电泳和Northern印迹分析；荧光基础性杂交分析；化学发光基础性杂交分析，和捕获性杂交微滴定分析。可以从本领域中证实的TCRβ基因的核酸序列合成寡聚核苷酸引物和探针(Waters等人，1992，Diabetes 41：308-312)。可以用本领域熟练技术人员已知的方法合成探针以结合上非同位素或同位素标记物。或者，也可以将标记物直接结合到放大产物中。
在这个实施例中，对从提取的肿瘤细胞mRNA通过反转录而获得的单股cDNA，使用从商业上购得的TCRβ基因的引物通过PCRTM进行放大。在1.2％琼脂糖凝胶上分离放大产物，并用溴化乙锭与阳性和阴性对照平行染色。用Photoquant SystemTM(BAF，西班牙)进行定量分析。D.定量荧光分析
将肿瘤细胞在24孔培养板上培养48小时，然后除去上清液，用PBS轻轻洗涤该孔，从组织培养板上轻轻刮下细胞，并在含有1μg/ml鼠FITC偶合的抗小鼠-TCRβ单克隆抗体的PBS溶液于4℃下保温30分钟，然后用1％对甲醛固定，并用一种显微荧光测定方法在48小时内分析。在所有情况下，只用第二种抗体制备对照组。用脾细胞作为抗原表达的阴性对照，用ConA-活化的脾细胞作为抗原表达的阳性对照。使用专用软件(ImageI，美国；和Photoquant，西班牙)对肿瘤细胞上的TCRβ表达进行定量分析。
表5表示的是与人非淋巴性肿瘤相关性较好的TCRβ细胞相关性表达。
                表5
    人非淋巴性肿瘤细胞上的TCRβ表达建立的肿瘤细胞系肿瘤    肿瘤类型            TCRβmRNALS174T   结肠癌                +T84      结肠癌                +SW620    结肠癌                +SW480    结肠癌                +R2       结肠癌                +E8       结肠癌                +A549     肺癌                  -SEPPLO   肾癌                  -HELA     宫颈癌                -HL-60    早幼粒细胞白血病      +HepG2    肝癌                  -原发肿瘤活组织检查BVal50         骨肉瘤            -BVal21         骨肉瘤            +BVal84         骨肉瘤            +BVal8          骨肉瘤            +BVal46         骨肉瘤            +BVal76         骨肉瘤            -BVal102        骨肉瘤            +BVal56         骨肉瘤            +BVal88         骨肉瘤            +BVal100        骨肉瘤            +BVal154        骨肉瘤            +BVal-C1594     成视网膜细胞瘤    +BVal-C-700     成视网膜细胞瘤    +BVal611        骨肉瘤            -3.2人实体非淋巴肿瘤的TCRβ细胞相关性表达的临床应用。3.2.1免疫调节
本发明提供了通过TCRβ特异性将化合物直接靶作用于转移肿瘤集落形成细胞以使转移肿瘤细胞处于休眠状态。葡萄球菌肠毒素(SEA，SEB，等)将肿瘤细胞的TCR可变β链连接到带抗原的细胞的CMH II上，接着产生了对免疫系统和肿瘤细胞的共同调节。这些反应与抗大多数肿瘤的免疫反应缺乏有关，并且与变化为保守状态的肿瘤细胞相关，这些细胞即使在原发肿瘤根除多年之后，在偶然的炎症环境下能够被转换过来。
本发明直接向集落形成肿瘤转移细胞、休眠细胞和癌细胞的TCRβ-靶作用方法一般包括下列实施方案所述的免疫调节：实施方案(A)一种调节免疫反应的方法是，提供能够识别每个特定来源(器官、组织、细胞群，等)肿瘤细胞TCRβ-特异性序列的分子，该分子可被免疫系统细胞所识别，控制引导所希望的免疫过程相互作用。这些分子包括葡萄球菌肠毒素或连接到IL-1或IL-2上的抗-TCRβ基因型。实施方案(B)。一种肿瘤增殖调节方法；该方法是提供能够识别每个特定来源(器官、组织、细胞群，等)的肿瘤细胞TCRβ-特定序列的分子，该分子可被免疫系统细胞所识别，控制引导所希望的免疫过程相互作用。
免疫调节或肿瘤增殖调节通过下述过程完成，即根据肿瘤的器官特异性，制备抗不同种类的非淋巴肿瘤细胞的抗-TCRβ基因型单克隆抗体，以用于诊断和药理学用途。或者，根据Basi等人的方法(1992，J.of Immunol.Methods 155：175-191)，制备抗从特定非淋巴肿瘤分离的可溶性人TCRβ的抗体，其中所产生的可以识别由该非淋巴肿瘤表达的细胞表面TCR上的多个表位。使用本领域中熟练技术人员已知的方法将IL-2或IL-1连接到抗-TCRβ基因型抗体上，含有治疗有效量的这IL-2或IL-1的化合物使得该化合物具有有效实现免疫调节的特性。该化合物可以含有被包含在载体脂质体中的IL-1或IL-2，使用本领域中熟练技术人员已知的方法将抗-TCRβ基因型抗体结合到脂质体表面上。这种化合物可以系统给药。3.2.2 TCRβ-靶给药抗肿瘤药物疗法
具体讲，根据本发明的TCRβ-靶给药抗肿瘤药物疗法包括一种含有治疗有效量的连接到毒素、放射性核素、或化疗药物上的分子的化合物，其中该分子是可系统给药的人性化的抗-TCRβ基因型抗体。这种化合物可以含有被包含在载体脂质体中的化疗药物，使用本领域熟练技术人员已知的方法将抗-TCRβ基因型抗体结合到脂质体表面上。使用上面3.1部分A-D所述的任何一种方法或其组合测定TCRβ的细胞相关性表达可以监测治疗效果，或者也可以使用临床诊断药盒测定，该药盒包括使用抗-TCRβ基因型抗体免疫测定方法，其中与治疗开始之前表达TCRβ的非淋巴肿瘤细胞数目相比，表达细胞相关性TCRβ的非淋巴肿瘤细胞数目减少表明了该疗法的抗癌效果。
可以将与肿瘤细胞的抗-TCRβ基因型对应的肽结合到APC的MHCII上下以用于其药理学用途。
为了靶给药以结合TCRβ，考虑到β链的肿瘤特异性变异体的因素，必须从病人身上分离肿瘤细胞以激发抗肿瘤变异体的特异性抗-TCRβ基因型抗体，或确定该变异体的核酸序列，以合成相应肽。
尽管本发明为了清楚和易懂的目的，通过实施例和说明较为详细地描述了本发明，但是从前面的描述和图示可知，各种变化方案对于相关领域中的熟练技术人员是显而易见的。这些变化倾向于包括在本申请的精神范围之内，并包括在附带的权利要求范围之内。
根据PCT条约第十九条修改权利要求的声明相信新的权利要求25和26不会引入新的内容，因为它们得到了申请说明书的支持。美国专利局审查员已同意权利要求25和26被允许(见重新编号的权利要求10和11)。特别是，在25页29～30行至26页的1～2行，可以注意到使用由其本身的IL-2Rα表达预测实体非淋巴肿瘤的转移可能性。在26页23～29行至27页1～11行中所公开的是使用标准动物模型系表示表达IL-2Rα的肿瘤细胞百分率与体内转移瘤发生之间相关性的结果。还提交了在美国专利申请中已提交的Dr.Barbera-Guillem的细则132的声明(附证据)，进一步支持权利要求25和26。该声明提供了其他的证据，包括对人原发肿瘤活检组织的回顾性双盲研究，支持权利要求25中所公开的方法，即，可以单独肿瘤细胞相关性IL-2Rα(即，不使用如表2中所公开的其他肿瘤细胞标记物)即可预测人原发肿瘤的转移可能性。权利要求26公开了用于测定申请说明书中所公开的，在，例如，原始权利要求2和14中也引用的肿瘤细胞相关性IL-2Rα的方法。
权利要求书
按照条约第19条的修改
1.一种确定实体非淋巴肿瘤的转移肿瘤可能性之预后的方法，包括下列步骤：
(a)测定细胞相关性IL-2α，分别测定对来自所说肿瘤样本的该肿瘤类型的特异性的肿瘤细胞标记物；
(b)计算包括肿瘤细胞或表示IL-2Rα存在的肿瘤组织表面和所说肿瘤标记物的第一种百分率；
(c)计算包括过表使用选自下列一组中的一个或几个特征而能够别识的肿瘤细胞的第二种百分率，该组特征包括大小，形状特性，FALS，也表现有IL-2Rα存在的所说肿瘤；和
(d)使第一种百分率与第二种百分离相加，获得一种转移肿瘤集落形成细胞(Met-CFC)系数，所说系数与转移肿瘤潜在危险性的预后以下述关系成比例关系：
Met-CFC系数    肿瘤转移潜在危险性
    0％                0％
 ＜10％             ＜30％
 ＞45％              100％
2.权利要求1的方法，其中使用选自下列一组中的一种方法测定细胞相关性IL-2Rα，该方法包括荧光显微方法，Western印迹分析，m-RNA Northern和狭槽印迹分析，m-RNA的酶放大和分析，荧光活化细胞分类，和免疫测定。
3.权利要求1的方法，其中使用对该肿瘤细胞标记物有结合特异性的抗体测定对该肿瘤细胞类型有特异性的肿瘤细胞标记物，所说的抗体选自根据表2的一组抗体。
4.一种对实体非淋巴肿瘤的转移肿瘤细胞或休眠转移肿瘤细胞的抗癌疗法，所说疗法是直接作用于靶器官的前转移区域，并包括用选自下列一组的化合物治疗该前转移区域，以有效的导致转移肿瘤细胞死亡，该化合物包括：抗体被连接到选自毒素、放射性核素或化疗剂的一种第二组份上。
25.一种预测实体非淋巴肿瘤转移可能性的方法，包括获得实体非淋巴肿瘤细胞的样本，并测定所说肿瘤细胞中IL-2Rα的肿瘤细胞相关性表达，其中实体非淋巴肿瘤的转移可能性被预测为：
(a)在没有肿瘤细胞被测定为表达IL-2Rα时为0％；
(b)当大约1％至大约10％的肿瘤细胞被测定为表达IL-2Rα时，转移可能性大约为30％；和
(c)当大约大于35％的肿瘤细胞被检测为表达IL-2Rα时，转移可能性大于大约80％。
26.权利要求25的方法，其中通过选自下列一组中的方法测定细胞相关性IL-2Rα，这些方法包括荧光显微技术，Western印迹分析，m-RNA Northern印迹和狭槽印迹分析，m-RNA的酶放大和分析，荧光活化细胞分类法，和一种免疫测定方法。

Claims (24)

1.一种确定实体非淋巴肿瘤的转移肿瘤可能性之预后的方法，包括下列步骤：
(a)测定该细胞相关性IL-2α，分别测定对来自所说肿瘤样本的该肿瘤类型的特异性的肿瘤细胞标记物；
(b)计算包括肿瘤细胞或表示IL-2Rα存在的肿瘤组织表面和所说肿瘤标记物的第一种百分率；
(c)计算包括过表使用选自下列一组中的一个或几个特征而能够识别的肿瘤细胞的第二种百分率，该组特征包括大小，形状特性，FALS，也表现有IL-2Rα存在的所说肿瘤；和
(d)使第一种百分率与第二种百分离相加，获得一种转移肿瘤集落形成细胞(Met-CFC)系数，所说系数与转移肿瘤潜在危险性的预后以下述关系成比例关系：
Met-CFC系数    肿瘤转移潜在危险性
    0％                0％
 ＜10％             ＜30％
 ＞45％              100％
2.权利要求1的方法，其中使用选自下列一组中的一种方法测定细胞相关性IL-2Rα，该方法包括荧光显微方法，Western印迹分析，m-RNA Northern和狭槽印迹分析，m-RNA的酶放大和分析，荧光活化细胞分类，和免疫测定。
3.权利要求1的方法，其中使用对该肿瘤细胞标记物有结合特异性的抗体测定对该肿瘤细胞类型有特异性的肿瘤细胞标记物，所说的抗体选自根据表2的一组抗体。
4.一种对实体非淋巴肿瘤的转移肿瘤细胞或休眠转移肿瘤细胞的抗癌疗法，所说疗法是直接作用于靶器官的前转移区域，并包括用选自下列一组的化合物治疗该前转移区域，以有效的导致转移肿瘤细胞死亡，该化合物包括：
(a)含有治疗有效量的IL-2或IL-1的能激活假休止转移肿瘤细胞的第一组份，和含有治疗有效量的抗肿瘤药物的第二组份组合使用，其中将第一组份和第二组份连接到一种对靶器前转移区域中1型内皮细胞以较高浓度表达的一种分子具有结合特异性的靶试剂上，所说的靶试剂选自：对N-乙酰基半乳糖胺和N-乙酰基葡萄糖胺具有结合特异性的植物血凝素分子和一种抗-ICAM抗体；和
(b)一种连接到毒素、放射性核素、或化疗剂上的治疗有效量的抗-IL-2Rα抗体。
5.权利要求4的方法，其中由1型内皮细胞以较高浓度表达的分子是N-乙酰基半乳糖胺，和该靶试剂是小麦胚芽凝集素。
6.权利要求4的方法，其中通过一种导管给药该化合物，以便将该化合物直接导入到前转移区的血管入径。
7.一种监测直接针对靶器前转移区域的抗实体非淋巴肿瘤转移瘤的抗癌疗法效果的方法，所说方法包括测定由所说转移瘤表达的细胞相关性IL-2Rα，细胞数目相比在所说疗法之后存在的表达细胞相关性IL-2Rα的非淋巴肿瘤转移细胞数目的减少，标志着该抗癌疗法的有效性。
8.权利要求7的方法，其中通过选自下列一组的方法测定细胞相关性IL-2Rα，该方法包括荧光显微技术，Western所迹分析，m-RNA Northern和狭槽印迹分析，m-RNA的酶放大和分析，荧光激活细胞分类法，和一种免疫测定法。
9.一种对实体非淋巴肿瘤细胞的免疫疗法，所说疗法包括系统给药一种化合物，该化合物含有一种治疗有效量的连接到具有肿瘤特异结合性的靶试剂上的IL-2或IL-1，其中该靶试剂选自抗-TCRβ基因型抗体和葡萄球菌肠毒素。
10.一种治疗实体非淋巴肿瘤的抗癌疗法，所说疗法包括系统给药一种化合物，该化合物含有一种连接到毒素、放射性核素或化疗剂上的治疗有效量的分子，其中该分子对肿瘤特异性TCRβ基因型具有结合特异性。
11.权利要求10的方法，其中对肿瘤特异性TCRβ基因型具有结合特异性的分子是抗-TCRβ基因型抗体。
12.权利要求10的方法，其中对肿瘤特异性TCRβ基因型具有结合特异性的分子是葡萄球菌肠毒素。
13.一种有助于确定实体非淋巴肿瘤转移可能性预后的临床诊断药盒，包括用于测定细胞相关性IL-2Rα的试剂，和分别测定对来自所说肿瘤样本的该肿瘤类型有特异性的肿瘤细胞标记物的试剂。
14.权利要求13的药盒，其中用于测定细胞相关性IL-2Rα的试剂包括IL-2Rα-特异性试剂，它基本上包括适用于下列一组检测方法的抗-IL-2Rα抗体，该方法包括荧光显微技术，Western印迹分析，荧光激活细胞分类法，和一种免疫测定法；或适用于选自下列一组检测方法的IL-2Rα-特异性寡聚核苷酸，该检测方法包括m-RNA Northern和狭槽印迹分析，m-RNA的酶放大和分析。
15.权利要求13的药盒，其中用测定对该肿瘤细胞类型具有特异性的肿瘤细胞标记物的试剂包括对该肿瘤细胞标记物有结合特异性的抗体，所说的抗体选自表2的一组抗体，或其组合。
16.一种有助于监测对实体非淋巴肿瘤转移细胞的抗癌疗法效果的临床诊断药盒，包括选自下列一组的试剂，即，用于测定细胞相关性IL-2Rα的试剂，和用于测定细胞相关性肿瘤特异性TCRβ基因型的试剂，或它们的组合。
17.权利要求16的药盒，其中用于测定细胞相关性IL-2Rα的试剂包括IL-2Rα-特异性试剂，它基本上包括适用于下列一组检测方法的抗-IL-2Rα抗体，这些检测方法是荧光显微技术，Western印迹分析，荧光激活细胞分类法，和一种免疫测定；或适用于下列一组检测方法的IL-2Rα-特异性寡聚核苷酸，这些检测方法是m-RNA Northern和狭槽印迹分析，和m-RNA的酶放大和分析。
18.权利要求16的药盒，其中用于测定细胞相关性肿瘤特异性TCRβ基因型的试剂包括TCRβ基因型特异性试剂，它基本上包括适用于下列一组检测方法的抗-TCRβ基因型抗体，这些方法是荧光显微技术，定量荧光分析，和一种免疫测定；或包括适用于下列一组方法的TCRβ基因型特异性寡聚核苷酸，这些方法包括m-RNA Northern和狭槽印迹分析，和m-RNA的酶放大和分析。
19.一种有助于监测对实体非淋巴肿瘤转移灶的抗癌效果的临床诊断药盒，包括用于测定细胞相关性IL-2Rα的试剂。
20.权利要求19的药盒，其中用于测定细胞相关性IL-2Rα的试剂包括IL-2Rα-特异性试剂，它基本上包括适用于下列一组检测方法的抗-IL-2Rα抗体，这些检测方法是荧光显微技术，Western印迹分析，荧光激活细胞分类法，和一种免疫检测法；或包括适用于下列一组检测方法的IL-2Rα-特异性寡聚核苷酸，这些方法是m-RNA Northern和狭槽印迹分析，和m-RNA的酶放大和分析。
21.一种适用于将抗癌疗法靶作用于前转移区的化合物，所说的化合物包括含有治疗有效量的IL-2或IL-1的第一组份，并结合使用含有治疗有效量的抗肿瘤剂的第二组份，其中将第一组份和第二组份连接到选自下列一组的靶试剂上，它们是对N-乙酰基半乳糖酶和N-乙酰基葡萄糖胺有结合特异性的植物血凝素，和对细胞外粘性分子有结合特异性的抗体。
22.权利要求21的化合物，还进一步包括一种脂质体，并且在所说脂质体表面上结合有植物血凝素或抗体，脂质体内部包含有第一和第二组份。
23.权利要求21的化合物，其中植物血凝素是小麦胚芽凝集素。
24.一种适用于将抗癌疗法靶作用于包括实体，非淋巴肿瘤或其表达细胞相关性IL-2Rα的转移灶在内的癌细胞的化合物，所说化合物包括含有抗-IL-2Rα抗体的第一组份，并且该抗体被连接到选自毒素、放射性核素或化疗剂的一种第二组份上。
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