JP2752614B2 - 細胞表面抗原に対する抗体を有する活性化血小板の検出 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、刺激状態にある活性化血小板の細胞膜上の
特異的哺乳動物細胞膜性抗体（cell membrane-associat
ed antigen）に結合するが、刺激状態にない休止血小板
には実質的に結合しない部位特異性像形成診断薬、該診
断薬の調製方法および刺激状態にある血小板を検出し、
標識し、かつ局在化（localizing）する診断系の利用に
関するものである。より詳しくは、本発明は特異的細胞
表面表現細胞内血液タンパク成分に結合したモノクロー
ナル受容体及びポリクロナール受容体に関するものであ
る。 背景 哺乳動物の血液には、血小板として知られる小さな細
胞が含まれている。ヒトの血小板は約２〜４μｍの直径
を有する核のない循環性の粒子である。自由浮遊細胞と
して血管内を自由に循環する血小板は「休止」血小板と
して知られている。 完全な休止血小板は通常は非付着性であり、完全な内
皮と、または他の血液細胞と制限された相互作用しか示
さない。しかしながら、これらの血小板は、止血の過程
において、即ち血栓の形成の際に自由浮遊細胞から、
「活性化血小板」として知られる、完全な血小板の付着
性凝集塊に急速に転化される。 血管壁が打撲によりまたは血管の事故の結果損傷をう
けた際には、止血応答が迅速に誘起されて、過度の血液
損失を防ぐ。この応答は、より高等な器官において進化
してきたものであるので、血小板の関連作用および凝固
系による止血部位の効果的な閉塞並びに局在化を誘起す
る。これとは対照的に慢性的疾患例えばアテローム性動
脈硬化症により損傷した血管中では、活性化血小板はお
互いに、また血管壁に付着し、血栓閉塞症を引き起こ
す。このような現象は心臓発作および静脈塞栓症を伴な
う発作において起こる。血小板は損傷サイトに輸送さ
れ、そこで凝集して止血プラグを形成する。この時フィ
ブリノーゲンは血餅の形成を助ける。 初期止血および血栓症における血小板の関与は、表面
接触相互作用により開始され、前記血小板細胞の付着特
性に依存している。３つの一般的現象が１つの付着現象
を構成している。すなわち（１）内皮下層マトリックス
のような基質への前記血小板の付着；（２）前記基質と
の付加的な接触サイトを形成する前記血小板の拡散；
（３）凝集物を形成する付加的な血小板の漸増である。
血小板凝集は、アデノシン−５−ジホスフエート（AD
P）、ADP/フィブリノーゲン、エピネフリン、トロンビ
ン、セロトニン、コラーゲン及びある種のアラキドン酸
代謝基質に上記細胞を曝露することにより刺激されう
る。 それゆえに、休止ヒト血小板の付着特性の表現は付着
応答を調節する適当な刺激によって開始される。この刺
激は、血小板を非付着性「休止」状態から血管に対する
およびお互いに対する前記血小板の付着性を裏付ける付
着性「活性化」状態に転化し、血栓を形成する。かくし
て、これら細胞の付着特性の変化は、宿主防御機構およ
び血栓塞栓症疾患の発病学においてきわめて重大な役割
を演じている。 「刺激状態にない血小板」および「休止血小板」とい
う用語は、本発明では前述のような生理的刺激に曝され
ず、それゆえ「非付着性」または「完全な」状態にある
ような正常な自由浮遊血小板を示すために互換的に使用
される。逆に「刺激状態にある血小板」および「活性化
血小板」という用語は本発明においては、前述のような
生理的刺激に曝され、それゆえに「付着性」状態にある
血小板を示すため互換的に使用されている。 止血および血栓症の際、休止血小板は、凝集および分
泌中に形態学的には形を変え、生化学的には細胞表面膜
組成を変えることが知られている。前記血小板は円板形
から長い仮足を有する球形に変形して近接血小板と共に
凝集する。前記活性化血小板は、周囲環境に顆粒分を分
泌し、血漿凝集を促進させ、発達したフィブリン繊維と
結合し、凝血退縮を促進させる。 トロンビンによる休止血小板の刺激に伴なう血小板表
面膜変化に関する研究は、主な血小板表面膜変化は分泌
後におこるが、可逆的な凝集後にはおこらないことを示
した。 ジョージ（George）等のジヤーナル オブ クリニカ
ル インベスティゲーション（J.Clin.Invest.），66,1
（1980）参照。 休止ヒト血小板へのトロンビンの作用に関するもう一
つの研究は、フィブリノーゲンでない、新しい細胞膜性
タンパクの存在に関するものである。バエンジケル（Ba
enziger）等のプロシーディングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミーオブ・サイエンス（米国）〔Proc.Nat
l.Acad.Sci.（USA）〕，68,240（1971）参照。これも本
発明の参考文献とする。この新しい膜タンパクは今まで
「トロンボスポンジン（thrombospondin）」として認識
されてきたが、時には「トロンビン感受性タンパク」ま
たは「糖タンパクＧ」としても知られている。 トロンボスポンジンは主な細胞下血液タンパク成分で
あると考えられる、約７×70ナノメーター（nm）の繊維
状巨大分子である〔ローラー（Lawler）等、ジヤーナル
・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.），23,8609（1978）〕。ローラー等は、また、ト
ロンボスポンジンはその各々が同一であってもよいし、
そうでなくても良いような、約142,000〜約190,000ダル
トンの３つのジスルフィド結合された鎖を含んでいるこ
とを報告した。トロンボスポンジンは、重量％比で約4:
3:1.5の中和糖、アミノ糖およびシアル酸（Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸）と共に約４重量％の炭水化物を含み、
ヘクスロン酸は含まない。あの血漿タンパクの欠乏患者
に関する研究から、血小板の付着性は、前述の刺激要求
以外にも選択された「付着性タンパク」によって媒介さ
れまたは調節されると考えられている。 付着性タンパクは、活性化血小板の細胞外部表面に表
現される補助因子タンパクである。これらのタンパクは
通常は休止血小板の細胞外部表面に全く存在しないか、
わずかな量でのみ存在するかである。かくして、細胞膜
性付着性タンパクは、初期は細胞内成分として、ある場
合には細胞外成分として表現されると考えられる。 活性化血小板の細胞外部表面上で識別された付着性タ
ンパクは、フィブリノーゲン、フィブロネクティン、フ
ォン・ウィレブランド（Von Willebrand）因子（第８因
子として公知）およびトロンボスポンジンを含む。これ
らの４つのタンパクは次のような共通の特徴を有する。
すなわち、これらは（１）通常は休止血小板の細胞外部
表面には存在しない；（２）刺激状態にない、完全な血
小板とはほとんど相互作用をおこさない；（３）血小板
刺激に伴って前記細胞表面で表現される；（４）全般的
な構造上の類似性を有する；ということである。血小板
細胞膜外部表面におけるこれら４つの付着性タンパクの
表現に対して提起された機構は、ギンズバーグ（Ginsbe
rg）とプロー（Plow）によるジャーナル・オブ・スープ
ラモレキュラー・ストラクチャー・アンド・セルラー・
バイオケミストリー（J.Supramolecular Structue and
Cellular Biochem.）17,91（1981）において議論されて
いる。 これらのタンパクの間での一次配列の類似性は十分に
知られていないが、前記４つのタンパクの選ばれた構造
上の特徴は同一ではない。上記の４つの付着性タンパク
はすべて、マルチマー状態において内部的に対称な元素
を有するグリコシル化巨大分子である。特に、フィブリ
ノーゲンは約340,000ダルトンの分子量を有し、約48,00
0、56,000および65,000ダルトンの分子量を有する複数
のサブユニットから成る二量体構造を有している。フィ
ブロネクチンは約450,000ダルトンの分子量を有し、初
めは、それぞれ約220,000、および230,000ダルトンの分
子量を有する二つの非常に類似しているが同一でないジ
スルフィド結合されたサブユニットの二量体として循環
している。フィブロネクチンのより高重合度のマルチマ
ー形成は血漿中で生ずることが知られ、前記マトリック
ス中において支配的である。 トロンボスポンジンは、約142,000〜190,000ダルトン
の分子量を有する非常に類似した大きさの三つのジスル
フィド結合されたサブユニットを有する分子量約450,00
0ダルトンのトライマーとして存在する。フォン ウィ
レブランド因子は、マルチマー化して約1,000,000〜20,
000,000ダルトンの分子量を与える、220,000タルトンの
サブユニットから構成される。 血漿および細胞外マトリックスは上記４種の付着性タ
ンパクの初期外因性タンパク源を構成すると考えられ
る。トロンボスポンジンは例外として、血漿は他の３種
の付着性タンパクの主な潜在的な源である。サグリオ
（Saglio）等は、トロンボスポンジンは血漿中において
20〜130（ng/ml）の濃度のフィブロネクチンまたはフィ
ブリノーゲンより３〜５桁程少ない量で存在することを
報告した〔ブラッド（Blood）,59,162,（1982）〕。 トロンビンに曝されると、血小板は、環境に内容物を
放出するようなある亜膜性の細胞質貯蔵顆粒（α顆粒）
を可動化することが知られている。血小板貯蔵顆粒は休
止血小板の細胞表面には通常存在せず、細胞表面に結合
した、トロンビンにより刺激された「活性化」血小板の
膜タンパクとして存在する多くのタンパクを含む。更に
前記付着性タンパク、特にトロンボスポンジンは初期は
前記血小板のα顆粒内の内在性プール中に存在すると考
えられている。 前記血小板細胞表面上の付着性タンパクの表現は、α
顆粒成分の分泌および放出を誘発する血小板刺激に依存
している。この放出により、前記付着性タンパクは前記
細胞外環境に解放され、前記細胞表面上に出現する。加
えて、付着性タンパクは通常は、休止血小板表面とわず
かにしか結合していないため、外因性タンパク源からの
付着性タンパクの細胞表面表現機構が開始され、これは
血小板刺激に依存すると考えられている。 血小板の活性化および局在化は血管損傷の基本的現象
であるので、活性化血小板と休止血小板との差異の検出
および識別可能な方法および試薬が必要となる。損傷し
た血管壁と選択的に反応しうる活性化血小板を検出する
能力により、特に犠牲者が外部的には明らかな損傷を有
しないような外傷の場合、柔かい組織の損傷位置を見出
し得る。 現在、循環する活性化血小板の検定は公知の血小板凝
集比検査を使用してインビトロに行なわれ、この方法は
未知の抗体含有試料の適当な希釈液を抗原担持細胞と共
に培養し、抗体濃度（力価）を得られた凝集応答と既知
の力価を有する標準抗体含有試料につき得られた応答と
を比較して決定するものである。しかしながら、この検
査はしばしば煩しく、かつ信頼性に乏しいものである。 血小板をインビボで像形成するため現在行なわれてい
る１つの方法としては、¹¹¹Inを標識した血小板を使用
した、時間のかかる不便な方法があげられる。この方法
は患者から血小板を単離し、インビトロで放射性ヌクレ
オチドで血小板を標識し、次いで放射性標識した前記血
小板を再び患者に注入する工程を含む。¹¹¹Inで標識し
た前記血小板はバックグラウンド信号の干渉を減少させ
るため十分な時間経過させた後にのみ像形成されうる。 かくして、特異的細胞膜性付着性タンパクに選択的に
結合し、像形成することのできる部位特異的像形成診断
薬は、刺激状態にある活性化血小板のサイトを迅速に指
示するという好ましい臨床上の有用性を有し、かつこの
ような血小板と休止血小板とを識別するために有用であ
り得る。 より詳しくは（これが刺激された活性化状態にある血
小板の細胞表面抗原として表現される際に）特異的血小
板タンパク成分に結合する抗体または抗体断片を含む部
位特異的像形成診断薬は、現在インビトロにかつインビ
ボで利用できる診断法の技術的な複雑さ、不便さおよび
時間浪費の点の多くを回避できる。 ニューウエンハイス（Nieuwenhuis）等は休止血小板
と交差反応しない、トロンビン活性化血小板に対するモ
ノクロナール抗体に関して報告している〔血栓症と止血
（Thrombosis and Haemostasis），50,100（1983）〕。
ネズミ（マウス）のミエロ−マセルラインと融合するこ
とによりハイブリドーマとされた、トロンビン活性化ヒ
ト血小板で免疫されたマウスから採取した脾細胞を使用
して、該モノクロナール抗体を活性化血小板に対して調
製した。抗血小板抗体が生産され、あるハイブリドーマ
はトロンビン活性化血小板またはADP活性化血小板上の
未知の抗原に結合した抗体を生成した。しかしながら、
前記抗体はADP,エピネフリン，コラーゲン，トロンビン
または抗性物質、レストセチンにより刺激された血小板
の凝集に関する研究においては、機能的特性を有してい
なかった。前記抗体が結合している前記抗原は、α顆粒
と異なる血小板顆粒の特定のサブクラスに位置すること
が知られていた。 ス−・リン（IIsu-Lin）等はまた、公知の標準的方法
を用いてマウスのハイブリドーマから調製されたトロン
ビン活性化血小板〔ブラッド（Blood），62（補追１）
（1983）〕に対して特異的なモノクロナール抗体の生産
に関し報告した。 ウェスターン（Weatern）法による分離においては前
記抗体の特異性は糖タンパクIIbと糖タンパクIIIaの間
を移動する識別されない単一のタンパク成分に対して存
在した。該識別されないタンパクは可溶性活性化血小板
から、または休止血小板から誘導され、かつ約98,000〜
120,000ダルトンの見掛分子量を有していた。 マックエバー（McEver）等は血小板膜糖タンパクIIa
に対するモノクロナール抗体が活性化血小板にのみ結合
していることを報告した〔ブラッド（Blood），62（補
追、１），（1983）〕。前記ハイブリドーマは特異的に
トロンビン活性化血小板に結合するが、末梢血液単核細
胞には結合しないトロンビン活性化ヒト血小板に対し免
疫されたマウスの脾臓細胞から生産された。前記抗体の
特異性は、約138,000（非還元性）ダルトンおよび148,0
00（還元性）ダルトンの見掛分子量を有し、かつ血小板
活性化後その立体配座を変える血漿膜分子であると考え
られる糖タンパクIIaに対して、または、放出反応の間
に血漿膜と融合する顆粒膜成分に対して一定の判定規準
に適合したタンパクに対して存在した。しかしながら、
該タンパクの機能は知られていない。 かくして、血液タンパク成分に対して前もって標識し
た抗体が必要となり、特に、前記血液成分を検出し、局
在化する手段として、前記サイトを像形成することによ
り、表現された細胞表面抗原のような前記血液成分を指
示することのできる細胞下のα顆粒中に位置する抗体が
必要となる。部位特異的指示診断薬は、血小板血栓の存
在を走査する際の迅速な臨床的評価手段を与える。 特に心臓発作および発作患者において血栓の存在を識
別し、かつ局在化するための、また急性心筋梗塞症を罹
う患者に、その場で血栓溶解療法を適用するための非侵
入性迅速臨床法が特に必要である。 また、損傷の後に、損傷をうけた血管壁の位置をイン
ビボで検出する、すなわち危険な状態にある患者の潜在
的冠状動脈疾患のスクリーニングを行なう必要もある。 発明の要約 本発明は、哺乳動物の部位特異的像形成診断薬、その
調製方法および適用に関するものであり、かつ該診断薬
を使用する診断系に関するものである。前記診断薬は、
血小板細胞膜性抗原に対し、動物宿主内に生成される受
容体を含む。 前記受容体は、通常血液細胞膜性でない特異的細胞内
または細胞外血液タンパク成分に対して動物宿主中に生
成したモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体または
これらの混合物を含む。前記タンパク成分は、血小板が
刺激された「活性化」状態にある時前記血小板の細胞外
部表面に存在し、かつ前述のような刺激状態にない正常
な、すなわち「休止」した完全状態にある血小板の細胞
外部表面には実質的に存在しない細胞膜性抗原である。 種々の文字通りの形で、「抗原」という用語は本発明
においては免疫原性である物質を含むとして使用されて
きた。しかしながら、ごく最近の使用によれば、抗原は
全抗体のような受容体が結合する物質として、かつ免疫
原は抗体の生産をインビボで誘起させる物質として、そ
れぞれ定義づけられている。抗体は外来物質の存在に応
答して宿主動物であるマウス系により生産され、また免
疫グロブリン（Ig）としても知られているタンパクであ
る。抗体の特異性は免疫原に支配され、この免疫原に対
して該抗体が生成される。本発明において使用されるよ
うに、「抗原」という用語は特異的細胞内または細胞外
血液タンパク成分を含み、該タンパク成分は抗体並びに
該抗体が結合する前記タンパクを生成するため使用さ
れ、かつ「受容体」という用語は該成分に対して宿主動
物中に生成される抗体を含む。 受容体自体の特質によれば該受容体は細胞外部表面に
接近しやすいものでなければならない。「細胞外部表
面」という用語は亜膜性細胞質表面に対抗するものとし
て外部細胞表面について使用されるものである。 抗原の細胞内成分は、前記細胞下血小板顆粒、特に前
記α顆粒に存在し、事実上血漿中に存在しないタンパク
を含んでいる。細胞外血液タンパク成分は正常な血漿中
に存在するタンパクを含む。 本発明において抗原として有用なタンパクは、通常
は、刺激状態にない休止血小板の細胞外部表面膜には存
在しないか、またはごくわずかな量でのみ存在する。前
記タンパクは前述のような活性化され、かつ刺激された
血小板の細胞外部表面における血小板細胞膜性抗原とし
て表現されたものとして知られている。 本発明の試薬において抗原として使用する好ましいタ
ンパクは、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォ
ンウィレブランド因子およびトロンボスポンジンから成
る多くの血液タンパク成分群を含む。特に好ましい糖タ
ンパクは、シアロ糖タンパク、より好ましくは、トロン
ボスポンジンである。 本発明の１つの局面は次の工程を含む部位特異的像形
成診断剤の形成に関するものである。すなわち、動物宿
主を、ヒト血小板細胞膜性抗原により、該抗原に対し抗
体産生を誘起するに十分な量で免疫する工程、ただし該
抗体は前記抗原に対する受容体である；前記免疫された
宿主を前記抗原に対する抗体を形成するに十分な時間維
持する工程と；前記免疫された宿主から抗体含有抗血清
を取り出し、収集する工程と；このようにして生成され
た受容体を実質的に純粋な形態で回収する工程と；前記
回収された受容体を指示手段と混合する工程とを含む。 本発明の特定の局面は、細胞膜性抗原として表現され
る際に、糖タンパク、特にトロンボスポンジンのような
シアロ糖タンパクを識別する部位特異的像形成診断薬に
関するものである。更に詳しくは、抗トロンボスポンジ
ン試薬（以下抗TSPと呼ぶ）は、刺激状態にある活性化
血小板の細胞外部表面上で細胞膜性抗原として表現され
るトロンボスポンジンに結合し、かつ、このように表現
されていないか、または刺激状態にない休止血小板の細
胞外部表面上に結合しているトロンボスポンジンに実質
的に結合していない抗−TSPに関する。 本発明の別の局面は、部位特異的試薬に使用されるモ
ノクローナル受容体を形成する方法に関するものであ
る。該方法は下記工程を含む。すなわち：（ａ）ヒト以
外の動物宿主に、ヒト血小板細胞膜性抗原を、該抗原に
対して抗体の生産を誘起するに十分な量で投与する工
程、但し前記抗体は前記抗原の受容体である；（ｂ）前
記免疫された宿主を前記抗原に対して抗体を形成するに
十分な時間維持する工程；（ｃ）前記免疫された宿主か
ら取り出された抗血清から抗体産生細胞を回収する工
程；（ｄ）好ましくは前記宿主断片から、前記抗体産生
細胞をミエローマ細胞と融合することによりハイブリド
ーマを形成する工程；（ｅ）適当な培地で、このように
融合した前記ハイブリドーマを培養する工程；（ｆ）血
小板が刺激された状態にある場合、該血小板の細胞膜性
抗原に結合するモノクローナル受容体を生産する能力に
対して前記ハイブリドーマを検定しかつ選択する工程、
ここで前記血小板が刺激状態にない場合には前記受容体
は実質的に前記血小板に結合しない；および（ｇ）前記
ハイブリドーマの生産物として実質的に純粋な形で前記
モノクローナル受容体を集める工程である。 上記方法は、また、工程（ａ）の後かつ、十分な成長
時間、例えば１〜２週間の後、かつ工程（ｂ）の前に前
記宿主に、抗体産生を増大するため同じ抗原の二度目の
注入を行なう工程を含む。 上記受容体を形成する方法は、前記ハイブリドーマを
インビトロで適当な培地中で培養し、周知の方法によっ
て該ハイブリドーマ上澄から前記抗体を回収することを
含む。これは細胞培養系として知られている。上記方法
は、変法として、動物宿主に前記ハイブリドーマを注入
し、前記宿主の腹水液から前記抗体を回収することを含
む。これは完全動物系として知られている。このような
完全動物系は、細胞培養系より多くの単位容積当たりの
抗体を生産する傾向にあるが、完全動物系は大量の抗体
が必要な場合に使用することは困難である。 本発明は任意の上記方法により生成されるモノクロー
ナル受容体およびポリクローナル受容体を含んでいる。
本発明の更なる局面において、上記モノクローナル受容
体の調製方法は、ハイブリドーマATCC HB8680または868
1を適当な培地中で培養し、前記ハイブリドーマの上澄
から前記受容体を回収することを含む。 本発明は更にキットなどの哺乳動物診断系を含み、該
キットは少なくとも一つのパッケージを含み、該パッケ
ージは活性成分として本発明の受容体を含み、該受容体
は指示手段と組当わせて、血液試料に導入した場合に、
該受容体の生成を誘起した抗原に選択的に結合し、かつ
結合サイトを指示することができる。更に詳しくは、前
記受容体はある指示手段で標識され、特異的血液タンパ
ク成分が刺激状態にある活性化血小板の細胞外部表面上
で細胞膜性抗原として表現される際、該成分に結合し、
それ程刺激状態にないかまたは休止状態にある血小板か
ら活性化血小板を検出しかつ識別する。 本発明の部位特異的像形成診断薬の使用は、通常は前
記休止血小板の細胞外部表面に存在せず、かつ血液試料
をインビトロで検定する際には活性化血小板の細胞外部
表面に抗原として細胞膜に結合している細胞膜性血液タ
ンパク成分の検出および局在化を含んでいる。 このような診断薬の特に好ましい用途は、インビトロ
およびインビボ プロトコールにおいて、血小板の細胞
膜性抗原として表現される血小板のα顆粒成分の検出に
関るものである。更に詳しくは、生理学的に許容できる
指示手段を用いて標識したモノクローナル受容体または
ポリクローナル受容体は、損傷を受けた血管壁に露出し
た活性化血小板の位置を選択的に局在化するための非侵
入性臨床的インビボ法を提供する。 本発明の部位特異的像形成診断薬の１つの利点は、血
小板血栓は心臓発作、卒中、静脈性血栓症、肺動脈塞栓
症の患者におこる血栓塞栓症を診断するため迅速に走査
され、短時間のその場の血栓融解法に対しこのような血
栓の位置を識別し局在化せしめるということである。 本発明の別の利点は、トロンボスポンジンが潜在的冠
状動脈疾患の重症患者における血管損傷の結果として、
内皮マトリックス中に露出したような損傷血管壁を走査
し、像形成するため、前記診断薬が使用されうることで
ある。 更に本発明の別の利点は、循環活性化血小板が、経口
避妊剤のような前血栓症薬剤を経口させた患者の血液試
料中でインビトロで検出されうるということである。 本発明の利点は、本発明が従来公知の血小板凝集比検
査より速く、より信頼性をもって活性化血小板を検出す
るということである。 更なる利点は、本発明の試薬、特に抗−TSPまたはそ
の結合体は組織プラスミノーゲンアクチベーター、天然
クロット溶解剤などの血栓融解剤のその場での治療比を
改善する目的でクロットを局在化するため使用されうる
ということである。 本発明の別の利点または利益は、下記本発明の説明お
よび請求の範囲から当業者にとって明白となろう。 発明の詳細な説明 本発明は刺激状態の、および非刺激状態の血小板を検
出し、区別する方法を意図している。本発明は、休止血
小板が作用物質により刺激され、活性化血小板上の細胞
外部表面抗原として表現される際、前記休止血小板のα
顆粒から放出される血液タンパク成分に対するモノクロ
ーナル受容体またはポリクロナール受容体の形成および
使用に関するものである。前記受容体はその上に前記細
胞膜性抗原を有する活性化血小板に結合し、前述のよう
に正常な休止血小板と交差反応しない。 本発明は更に、上記のような受容体および前記細胞表
面表現抗原の位置を識別するための指示標識手段を含
む、哺乳動物の部位特異的像形成診断薬を意図してい
る。α顆粒の特異的血液タンパク成分は本発明を説明す
るためのマーカーおよびターゲット抗体として使用され
るが、本発明をこのように限定することを意図しない。 トロンボスポンジンは、次章で議論するように、前記
ターゲット抗原として使用する上で特に好ましい血液タ
ンパク成分である。トロンボスポンジンは休止血小板の
細胞外部表面に極めて少量で存在するが、活性化血小板
の細胞外部表面には検出可能な量で表現される。トロン
ボスポンジンは、血小板の内在性細胞内のα顆粒プール
内に存在する。逆に、約0.1％の循環トロンボスポンジ
ンは血漿中で自由な状態にある。 モノクローナル受容体およびポリクローナル受容体は
本明細書に記載されるようにトロンボスポンジンに対し
特異的であり、かつ他の血漿タンパクと交差反応しない
ものとして述べてきた。更に本明細書において述べたよ
うに、標識した受容体はトロンビン刺激性血小板に結合
し、実質的に刺激状態にない血小板とは結合しない。か
くして、本発明の受容体は、部位特異的な方法で休止血
小板から活性化血小板を検出し、区別する像形成剤を提
供しうる。 I.序論 付着性タンパクとして活性化血小板の細胞外部表面に
表現される血液タンパク成分は、前記内在性細胞内α顆
粒プールから、または、血漿か内皮下マトリックスのよ
うな外因性源から誘導されうる。これらの潜在的な源に
存在する前記付着性タンパクの近似量の比較を第１表に
示す。 第１表 付着性タンパク 血小板含量 血漿含量 （μg/10⁹血小板）（μg/ml） フィブリノーゲン 50 3,000 フィブロネクチン ３ 300 フォンウィレブランド因子 ２ 20 トロンボスポンジン 20 0.02 かくして、血漿はトロンボスポンジンのそれ程重要な
源ではなくフィブリノーゲン、フィブロネクチンおよび
フォンウィレブランド因子の実質的な源である。無限の
アフィニティーを仮定すると、トロンボスポンジンの血
小板への完全な結合により、１細胞あたり約50〜300分
子の血液タンパク成分が配置されるにすぎない。 他方、トロンボスポンジンは下記の前記細胞のトロン
ビン刺激を表現した細胞表面であることが知られている
α顆粒プールの主な血小板成分である。トロンボスポン
ジン表面表現は、カルシウムやマグネシウムのような二
価金属イオンの存在下でおこるが、エチレンジアミン四
酢酸（EDTA）によって減小する。トロンボスポンジンの
血清中濃度は約10,000〜30,000ナノグラム／ミリリット
ル（ng/ml）であり、これは、約20,000ng/10⁹細胞の血
小板含量を示している。 前記内皮マトリックス細胞はフィブロネクチン、フォ
ンウィレブランド因子およびトロンボスポンジンの外因
性源となる。トロンボスポンジンは内皮細胞、平滑筋細
胞、単核細胞および線維芽細胞によって合成され、かつ
細胞下マトリックスにとり込まれる。ラウギ（Raugi）
等による「トロンボスポンジン：培養中の細胞による合
成および検出」、ジャーナル・オブ・ザ・セル・バイオ
ロジー（J.Cell.Biol.），95,351（1982）に報告されて
いるように、内在性標識化に関する研究においては、ト
ロンボスポンジンは18時間にわたり、約10〜71ng/10⁴細
胞の速さで合成されることが示されている。他の研究と
しては、モッシャー（Mosher）等による「培地された内
皮細胞によるトロンボスポンジンの合成および分泌」，
ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell.Bio
l.），93,343（1982），（以下モッシャー等と呼ぶ），
およびジャフエ（Jaffe）等による「トロンボスポンジ
ンを合成かつ分泌し、かつこれを内皮マトリックスに取
り込む培養ヒト線維芽細胞」、プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミーオブサイエンス（米
国）〔Prac.Natl.Acad.Sci:（USA）〕、80,998（198
3），〔以下ジャフェ等（1983）と呼ぶ〕が知られてい
る。 血小板凝集におけるトロンボスポンジンの役割は、十
分理解されていないが、凝集活性に対して応答可能な刺
激状態にある血小板表面上の分子であることが知られて
いる。この知見は、ジャフェ（Jaffe）等による「ヒト
血小板の外因性レクチンであるトロンボスポンジン」ネ
ーチャー（Nature），295,246（1982）〔以下ジャフェ
等（1982）という〕に報告された。 トロンボスポンジンはフィブリノーゲンとの相互作用
を介して血小板凝集に１つの役割を演じていると考えら
れている。なぜならば、フィブリノーゲンは血小板分泌
がなくても血小板凝集を維持できる。ここにおいて、ト
ロンボスポンジンは前記血小板（例えばグレー（Gray）
血小板）において存在しないか、またはほんのわずかに
存在する。しかしながら、逆に、ヌーデン（Nurden）等
は「血栓症と止血，50，（抄録）401（1983）におけ
る、「ヒト血小板トロンボスポンジンに対するウサギ抗
体の、トロンビン誘起血小板凝集の抑制」を報告した。 線維芽細胞により合成されたトロンボスポンジンの機
能も明らかでない。マウスのモノクローナル抗トロンボ
スポンジンおよびウサギポリクローナル抗トロンボスポ
ンジンを使用して、ジャフェ等（1983）は螢光抗体法に
より、培養したヒト線維芽細胞の原線維の細胞外マトリ
ックスにトロンボスポンジンを局在化した。ヒト包皮お
よび胎児肺線維芽細胞はそれぞれ、酵素結合イムノソル
ベント検定法（以下ELISAと呼ぶ）により決定されるよ
うに、約15.7および5.8μg/10⁶細胞/24時間の速さで時
間に依存して、培養培地にトロンボスポンジンを分泌し
た。 II概論 本明細書において使用される「受容体」という用語
は、抗原に結合する生物学的に活性な分子を意味してい
る。本発明の受容体分子は完全抗体であり、実質的に完
全な抗体すなわち、免疫された動物の腹水液または血清
のような実質的に純粋な形の抗体のイディオタイプ含有
ポリペプチド部分である。 受容体分子の生物学的活性は、少なくとも生物学的pH
値かつイオン強度にある水性媒質中のこれらの混合物上
での前記受容体のその抗原性リガンドへの結合により立
証される。好ましくは、前記受容体は、また約５〜約９
のpH値範囲内でまた、例えば蒸留水のイオン強度から約
1MNaClのイオン強度までの範囲で前記抗原性リガンドに
結合している。 抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド部分（抗体結
合サイト）は前記イディオタイプを含み、前記リガンド
に結合し、かつ前記抗体のFab,Fab′およびＦ（ab′）
_２部分を含む抗体分子のポリペプチド部分である。抗体
のFabおよびＦ（ab′）_２部分は周知のものであり、公
知の方法により実質的に完全な抗体と、それぞれパパイ
ンおよびペプシンとの反応により調製される。例えば、
テオフィロポラス（Theofilopolous）とディクソン（Di
xon）による米国特許第4,342,566号参照。Fab′抗体部
分も公知のものであり、メルカプトエタノールのような
もので２つの大きな鎖状部を架橋するジスルフィド結合
を還元し、次いで得られたタンパクメルカプタンをヨー
ドアセタミドのような試薬でアルキル化することにより
Ｆ（ab′）部分から調製される。完全抗体が好ましく、
これは本発明の受容体分子の例証として使用される。 本発明に有用な受容体はモノクローナル受容体または
ポリクローナル受容体である。「モノクローナル受容
体」（Mab）はただ１種の受容体分子を分泌するハイブ
リドーマと呼ばれる単一細胞のクローンによって生産さ
れた受容体である。「ポリクローナル」受容体（Pab）
は、免疫原性分子の複数のエピトープに結合する、種々
の抗体を分泌する種々の細胞から誘導されるクローンに
より生産される受容体である。ポリクローナル受容体の
調製はMabsの生産の１部として本発明では議論されてい
る。 前記ハイブリドーマ細胞は抗体産生細胞およびミエロ
ーマまたは他の自己永続性セルラインから融合される。
このような受容体は最初にコーラー（Kohler）とミルス
タイン（Milstein）により、ネーチャー（Nature），25
6,495（1975）に記載された。この文献を本発明の参考
文献とする。モノクローナル受容体は、本発明のモノク
ローナル受容体を得る好ましい方法である。ハイブリド
ーマ組織培養から、または、別に、前記ハイブリドーマ
組織が導入される非ヒト温血宿主動物から得られる複水
体液から代表的に得られる。 抗体はＢ細胞（骨髄誘導リンパ細胞）とよばれる分化
細胞によって分泌される。各々のＢ細胞は単一の特異性
を有する１種の抗体を分泌し、この結果種々の特異性を
有する種々の抗体が各々種々のＢ細胞によって分泌され
る。前記Ｂ細胞をクローニングして、前記諸抗体の起源
とする。しかしながら、Ｂ細胞は、培地中では数日で死
亡するるため、比較的「不死性」のものとして、所定の
抗体の供給源が得られるようにしなければならない。こ
れは、動物、代表的には脾臓からＢ細胞を取り出し、該
Ｂ細胞を癌細胞またはミエローマ細胞と融合して、細胞
ハイブリッド（「ハイブリドーマ」と呼ぶ）を形成し、
次いで該ハイブリドーマを培養することにより達成でき
る。２つの方法を以下に示す。 モノクローナル受容体を生産するハイブリドーマを形
成するために、ミエローマセルライン免疫原としてのト
ロンボスポンジンで免疫された哺乳動物からの脾細胞の
ような血液タンパク成分と反応する抗体を生産する抗体
産生細胞と融合される。 使用される前記抗体産生細胞は霊長動物、ヒト、ゲッ
歯動物（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、ウシ、イ
ヌ、羊等のような任意の哺乳動物から誘導されうる。適
当な非ヒト宿主動物が免疫原、この場合はトロンボスポ
ンジン、の注入により免疫され、次いで前記宿主が抗体
を生産するための十分な時間の経過後に、追加抗原注
入、および前記脾臓の単離を行うがこれは代表的に最初
の免疫の約１〜３ケ月後である。 宿主として本発明に使用できる非ヒト定温動物は、家
禽（例えばニワトリ、ハト）、平胸類鳥群（例えば、エ
ミュー、ダチョウ、ヒクイドリまたはモア）または哺乳
動物（例えば、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、
ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスターまたは
マウス）を含んでいる。好ましくは、前記宿主動物とし
ては、マウス、ウサギまたはエミューがあげられる。 ミエローマセルラインは抗体産生細胞と同じ種からの
ものが好ましい。それゆえに、マウス−マウスハイブリ
ッド〔シュルマン（Shulman）等.,ネーチャー（Natur
e)，276,269（1978）または、ラット−ラットハイブリ
ッド（ガルファ（Galfre）等，ネーチャー（Nature），
277,131（1979）〕が、代表的に使用される。しかしな
がら、数種のラット−マウスハイブリッドはハイブリド
ーマの形成においてよく使用されてきた。〔ゴーディン
グ（Goding），「細胞融合によるモノクローナル抗体の
生成」，アンチボディー・アズ・ア・トゥール（Antibo
dy as a Tool），マーチャロニス（Marchalonis）等
編、ジョン・ウィリー アンド サンズ・リミテッド
（John Wiley ＆ Sons Ltd.）,273-289（1982）に掲載
されている；以下マーチャロニス等という〕。本発明に
使用される適当なミエローマセルラインとしては、MPC-
11（ATCCCRL 167）,P3×63-Ag8.653（ATC CRL1580）、S
p²/₀-Ag14（ATCC CRL 1581）,P3×63Ag8V.1（ATCC CRL
1597）、Y3-Ag1.2.3〔フランス国、パリのコレクション
・ナショナール・ド・クルチュール・ド・ミクロオルガ
ニズム（Collection Nationale de Cultures de Micror
ganisms）に寄託No.I-078として寄託〕およびP3×63Ag8
（ATCCTIB9）が挙げられる。ミエローマライン×63.657
が本発明において好ましい。 モノクローナル抗トロンボスポンジン（抗−TSP）受
容体は、本明細書に記載されるようにネズミ（マウス）
ミエローマラインから形成され、かつポリクローナル抗
トロンボスポンジン受容体はウサギミエローマラインお
よびエミューミエローマラインから形成された。前記モ
ノクローナル抗−TSP試薬は、以下に示すようなATCC承
認番号の下でアメリカンタイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）（ATCC）、
メリーランド州、ロックビルに1984年12月12日付で寄託
された。 モノクローナル ATCC承認番号 TSP I-1（14E7） HB 8680 TSP I-2（ 9D7） HB 8681 受容体は指示標識手段すなわち「指示原子団」または
「標識」と共に使用される。指示原子団または標識は特
異的細胞表面に表現された抗原の位置を決定し、かつあ
る場合には前記受容体と前記抗原間の反応程度を決定す
るための手段として前記受容体と共に使用される。 「指示標識手段」、「指示原子団」または「標識」な
る用語は、本発明では、前記受容体に結合されるかまた
は別々に使用される単一原子および分子を含むものとし
て使用され、これら原子または分子は単独でまたは追加
試薬と共に使用される。このような指示原子団または標
識はそれ自身免疫学においてよく知られており、これら
が新規受容体、方法および／または系と共に使用される
限りにおいては、本発明の１部を構成する。 前記指示標識手段は、変性を伴なわずに化学的に抗体
または抗原に結合し、有用な免疫螢光トレーサーである
螢光色素（色素）を形成する、螢光標識剤でありうる。
適当な螢光標識剤としては、フルオレセインイソシアネ
ート（FIC）、フルオレセインイソチオシアネート（FIT
C）、ジメチルアミノ−ナフタレン−Ｓ−スルホニルク
ロライド（DANSC）、テトラメチルローダミンイソチオ
シアネート（TRITC）、リザミン、ローダミンB200スル
ホニル クロライド（RB 200SC）等がある。免疫螢光分
析法の記載はマーチャロニス等の「免疫螢光分析」189-
231に見られる。この文献も本発明の参考文献とする。 前記指示原子団はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRP）またはグルコースオキシダーゼ等のような酵素
であっても良い。ここで主な指示原子団はHRPまたはグ
ルコースオキシダーゼのような酵素であるが、受容体−
リガンド錯体が形成した事実を可視化するため補助試薬
が必要とされる。HRPに対するこのような補助試薬とし
ては過酸化水素およびジアミノベンジジンのような酸化
色素プレカーサーが挙げられる。グルコースオキシダー
ゼに有用な補助試薬としては2,2′−アジノ−ジ−（３
−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ABT
S）が挙げられる。 特に好ましい、螢光性標識剤はフルオレセインイソチ
オシアネートである。細胞に結合した螢光色素はオルソ
ダイアグノスティックス・オブ・ウエストウッド（Orth
o Diagnostics of Westwood），マサチューセッツ州、
によって販売されているような活性化細胞選別剤（FAC
S）を使用して、螢光顕微鏡によって測定される。活性
化血小板の細胞外部表面における血液タンパク抗原の表
現は、下記のように、本発明の標識された受容体の結合
によりフルオレセイン螢光強度を増大させる。 代表的な放射性標識剤はガンマ線放射を生ずる放射性
元素である。それ自身がガンマ線を放射する、例えば
¹²⁴I,¹²⁵I,¹²⁸I,¹³¹I,¹³²I,および⁵¹Crのような元素は
１組のガンマ線放射生成放射性元素指示原子団を表わす
¹²⁵Iは特に好ましい。別の組の有用な指示原子団は、そ
れ自身がポジトロンを放射する¹¹C、¹⁸F、¹⁵Oおよび¹³N
のような元素である。このようにして放射されたポジト
ロンは、前記動物の身体に存在する電子と出会うとガン
マ線を発生する。¹¹¹Inのようなベータ線放射物質も有
用である。 好ましい放射性標識モノクローナル受容体は、よく知
られているように、放射性アミノ酸を含む培地において
ハイブリドーマ細胞を培養することにより、並びに、ビ
ーバー（Bieber）とハワード（Howard）による米国特許
第4,381,292号に記載されているように前記モノクロー
ナル受容体を単離し、次いで、上記放射性元素の１種で
上記モノクローナル受容体を標識することにより調製さ
れうる。 抗−TSPまたはそのイディオタイプ含有ポリペプチド
部分のような放射性標識は、次いで血管疾患、特に動脈
血栓症または血管壁損傷を有する哺乳動物の血流中に注
入することにより導入される。前記標識受容体はトロン
ビンで刺激した活性化血小板の細胞外部表面上で前記ト
ロンボスポンジンと錯体を形成し、その位置は身体から
の非結合標識受容体のクリアランスを可能とする適当な
設定時間（約18〜約24時間）後に決定されうる。 前記哺乳動物は、ゼネラルエレクトリック（General
Electric）社（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）か
らCT（80-800CT/T）の名称で販売されている軸性断層撮
影スキャナーのようなガンマ線放射検出器で、またはブ
ルックハーベン・ナショナル・ラボラトリー（Brookhav
en National Laboratory）にあるペット（Pett）VIと呼
ばれる装置などのポジトロン放射トランスアキシャル
（transaxial）断層撮影スキャナーで走査されるこのよ
うな走査は使用される放射性標識受容体の特異性の故に
活性化血小板の像、並びに血餅または損傷を受けた柔ら
かい組織の位置や大きさに関する情報を提供する。 別の態様においては、受容体は該磁気共鳴（NMR）分
析に活性な元素、すなわちNMR活性元素を含む指示原子
団で標識されうる。多くのこのような元素がより一般的
に使用される¹³C、¹⁵N、¹⁹F等以外にも市販されてい
る。 前記NMR活性¹⁹F原子を含む指示原子団、または複数の
このような原子を次のような条件下で、使用することが
特に好ましい。すなわち（ｉ）実質的にすべての天然に
豊富なフッ素原子は¹⁹F同位体であり、かくして実質的
にすべてのフッ素含有化合物はNMR−活性である；（i
i）トリフロロ無水酢酸のような多くの化学的に活性な
ポリフッ素化化合物は比較的低価格で市販品として入手
できる；また（iii）多くのフッ素化化合物はヘモグロ
ビン置換時に酸素を運ぶために使用されるポリフッ素化
ポリエーテルのように、ヒトへの使用に対して医学的に
許容できることが知られてきた。 フッ素含有NMR活性指示原子団を使用するもう一つの
特定の利点は哺乳動物の身体は正常の状態ではほとんど
フッ素を含まないということである。従って実質的に哺
乳動物には存在しないNMR活性元素を使用することによ
り、身体のフッ素原子によるバックグラウンド信号は実
質的に存在しないこととなる。かくして、観測される主
な信号は、標識受容体−血液タンパク成分錯体によるも
のとなる。 １つの態様においては、抗−TSPのような受容体が好
ましくは、トリフロロ無水酢酸またはヘキサフロロエタ
ノールのようなフッ素含有物質で標識され、それぞれ、
フッ素化アミドまたはフッ素化エステル誘導体を形成す
る。次いで前記フッ素化受容体は血管損傷をうけた哺乳
動物の血流中への注入によって導入される。前記活性化
血小板表面の表現されたトロンボスポンジンと錯体を形
成する標識受容体に対し、かつ前記身体から除去される
べき任意の非錯体受容体に対し、予め設定した培養時間
の後、いわゆる「全体」NMR測定がピケット（Pykett）
のサイエンティフィックアメリカン（Sientific Americ
an），246,78（1982）に記載された装置のいずれかを使
用して行なわれ、位置を決定し、活性化血小板の像を形
成する。 前記ガンマ線、ベータ線およびポジトロン エミッタ
−のようなそれ自身が放射性である指示手段または標識
および前記NMR活性元素は、好ましくは検定されるべき
哺乳動物の体内で使用され、それ故にインビボ標識また
は指示手段といえるかもしれない。「指示手段」、「指
示原子団」および「標識」という、より一般的な用語が
本発明では使用されており、ここではインビボ標識また
は螢光色素または酵素のように検定する動物の体内で
は、それ程有用でない標識が意図されている。 前記指示手段は、前記受容体と結合するが、ここでは
抗体が¹²⁵Iで標識されている。該手段は、またすべての
指示物質または１部の別々の分子または原子を構成し、
該分子または原子はHRPの結合したウサギ抗マウス抗体
のような受容体分子と反応し、該抗体受容体はマウス内
に生成され、または¹²⁵Iのような放射性元素がスタフィ
ロコッカス アウレウス（Staphylocoocus aureus）か
ら得られるタンパクＡに結合される。 指示標識剤は好ましくは前記受容体と共に供給され、
一緒にパッケージされるか、または別々にパッケージす
ることができる。過酸化水素およびジアミノベンジジン
のような補助剤が、HRPのような指示原子団を使用する
際、系に含まれ得る。このような物質は多くの指示原子
団と同様に市販品として容易に入手でき、診断系と共に
供給する必要はない。加えて、過酸化水素のような、い
くつかの試薬は時間と共に分解し、またいくつかの放射
性元素などは短命である。これらは好ましくは最終利用
者自身により調達される。 かくして、哺乳動物においてインビボで活性化血小板
のサイトを検出する上記方法は、次の工程を含んでい
る。すなわち、 （ａ）本発明の受容体を有効量で含む組成物を調製す
る。ここで抗−TSPのような受容体は、インビボ指示原
子団に結合している。代表的組成物としては、水単独、
水性生理塩水、リン酸緩衝生理塩水（PBS）または他の
水性緩衝液によって与えられるような水性の、生理学的
に許容できる媒体中に、約１〜約100mgの前記標識受容
体を含むものが挙げられる使用される受容体の量は、と
りわけ、完全抗体が使用される哺乳動物、血管刺激性現
象および受容体のクラスに依存している。有用な指示原
子団としては、前述のようにガンマ線放射元素、NMR活
性元素等が含まれる。 （ｂ）このようにして与えられた組成物は、血栓症血管
刺激現象によって生成されるような活性化血小板の存在
に対し検定されるべき哺乳動物の血流中に注入すること
により導入される。 （ｃ）このようにして注入された哺乳動物は、前記指示
原子団の結合した（標識された）受容体が活性化血小板
表面で錯体を形成し、かつ任意の錯体形成しない受容体
を身体から除去するに十分な、前もって設定した時間維
持される。 （ｄ）前記哺乳動物は、次いで前記錯体形成した、標識
受容体の位置検出手段で走査される。代表的検出手段と
しては、通常使用されるガンマ線検出器、ポジトロン放
射断層撮影に使用される装置および実際に任意の時に身
体の１部のみを走査するいわゆる「全体」NMR分光器が
含まれる。 本発明は、更に、本発明の受容体を調製する方法、こ
のような受容体を使用した検定方法およびパッケージ形
態で本発明の受容体を含む診断系を意図している。下記
の議論においては、より一般的発明の代表として、特に
好ましい受容体、これらの調製および利用に重点をおい
て本発明のいくつかの特定かつ例示的な具体例を述べ
る。 III特定の態様 A.モノクローナル 抗−TSPの形成 ローラー（Lawler）等、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）23,8609（197
8）に記載されているように、血小板をトロンビンで活
性化し、トロンボスポンジンを単離し、これを精製する
ことにより、血小板濃縮物より得られ、１〜３日経過し
た血小板濃縮物からヒト血小板トロンボスポンジンを解
放した。簡単にいえば、安定な可溶性のトロンボスポン
ジンを生理塩水中で排除、クロマトグラフィーおよびア
フィニティークロマトグラフィーの組合せにより単離し
た。前記トロンボスポンジン（TSP）生成物の純度は、
等電点電気泳動およびドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析法により決
定した場合、95％より大きな値であった。 モノクローナル 抗−TSPはコーラー（Kohler）等、
ネーチャー（Nature），256,495（1975）における標準
ハイブリドーマ技術を使用して形成した。簡単に言えば
BALB/Cマウスを完全フロインドアジュバンド中に乳化さ
れたマウスあたり約25μｇのトロンボスポンジン試料の
腹腔内注入によって免疫した。前記マウスを同じ容積の
不完全フロイドアジュバント中の25μｇの前記トロンボ
スポンジン試料で、14,26,36,および47日目に再び免疫
した。 次いで、各々のマウスを後法眼窩叢から出血させた。
得られた血清を、抗体識別剤としてのI¹²⁵−山羊−抗−
マウス免疫グロブリン〔シグマケミカルズ（Sigma Che
m.）社、ミズーリー州・セントルイス〕と、固相抗原と
しての各々のウエル上に塗布した2.5μg/mlのトロンボ
スポンジンとを用いた固相放射線免疫検定を使用して、
抗トロンボスポンジン抗体に対しスクリーニングした。 最も高い力価の抗−TSP抗体を有する二匹のマウスを
更に免疫するため選択し、最初の免疫から90日経過後に
静脈内に20μｇの前期TPS試料を投与し、腹腔内に20μ
ｇの前期TSP資料を投与することにより再び免疫する。
前期マウスを93日経過後40μｇのトロンボスポンジン試
料で再び免疫し、最も高い力価の抗−TSP抗体を有する
マウスを細胞融合のため選択した。 前期マウスは最後の免疫後３日経過後に殺した。前記
マウスの脾臓を取出し、脾細胞を単離し、適当な媒質中
に懸濁させた。この実験方法は周知の技術である。適当
な媒質としてはHAT（ヒポキサンチン，アミノプテリン
およびチミジン）があり、脾臓当たり約1mlの媒質で十
分である。別の適当な媒質としては、10％の仔牛胎児血
清（FCS）を含むダルベッコ改良イーグル培地（Dulbecc
o's Modified Eagle's Medium）がある。 前記脾細胞を、全体で1.5×10⁸個の細胞を生成するた
めプールした。前記細胞を、次いで、適当な細胞融合促
進剤の存在下で未融合ネズミ（マウス）ミエローマセル
ライン×63.657と融合させ、未融合脾細胞、未融合ミエ
ローマ細胞および融合ハイブリドーマ細胞を含む組成物
を得た。適当な融合促進剤としては、約1000〜約4000の
分子量を有するポリエチレングリコール（PEG）〔シグ
マケミカルズ（Sigma Chemical）社、ミズーリー州、セ
ントルイスより市販されているPEG1000、PEG4000〕があ
る。 全容積約0.5〜1.0mlの融合培地は、代表的には約３×
10⁷個のミエローマ細胞と融合した10⁸個の脾細胞に対し
適切である。カーティス（Curtiss）等のジャーナル・
オブ・バイロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），
257,15213（1982）に記載されているように、好ましい
比率は10個の脾細胞あたり約１個のミエローマ細胞であ
る。 多くのマウスミエローマセルラインが知られ、例え
ば、サルク・インスティテュート・セル・ディストリビ
ューション センター〔（Salk Institute Cell Distri
bution Center）カリフォルニア州、ラ・ジョラ〕のよ
うな種々の寄託機関より入手できる。容認しうる実施に
よれば、前期マウスミエローマセルラインは好ましくは
「薬物抵抗」型であるべきである。この結果、未融合ミ
エローマ細胞は選択培地中では生存せず、一法ハイブリ
ッドは生存する。最も一般のクラスは８−アザグアニン
抵抗セルラインであり、これは、酵素ヒポキサンチン
グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼに乏し
く、従ってHAT培地で生育しない。 未融合脾臓細胞、未融合ミエローマ細胞および融合細
胞の混合物を未融合細胞を殺すに十分な時間（約10〜14
日）で選択HAT培地において、別々のコンテナで稀釈
し、培養した。「コンテナ」という用語は、本発明で
は、特に微量滴定プレートまたは組織培養プレートのウ
エルを言うが、他の適当なコンテナも使用しうる。 特に、融合３日経過後、生育可能な細胞がHAT培地中
で１ウエルあたり２×10⁴生育可能細胞（全体で約3,500
ウエル）で96ウエルの組織培養プレートを覆った。前記
プレートを覆った細胞に融合後７日経過後にHAT培地を
供給しかつその後約４〜５日間隔で必要に応じて更に供
給した。微細な成長がおこり、抗体を含む培養上澄を融
合14日経過後に、固相放射線免疫検定（RIA）による抗
原特異的抗体産生の検定のため集めた。14日経過後に、
3,500ウエルのうち700ウエルが生育可能な細胞のコロニ
ーを含んでいた。 ヤギ抗マウス免疫グロブリンを使用した固相免疫検定
によって測定されるように、25個のウエル、すなわち１
％未満の培養上澄がヒトトロンボスポンジン（抗−TSP
を含む）と反応した。これら25ウエル中６ウエル（9D
3、11F3、14F7、9D7、11D7および13F5と名づける）を融
合22日経過後に確認スクリーニング、すなわち、正常な
ヒト休止血小板とは反応がなく、ヒト活性化血小板と良
好に反応がおこるようにスクリーニングを行なうため選
択した。更に限界稀釈法によって再びクローニングし
た。ここで稀釈液の容積は統計的に計算し、各々、別々
のコンテナ（例えば、微量滴定プレートの各々のウェ
ル）において一定数の細胞（例えば1-4）が分離される
ようにした。 ハイブリドーマ成長および抗体分泌に適した時間（14
〜28日）の経過後、得られた各コンテナ中の上澄液を、
リトン バイオネティックス キット〔Litton Bioneti
cs Kit（メリーランド州（MD），ケンシングトン（Kens
ington）のリトンバイオネティックス（Litton Bioneti
cs）〕を用いて、該キットの仕様に記載のように、分泌
された抗−TSPのイソタイプにつき評価した。所定のハ
イブリドーマを選択し、培養上澄液から抗−TSPを回収
した。 クローン化ハイブリドーマを10％の牛胎児血清（FC
S）を含む培地内で培養し、ケネディー（Kennedy）等の
ダイアビーテス（Diabetes）、1982,31（サプルメント
３）,52に記載のように液体窒素中で凍結保存した。 一旦所定のハイブリドーマを選択し、かつクローニン
グすれば、得られる抗体は２つの方法の一つにより生産
できる。より純粋なモノクローナル抗体が、適当な培地
中で適当な長さの時間、所定のハイブリドーマをインビ
トロで培養し、次いで上澄液から所定の抗体を回収する
ことにより生成される。適当な培地並びに培養時間の長
さは公知であり、また容易に決定される。インビトロ技
術は、ヒト由来の抗原と免疫反応する他の特異的免疫グ
ロブリン（抗ヒト免疫グロブリン）を本質的に含まない
受容体を生成する。少量の他の免疫グロブリンが存在す
る場合があるが、これは培地が外因性血清（例えば、牛
胎児血清）を含むためである。しかしながら、このイン
ビトロ法は、いくつかの目的にとって十分な量のあるい
は濃度の抗体を生成し得ない。 わずかに純度の劣るモノクローナル抗体をより高濃度
で生産するためには、所定のハイブリドーマを、プリス
タン〔アルドリッチ ケミカル カンパニー（Aldrich
Chem.Co.），ミルウォーキー（Milwaukee）、ウイスコ
ンシン州（WI）〕感作マウス、好ましくは脾細胞を得た
マウスに対して同系のもしくは準−同系のマウスに注入
することができる。このハイブリドーマは適当なインキ
ュベーション時間後に、抗体産生腫瘍を形成する。これ
は宿主マウスの血流中および腹膜滲出液（腹水）中に所
定の抗体を比較的高濃度で与える。これらの宿主マウス
はまた、その血液および腹水中に通常の抗体類を有して
いるが、これら通常の諸抗体の濃度はモノクローナル抗
体濃度のわずか約５％にすぎない。その上、これらの通
常の抗体はこの特異性において支配的に抗−ヒト性では
ないので、回収した腹水または血清から得られるモノク
ローナル抗体は、任意の痕跡の抗−ヒト免疫グロブリン
を本質的に含まない。 クローン化ハイブリドーマにより分泌された抗体の免
疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖は、モノ（Mono）AB-ID
EIAキット（Kit）Ａ（ロットNo.20920,カリフォルニア
州（CA），サンフランシスコ（San Francisco）のジム
ドラブズ インコーポレーテッド（Zymed Labs Inc.）
を用いて決定された。この検定は該キットの製造業者に
より記載されたように、ハイブリドーマ培養上澄につい
て実施した。 腹水を、上記６種のセルライン（9D3、11F3、14E7、9
D7および11D7）の５種から調製した。9D3から得たもの
以外のすべての抗体の場合において、酢酸セルロース電
気泳動で単一のバンドが観察された。このことは更にモ
ノクローナル性を証拠づけている。 9D3の場合においては、３つのバンドがみられた。こ
のため、このセルラインはサブクローン化され、腹水を
元のクローン２種およびサブクローン２種から集めた。
各場合において、上記３つのバンドパターンを観測した
ところ、このセルラインもモノクローナルであることを
示唆した。これら３つのバンドは恐らく抗体のＨ鎖およ
びＬ鎖と親ミエローマラインにより生成されたミエロー
マタンパクとの再結合によるものであろう。 セルライン14E7（ATCC HB8680）は、オクテルロニー
免疫拡散法によりKL鎖を有するIgG₂a抗体（Mab TSP I-
1）を産生するものと決定された。Mab TSP I-1）は10⁸
のヒトトロンボスポンジンに対する固相放射線免疫検定
（本明細書の第IIIC章に記載したように）においてある
力価を有し、かつヒトフィブリノーゲンまたはフィブロ
ネクチンとは反応しない。加えて、Mab TSP I-1は酢酸
セルロース電気泳動においてγ移動度の単一の主バンド
を示す。精製トロンボスポンジンまたはヒト血小板のウ
エスタン法において、この抗体は見掛け上のサブユニッ
ト分子量180,000ダルトンの単一のポリペプチドと反応
する。上記分子量は公知のトロンボスポンジンのサブユ
ニット分子量と一致する。免疫螢光染色（本明細書の第
IIID（１）章参照）法において、抗体は血小板α−粒子
を染色する。これはトロンボスポンジンの貯蔵サイトで
あることが知られている。 セルライン9D7（ATCC HB8681）は“Mab TSP I-2"と命
名されモノクローナル抗体を産生し、該抗体はMab TSP
I-1と類似の諸特性を示すが明白なエピトープを認識す
る。 B.ポリクローナル 抗−TSPの形成 モノクローナル抗−TSPの形成に関連して前に記載し
たように、ポリクローナル抗−TSPは、ローラー（Lawle
r）等〔ジャーナル オブ バイロジカル ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）,1978,23,8609〕に従って精製され
たトロンボスポンジン調製物を用いて生成された。 兎を、1mgのトロンボスポンジンの完全フロインドア
ジュバント溶液で２ケ月に１回の割合で皮下投与するこ
とで免疫した。 次いで、各兎を放血し、I¹²⁵−山羊−抗マウス免疫グ
ロブリン〔シグマケミカルコーポレーション（Sigma Ch
emical Co.），セントルイス（St.Louis），ミズリー州
（MO）〕を用いた固相放射線免疫検定法で、血清を抗−
トロンボスポンジン抗体につきスクリーニングし、2.5m
g/mlのトロンボスポンジンを前記のごとく各ウエルに塗
布した。 C.固相放射線免疫検定法（RIA） 可撓性丸底ポリビニルクロリド製微量滴定プレート
〔ファルコン，マイクロテストIII（Falcon,Micro Test
III），ベクトン ディッキンソン＆コーポレーション
（Becton Dickinson and Co.），オクスナード，カリフ
ォルニア（Oxnard,California）〕中で検定を行った。
これらウエルを、0.05mlのトロンボスポンジンのPBS溶
液を加え、プレートを３時間室温でインキュベートして
一定の最終固相−結合抗原濃度を与えるように、トロン
ボスポンジン抗原で被覆した。すべての抗原を１μg/ml
で被覆した。これらウエルを30分間、0.25mlの３％牛血
清アルブミン（BSA）および３％の正常山羊血清を含むP
BSで“後−被覆”して残留する活性サイトを隠蔽した。 検定のため、0.05mlのマウス血清およびハイブリドー
マ培養上澄を含有する水性培地を、３％のBSAを含む溶
液で0.25mlに希釈し、３％の山羊血清および0.05％のポ
リオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート（ツ
イーン−20）を各ウエルに添加して、固相−結合抗原を
接触させ、かつ固／液相混合物を形成した。この固／液
相混合物は、血清または上澄中に存在する抗−TSP抗体
が該抗原と免疫反応するのに十分な時間（４℃で18時
間）維持した。この固相および液相を分離して、固相を
洗浄した。 洗浄後、免疫反応したマウス抗体即ち固相抗原に結合
した抗体を、ウエル当り10ngの免疫化学的に精製、放射
性ヨウ素化した山羊抗−ネズミ免疫グロブリン（３〜４
μCi/μｇ）を含む組成の混合物によって検知して、第
２の固／液相混合物を形成した。この第２の固／液相混
合物を、該山羊抗−ネズミ抗体が存在する任意の固相−
結合抗体と免疫反応しかつこれに結合するのに十分な時
間、例えば４時間、４℃にてカーチス（Curtiss）等の
上記文献に記載のように保持した。 この第２の固／液相混合物は分離され、分離された固
相は典型的には洗浄して、あらゆる付着物、非特異的に
結合した放射性ヨウ素化された山羊抗、ネズミ抗体を除
去した。 次に、固相に結合した、山羊結合抗−ネズミ抗体の量
を測定し、力価を標準的な周知の技術に従って得た。 コンペティティブアッセイは同様な方法で行い、３％
の牛血清アルブミン、３％の山羊血清および0.05％のツ
イーン−20を含むPBSで希釈した0.025mlの競合体および
限界量のモノクローナル抗体を含有する培養上澄0.025m
lを含んでいた。非特異的結合は特異的ハイブリドーマ
培養上澄を、同じＨ鎖型の免疫グロブリンを産生する非
関連ハイブリドーマの培養上澄の同様な希釈物で置換す
ることにより決定した。 特異的抗体（B₀）の接合した¹²⁵I−第２抗体の最大量
は競合体の不存在下で測定した。データはB/B₀として計
算した。ここでＢはコンペティターの所定の濃度の下で
結合した抗体１分当たりの平均カウント数を表わす。対
照モノクローナル抗体は抗−アポリポタンパクＢであっ
た。 D.像形成試薬の調製 １）螢光法 免疫螢光染色法は、ポリリジン−被覆円形ガラスカバ
ースリップ上で２％のホルムアルデヒドを固定した血小
板につき行った。これら細胞は0.1％トライトンX-100で
約３分間処理して、抗体に対して透過性とし、かつ約20
分間抗−TSP抗体と共にインキュベートした。これら細
胞をPBSですすぎ、20分間、ローダミン標識兎Ｆ（a
b′）_２ 抗−山羊免疫グロブリン〔カッペルラボラト
リーズ（Cappel Laboratories），コックランビル、ペ
ンシルバニア（Cochranville,PA）〕で染色した。この
血小板はHBO50W水銀ランプおよびIVFIエピ螢光（epiflu
orescence）コンデンサを備えたツァイス（Zeiss）ユニ
バーサル顕微鏡〔カールツァイス（Carl Zeiss）インコ
ーポレーション、ニューヨーク〕により可視化された。 ２）放射線標準法 抗−TSP抗体は約0.5μCi/μｇの特異的活性まで¹²⁵I
で放射線標識された。また２抗体放射線免疫検定法を実
質的にプロー（Plow）等のジャーナル オブ イムノロ
ジー（J.Immunol.）,1971、107,1495に記載のように行
った。ここで、この文献を本発明の参考文献とする。 検定はプラスチック製のシリコン処理したチューブ内
で約22℃にて、0.025MNaCl,0.04M硼酸ナトリウム、1mME
DTAのバッファー系（pH約8.3）中で最終濃度約15ng/ml
の¹²⁵I−標識抗体で実施した。 E.診断系 好ましくはキット形の診断系は、更に別の本発明の態
様を構成する。この系は細胞表面表現された血液タンパ
ク成分の血中での活性化および休止血小板間の差異を検
出し、かつ識別する上で有用である。この系は少なくと
も１つのパッケージを含み、これは本発明の生物学的に
活性な受容体の有効量を含む。これは、活性化血小板に
結合するが休止血小板には結合しない受容体である。 予め決められた量の受容体が、予め決められた量の血
小板含有血液サンプルと、適当な指示手段の存在下で混
合されるこの混合物を、該受容体がサンプル中に存在す
るかも知れない活性化血小板と免疫反応するのに十分な
時間維持する。即ち、該混合物を、上記受容体と細胞表
面表現タンパクとの間で錯体を形成するのに十分な時間
維持する。該受容体は該細胞表面表現タンパクに対して
生成されたものである。上記指示手段は、血小板が残り
のサンプルから分離された後に、錯体の形成を検知し信
号を発生するのに利用される。 ハイブリドーマ上澄液、腹水液またはバッファー中の
受容体の水性溶液を指示体標識手段と混合して、液状試
薬として血液サンプルと混合することができる。また、
この試薬は微量滴定プレートの壁に被覆し、次いでトロ
ンビン−感作血液サンプルと混合することができ、また
このトロンビン−感作血液サンプルは微量滴定プレート
壁またはニトロセルロースシート上に塗布でき、あるい
はまたここで混合された試薬を含むバッファー溶液、組
織部ハイブリドーマ上澄液または腹水液中に存在しても
よい。 本明細書で議論した結果は、本発明のハイブリドーマ
ATCC HB 8680およびHB 8681によって産生されたモノク
ローナル抗体につき得られた。しかしながら、本明細書
で議論した結果は上記モノクローナル抗体を用いた態様
の例示であり、かつ本発明はこのように限定することを
意図するものではないものと理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 プロー エドワード エフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サン ディエゴ ラウス スト リート 4359 (56)参考文献 Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅａｍｏｓｔａｓｉ ｓ 52［３］（1984）ｐ．354−357

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．トロンボスポンジンに対する抗体と指示手段を含む
   部位特異的像形成診断薬であって、 前記抗体は、血小板が刺激状態にある場合には、該血小
   板のトロンボスポンジンに選択的に結合することができ
   るが、該血小板がそれ程刺激されていない場合には実質
   的に前記血小板には結合せず、かつ前記指示手段は、前
   記抗体を標識し、前記トロンボスポンジンの位置をイン
   ビボで像形成し、これによって前記診断薬は刺激状態に
   ある血小板と刺激状態にない血小板を検出し、区別する
   ことができることを特徴とする上記診断薬。 ２．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第
   １項に記載の診断薬。 ３．前記抗体がハイブリドーマATCC HB 8680又はATCC H
   B 8681により生産されるモノクローナル抗体である請求
   の範囲第１項に記載の診断薬。 ４．前記指示手段が放射性標識剤であることを特徴とす
   る請求の範囲第１項に記載の診断薬。 ５．前記指示手段が¹¹¹インジウムであることを特徴と
   する請求の範囲第４項に記載の診断薬。 ６．前記指示手段が¹²⁵沃素であることを特徴とする請
   求の範囲第４項に記載の診断薬。 ７．（ａ）トロンボスポンジンを、これに対する抗体産
   生を誘起するのに十分な量で非ヒト動物宿主に投与し、 （ｂ）前記免疫された宿主を前記トロンボスポンジンに
   対する抗体を形成するのに十分な時間維持し、 （ｃ）前記免疫された宿主から抗血清を取り出し、 （ｄ）このようにして生成された抗体を実質的に純粋な
   形で回収し、および （ｅ）前記抗体を指示手段と混合する、 工程を含む部位特異的診断薬の製造方法。 ８．試料中におけるトロンボスポンジンの存在を検出
   し、かつ像形成するための診断用キットであって、少な
   くとも１つのパッケージ内に活性成分として、有効量の
   部位特異的試薬を含み、該試薬が、トロンボスポンジン
   に対する抗体と指示手段を含む部位特異的像形成診断薬
   であって、前記抗体は、血小板が刺激状態にある場合に
   は、該血小板のトロンボスポンジンに選択的に結合する
   ことができるが、該血小板がそれ程刺激されていない場
   合には実質的に前記血小板には結合せず、かつ前記指示
   手段は、前記抗体を標識し、前記トロンボスポンジンの
   位置をインビボで像形成し、これによって前記診断薬は
   刺激状態にある血小板と刺激状態にない血小板を検出
   し、区別することができることを特徴とする、上記診断
   用キット。