SE469451B - Karakterisering eller bestaemning av maengden mammalieceller medelst antikroppar - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 2 undersökningar väntas också få stor betydelse inför beslut om vilka patienter som bör erhålla trombocytkoncentrat.

Hemostas kräver aggregering av trombocyter. Denna aggregering kan dock endast äga rum om trombocyterna expo- nerar receptorer för fibrinogen på sina ytor. I vilotill- ståndet har trombocyterna liten förmåga att binda fibrino- gen och kan då inte heller bilda aggregat, vilka utgör den primära hemostaspluggen (första tilltäppningen av en kärl- skada) eller en del av en trombos (blodpropp). Aktivering av trombocyter innebär att trombocyterna får kraftigt ökad förmåga att binda fibrinogen.

Det föreligger med andra ord ett stort behov av att i blodet hos en patient bestämma den andel trombocyter som är aktiverade, d v s vilka som har stor förmåga att binda fibrinogen. De rutinmetoder som har använts för test av trombocytfunktionen, t ex blödningstid och trombocytaggre- gation, är dock omständliga och okänsliga och ger enbart ospecifik information om funktionen. De ger t ex ingen bild av enskilda trombocyter utan enbart ett medelvärde.

Vidare finns det metoder för att mäta proteiner som fri- sätts ur trombocyterna, men resultaten är osäkra, då de bl a påverkas av patientens ämnesomsättning.

På senare tid har emellertid fluorescensaktiverad flödescytometri gjort det möjligt att utveckla nya ana- lyser av trombocytfunktioner. Man utnyttjar härvid laser- ljus, som belyser celler i en passerande vätskestràle.

Ljusspridningen ger upplysning om storlek av cellerna och deras struktur. Ytterligare information fås genom tillsats av antikroppar eller andra ämnen vilka kopplats samman med olika ämnen som vid belysning fås att avge ljus (fluor- escens). Metoderna är snabba och känsliga och kan ge specifik information om trombocytfunktioner. Dessutom är det möjligt att studera varje trombocyt för sig och inte bara ett genomsnitt av alla trombocyter. För en analys åtgår några mikroliter helblod eller trombocytrik plasma.

Trombocyterna kan särskiljas från andra blodkroppar med en specifik antikropp eller genom sin storlek. 10 15 20 25 30 35 O“\ \§) Cïl _..\ 3 Kommersiellt tillgängliga fluorescensmärkta kanin- antikroppar har kommit att användas för studium av trombo- cyternas fibrinogenbindning i dessa sammanhang. Detta finns beskrivet i en artikel av R.M. Hardisty et al i "Measurement of fibrinogen binding to platelets in whole blood by flow cytometry: a micro method for the detection of platelet activation." Br. J. Hematol 1990, 76, 387-394.

ALLMÄN BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt föreliggande uppfinning har det överraskande visat sig att man genom val av ett annat slag av antikrop- par, än de mammalieantikroppar som tidigare har använts för karaktärisering eller bestämning av mammalieceller uppnår väsentliga fördelar i förhållande till den kända tekniken.

Det har mera specifikt konstaterats att man genom val av antikroppar från fåglar eller reptiler kan undvika eller eliminera metodartefakter uppträdande i samband med mammalieantikroppar. Sålunda bildar mammalieantikroppar immunkomplex med fibrinogen i plasma, vilka aktiverar trombocyterna och ger_upphov till felaktiga mätresultat.

Detta sker uppenbarligen inte alls eller i mycket redu- cerad omfattning vid användning av de nya antikropparna enligt föreliggande uppfinning. Även om uppfinningen inte är begränsad till någon speciell teori i detta avseende, synes det som om antikropparna från fåglar och reptiler inte utlöser fysiologiska reaktioner vid bildandet av komplex med antigen och interaktioner med antikroppsspeci- fika cellreceptorer.

Med andra ord är föreliggande uppfinning baserad på den överraskande upptäckten att vid försök med antikroppar mot fibrinogen, vilka antikroppar var framställda genom immunisering av höns med humant fibrinogen, fibrinogen kunde påvisas på trombocytytan utan att trombocyterna aktiverades, och detta trots att immunkomplex kunde observeras mellan plasmafibrinogen och fluorescensmärkt hönsantifibrinogenantikropp (vid mätningen kunde trombo- .rm G\ ÅÄ LW ...à 10 15 20 25 30 35* 4 cyter och immunkomplex särskiljas på grund av olika ljusspridning eller med hjälp av en trombocytantikropp märkt på annat sätt, t ex med annan färg eller med radionukleid). _ Användning av hönsantikroppar vid en analys av typ ELISA är i och för sig förut känd (se t ex Comp. Immun.

Microbiol. Infect. Dis., Vol. 13, No. 4, pp. 199-201, 1990) men det överraskande i samband med uppfinningen är sålunda att besvärande påverkan av undersökta celler undvikes.

Detta innebär att förfarandet enligt uppfinningen är avsett för karaktärisering eller bestämning av sådana celler som interagerar med antikroppar från mammala djur- slag, eller med deras komplex med antigen, på annat sätt än genom antikropparnas antigenbindande förmåga. Detta in- nebär vanligtvis att det är fråga om celler vilka kan undergå fövandling, dvs en förändring av ytstrukturen och där antikroppar från mammala djurslag, eller deras komplex med antigen, inducerar sådan förvandling.

Syftet med förfarandet enligt uppfinningen blir häri- genom att påvisa i vilket tillstånd cellerna befinner sig eller att bestämma andelen celler i åtminstone ett av dessa tillstånd, varvid man enligt uppfinningen kan und- vika metodartefakter eller förvandling av nämnda celler, vilket skulle ge ett överskattat eller felaktigt värde av andelen celler i ena eller andra tillståndet. Även om uppfinningen har omtalats ovan i samband med hönsantikroppar, torde den vara användbar för antikroppar från fåglar eller fjäderfä i allmänhet liksom för anti- kroppar från reptiler. Dessutom är det inte nödvändigt att utnyttja antikropparna som sådana, då motsvarande resultat torde erhållas med immunologiskt likartade proteiner, d v,s sådana som uppvisar väsentligen samma'antigenbindan- de förmåga som ifrågavarande antikroppar. Det kan härvid t ex röra sig om fragment av antikroppar och rekombinanta antikroppar. I 10 15 20 25 30 35 f; (_ 1'\ vb FX 01 _4 5 Närmare bestämt innebär detta att förfarandet enligt uppfinningen utmärkes av att man som antikroppar utnyttjar antikroppar från fåglar eller reptiler eller immunologiskt likartade proteiner med väsentligen samma antigenbindande förmåga som nämnda antikroppar och att man utför karak- täriseringen och/eller bestämningen på sådana mammalie- celler vilka interagerar med antikroppar från mammala djurslag, eller med deras komplex med antigen, på annat sätt än genom antikropparnas antigenbindande förmåga, varvid karaktäriseringen innebär att man påvisar i vilket tillstånd cellerna befinner sig och/eller bestämningen innebär att man bestämmer andelen celler i åtminstone ett av nämnda tillstånd.

Vad beträffar uttrycket "karaktärisering" av mamma- lieceller gäller att detta skall tolkas i vid betydelse, speciellt som karaktäriseringarna i sig kan ske enligt i och för sig kända principer, t ex för att påvisa vissa yt- strukturer hos cellerna. Varje karaktärisering där mamma- liecellerna interagerar på angivet sätt eller föreligger i omvandlingsbar form och där omvandlingen kan påverka mätresultatet kan sålunda komma ifråga enligt uppfinningen.

Enligt en föredragen utföringsform av uppfinningen använder man som fågelantikroppar antikroppar från höns, såsom från hönsblod.

Ofta kan det dessutom vara fördelaktigt att i stället utnyttja hönsantikroppar från ägg, då den mängd antikropp som därvid kan erhållas är betydligt större än om hönsblod utgör källan.

Inte minst med tanke på vad som har omtalats ovan i samband med trombocyter, kan det vidare vara föredraget att utnyttja hönsantifibrinogenantikroppar. I För samtliga föredragna utföringsformer med hönsanti- kroppar är det underförstått att ifrågavarande använd- ningar också innefattar användning av motsvarande immuno- logiskt likartade proteiner. <5š \Q .Ps 10 15 20 25 30 35 (TI 6 Förfarandet enligt uppfinningen är tillämpbart på karaktärisering eller bestämning av mängden av vilka som helst mammalieceller, t ex blodceller, såsom trombocyter och vita blodkroppar, eller endotelceller, etc, men av ovan angivna skäl är naturligtvis karaktärisering och/eller bestämning av trombocyter speciellt intressant, varvid syftet vanligtvis är att påvisa trombocyter i aktiverad form eller att bestämma andelen aktiverade trombocyter. Aktivering innebär härvid primärt förmåga att binda fibrinogen.

Vidare gäller att förfarandet enligt uppfinningen med fördel utföres i form av fluorescensaktiverad flödescyto- metri (FACS Fluorescent Antibody Cell Sorter), främst med tanke på metodens snabbhet, känslighet och förmåga att ge specifik information.

EXEMPEL I syfte att jämföra uppfinningen med användning av antikroppar enligt den kända tekniken blandades trombo- cyter i plasma med antikroppar från höns respektive kanin riktade mot de humana plasmaproteinerna fibrinogen, d-2- makroglobulin och IgA. Koncentrationerna av antikropparna valdes så att immunkomplex skulle bildas i riklig omfatt- ning. Graden av aktivering mättes med hjälp av fluor- escensmärkta hönsantikroppar riktade mot fibrinogen. Som negativ kontroll tillsattes enbart en saltlösning och som positiv kontroll det kända trombocytaktiverande ämnet adenosindifosfat.

En detaljerad metodbeskrivning följer nedan och re- sultaten presenteras i den bilagda figuren, av vilken det framgår att kraftig aktivering erhölls med alla immun- ¿ komplex innehållande kaninantikroppar. Den enda kombina- tion med hönsantikroppar, för vilken aktivering erhölls, f var däremot i komplex med IgA, men där torde det ingående humana immunoglobulinet IgA självt vara ansvarigt för aktiveringen. 10 15 20 25 30 35 -[Z: O\ flfi JE» U1 ...ål DETALJERAD METODBESKRIVNING Rêagens Normal mus IgG, adenosin-5-difosfat (grade 1) och fluoresceinisotiocyanat (FITC) inköptes från Sigma (St Louis, Mo, USA). Sephadex G-25 och DEAE-Sepharose köp- tes från Pharmacia (Uppsala, Sverige). Hönsantikroppar, IgG-fraktioner renade från äggulor, riktade mot humant fibrinogen, humant IgA, humant alfa-2-makroglobulin och musimmunoglobulin kom från Immunsystem AB (Uppsala, Sverige). Antifibrinogenantikropparna affinitetsrenades på insolubiliserat humant fibrinogen (Larson A. et al J Immunol Meth 1988, ll3:93-99). En del av dessa konjugera- des med FITC efter att först ha dialyserats över en natt mot 0,1 mol/L NaHC03, pH 9,5. Konjugationskvoten var 11:l, dvs ll moldelar FITC till l moldel antikropp. Blandningen inkuberades vid rumstemperatur i mörker i tre timmar.

Konjugerad antikropp separerades fràn fritt FITC genom gelfiltrering i 0,01 mol/L Tris, pH 7,3 genom gel- filtrering på Sephadex G-25. Antikroppar med lämplig F/P- kvot separerades fram genom jonbyteskromatografi på DEAE- Sepharos CL 6B. Kolonnen tvättades med Trisbufferten med tillsats av 0,1 mol/L NaCl och antikropparna eluerades med en saltgradient till 0,25 mol/L. Okonjugerade och FITC- konjugerade kaninantikroppar mot humant fibrinogen, humant IgA, humant alfa-2-makroglobulin samt musimmunoglobulin köptes från Dakopatts AS (Glostrup, Danmark).

Blodprovstagning Venöst blod togs med öppen nål utan stas från friska frivilliga försökspersoner som inte ätit några mediciner de senaste 2 veckorna. 4,5 mL blod samlades upp i plaströr innehållande 0,5 mL 3,8 % natriumcitrat. Trombocytrik plasma preparerades genom centrifugering 10 minuter vid 140 x g.

-Ps Ci\ QS 10 15 20 25 30 35 Preparering av prover för flödescytometri 5 pL trombocytrik plasma sattes till plaströr som innehöll 50 eller 55 pL HEPES-buffert (137 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 5,6 mmol/L glukos, l mg/mL bovint serumalbumin och 20 mmol/L HEPES, pH 7,40) och i vissa experiment 5 pL antikroppar. I vissa fall fanns ADP tillsatt till fiEPEs-bufferten. tigt en gång och fick stà vid rumstemperatur exakt 10 minuter. Därefter tillsattes 10 uL FITC-konjugerad höns- antifibrinogenantikropp (0,35 g/L) och provrören fick stå ytterligare exakt 20 minuter. Reaktionen avbröts med 500 pL iskall PBS med eller utan 1% paraformaldehyd. Inga tvättsteg behövdes. Proverna förvarades mörkt på is till dess att de anlyserades i flödescytometern, vilket alltid skedde samma dag.

Proverna blandades försik- Flödescgtometri De fluorescensmärkta trombocyterna i buffert analy- serades med en FACScan-cytometer (Becton Dickinson, Mt View, Kalifornien, USA) utrustad med en 15 mW luftkyld 488 nm argonlaser med ljusspridning framåt (FwSc) och åt sidan (SSc), och grön (FITC)- samt röd (PHYCO)-signaler samlades med logaritmisk förstärkning med ett 530/30 nm och ett 585/42 nm filter för grön respektive röd signal.

Insamlande och databehandling från 10.000 celler per prov gjordes med ett Consort 30 program (ocksâ Becton Dickinson) på en Hewlett Packard 310 persondator. På grundval av ljusspridningsegenskaper representerades varje cell av en punkt i ett rektangulärt koordinatsystem. Ett insamlingsfönster sättes runt svärmen av punkter som är trombocyter. Kontroller har gjorts med fluorescensmärkta antikroppar mot trombocytreceptorerna GPIIIa och GPIb.

Instrumentet ger den procentuella andelen positiva celler (för fibrinogen har i regel trombocyter i buffert med tillsats av adenosin och theofyllamin eller EDTA valts som negativ kontroll, för ovannämnda glykoproteiner en fluor- -a- 10 15 20 25 30 35 .Fr Cfx \C) [IN U1 _.\ , 9 escensmärkt antikropp mot leukocytytantigenet CD-3), medelfluorescensintensitet, komplexitet (SSc) och medel- partikelvolym (FwSc) för cellpopulationen inom analys- fönstret.

Andra experimentella resultat Aktivering av immunkomplex kan åtminstone delvis motverkas om trombocyterna först blandats med en mono- klonal antikropp mot Fc-receptorn. Immunkomplex mellan musantikroppar och kaninantikroppar aktiverar trombocyter men inte komplex mellan musantikroppar och hönsantimus- antikroppar. Åtminstone vissa monoklonala antikroppar mot trombocytytantigen kan ge en viss aktivering utan att någon andra antikropp tillsatts. Denna aktivering för- stärks kraftigt av kaninantimusantikroppar men inte höns- antimusantikroppar.

Claims (8)

10 15 20 25 30 35 10 PATENTKRAV

1. Förfarande för karaktärisering och/eller bestäm- ning av mängden av mammalieceller med hjälp av antikrop- par, k ä n n e t e c k n a t av att man utför karak- täriseringen och/eller bestämningen på blod- eller endo- telceller, vilka interagerar med antikroppar från mammala djurslag, eller med deras komplex med antigen, på annat sätt än genom antikropparnas antigenbindande förmåga, och att man som antikroppar utnyttjar antikroppar från fåglar eller reptiler eller fragment av antikroppar eller rekom- binanta antikroppar med väsentligen samma antigenbindande förmåga som nämnda antikroppar, varigenom störande inter- aktion med antikropparna undvikes, varvid karaktäriser- ingen innebär att man påvisar i vilket tillstånd blod- eller endotelcellerna befinner sig och/eller bestämningen innebär att man bestämmer andelen blod- eller endotel- celler i åtminstone ett av nämnda tillstånd.

2. n a t av att man utnyttjar hönsantikroppar eller fragment Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k - därav eller motsvarande rekombinanta antikroppar.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k - n a t av att man utnyttjar hönsantikroppar från ägg.

4. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att det utföres på trombocyter eller vita blodkroppar.

5. n a t av att det utföres på trombocyter. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k -

6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k - n a t av att det utföres på trombocyter i syfte att påvisa trombocyter i aktiverad form och/eller att bestämma andelen aktiverade trombocyter.

7. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a t av att man utnyttjar hönsantifi- brinogenantikroppar.

8. k ä n n e t e c k n a t av att det utföres i form av Förfarande enligt något av de föregående kraven, fluorescensaktiverad flödescytometri.