JPH06504842A - 血小板凝集疾患の特徴付け - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板凝集疾患の特徴付は 技術分野 本発明は血液血小板疾患の特徴付けに関する。本発明は、特に血小板欠陥を特徴 付けするための新規な抗体系およびそのための方法に関する。

叩 一次血小板凝集は正常な止血にとって本、質的なものであり、また血栓症におい ていることを示している。このＧＰＩ　１ｂ−１１１ａは血小板細胞の膜種タン パクであり、該膜種タンパクはインテグリンと呼ばれる一群の細胞外レセプタに 属する。ＧＰｆｌｂ−１１１ａに欠陥をもつ患者は、血小板機能不全に基（長い 出血時間または出血体質をもつことが観察されている。

血小板凝集過程は一連の必然的な細胞事象、即ちｌ）フィブリノーゲンの結合サ イトを露出するＧＰＩｌｂ−１１１ａのアゴニスト−誘起活性化、２）フィブリ ノーゲンリガンドとＧＰＩ　１ｂ−１１１ａの露出した結合サイトとの結合、お よび３）リガンド結合に伴う後−占有事象（ｐｏｓｔ−ｏｃｃｕｐａｎｃｙ　ｅ ｖｅｎｔｓ）と考えることができる。これら３段階全てが正常な血小板凝集にと って重要であると考えられている。従って、血小板膜中にＧＰＩＩｂ−１１１ａ が存在している場合においてさえ、上記段階の何れかの機能不全が不完全な血小 板凝集を引き起こす可能性がある。

血小板凝集に導く事象に関する上記見解の裏付けは、最近の幾つかの研究に見出 すことができる。第一に、大きなＧＰＩ　１ｂ−１１１ａリガンド、例えばフィ ブリノーゲンまたは抗−ＧＰＩ　１ｂ−１１１ａ抗体の効果的な結合が、アゴニ スト例えばＡＤＰまたはトロンビンによる血小板の活性化を必要とすることが分 かっている。これについては、例えばシャッティル（Ｓｈａｔ…）等、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　１９８５．２６０．　ｐ、　１１１０７を参照 のこと。更に、小さなフィブリノーゲン−類似（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ａ＋ｉ ｍｅｔｉｃ）リガンド、例えばＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　（ＲＧＤ）−含有ペプ チドは活性化とは無関係にＧＰＩ　１ｂ−１１１ａと結合する。これについては 、例えばラム（ＬａＩｌｌ）、　Ｓｃ−を等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｍ 、、　１９８８、２６３．１１ｐ、　１２３９７−４０２を参照のこと。このこ とは、ＧＰＩｌｂ−１１１ａの該フィブリノーゲン結合領域が、糖タンパクのア ゴニスト−誘起活性化がない場合には、太きなりガントに対する限られた利用性 しかもたないという仮説に導（。該フィブリノーゲンレセプタのアゴニスト−誘 起発現は、プロティンキナーゼＣの活性化を伴うホスホリパーゼＣのＧタンパク −媒介活性化を包含することが提案されている。これニツイては、シャッティル （Ｓｈａｔｔｉｌ）、　Ｓ、ｊ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、１９８ ７゜・２６２．　ｐｐ、　９９２−１０００を参照のこと。ＧＰＩｌｂ−１１１ ａをフィブリノーゲンと結合し得るものとする該ＧＰＩｌｂ−１１１ａにおける 変化の正確な特徴は今のところ明らかにされていない。

該ＧＰＩｌｂ−１＋１ａ錯体を含む後−占有事象も、血小板凝集においである役 割を演じていると考えられる。例えば、ＧＰＩＩｂ−１１１ａがフィブリノーゲ ンまたはＲＧＤ−含有ペプチドの何れかに結合した場合には、幾つかの抗−ＧＰ Ｉｌｂおよび抗−ＧＰＩＩＩａ抗体が該ＧＰＩ　Ｊｂ−１１１ａ錯体の対応する 立体配座変化の検出を可能とすることが観測された。

この結果は、該レセプタ／リガンド錯体における立体配座変化が結合に伴って生 ずることを示唆する。このような立体配座変化が如何に血小板凝集の程度に影響 を及ぼすかは依然として未知である。これについては、例えばフレリンジャー（ Ｆｒｅｌｉｎｇｅｔ）等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　１９９０．２６ ５．１１．６３４６を参照のこと。更に、該フィブリノーゲンリガンドの立体配 座変化は、該リガンドの結合機能を高める可能性のある結合が生じた際に誘起さ れる。これについては、例えばザマロン（Ｚａｍａｒ「Ｏｎ）等、　Ｂｌｏｏｄ 、　１９８９．７４：　２０８ａ（別冊ｌ）を参照のこと。

血小板凝集の最も重大な欠陥は、遺伝性の疾患グランラマン血小板無力症を患う 患者に見られる。この疾患の古典的な形態をもつ殆どのホモ接合体の血小板は１ ０％未満のＧＰＩＩｂ−１１１ａを存する。これらの固体の血小板凝集において 観測された欠陥は、単に機能性のＧＰＩＩｂ−１１１ａの欠乏によるものと見做 すことができる。

しかし、グランラマン血小板無力症を患う他の患者は該疾患の種々の変種形を示 し、該疾患においてはその血小板中には殆ど正常なレベルのＧＰＩｌｂ−１１１ ａが存在する。従って、これら後者の患者はＧＰＩｌｂ−１１１ａの活性化、リ ガンド結合および／または後−占有機能に関連する欠陥をもつ可能性がある。こ のような欠陥はＧＰＩＩｂ−ＩＨａのアミノ酸配列における１種以上の一次欠陥 によるものと考えることができる。

血小板凝集欠陥は幾つかの臨床的背景にも見られる。例えば、骨髄増殖性の諸疾 患、薬物投与、尿毒症および心肺バイパス手術後などには、しばしば後天的な血 小板凝集欠陥が見られる。このような欠陥は、上記諸過程、即ち活性化、リガン ド結合、および後−占有欠陥の１種以上によるものと考えられる。

血小板凝集機能不全の以前の診断法、例えば血小板凝集検出法は活性化、結合、 および後−占有事象の一次的段階による該疾患の分類を可能とはしなかった。こ の疾患を、かかる段階における１以上の欠陥により特徴付けして、患者の状態を より一層正確に診断することが望ましい。より正確な診断は血小板機能不全に罹 った患者のための改良された治療プログラムを与えることが期待される。凝集欠 陥の改善された定義も、提案された抗−血小板薬剤の作用様式の特徴付は等にお ける研究上のセツティングにおいて価値がある。

発明の簡単な概要 本発明は、血小板凝集機能不全を示す患者の血小板凝集欠陥を特徴付けするため の改良された方法を提供するものである。本発明の方法は、患者からの第一の流 体試料中における、活性化能力をもつ血小板の存在を決定することを含む。リガ ンド占有能をもつ血小板の存在は、また該患者からの第二の流体試料中でも測定 される。活性化能およびリガンド占有能に関するこれらテストの結果を記録し、 かつ血小板凝集欠陥を特徴付けするための予め測定した基準と比較する。その結 果としての該第−試料中の活性化能のある血小板の不足は活性化欠陥の存在を示 す。該第二の試料中のリガンド占有能をもつ血小板の不足はリガンド結合欠陥の 存在を示す。十分な量の活性化能をもつおよびリガンド結合能をもつ血小板の存 在は、該患者が正常な血小板凝集挙動を示さない場合には常に、後−占有欠陥の 存在を示唆する。

該活性化能の測定は、好ましくは該第−の血小板−含有試料と、該血小板を活性 化して結合し得るものとする所定量の血小板アゴニストとを混合する工程を含む 。活性化特異的リガンド（ＡＳＬ）も混合され、これは静止状態にある（ｒｅｓ ｔｉｎｇ）正常な血小板と比較して、活性化された正常な血小板と選択的に結合 する。このＡＳＬは、また活性化条件下に置かれた欠陥をもつ血小板に対する幾 分高い結合性を示す可能性がある。しかし、該ＡＳＬは活性化された欠陥をもつ 血小板に対するよりも、活性化された血小板に対してずっと大きな結合アフィニ ティーを示すであろう。該反応混合物を所定の条件下で、活性化された正常な血 小板が該ＡＳＬと結合するのに十分な時間維持した後、該試料中に形成されたＡ ＳＬ−血小板反応生成物の量を測定する。本発明の更に別の好ましい態様によれ ば、該活性化特異的リガンドはモノクローナル抗体、例えばＰＡＣ−１（シャッ ティル（Ｓｈａｔｔｉｌ）等、　Ｊ、　Ｂｉ。

好ましくは、患者の血小板のリガンド結合能に関する分析は、該第二の体液試料 と、正常なインテグリンー含有血小板上にリガンド−誘発性の結合サイト（ＬＩ ＢＳ）を形成するのに十分な量の活性化に関して独立のリガンド（ＡＩＬ）とを 混合する工程を含む。また、この試料を抗−ＬＩＢＳ抗体と混合する。該抗体は 該リガンドーインテグリン錯体の該リガンドー誘発性結合サイトと免疫反応する 。この検査した血小板のりガント−占有能は生成する免疫反応生成物の量により 決定される。

本発明の更に別の好ましい態様によれば、該ＡルはＲＧＤアミノ酸配列配列み、 かつ該抗−ＬＩＢＳ抗体プローブはＰＭＩ−１である。この２組−１はＡＴＣＣ 承認番号ＨＢ９４７６の下で寄託されているハイブリドーマにより産生きれる。

、本発明は、また診断キットをも提供し、該キットはＡＳＬ　、　Ａルおよび抗 −ＬＩＢＳ抗体を含む。本発明のキットの好ましいＩＩ！Ｉｌｌ様では、ＡＳＬ はＰＡＣ−１、その機能的等傷物またはフィブリノーゲンであろう。Ａルは好ま しくはポリペプチドであり、該ポリベブチドハアミノ酸残基配列、例えばＲＧＤ 　、　ＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ、　ＫＹＧＲＧＤＳ　、　ＧＲＧＤＳＰおよびＫＱ ＡＧＤＶを含む。

本発明の新規な方法並びにキットは、従来の血小板凝集欠陥の特徴付は法を凌駕 する大きな利点をもたらす。本発明は、例えば０．５ｍｌという少ない試料の使 用を可能とするが、従来の凝集法では２０〜３０ｍ＋を必要とした。本発明は、 また血小板に富む血漿または全血において、３０分未満の迅速な分析を可能とす る。より一層重要なことに、本発明は活性化、リガンド結合および後−占有事象 により、血液血小板凝集の改良された定義を与える。このような特徴付けは研究 および製薬工業の編成における価値が見出されるであろう。本発明の方法は、ま た血小板機能不全をもつ患者の改良された臨床的治療法をも与える。即ち、本発 明は上記諸欠陥による、グランラマン血小板無力症および骨髄線維症のＣａｍ変 種（ＣａｏＩｖａｒｉａｎｔ）等の血小板凝集疾患の特徴付は法を与える。

図面の簡単な説明 第１図は提案された血小板凝集メカニズムを模式的に示した図である。左上部に は静止状態にある血小板表面上のＧＰＩｌｂ−１１１ａ−含有フィブリノーゲン レセプタが描写されている。このレセプタはりガント−結合性ポケットを有する が、例えばフィブリノーゲンまたはＰＡＣＩ抗体等の巨大分子リガンドに対して は非結合性である。アゴニスト、例えばＡＤＰによる活性化後には、該リガンド ー結合性ポケットは、該ポケットの口を拡大することにより示した如く、フィブ リノーゲンまたはＰＡＣＩ抗体等の巨大分子リガンドに対して利用可能なものと なる。フィブリノーゲンの結合後、その占有されたレセプタは占有−依存性エピ トープ、例えばＬＩＢＳｌを発現する。この後、付随的な過程を介して該細胞は 凝集する。このフィブリノーゲンレセプタも、予め活性化することなしに小さな ペプチドリガンドによる占有を可能とし、結果として該ＬＩＢＳ　１エピトープ （左下部、（）抗−ＬＩＢＳ抗体）の露出に伴って立体配座変化を生ずる。

第２図は血小板無力症のＣａｍ変種における欠損の流動血球計数分析を示す。図 示されたヒストグラムにおいて、横軸は蛍光強度の対数値であり、縦軸は細胞数 である。報告した抗体を左欄に示した。Ｃａｍ血小板を左側のパネルに、また正 常なコントロールを右側のパネルに配列した。パネルの各列は添加されたアゴニ スト、ペプチドまたは抗体を示す説明が付されている。ＡＤＰは最終濃度１００ μｍｏｌ／ｌで添加され、ＧＲＧＤＳＰ　は最終浸度２００μｍｏｌ／Ｉで添加 された。最下部には、抗−ＧＰＩＩｂ−１１１ａ錯体（ＡＪｖ）および抗−ＧＰ ＩＩＩａ（ＡＢ−１５）を使用した場合の結果が示されている。同様なデータが ＧＰＩＩｂ−１１１ａに対する他の抗体（７Ｅ３．１０Ｅ５．４Ｆ１０）および ＧＰＩｌｂに対する抗体（’ｔａｂ）を使用して得られた。図示したＣａｎ変種 のデータは同一の結果を与える２名の罹患した兄弟に関する測定を表す。

第３図は骨髄線維症を患う患者における凝集機能不全の流動血球計数分析を示ず 。骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）に罹患した患者の血小板から得たデータを左側のパ ネルに、またコントロール血小板から得たデータを右側のパネルに示した。使用 した抗体は左側の欄に示されている。各列において、与えられた説明は添加され たアゴニストまたはペプチドを示す。アゴニストおよびペプチドの濃度は第２図 で使用したものと同一であった。ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ） を最終濃度５０ｎωｏｌ／ｌで存在させた。抗−ＴＳＰはトロンポスポンジンに 対するＭｏＡｂの結合を表す。

解）の際に形成されるアミノ酸を意味する。本明細書に記載するアミノ酸残基は 、好ましくは”Ｌ”異性形にある。しかし、“Ｄ°異性形の残基により任意のし 一アミノ酸残基を置換することも可能である。但し、得られるポリペプチドが所 定の機能性を維持する必要がある。ＮＨ，はポリペプチドのアミノ末端に存在す る遊離アミノ基を意味する。Ｃ０ＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在す る遊離カルボキシル基を意味する。標準的ポリペプチド命名法Ｑ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、、　１９６９．２４３．　ｐｐ。

３５５２−５９に記載され、３７Ｃ，Ｐ、　Ｒ，１１，８２２（ｂ）　（２）で 採用されている）を念頭において、アミノ酸残基の略号を以下の対応表に示す。

Ｇ　ＧＩＹ　グリシン Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン Ｍ　Ｍｅｔ　メチオニン Ａ　Ａｌａ　アラニン Ｓ　Ｓｅｒ　セリン １　１１ｅ　イソロイシン Ｌ　Ｌｅｕ　ロイシン Ｔ　Ｔｈｒ　スレオニン Ｖ　Ｖａｌ　バリン Ｐ　Ｐｒｏ　プロリン Ｋ　Ｌｙｓ　リジン ＨＨｉｓ　ヒスチジン Ｑ　Ｇｉｎ　グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｚ　Ｇｌｘ　Ｇｌｕおよび／またはＧｉｎＷ　Ｔｒｐ　トリプトファン ＲＡｒｇ　アルギニン Ｄ　Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギン Ｂ　Ａｓｘ　Ａｓｐおよび／またはＡｓｎＣＣｙｓ　システィン Ｊ　Ｘａａ　未知またはその他のもの 本明細書において式で表された全てのアミノ酸残基配列は、公知のアミノ−末端 からカルボキシ−末端への方向に、左から右への配向をもつものと理解すべきで ある。更に、「アミノ酸残基Ｊなる用語は広義の意味に解され、上記対応表に列 挙されたアミノ酸、変性されたおよび異常なアミノ酸、例えば３７Ｃ，Ｆ、　Ｒ ，９１，８２２（ｂ）　（４）に列挙されたアミノ酸を包含する。この文献を本 発明の参考文献とする。

更に、アミノ酸残基配列の初めまたは終わりのダッシュは他の１以上のアミノ酸 残基をもつ配列またはアミノ末端基例えばＮＨ，、またはカルボキシ末端基、例 えばＣ０ＯＨに対するペプチド結合を表す。

抗体：ハブテン基、即ちリガンドに、化学的に結合するポリペプチドを意味する 。本明細書で使用する抗体は免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グ ロブリン分子のフラグメントである。当分野で公知の、Ｆａｂ％Ｆａｂ’、Ｆ（ ａｂ’　）　＊およびＦｌが含まれる。典型的には、抗体はサイズが約６〜約３ ４人の範囲内にあるリガンドと、結合定数的１０’〜１０１＠　Ｍ−１の範囲並 びに１０１１Ｍ−１程度で結合する。

抗体はポリクローナルまたはモノクローナル（ＭｏＡｂ）の何れであってもよい 。抗体は小さな分子、例えばステロイドおよびプロスタグランジン類、バイオポ リマー、例えば核酸、タンパクおよび多糖類、および合成ポリマー、例えばポリ プロピレン等を包含する、広範囲のリガンドと結合できる。「抗体結合サイト」 とは抗原と特異的に結合（免疫反応）する重鎮および軽鎖の可変および高頻度可 変領域を含む抗体分子の構造的部分を意味する。本明細書で使用する種々の形で の「免疫反応Ｊなる用語は、抗原決定基含有分子と抗原結合サイトを含む分子、 例えば完全な抗体分子またはその一部との結合を表す。［抗原決定基ｊとは抗体 結合サイトにより免疫学的に結合した抗原の実際の構造的部分を意味する。この 用語は、また「エピトープ」なる用語と互換性あるものとしても使用する。

リガンド：特定のレセプタ分子との特異的相互作用により結合する構造部分を含 む分子を意味する。

リガンド−誘起結合サイト（ＬＩＢＳ）　：非−占有レセプタまたは非−結合リ ガントの何れによっても発現されないが、非−無秩序（特異的）結合反応により 生成される細胞表面レセプターリガンド錯体により発現されるネオ−抗原決定基 を意味する。ＬＩＢＳは［立体配座型（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）Ｊまた は「配列型（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）Ｊの何れであってもよい。本発明で使用す るＬＩＢＳはリガンド結合により誘起された該レセプタの特異的改変の結果生ず るもの、即ち［潜在抗原決定基（ｃｒｙｐｔｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｄｅｔｅｒ ｍｉｎａｎｔ）　Ｊであり得、あるいはレセプターリガンド接触サイトにおける レセプタとりガントアミノ酸残基との組み合わせにより形成することも可能であ る。

オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドニー木繊または二本鎖ヌクレオチド を含むポリマーを意味する。本明細書で使用する［オリゴヌクレオチド」および その文法上の等傷物は全範囲の核酸を包含する。オリゴヌクレオチドは、典型的 には２以上のデオキシリボ核酸および／またはリボ核酸の線状鎖を含む核酸分子 を意味するであろう。その正確なサイズは多（の因子に依存し、該因子はまた当 業界で公知の如（後の使用条件に依存する。

ポリペプチドまたはペプチド：少な（とも２個のアミノ酸残基の線状の連なりを 意味し、ここで隣接する残基は一種の残基のα−アミノ基と隣接残基のα−カル ボキシル基との間のペプチド結合により結合している。

タンパク：タンパクとは、５０個を越えるアミノ酸残基の線状の連なりを意味し 、ここで隣接残基同志はペプチド結合を介して結合している。

レセプタ：これは生物学的に活性なタンパク様分子を意味し、該分子は特異的に 他の分子（リガンド）と結合している。レセプタはグリコジル化されていてもよ い。

Ｂ、血小板の特徴付は方法 本発明の方法は、活性化、リガンド結合および後−占有欠陥によって血小板凝集 欠陥を特徴付けするためのプロトコールを提供する。第１図に記載したモデルに よれば、異常な血小板凝集は血小板フィブリノーゲンレセプタにおける欠陥、フ ィブリノーゲン結合自体における欠陥、または最適の凝集に必要とされる後−占 有事象における欠陥の結果として起こる可能性がある。このモデルの有用性を、 血小板凝集における永続性で重度の欠陥を有する患者につきテストした。好まし い態様においては、レセプタの活性化を１！１１−フィブリノーゲンまたはフル オレセイン−標ｗＬμｏＡｂ（ＰＡＣＩ）の何れかを使用して定量した（シャッ ティル（Ｓｈａｔｔｉｌ）等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　＋９８５． ２６０．　Ｌ　１１１０７）。これらはＧＰＩｌｂ−１１１ａの活性化型を特異 的に認識する。ここに挙げる文献の全てを本発明の参考文献とする。

！、活活性能能測定 本発明の方法は、一部において、患者から採取した血小板−含有体液試料を活性 化能を示す血小板につき分析する工程を含む。有用な体液試料は、典型的には血 管流体試料、例えば血液および血液の血小板−含有部分、例えば血小板に富む血 漿等である。この分析は、好ましくは蛍光活性化流動血球計数法を利用して、活 性化能をもつ血小板の存在を決定する。典型的には、この方法は該患者の血小板 −含有試料と、正常な血小板を活性化するのに十分な所定量の血小板アゴニスト と混合する工程を包含する。この試料は、また活性化された正常な血小板に選択 的に結合する活性化特異性リガンド（ＡＳＬ）と混合されるであろう。ＡＳＬお よび活性化された血小板を含むこの反応混合物は、所定の生物学的アッセイ条件 下にて、正常な活性化された血小板が該ＡＳＬと結合して反応生成物を形成する のに十分な時間維持される。この反応生成物の量を測定し、通常はこれを記録し 、かつこれを該試料中に存在する活性化能をもつ血小板の量と関連ずける。この 形成される生成物の量を、本明細書に記載したアッセイプロトコールを利用して 予め定めた基準値と関連ずけて、活性化欠陥を同定することができる。

ａ、　血小板アゴニスト 本発明で使用する血小板アゴニストは、正常なターゲット血小板をその正常な静 止状態から後の凝集に適した状態に転化することにより、該ターゲット血小板を 凝集に対して「活性化する」。活性化のメカニズムは周知ではな（、使用するア ゴニストの型に応じて変動すると考えられている。少なくとも１つの活性化経路 は、プロティンキナーゼＣの活性化を伴う、ホスホリパーゼＣのＧタンパク−フ ィブリノーゲンの血小板への結合は血小板膜種タンパクＧＰＩｌｂ−１１１ａを 必要とする。更に、フィブリノーゲン等の太きなリガンドの効果的な結合は適当 なアゴニストによる活性化を必要とする。例示的アゴニストは＾ＤＰ（アデノシ ンニ燐酸）、トロンビン等を包含する。更に、ＰＭＡ等のアゴニストも使用でき 、これらはプロティンキナーゼＣを直接活性化する。他のアゴニストを使用する ことも可能であり、当業者には周知である。例えば、ナーデン（Ｎｕｒｄｅｎ） 等、　Ｂｒ　Ｊ、　Ｉ（ａｅｍａｔｏｌ、、　１ストは、ＧＰＩＩｂ−１１１ａ の該リガンド結合ポケットを拡張させ、それにより大きなリガンドに対する該リ ガンド結合サイトの高い利用性を保証することにより機能するものと考えられて いる（第１図）。

ｂ、　活性化特異的リガンド 本明細書で使用する「活性化特異的リガンドＪ（ＡＳＬ）は活性化されたレセプ タ分子を特異的に結合する分子である。ここで使用するように、「特異的結合ｊ なる用語およびその文法的に等価な用語は、細胞表面レセプタとリガンド分子と の間の非−無秩序結合反応を意味する。ここで意図するような特異的に結合した レセプターリガンド錯体の例は、血小板表面上における活性化された血小板ＧＰ Ｉｌｂ−１１１ａとフィブリノーゲンとの錯体である。活性化されたＧＰＩ　１ ｂ−１１ｌａと特異的に結合することが知られている他のリガンドはＭｏＡｂ　 ＰＡＣ−１およびその機能的に等価なもの〔シャッティル等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　ＣｈｅＩｌｌ、、　１９８５．２６０．　ｐ、　１１１０７］、フィブロネ クチン、ビトロネクチン、およびフォンウイルブランド（ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂ ｒａｎｄ）因子を包□　含する。かくして、適当なリガンドは活性化されたＧＰ Ｉｌｂ−１１１ａに対する本来のリガンドおよびＧＰＩｌｂ−１１１ａの抗原決 定基に対して生成する抗体を含む。

このＡＳＬ分子は、更に活性化血小板に選択的に結合する。本明細書で使用する 本発明の試薬分子はこのアッセイにおいて、該試薬がこのアッセイにおいて存在 する他の種よりも一層強力に結合する場合には、「選択的結合性」のターゲット 種と見做される。か（して、試薬分子とターゲットとの反応は、一般的にこのア ッセイにおいて存在する任意の他の種と該試薬との反応の結合定数よりも高い結 合定数をもつであろう。典型的には、本明細書において試薬は［選択的に」その ターゲット種と結合し、例えばターゲットに対する該試薬の結合アフィニティー がその他の種に対する該試薬の対応するアフィニティーよりも２〜３倍高い、好 ましくは少なくとも１０倍高い場合に、ＡＳＬは活性化されたインテグリンと結 合するであろう。

ターゲット種に対する試薬分子の相対的な結合アフィニティーは、本明細書に記 載するように、蛍光活性化流動血球計数法を利用して有利に測定できる。従って 、ここで使用するのに適した標識ＡＳＬは、正常な血小板試料が活性化された場 合には、該試料の平均細胞蛍光強度（＆ＩｃＦＩ）の増大を示すであろう。この ＭＣＦＩにおける増加は、典型的には活性化されていない正常な血小板試料のＭ ＣＦＩの約２倍以上、好ましくは約１０倍以上大きいであろう。

本発明の抗体ＡＳＬは、活性化されたＧＰＩｌｂ−１１１ａと免疫反応するが、 活性化されていないＧＰＩｌｂ−１１１ａとは選択的に結合（免疫反応）しない 抗体分子を含むことにより特徴付けられる。好ましい態様において、該抗体分子 はインテグリンのＧＰＩＩＩａまたはＧＰＩＩｂ鎖の何れかと免疫反応する。通 常、これらの抗体もＧＰＩｌｂ−１１１ａのリガンド結合サイトに結合する。と いうのは、該リガンド結合サイトが該活性化過程により最も影響を受けるアミノ 酸残基と近接しているであろうからである。

もう一つの好ましい態様においては、本発明の抗体組成物は活性化ＧＰＩＩｂ− １１１ａと免疫反応し得る１種以上のバラトープを有する。

本発明で意図するような好ましいＡＳＬ抗体は、典型的には哺乳動物を予め選択 された宿主動物からの血小板を含む接種材料で感作して、該哺乳動物中に該血小 板上のＧＰＩＩｂ−１１１ａ分子に対して適当な免疫特異性を有する抗体分子を 誘発させることにより作られる。これらの抗体分子を、次いで該哺乳動物から回 収し、周知の技術、例えば感作された血小板に対する免疫アフィニティーにより 所定の程度までスクリーニングする。このようにして生成した抗体組成物は、特 に診断法および体液試料中の活性化された血小板を検出するための本発明のシス テムで利用゛　できる。

本発明は抗−活性化ＧＰＩｌｂ−１１１＆モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）をも 意図する。種々の文法的形態での「モノクローナル抗体Ｊなる用語は特定の抗原 と免疫反応し得る只一種の抗体結合サイトを含む抗体分子の集合を意味する。か くして、このＭＯＡｂ組成物は典型的にはこれが免疫反応する任意の抗原に対し て単一の結合アフィニティーを示す。モノクローナル抗体組成物は、従って異な る抗原に対して免疫特異的である複数の抗体結合サイトを有する抗体分子、例え ば二重特異的モノクローナル抗体を含有する。

本発明のＭｏＡｂは、典型的には一種のみの抗体分子を分泌（生成）するハイブ リドーマと呼ばれる単一細胞のクローンにより産生される抗体を含む。このハイ ブリドーマ細胞は抗体−産生細胞とミエローマまたは他の自己−永続性のセルラ インとを融合することにより形成される。このような抗体は、最初にケーラーと ミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、　Ｎａｔｕｒｅ 、　１９７５．２５６．　ｐｐ、　４９５−４９７に記載された。これを本発明 の参考文献とする。

モノクローナル抗体は、またキメラ抗体を生成する当業者には周知の方法によっ ても作ることができる。これらの方法は単離、刺激、および核酸の発現工程を含 み、該核酸は免疫グロブリンの可変領域の全部または部分をコードし、該可変領 域は免疫グロブリン軽鎖の可変領域を含み、また該可変領域の部分は免疫グロブ リン重鎮の可変領域を含む。原核および真核宿主中で単離し、刺激しおよび核酸 をコードする該可変領域を発現する方法はロビンソン（Ｒｏｂｉｏｓｏｎ）等、 　ＰＣＴ公開Ｎｏ、　ＮＯ８９１００９９：ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）等、欧 州特許公開Ｎｏ、　０２３９４００；リーディング（Ｒｅａｄｉｎｇ）のＵ、Ｓ 、Ｐ、　Ｎｏ、　４，７１４．６８１：カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）等の欧州特 許公開Ｎｏ。

核酸は、予め選択された抗原（リガンド）と結合する免疫グロブリンの可変領域 全体またはその一部をコードする。かかる核酸の源は当業者には周知であり、例 えば予め選択された抗原を結合するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー マから得ることができ、あるいは該予め選択された抗原を、複数の免疫グロブリ ン可変領域をコードする発現ライブラリーをスクリーニングするために使用して 、該核酸を単離することができる。

これらの好ましいモノクローナル抗体は遊離の活性化されたＧＰＩｌｂ−１１１ ａと免疫反応する。これら抗体は、またリガンドと未結合状態にあり、かつリガ ンド例えばフィブリノーゲンと結合状態にない場合には、血小板−結合ＧＰＩＩ ｂ−１１１ａと免疫反応することもできる。この種のモノクローナル抗体の代表 的なものはＰＡＣ−１抗体である。

本発明は、ＧＰＩｌｂ−１１１ａの活性化領域、即ち該インテグリンがその静止 立体配座にある場合とは異なる三次元構造を有する領域と免疫反応するモノクロ ーナル抗体分子の製造法をもその目的とする。この方法は以下の諸工程を含む。

（ａ）ある動物を細胞表面−レセプターリガンド錯体で感作する工程。好ましく は、この免疫原は対象動物種から採取した血小板の相同試料である。しかし、こ の抗原は、特に該抗原が小さい場合には、キャリヤタンパク、例えばキーホール リンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン等と結合することも できる。該感作は、典型的には免疫学的に反応性をもつ哺乳動物に該試料を免疫 学的に有効な量、即ち免疫応答を生ずるのに十分な量で投与することにより達成 される。好ましくは、該哺乳動物は嗜歯目動物、例えばウサギ、ラットまたはマ ウスである。この哺乳動物を、次に該動物が該レセプタと免疫反応する抗体分子 を分泌する細胞を形成するのに十分な時間維持する。

（ｂ）次に、該感作哺乳動物から分離した抗体−産生細胞の懸濁液を調製する。

これは、典型的には該哺乳動物の牌臓を取り出し、当分野で周知の方法を利用し て、生理学的に許容される媒体中で個々の牌臓細胞を機械的に分離することによ り達成される。

（Ｃ）この懸濁された抗体−産生細胞を形質転換された（「不死化された」）セ ルラインを形成できる形質転換剤で処理する。不死化されたセルラインを形成す るための形質転換剤およびその使用は当分野で周知であり、Ｉ）ＮＡウィルス例 えばエプスタインパールウィルス（ＥＢＶ）、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０ ）、ポリオーマウィルス等、ＲＮＡウィルス例えばモロニー二十日ネズミ白血病 ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）、ラウスザルコーマウィルス等、およびミエローマ 細胞例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４等を包含する。

好ましい態様において、該形質転換剤による処理は、該懸濁された牌臓細胞と適 当なセルライン、例えば５Ｐ−２からのマウスミエローマ細胞とを、適当な融合 促進剤を使用して、融合することにより、「不死化されたＪ／＼イブリドーマを 形成する。好ましい比率は、約１０１個の牌細胞を含む懸濁液中で、ミエローマ 細胞ｌ佃当たり約５個の牌細胞なる値である。好ましい融合促進剤は平均分子量 約１０００〜約４０００を有するポリエチレングリコール（ＰＥ６１０００等と して市販されている）であるが、当分野で公知の他の融合促進剤を使用してもよ い。

使用するこのセルラインは、好ましくは所ｇｒ薬物耐性」型のものであり、こ・ れを使用することにより１選択培地中で未融合細胞は生存せず、一方ノ＼イブ１ ルツドは生存する。最も一般的な群は８−アザグアニン耐性セルラインであり、 これは酵素ハイポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼに乏 しく、従ってＨＡＴ培地（ハイポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン ）により維持されないであろう。同様に、使用する該ミエローマ細胞はそれ自体 如何なる抗体をも産生じない所謂「非−分泌」型のものであることが好ましい。

しかし、幾つかの場合には、分泌型のミエローマ細胞が好ましい場合もある。

（ｄ）該形質転換細胞を、次いで好ましくはクローニングしてモノクローナル性 のものとする。このクローニングは、形質転換されなかった細胞を維持（生存） しない組織培養培地中で実施することが好ましい。該形質転換細胞がハイブリド ーマである場合には、このクローニングは典型的には未融合牌細胞、未融合ミエ ローマ細胞および融合細胞（ハイブリドーマ）を含む混合物を、未融合ミエロー マ細胞を維持しない選択培地中で、別々の容器内で希釈および培養することによ り達成される。該未融合細胞が死滅するのに十分な時間（約１週間）、これら細 胞を該培地中で培養する。該希釈は限界希釈であり得、該限界希釈においては該 各別々の容器（即ち、マイクロタイタープレートの各ウェル）中で成る数の細胞 （例えば、１〜４）を単離するように、希釈容積を統計的に算出する。該培地は 薬物−耐性（例えば、８−アザグアニン耐性）の未融合ミエローマセルラインを 維持しないもの（例えば、ＨＡＴ培地）である。

（ｅ）このクローニングした形質転換体の組織培養培地をアッセイ（免疫学的に アッセイ）して、活性化された血小板上のＧＰＩＩｂ−１＋１ａと選択的に反応 する抗体分子の存在を検出する。この検出は周知の免疫学的方法を利用して達成 される。

（ｆ）次いで、所定の形質転換体を選別し、適当な組織培養培地中で適当な時間 育成し、次に周知の技術により培養上澄から所定の抗体を回収（収穫）する。適 当な培地および適当な培養時間も周知であり、容易に決定できる。

幾分純度の低いモノクローナル抗体をより高濃度で生成するためには、該所定の ハイブリドーマをマウス、好ましくは同系のまたは準同系のマウス内に注射によ り移すことができる。該ハイブリドーマは適当なインキュベート時間の経過後に 抗体−産生腫瘍を形成し、該腫瘍は該宿主マウスの血流および腹腔浸出液（腹水 ）中に所定の抗体を高濃度（約５〜２０　ｍｇ／ｍｌ）で成形するであろう。

これら組成物の調製に有用な培地および動物両者は何れも当分野で周知のもので あり、市販品として入手でき、合成培地、同系繁殖マウス等を包含する。合成培 地の例は、４．５ｇ／ｌのグルコース、２０ｍＭのグルタミンおよび２０％の子 牛血清を補充したドゥルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ）最小基本培地［ＤＭＥ Ｍ：ドゥルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）等。

Ｖｉｒｏｌ、、　＋９５９．８．　ｐ、　３９６］である。該同系繁殖マウス種 の例はＢａ１ｂ／ｃｖウスである。

上記方法により作成されるモノクローナル抗体は、例えば活性化能をもつ血小板 免疫反応生成物が必要とされる診断並びに治療法において利用できる。所定の免 疫特異性、即ち特定のタンパク、特定のタンパク上の同定可能なエピトープおよ び／またはポリペプチドとの免疫反応性をもつ抗体分子を生成（分泌）するハイ ブリドーマを形成する方法は当分野で周知であり、かつ本明細書でも更に記載す る。特に利用できる方法は、ナイマン（Ｎｉｍａｎ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕの参考文献とする。

本発明の抗体組成物を生成するための更に好ましい方法は、ヒユーズ（Ｈｕｓｅ ）等。

５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８９．２４６．　ｐ、　＋２７５に記載の方法を利用し た、Ｆａｂ分子のライブラリーの形成を含む。この方法においては、重および軽 抗体鎖に対するｍＲＮＡ分子を感作動物から単離する。このｍＲＮＡをポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用して増幅する。次いで、これらの核酸をラン ダムにλ−ファージにクローニングして、組み換えファージ粒子のライブラリー を得る。次いで、該ファージを使用して、Ｌ三ユ等の発現宿主を感染させる。該 り三ユコロニーおよび対応するファージ組み換え体を、次に所定のＦａｂフラグ メントを産生するものについてスクリーニングすることができる。

本発明で使用する該抗体分子−含有組成物は溶液、懸濁液の何れであってもよい 。活性成分として抗体分子を含有する組成物の調製は当分野で十分に理解されて いる。典型的には、かかる組成物は液状溶液または懸濁液として調製される。

しかし、液体により溶液または懸濁液とするのに適した固体形状で調製すること も可能である。この処方物を乳化することもできる。該活性治療成分はしばしば 該アッセイを妨害せず、かつ該活性成分と相容性の賦形剤と混合される。適当な 賦形剤は、例えば水、塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等、およ びその混合物である。更に、必要に応じて、この組成物は少量の該活性成分の有 効性を高める補助的物質、例えば湿潤または乳化剤、ｐｕ緩衝剤等を含むことが できる。

抗体分子組成物は中和された生理的に許容される塩として処方してもよい。許容 される塩は酸付加塩（該抗体分子の遊離アミノ基と共に形成される）を含み、こ れらは無機酸、例えば塩酸または燐酸、もしくは有機酸、例えば酢酸、酒石酸お よびマンデル酸等により形成される。遊離カルボン酸基で形成される塩としては 無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水 酸化第二鉄、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、 ２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導できる。

２、　リガンド−占有能の決定 本発明は、また血小板−含有体液試料中におけるリガンド−占有能をもつ血小板 の存在を決定することにも関連する。このリガンド−占有能の決定は活性化され たレセプタのリガンド結合能を測定することにより、あるいは活性化とは無関係 にレセプタのリガンド結合能を測定することにより行うことができる。後者の場 合においては、活性化に無関係なリガンド（Ａｔいを使用し、これを膜−結合血 小板レセプタと反応させる。

こ′めリガンド−占有能の決定は、典型的には血小板試料と、正常な血小板上に リガンド−誘起性結合サイト（ＬＩＢＳ）を形成するのに十分な所定量のＡＩＬ とを混合する工程を含む。このＬＩＢＳは、これと免疫反応する抗−ＩＪＢｓ抗 体組成物で精査し得る。該ＬＩＢＳは該血小板レセプタ上に局在化され、あるい はまた該リガンドの表面上に拡がっていてもよい。該ＬＩＢＳが該レセプタ上に のみ局在化されているか否かの決定は該リガンドを変えて、該抗−ＬＩＢＳ抗体 に異なるエピトープを提示することにより簡単に実施できる。ＬＩＢＳの適当な プローブであるためには、該抗−ＬＩＢＳ抗体は該ＬＩＢＳとは免疫反応するが 、遊離のＡルまたはリガンドとは結合していない血小板、即ち静止または活性化 されてはいるが占有されていない血小板とは実質上反応しない。

もう一つの態様において、リガンド−占有能は活性化能をもつ血小板で測定され るであろう。この方法は、体液試料と正常な血小板を活性化するのに十分な所定 量の血小板アゴニストとを混合することを含む。また、活性化特異的リガンド（ ＡＳＬ）は試料と混合され、か（して上記の如く該ＡＳＬは活性化された血小板 と結合して、ＬＩＢＳを形成する。更に、ここに記載する如く抗−ＬＩＢＳ抗体 を該試料と混合して、ＬＩＢＳの存在を検出し、結果として該血小板中のりガン ト−占有能を決定する。このようにして生成した反応混合物をここに記載の如（ 維持して、成る量の免疫反応生成物を形成する。この生成物は予め測定した基準 によりリガンド−占有能をもつ血小板の量と関連付けられる。

好ましくは、本発明におけるＬＩＢＳの検出は蛍光活性化流動血球計数法により 実施される。即ち、ここで使用するのに適した標識抗−ＬＩＢＳ抗体は、ＬＩＢ Ｓの存在を示さない試料、例えばＡルにより占有されていない血小板に比して、 ＬＩＢＳの存在を示す正常な血小板試料の平均細胞蛍光強度（ＭＣＰ　ｌ　）に おける増大を示す。ＭＣＦ　Ｉにおけるこの増加は、典型的にはＬＩＢＳの存在 を示さない血小板試料、即ち添加された＾ルに暴露されていない血小板試料のＭ ＣＦＩの約２倍以上、好ましくは約１０倍以上であろう。

ａ、活性化に独立なリガンド この活性化に独立なリガンド（ＡＩＬ）は血小板の活性化とは無関係にこれと結 合する分子である。この人ルは、典型的には血小板に、例えばＧＰＩｌｂ−１１ １ａレセプタのペプチド結合領域において結合する小さなポリペプチド分子であ る。このような結合サイトの占有は、他の競合リガンド例えばＡＳＬ上のＡ比で 示される阻害を測定することにより直接精査し得る。また、該結合領域のリガン ド占有度は、ここに記載する如＜　ＬＩＢＳを精査することにより間接的に測定 することができる。

上記の如く、この目的のＡＩＬポリペプチドはアミノ酸残基配列を含むことがで き、該配列は例えばＧＰＩｌｂ−１１１ａに結合することにより血小板の付着を 阻害する能力をもつ。特に好ましい血小板付着−阻害性ポリペプチドはアミノ酸 残基配列ＲＧＤを含むものであり、例えばｕｓＰ　Ｎｏｓ、　４，６８３．２９ １および４．５７８．０７９に記載されているものを包含する。特に好ましいＲ ＧＤ−含有ペプチドはＧＲＧＤＳＰである。

上記式に対応する配列に加えて、目的とするポリペプチド中に存在するアミノ酸 残基は、本明細書で議論したような該ポリペプチドの基本的かつ新規な諸特徴に 実買上影響を与えない任意の残基であり得る。このような付随的な残基は通常列 挙されたペプチドの一端または両端に付加され、かつ列挙したペプチドの繰り返 しおよびその部分、あるいは該ポリペプチド配列の連続する残基を含むことがで きる。好ましいポリペプチドは１個のＲＧＤ配列を含むであろう。かくして、本 発明のポリペプチドは本明細書に示したポリペプチドのアミノ酸残基配列と同一 である必要はない。但し、該ポリペプチドは目的とするポリペプチドの上記の好 、ましい諸特徴の少なくとも１つ、即ち不活性化血小板に対する結合性またはＡ ＳＬ阻害特性を示すことのできるものである。従って、目的とするポリペプチド は種々の変化、例えば保存型または非−保存型の挿入、欠失および置換を受ける ことができる。ここで、かかる変化はその用途において幾つかの利点を与えるも のである。

保存型の置換は１個のアミノ酸残基が別の生物学的に類似の残基により置換され たものである。保存型置換の例は１個の疎水性の残基、例えばイソロイシン、バ リン、ロイシンまたはメチオニン残基の他の残基による置換、または１個の極性 残基と他の残基との置換、例えばアルギニンとリジンとの間、グルタミン酸とア スパラギン酸との間またはグルタミンとアスパラギンとの間の置換等を包含する 。この［保存型の置換ｊなる用語は、未置換の親アミノ酸に代えて置換アミノ酸 を使用することも包含するが、このようなポリペプチドは必要な結合活性をも呈 する。

本発明のポリペプチドが、−以上の保存型または非−保存型置換がなされたため に、好ましい配列と同等でない配列を有する場合、通常約２０％以下、およびよ り一般的には１０％以下のアミノ酸残基が置換されている。例外は、付随的な残 基が何れかの末端に付加されている場合であり、これは「リンカ−」を与えて、 本発明のポリペプチドを標識または固体マトリックス、あるいは抗原性キャリヤ に有利に付加させるためである。本発明のポリペプチドと共に使用できる標識、 固体マトリックスおよびキャリヤを以下に記載する。

アミノ酸残基リンカ−は通常少なくとも１個の残基であり、４０個またはそれ以 上の残基、より頻繁には１−１０個の残基を含むことができる。結合のために使 用される典型的なアミノ酸残基はチロシン、システィン、リジン、グルタミン酸 およびアスパラギン酸等である。代表的なリンカ−は目的とするポリペプチドの アミノ末端に、該リンカ−のカルボキシ末端グリシン残基により結合したトリペ プチドＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＣＧＧ−）である。更に、本発明のポリペプチ ド配列は、該配列が末端−ＮＨ，アシル化、例えばアセチル化またはチオグリコ ール酸アミド化、末端−カルボキシアミド化、例えばアンモニア、メチルアミン 等での処理によって変性されていることにより、天然の配列とは異なっていても よい。

目的のポリペプチドはポリペプチド分野の当業者には公知の任意の技術を利用し て合成できる。利用可能な多（の技術の優れた概説はＪ、Ｍ、スチュワード（Ｓ ｔｅｗａ’　ｒｄ）およびＪ、　Ｄ、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、　ｒ固相ペプチド 合成（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｊｈｅｓｉｓ）Ｊ、　 Ｗ、Ｈ，フリーマン社（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、）、サンフランシスコ 、および固相ペプチド合成に関するＪ、マイエンホーファー（Ｍｅｉｅｎｈｏｆ ｅｒ）、　ｒホルモンタンパクおよびペプチド（Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊ、　Ｖｏｌ、　２．　ｐ、　４６．アカ デミツクプレスにューヨーク）、　１９８３　、および古典的な溶液合成に関す るＥ、シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）およびに、クブケ（Ｋｕｂｋｅ）、　 ｒザペブタイズ（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊ、　Ｖｏｌ。

■、アカデミツクプレスにューヨーク）、　＋９６５に見出すことができる。

関連する態様は、細胞の基質への付着（接着）を促進する組成物を意図する。

目的とするポリペプチドの血小板に結合する能力に基づいて、該ポリペプチドを 基質に固定化する際の細胞付着活性を高めるために、該ポリペプチドを利用する ことができる。

目的とするポリペプチドを含有する組成物は、基質を処理し、それによって該組 成物中に含まれる該ポリペプチドを該基質上に固定化するために利用される。

該基質は、細胞付着促進活性をもつことが望まれる任意の表面であり得、細胞培 養用の容器、医療用デバイス、プロテーゼ用器具、合成樹脂繊維、血管または血 管移植片、経皮デバイス、人工臓器等を包含する。該表面はガラス、合成樹脂、 ニトロセルロース、ポリエステル、アガロース、コラーゲンまたは長鎖多糖から 作られたものであり得る。

ポリペプチドの基質上への固定は種々の手段により達成でき、特に該基質および 所定の固定化メカニズムに依存する。ポリペプチドの固定化またはカップリング 法は当分針で周知であり、典型的には該ポリペプチド上のチオールまたはアミノ 基と該基質上に存在する反応性の基との間の共有結合を含む。ポリペプチドの固 定カップリング法の例に関しては、オーラメアス（Ａｕｒａｏ＋ｅａｓ）等、　 ５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、、　＋９７８．　Ｖｏｌ、８．５ｕｐｐ １．７．　ｐｐ、　７−２３：　ＵＳＰ　Ｎｏｓ、　４，４９３，７９５．４． ５７８D０７９ および４．６７１．９５０：クリブシュタイン（Ｋｌ　１ｐｓｔｅｉｎ）等、　 Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１９８３．１４７、　ｐｐ、　３１Ｂ−３ ２６およびリュー　（Ｌｉｕ）等、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９７９．８０．　 ｐ、　６９０を参照のこと。細胞付着促進ポリペプチドの使用の例については、 ＵＳＰ　Ｎｏ、　４．５７８，０７９を参照のこと。

ｂ、抗−ＬＩＢＳ抗体 流体試料中のりガント−占有能をもつ血小板の存在は、一般的には抗−ＬＩＢＳ 抗体を使用して検出されるであろう。これらの抗体はレセプターリガンド錯体形 成の際に生成される該血小板上のエピトープと免疫反応する。かくして、該抗体 は錯体形成しない血小板とは実質的に反応せず、またこれらは未結合のリガンド とも反応しない。錯体形成の際に生成される該エピトープは該レセプタ、リガン ドまたはその両者上に局在化されている可能性がある。該錯体に対する該抗−Ｌ ＩＢＳ抗体の正確な結合サイトはＮＭＲ、Ｘ−線結晶解析、変異レセプタを使用 した免疫吸着クロマトグラフィー、およびレセプタとリガンドとの架橋反応等の 技術により精査できる。

この抗−ＬＩＢＳ抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体の何れであっ てもよ（、またＡＳＬに関する上記の如き技術を利用して調製できる。抗−ＬＩ ＢＳ抗体の調製およびその特性は米国特許出願第４１７．５６５号に十分に議論 されている。これを本発明の参考文献とする。

好ましい態様において、該抗−ＬＩＢＳ抗体はモノクローナル抗体、例えばＰＭ Ｉ−１ハイブリドーマにより形成される抗体であろう。この抗体は該ＧＰＩｌｂ −１１１＆アトへジン（ａｄｈｅｓｉｎ）上のＬＩＢＳと免疫反応する。

リガンド結合能をもつ血小板の更に別の検出手段は、該レセプタに対するリガン ド上のレセプター誘起性結合サイト（ＲＩＢＳ）に対する抗体の使用であろう。

リガンド結合能は該リガンド上でのレセプター誘起サイトの生成により推定でき るので、この方法はレセプタ／リガンド錯体の形成を検出する。抗−ＲＩＢＳ抗 体はザマロン（Ｚａｍａｒｒｏｎ）等、　Ｂｌｏｏｄ、　１９８９．７４：　２ ０８ａ　（Ｓｕｐｐｌ、　１）において更に詳細に議論されている。

３．結果の相関・後−占有欠陥の同定 活性化能をもつおよびリガンド結合能をもつ血小板に関する分析結果を、欠陥の 存在を評価するための前もって測定した基準と比較する。かくして、測定された 活性化能をもつ血小板の量を、かかる血小板の予め測定した閾値レベル（これ以 下のレベルは欠陥の存在を示す）と比較する。受容能をもつ血小板のこのような 基準レベルは、通常選択された反応条件、例えばｐＨ１温度、反応時間等（本明 細書ではより一層詳細に記載される）を使用して、該アッセイに先立って測定さ れる。使用する該反応条件は、通常正常な血小板における活性化の徴候を最大と するように最適化されるであろう。血小板の実際の測定値は任意の便利な様式、 例えば重量、細胞数、濃度等により表すことが可能である。

同様に、リガンド−占有能をもつ血小板の量は予め決められた反応条件を使用し て測定されるであろう。確定された受容能をもつ血小板の量は予め決められた受 容能レベルと関連ずけて、受容能をもつ血小板の量が欠陥の存在を示す閾値レベ ル未満であるか否かを決定する。血小板の存在が所定のレベル未満である場合に は、リガンド結合における欠陥が存在する。

大きな血小板機能不全の存在が、例えばアブレボメトリー（ａｇｇｒｅｇｏｍｅ ｔｒｙ）により示された場合、十分な量の活性化およびリガンド−結合能をもつ 血小板の存在の指標は、後−占有欠陥の存在の同定を可能とする。

Ｃ０診断系 本発明は、また上記の血小板の特徴付けを実施するための診断キットをも意図す る。本発明のキット型の診断系は、少なくとも１種のアッセイに対して十分な量 で、本発明の抗体またはモノクローナル抗体分子もしくはそのフラグメントを、 別個に包装される試薬としての、免疫反応生成物の存在を指示する標識と共に含 有する組成物を含む。このキットは典型的には包装された試薬の使用に関する指 示をも含む。「使用の指示」は、典型的には該試薬の濃度または少なくとも１つ のアッセイ法のパラメータ、例えば混合すべき試薬と試料との相対的な量、試薬 ／試料混合物に対する維持時間、温度、ノ（・ツファー条件等を記載した明確な 表現を含む。−態様においては、診断系は活性化された血小板の存在に関するア ッセイおよび錯体−含有血管流体試料、例えば血液または血漿中のレセプターリ ガンド錯体に関するアッセイを意図するものである。

このキットは包封体（包装）として与えられ、これは活性化された血小板と反応 するＡＳＬ分子用の容器を含む。典型的には、このキットは正常な血小板をその 活性化された状態に刺激するための血小板アゴニストをも含む。アゴニストの例 はＡＤＰおよびトロンビンを包含し、一方で該＾ＳＬ分子はＰＡＣ−１抗体であ る。

このキットは、またＡＩＬ分子用の容器をも含み、該Ａ比分子は該血小板上のレ セプタと結合して、該レセプタ上にＬＩＢＳを形成する。好ましいＡル化合物は ＧＲＧＤＳＰである。

また、該アゴニスト系は、レセプターリガンド錯体上に存在するＬＩＢＳと免疫 反応する抗−ＬＩＢＳ抗体分子用の容器を含む。抗−ＬＩＢＳ抗体は、好ましく はＰＭＩ−１である。更に好ましいキットにおいては、該抗体分子は放射性ヌク レオチド標識に結合した抗体分子、好ましくは１川−標識抗体分子である。

本発明のインビトロ診断系は本発明の抗体分子を含む特異的に結合した錯体の形 成を示すことのできる標識または指示手段を含む。本明細書で使用する、種々の 文法上の形態の［標識」および［指示手段Ｊなる用語は検出可能なシグナルの形 成に直接または間接的に関与して、錯体の存在を表示する単一の原子および分子 を意味する。標識の例は”’Ｉｎ　ｓ　”７０％　”Ｇａおよび１８１１並びに 非放射性標識、例えばビオチンおよび酵素−結合抗体を包含する。任意の標識ま たは指示手段を、本発明の抗体またはモノクローナル抗体組成物の一部としての 抗体分子に結合または組み込むことができ、あるいは別々に使用でき、またこれ らの原子または分子は単独でまたは付随的な試薬と組み合わせて使用できる。か かる標識は臨床的診断化学においてそれ自体周知であり、かつこれらが新規な方 法および／または系と共に使用された場合に限り本発明の一部を構成する。

標識のポリペプチドおよびタンパクへの結合は当分野で周知である。例えば、ハ イブリドーマにより生成された抗体分子は、培地の成分として与えられる放射性 同位体−含有アミノ酸の代謝による組み込みにより標識できる。これに関しては 、例えばガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）等、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１ ９８１．７３．　ｐｐ、　３−４６を参照のこと。活性化された基によるタンパ クの結合またはカップリング技術が特に利用できる。これに関しては、例えばオ ーラメアス（Ａｕｒａｍｅａｓ）等、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　１ｍｍｕｎ。

これらの診断系も、特異的結合試薬を含むことができる。［特異的結合試薬Ｊと は、本発明の試薬種とは選択的に結合できるが、それ自体は本発明の抗体分子で はない化学種である。特異的結合試薬の例は、抗体分子、補体タンノくりまたは そのフラグメント、プロティンＡ等であり、これらは本発明の抗体分子が錯体の 一部として存在する場合には、本発明の抗体分子と免疫反応する。

好ましい態様において、該特異的結合試薬は標識されている。しかし、この診断 系が標識されていない特異的結合試薬を含む場合には、該試薬は典型的には増幅 手段または試薬として使用される。これらの態様において、該標識された特異的 結合試薬は、該増幅手段が本発明の試薬の１種を含む錯体と結合している場合に は、該増幅手段と特異的に結合できる。

例えば、本発明の診断キットを“ＥＬＩＳＡ”フォーマットで使用して、体液試 料、例えば血清、血漿または尿中のフィブリノーゲン−結合血小板の存在または その量を検出することができる。ＥＬＩＳＡ”とは、酵素結合イムノソルベント アツセイ法を意味し、ここでは固相に結合した抗体または抗原と、酵素−抗原ま たは酵素−抗体複合体を使用して、試料中に存在する抗原または抗体を検出しま たはその量を定量する。ＥＬＩＳＡ法の説明は、Ｄ、　Ｐ、サイプ（Ｓｉ　ｔｅ ｓ）等のベーシックアンドクリニカルイムノロジー（Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌ １ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第４版の第２２章（ＣＡ。

ロスアルトスのランゲメディカルパブリケーションズ（Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃ ａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）発行およびＵＳＰ　Ｎｏｓ、　３．６５４． ０９０：　３，８５０，７５２および４．０！６．０４３に見られる。

これら文献を本発明の参考文献とする。

好ましい態様において、該抗体または抗原試薬成分を固体マトリ・ソクスに固定 して、固体担体を形成することができる。該固体担体は本発明の診断系では別々 に包装される。この試薬は、典型的には水性媒体からの吸着により該固体担体に 固定される。勿論、当業者に周知の他の固定化法を利用することも可能である。

有用な固体マトリックスは当分野において周知である。このような材料＋ｉ商標 セファデックス（ＳＩＥＰＨＡＤＥＸ）の下でファルマーンアファインケミカル ズ社（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；　ＮＪ、ビスカタウ エイ）から入手できる架橋されたデキストラン；アガロース；■Ｌ州ソノ−スジ カゴアボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ）から入手できる径約１μｍ〜約５μｍのポリスチレンビーズ；ポリ塩 化ビニル；ポリスチレン；架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースまたはナ イロンを主成分とするウェブ、例えばシート、ストリップまたは、（ドル：また はポリスチレンまたはポリ塩化ビニル等から作成されたチューブ、プレートもし くＣマイクロタイタープレートのウェル等を包含する。

本明細書に記載する任意の診断系の該試薬種、標識した特異的結合試薬または増 幅試薬は溶液、液状分散体または実質的に乾燥された粉末、例えば凍結乾燥形と して供給できる。指示手段が酵素である場合、該酵素の基質も系の別個の包装と して与えることができる。固体担体、例えば上記のマイクロタイタープレートお よび１種以上のバッファーも、本発明の珍断ア・ツセイ系の別途（二包装された 要素として含むことができる。

診断系に関連して本明細書で議論する包装とは診断系において通常使用されてい るものである。かかる包装はガラスおよびプラスチック（例えば、ポリスチレン 、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）製のビン、ノ（イアル、プラスチッ クおよびプラスチック箔を積層した包封体等を包含する。通常、該試薬は不活性 雰囲気下で包装される。

Ｄ、アッセイ法 本発明は、細胞表面レセプターリガンド錯体上のＡＳＬまたはＬＩＢＳの検出を 可能とするあらゆる方法を意図する。好ましくは、該＾ＳＬは活性化されたＧＰ ［１ｂ−１１１ａに結合し、かつＬＩＢＳはリガンドのＧＰＩ　１ｂ−１１１ａ への結合に応答して発現される。

試薬分子の、そのターゲット種に対する相対的な結合アフィニティー１よ、蛍光 活性化流動血球計数法を利用し、本明細書に記載の如（して有利に測定される。

かくして、活性化欠陥をもつものと考えられる患者から採取した血小板−含有試 料の平均細胞蛍光強度（＆ＩｃＦＩ）が正常な血小板試料のＭＣＦＩの約５０％ 未満、好ましくは約１０％未満である場合には常に活性化欠陥が存在することに なる。

ＬＩＢＳの検出法は、ここに記載した如（、ＬＩＢＳと抗−ＬＩＢＳ抗体分子と の間の免疫反応生成物の形成およびか（して形成された該免疫反応生成物の後の 検出を包含する。検出すべき該ＬＩＢＳは血管流体試料、例えば血小板含有血液 試料中に存在するか、あるいは体組織中に存在し得る。当業者は、検出可能な免 疫錯体を形成するために利用できる多くの周知の臨床的診断化学手法があること を理解するであろう。従って、例示的診断アッセイ法をここに記載するが、本発 明はこれらに限定されない。

特に好ましいアッセイ法はＬＩＢＳの検出のために蛍光活性化流動血球計数法を 利用する。従って、ここに記載のアッセイ法を利用して、リガンド結合欠陥をも っと考えられる患者から採取した血小板含有試料のＭＣＦ　Ｉが正常な血小板試 料のＭＣＦ　１の約５０％未満、好ましくは約１０％未満である場合には常に該 リガンド結合欠陥が存在することになる。

種々の異種のおよび等積のアッセイプロトコールが利用でき、これらは血小板含 有血液試料、好ましくは体液試料、より好ましくは血管流体試料、例えば血液ま たは血液の血小板含有部分中のフィブリノーゲン結合血小板の存在、好ましくは その量の検出並びに測定に関して競合的であってもまた非−競合的であってもよ い。この方法は、血小板含有血液試料と血小板ＧＰＩＩｂ−１＋１ａと免疫反応 する抗体分子とを混合する工程を含む。このようにして形成した免疫反応混合物 を生物学的アッセイ条件下で、全てのフィブリノーゲン結合血小板が標識された 抗体と免疫反応し、かつ標識された免疫反応生成物を生成するのに十分な時間維 持する。

次いで、該標識された免疫反応生成物を、典型的には十分に遠心処理して、該試 料中に存在する全ての血小板をペレット化することにより、未反応の標識された 抗体から分離する。次いで、形成された標識免疫反応生成物の量をアッセイする 。

生物学的アッセイ条件は、本発明のポリペプチド分子および抗体分子並びにアッ セイすべきフィブリノーゲン結合血小板の生物活性を維持するような条件である 。これらの条件は約り℃〜約４５℃の範囲、好ましくは約３７℃の温度、約５〜 約９の範囲、好ましくは約７のＰＨ１および蒸留２水の値乃至約ＩＭの塩化ナト リウムの値の範囲、好ましくはほぼ生理塩水の値に相当するイオン強度を含む。

このような条件の最適化法は当分野で周知である。

種々の薬物、例えば合成ペプチドＧＲＧＤＳＰまたは蛇毒ペプチドトリグラミン （ｔｒｉｇｒａａ＋ｉｎ）等が、ＲＧＤ−含有リガントに対する結合サイトを介 してＧＰＩｌｂ−１１１ａを錯化することにより血小板機能を変調するのに使用 できるので、本発明はＧＰＩｌｂ−１１１ａ上の該リガンド結合サイトの薬物に よる占有の程度の検出方法をも意図する。この方法は本質的に上記のフィブリノ ーゲン結合血小板の検出に関連して記載した方法と同様に実施されるが、フィブ リノーゲンではなく、ＲＧＤ−含有リガント類似体が血小板と結合する。この方 法は類似体（薬物）の結合量、即ちＲＧＤ−リガンド結合サイトの占有の程度を 定量するために実施される。

本発明の診断法では、フィブリノーゲンに結合しおよび／またはＬＩＢＳを発現 する血小板の能力を監視することができる。血小板−含有体液試料を、ＧＰＩ　 １ｂ−１１１ａ特異的リガンド、例えばフィブリノーゲンまたはＧＲＧＤＳＰ等 の合成ペプチド、または他のＧＰＩｌｂ−１１１ａ特異的リガンド、例えばフィ ブリノーゲンγ−鎖ポリペプチド（Ｆｂγ４００−４１１）と共に、該リガンド が該血小板表面上のＧＰＩ　１ｂ−１１１ａ含有レセプタと結合して錯体を形成 するのに十分な時間混合かつインキュベートする。混合するリガンドの量は該体 液試料中の該血小板上に存在するＧＰＩｌｂ−１１１ａ特異的ＬＩＢＳを飽和す るのに十分な量である。該ＧＰＩ　Ｉｂ−１１１ａ錯体の形成は正常な血小板中 のＧｐＨ１ａ上でのＬＩＢＳの発現を生ずる。

好ましい態様においては、分析すべき血液試料を患者から採取し、アリコートに 分割する。少な（とも１個のアリコートを活性化能の測定に使用し、少なくとも １個のアリコートをリガンド−結合能分析に使用する。この分析は並行して実施 できるが、一般的には順次継続的に実施される。これらの分析を継続的に実施す る場合、該リガンド−結合能の測定は該活性化能の分析に先立っであるいは該分 析に引き続き実施することができる。

好ましい態様において、この活性化およびリガンド−占育能分析で得られたデー タを、有形の媒体、例えばコンピュータ保存またはハードコピーバージョンによ り記録する。該データは市販品として入手可能な標準的Ａ／Ｄ計装により自動的 に入力し、かつ記憶できる。また、該データは、データの相関性の最適な表示の ために、必要ならば呼出し、報告しまたは表示することができる。従って、本発 明の方法と共に使用するのに適した計装およびソフトウェア−も本発明の範囲内 に入るものとする。

本発明は、以下に記載する特定の実施例および添付した請求の範囲により、より 一層十分に理解される。

実施例 以下の実施例は本発明を例示するものであるが、本発明を限定するものではない 。

第１図に記載のモデルによれば、異常血小板凝集は血小板フィブリノーゲンレセ プタの活性化における欠陥、フィブリノーゲン結合自体の欠陥、または最適の凝 集に必要とされる後−占有事象における欠陥により生ずる可能性がある。このモ デルの潜在的な有用性を、持続性かつ重度の血小板凝集における欠陥をもつ２名 の患者を調べることによりテストした。フィブリノーゲンレセプタ活性化および リガンド結合を定量するために、ＧＰＩ　１ｂ−１１１ａの活性化型を特異的に 認識するフルオレセインで標識したＭｏＡｂ（ＰＡＣＩ）を使用した（シャッテ ィルＣ５ｈａｔｔｉｌ）等、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　１９８５．２６０．　ｐ、　＋１１０７）。抗体結 合を、流動血球計数法により血小板に富む血漿の少量の（５μＩ）試料で測定し た。

１、本発明の抗体 ここで使用する抗体の調製および特徴付けは至る所に詳細に記載されている。

またその特性を表１に掲載する。表１に列挙した抗体を調製しかっスクリーニン グする方法は以下の文献に記載されている。即ち、ＰＡＣ−１については、シャ ッテＩおよびＡｂ１５については、フレリンジ＋−（Ｆｒｅｌｉｎｇｅｔ）等、 　Ｊ、　Ｒ４ａ１．　Ｃｈｅｍ、、　１９９０、２６５．　ｐ、　６３４６：　 Ｔａｂについては、？−／クエバー（ＭｃＥｖｅｒ）等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、。

１９ｇ３．２５８．　ｐ、　５２６９：　４Ｆ１０については、ウッズ（Ｗｏｏ ｄ３）等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　１９８６、２６１．　ｐ、　＋５ ２４２：　ｌ０Ｅ５については、コラ−（Ｃｏｌｌｅｒ）等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ 、　Ｉｎｖｅｓｔ、。

！９８３．７２．　ｐ、　３２５：　７Ｅ３については、コラ−（Ｃｏｆｆｅｒ ）等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　１９３０５ａ　、ベネット（Ｂ ｅｎｎｅｔｔ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 、１９８３．８０．　Ｐ、　２４１７：　ＴＳＰＩ−１については、アイケン（ ＾１ｋｅｎ）等、　Ｂｌｏｏｄ、　１９８７．６９：　５８を参照のこと。フル オレセインイソチオシアネート−結合抗体は以下の文献に記載の如く、モル比： フルオレセイン／タンパクが３二６となるように調製した（シャツテイルＰＡＣ Ｉ　ＧＰＩＩｂ−１１１ａ−減少　減少（活性化血小板上） ＰＭＩ−Ｉ　ＧＰＩＩｂ　１鎖　なし　増大（Ｃ−末端） ＬＩＢＳＩ　ＧＰＩＩｌａ　なし　増大Ａｂ　１５　ＧＰＩＩＩａ　なし　なし Ｔａｂ　ＧＰＩＩｂ　なし　なし ４Ｆ１０　６ＰＩｌｂ−＋１１ａ　減少　Ｎ、　Ｄ。

１０Ｅ５　ＧＰＩＩｂ−１１１ａ　減少　Ｎ、Ｄ。

７Ｅ３　ＧＰＩｌｂ−１１１ａ　減少　Ｎ、　Ｄ。

Ａ！Ａ＠　ＧＰＩｌｂ−１１１ａ　減少　ＲＧＤ＝なしγ（４０２−４１１）　 ＝減少 抗−ＴＳＰ　トロンポスポンジン　なし　なし’　ＧＰＩｌｂ−＋１１ａ錯体 ゝ血小板に対するフィブリノーゲンの結合に及ぼす抗体の効果１抗体結合に及ぼ すＲＧＤ　、フィブリノーゲンγ鎖、Ｃ−末端ペプチドの効果’Ｎ、Ｄ、・測定 せず アブライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；　ＣＡ 州マウンテンビュー）製のペプチドシンセサイザーおよびこの製造業者の推奨す る方法を使用して、ペプチドを合成した。ペプチドは高速液体クロマトグラフィ ーによれば９０％を越える均一性をもつものであり、そのアミノ酸組成は所定の 配列と一致した。該ペプチドはＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｒ ｏ　（ＧＲＧＤＳＰ）、フィブリノーゲンｙ（４０２−４１１）　＝Ｌｅｕ−Ｇ ｌｙ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｖａｌ　（ ＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ）、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−`ｒｇ−Ｇｌｙ− Ａｓｐ−５ｅｒ　（ＫＹＧＲＧＤＳ）およびＬｙｓ−Ｇｉｎ−＾１ａ−Ｇｌｙ− ＾５ｐ−Ｖａｌ　（ＫＱＡＧＤＶ）であった。

３、流動血球計数法による血小板表面ＧＰ　Ｉ　１ｂ−１１１ａの分析血小板に 富む血漿を、患者および少なくともｌＯ日日間渡り薬物を摂取していないコント ロールから静脈血を採取し、ｌ／１０容の３．８％クエン酸ナトリウムで抗凝集 処理し、かつ室温にて１８０　ｇで２０分間赤血球および白血球を沈降させるこ とにより得た。その直後に、該血小板に富む血漿の５−μｍアリコートを、タイ ロードのバッフｙ−（Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒ：　１％ウシ血清アルブ ミン、２ｄ／ｌのＭｇＣ１５，１３７，５ｍＭ／ｌのＮａＣｌ５１２　ｍＭ／１ ＯＮａＨＣＯ，，２，６−ハのにＣ１、ｐＨ７，４）中に分散したフルオレセイ ンイソチオシアネート−結合モノクローナル抗体（１０１〜１０”　ｍｏｌ／ｌ ）を含むポリプロピレンチューブに添加した。第２図参照。試料を、全容積５０ μｍで室温にて攪拌せずに、上記の如きペプチドおよびアゴニストと共にインキ ュベートした。次いで、該試料をタイロードバッファーで０．５ｍｌにまで希釈 し、ファクスター（ＦＡＣＳｔｅｒ：　ＣＡ州マウンテンビューのベクトンーデ ィッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓ ｏｎ　１ｍｎ＋ｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ））で分析した。散 乱光および蛍光シグナルを対数で表したゲインとして得、各試料中の１０，００ ０個の血小板を分析した。結果は、任意の蛍光単位での平均血小板蛍光強度とし て表すか、または横軸に１０ｇ（任意の蛍光単位での血小板蛍光強度）をとり、 かつ縦軸に血小板数をとったヒストグラムで表す。

血小板無力症のＣａｍ変種はリガンド認識における欠陥のためであるグランラマ ンの血小板無力症のＣａａｉ変種は、殆ど正常な量のＧＰＩ　Ｊｂ−１１１ａを 含む血小板に対する著しく低いフィブリノーゲンの結合により特徴付けられる（ ギンスバーグ（Ｇｊｎｓｂｅｒｇ）等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、 　１９８６．７Ｂ、　９．１１０３）。該Ｃａｌ１血小板表面上におけるＧＰＩ ｌｂ−１１１ａの存在は流動血球計数法により確認され、該方法では抗−ＧＰＩ Ｊｂ　ＭｏＡｂ　（Ｔａｂ）および抗−ＧＰＩｌｌａ　ＭｏＡｂ　（ＡＢ−１５ ）の、Ｃａ１１および正常な血小板へのかなりの結合が見られた。更に、該ＧＰ Ｉｌｂ−１１１ａ錯体に特異的な４種のＭ。

ｘｂ　（Ａ＊Ａｓ、７８１３．１０Ｅ５．４ＰＩＯＸこれら全てはｌ：ｌの化学 量論量でＧＰＩ　Ｉｂ−１１１ａの非活性化型を認識し、かつ血小板へのフィブ リノーゲンの結合を阻害する）もかなりの量でＣａｎおよび正常な血小板に結合 した（第２図）。これについては、マツと。活性化−特異的ＭｏＡｂ　ＰＡＣＩ の＾ＤＰ−活性化ＣａＩＢ血小板への結合の完全な欠乏が鮮明なコントラストで 見られた（第２図）。この欠陥はＡＤＰ刺激に対して特異的ではない。というの は、５０　ｎｏ＋ｏｌ／１のホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）で活 性化したＣａｍ血小板も、ＰＡＣＩ蛍先における増加を示さなかったからである （図示せず）。

ＰＡＣＩはＧＰＩｌｂ−１１１ａのリガンド結合サイトを認識できるので、ＰＡ Ｃｌの結合がないことはＧＰＩ　１ｂ−１１１ａ活性化のないこと、リガンド結 合における欠陥、またはその両者によるものである可能性がある（シ’ｒッティ ル（Ｓｈａｔｔｉｌ）等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｏ、。

小さなフィブリノーゲン−類似ペプチドが活性化に独立な様式でＧＰＩｌｂ−＋ １１ａと結かかるペプチドの１種（ＧＲＧＤＳＰ）の結合を、フィブリノーゲン または小さなペプチドリガンドの結合を伴ってｌ：１化学量論量でＧＰ　Ｉ　１ ｂ−１１１ａを選択的に認識するＰＭＩ−１および抗−ＬＩＢＳＩ　１ｌｏＡｂ を使用してアッセイした（フレリンジ＋−（Ｆｒｅｌｉｎｇｅｔ）等、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、、　１９８８．２６３．　ｐ、　＋２３９７）。正常 な個体から採取した血小板は、２００μｍｏｌ／ＩのＧＲＧＤＳＰの存在下でＰ ＭＩ−１の結合において２，５−倍の増加を示したく未処理の血小板の平均蛍光 強度＝６０任意蛍光単位：　ＧＲＧＤＳＰ−処理血小板＝１５１１５１蛍光単こ れとは対照的に、ＣＩＬＱＩ血小板はＧＲＧＤＳＰに応答するＰＭＩ−１結合の 増加を示さなかった（未処理の血小板の平均蛍光強度＝１０２蛍光単位；　ＧＲ ＧＤＳＰ−処理血小板＝１０７蛍光単位）（第２図）。

未処理のＣａｍ血小板に結合するＰＭＩ−１が正常な血小板よりも高いことは、 ＰＭＩ−１の結合がＧＲＧＤＳＰのＣａａ＋血小板に対する結合の信頼性ある指 示体として使用できないことを示唆していることに注意すべきである。しかし、 抗−ＬＩＢＳＩ抗体はこの点に関してより有益である。第２図に示した如く、未 処理のＣａｍ血小板はコントロール血小板よりも、抗−ＬＩＢＳＩとの結合性が 低い（それぞれ、平均蛍光強度は２７および５８Ｕである）。該フィブリノーゲ ンー類似ペプチド、ＧＲＧＤＳＰは正常な血小板に対する抗−ＬＩＢＳＩの結合 性において４倍の増加を生じた（平均蛍光強度２０５　Ｕ）が、抗体結合におけ る増加はＣａ１１１血小板においては観察されなかった（平均蛍光強度２５Ｕ） 。Ｃａａ＋血小板に対する抗−ＬＩＢＳＩの結合も、血小板がＧＲＧＤＳＰの代 わりに他のフィブリノーゲン−類似ペプチドγ（４０２−４１１）（４００μｍ ｏｌ／１）で処理された場合には、増加を示さない（コントロール血小板＝２０ １蛍光単位Ｕ　；　Ｃａ１１血小板：　３１Ｕ）　（クロクチェビアック（Ｋｌ ｏｃｚｅｗｉａｋ）等、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ ｏｍａ＋ｕｎ、、　１９８２．１０７．　ｐ、　１８１ニブｏ　−（Ｐｌｏｗ） 等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、、　１９８４．２５X．　ｐ。

５３８８）。

抗−ＬＩＢＳＩ結合をある範囲のＧＲＧＤＳＰＩＩ度に渡り調べた場合、コント ロール血小板は、抗体結合において、ＧＰＩｌｌａ上のＬＩＢＳＩエピトープの 半一最大発現が２０μｍ。

１／ｌペプチドにおいて観測されるように、飽和性の増加を示した。これは、フ ィブリノーゲンの活性化された血小板への結合に対するこのペプチドのＩＣ１， と類似する（ブＣ’　−（Ｐｌｏｗ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　１９８５．８２．　Ｐ、　８０５７）、■ れとは対照的に、２００　μｍｏｌ／ｌのＧＲＧＤＳＰｉ：おいて、抗−ＬＩＢ ＳＩのＣａｍ血小板に対する結合は１μｍｏｌ／ｌのペプチドの存在下でコント ロール血小板につき観測される値よりも低かった。このことは、このペプチドに 対するＣａｍ　ＧＰＩＪｂ（Ｉｌａのアフィニティーが正常なＧＰＩｌｂ−１＋ １ａのアフィニティーよりも少なくとも２００−倍低いことを意味する。表２を 参照のこと。

の相関関係 ＊・抗−ＬＩＢＳＩ結合は指定した濃度のＧＲＧＤＳＰペプチドの存在下で測定 した。

４、血小板の単離並びに表面の放射性ヨウ素化立体配座−特異的抗体および完全 な細胞の使用により、上記のデータは、該Ｃａｍ変種が少なくとも部分的にはＧ ＰＩｌｂ−１１１ａによるリガンド認識における欠陥によるものであることを示 した。Ｃａａ＋　ＧＰＩｌｂ−１１１ａのりガント結合機能を直接調べるために 、１１１１表面−標識血小板の抽出物を、固定化ＲＧＤペプチドを使用したアフ ィニティークロマトグラフィーにかけた。

示差遠心分離処理し、次いでセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　２Ｂ、上で ゲル濾過することにより、酸−シトレードデキストロース抗−凝集ヒト血液から 血小板を単離れたように、ＫＹＧＲＧＤＳアフィニティークロマトグラフィーに より分析した。簡単に言えば、完全な血小板をラクトパーオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ ，法により放射性ヨウ素化し、次いで２Ｘ１０’血小板／ｍｌとなるように再懸 濁し、１０　ｍＭ／ＩのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎｏ−２−エタ ンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７，５，０，１５ｍｏｌ／ＩのＮａＣＬ　１ 　ｍＭ／１１０ＣａＣ１，１ｍｌｌ／１のＭｇＣ１ｘ　、０．１　ｍＶ／ｌのロ イペプチン、１　ｍ／１のフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ） 、１０１ｍＭ／ＩのＮ−エチルマレイミドおよび５０　ｍＷ／ｌのオクチルグル コシドを含む溶解バッファー中に可溶化させた。この溶解物をＣＮＢｒ−活性化 セファロースに結合したＫＹＧＲＧＤＳと共に４℃にて１２時間インキユベート シ、洗浄し、ｌｌ１ｔｈＩ力のＧＲＧＤＳＰで溶出した。これらの条件下で、約 １０２の正常なＧＰＩｌｂ−１１１ａが結合し、かつ溶出された。かなりの量が 該パススルー（ｐａｓｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ）画分の再クロマトグラフィーの際に 結合し、このことは１００％未満の結合が、ＧＰＩ　Ｉｂ−１１１ａの不活性な 準集団よりも、該相互作用の低いアフィニティーによるものであることを示唆し ている。

表面−標識した正常な血小板を、ＫＹＧＲＧＤＳペプチドマトリックスに通し、 次いでＧＲＧＤＳＰペプチドマトリックスに通したところ、ＧＰＩｌｂおよびＧ ＰＩＩＩａが結合し、溶出された。対照的に、Ｃａｎ血小板を使用した場合には 、該出発抽出物がかなりの量の表面−標識したＧＰＩＩｂ−１１１ａを含んでい たにもかかわらず、このようなＧＰＩｌｂ−１１１ａの溶出はなかった。出発材 料および該カラム両分中のＧＰＩ　１ｂ−１１１ａ含有率をＥＬＩＳＡアッセイ においてポリクローナル抗−ＧＰＩ　１ｂ−１１１ｎ抗体を使用することにより 定量した。使用したコントロール抽出物は３３２μｇの、また該Ｃ１１０１個体 はその出発抽出物中に２４０ａｇのＧＰＩｌｂ−１＋１ａを含有していた。該コ ントロール抽出物からの溶出画分は２０ａｇのＧＰＩＩｂ−１１１ａを含んでい た。これとは対照的に、Ｃａｍ抽出物からの溶出画分は２．６ａｇのＧＰＩＩｂ −１１１ａを含んでいた。かくして、Ｃａｏ＋　ＧＰＩｌｂ−１１１ａはＲＧＤ ペプチド等のリガンドの認識が不十分である。

５、　患者 グランラマン血小板無力症のＣａａ＋変種は詳細に記載されている（ギンスバー グ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　１９８６ ．７８．　ｐ、　１１０３）。この変種をもつ患者は殆ど正常な量のＧＰ　Ｉ　 ｌｂ−１ｌ　１ａおよび検出不能な血小板へのフィブリノーゲンの結合をもち、 かつ血小板凝集を示さない。この結果は、同等な結果を有する２名の男性の兄弟 につき観測された。

１９８４年に拡大する痣を示す５８才の婦人は骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）に罹っ ていることが示された。研究により、血小板数は１．５００．０００／μｌであ り、骨髄に巨核球の過度の生成および骨髄線維症が見られた。診断後は、この婦 人の痣は一定であり、初めその四肢および前胸部にも痣がみられ、また時折鼻血 を出した。彼女は４回に渡る胃腸管出血のエピソードをもち、その各々において ＲＢＣの２〜５単位（Ｕ）の輸注を必要とした。痣の発症の前に、彼女は数回の 止血鉗子による処置を受け、これは扁桃摘出、痔核切除および尾骨切除を含み、 また３回の合併症のない経膣分娩を経験した。肝牌腫大症および全身的な痣を除 けば、一般的な身体検査結果は正常であった。最近の研究室における発見は以下 の如くであった。即ち、ヘマトクリット３３、白血球数２９．０００／μｍ、好 中球２７、バンド（ｂａｒ＋ｄｓ）１８　、後骨髄球１２、骨髄球１１．芽細胞 ８、単核細胞２、リンパ球２１、好塩基球７、および有核ＲＢＣ６゜この患者は 〉２０分という異常な出血時間を示し、また正常な凝集プロフィール（プロトロ ンビン時間、活性化された部分トロンボプラスチン時間、トロンビン時間、およ びフィブリン分裂生成物）およびフオンウイルブランドパネル（Ｖｏｎ　１ｌｌ ｆｌｌｅｂｒａｎｄ　ｐａｎｅｌ：フォンウイルブランド抗原およびリストセチ ンコファクター活性、および正常なフォンウイルブランドマルチマー（ｍｕｌｔ ｉａ＋ｅｒｓ）分布）を示した。薬物の摂取なしに実施した、血小板凝集研究に より、ｌＯ〜！００μｍｏｌ／ｌのアデノシンニ燐酸（ＡＤＰ）　、５０μｍｏ ｌ／１のエピネフリン、およびコラーゲンに対して凝集を示さないことが明らか となった。

骨髄線維症を患う患者における低い血小板凝集はＧＰＩＩｂ−１１１ａの活性化 における欠陥により生ずる 次に、この方法を骨髄線維症および後天的な重度の血小板凝集における欠陥をも つ患者の特徴付けに適用した。この患者（ＭＰＤ）から採取した血小板は、１０ ８ｍのＡＤＰ　（第３図）および５０μｍｏｌ／ｌのエピネフリン（図示せず） で刺激した場合には、ＰＡＣＩ結合サイトを発現しなかった。このことは、ＧＰ Ｉｌｂ−１１１ａの活性化またはリガンド結合の何れかにおいて欠陥をもつこと を示す。

Ｃａｍ患者とは対照的に、ＧＲＧＤＳＰの存在下および不在下で、抗−ＬＩＢＳ およびＰＭＩ−１シグナルは正常なコントロール（第３図）と同様であり、この ことはリガンド結合機能が完全であることを示している。更に、ＰＡＣＩはＰＭ Ａに応答してＭＰＤ血小板と結合し、直接プロティンキナーゼＣを活性化するこ とにより正常なレセプター媒介経路を遮断する。この患者の血小板は、またＰＭ Ａに応答して正常なα顆粒を分泌する。これはα顆粒タンパクトロンポスポンジ ンの表面発現により証拠付けられる。この患者の血小板における凝集欠陥は、彼 女の血小板を正常な血漿中に懸濁しても解消し得ず、また該患者の血漿中で正常 な血小板をインキュベートすることによっては、該欠陥を該正常な血小板中に誘 発することはできなかった。

か（して、この患者からのＧＰＩＩｂ−１１１ａはＲＧＤリガンドに結合する能 力をもつが、ＧＰＩｌｂ−１１１ａのレセプター媒介活性化における固有の細胞 欠陥があるように思われる。

６、実施例１〜５の議論 ここ２０年間に渡り、血小板機能不全のために長期間におよぶ出血時間または出 血体質を持つ患者の特徴付けにおいて、インビトロでの血小板凝集の研究が日常 的に利用されてきた。最近の研究の結果は、正常な凝集がフィブリノーゲンの血 小板ＧＰＩｌｂ−１１１ａへの結合を必要とすることを明らかにした。更に、こ の凝集過程は一連の必要な細胞的事象、即ち（ａ）フィブリノーゲン結合サイト の露出をもたらす、ＧＰＩＩｂ−１１１ａのアゴニスト−誘起性活性化、（ｂ） フィブリノーゲンの結合、および（Ｃ）リガンド結合の際にみられる後−占有事 象（第１図）と考えることができる。上記の流動血球計数法に基いて、この一連 の事象によって血小板凝集の疾患を分類することができる。ここで使用する流動 血球計数法は迅速な測定を可能とし、かつ血小板に富む血漿または全血に対して 実施できる。この方法は、ＧｐＨｂ−１１１ａの静止、活性化、およびリガンド −占有型の間の区別を可能とするＭｏＡｂが入手可能となった結果実施可能とな った。低い血小板凝集に導く可能性のあるこれら３種の血小板機能不全および予 想された流動血球計数法による結果を以下の表３にまとめた。

表３　血小板業種機能不全の流動血球計数法による分析応答 （＋）：正の応答；　（−）：　無視できる応答ａ・アゴニスト刺激血小板凝集 ｂ・＋＝アゴニストに対する応答において、活性化依存性リガンド（ＰＡＣ１抗 体）の結合増大 Ｃ：＋＝活性化−独立リすントＧＲＧＤＳＰの存在下での、占有依存性抗体（抗 −ＬＩＢＳ　１）の結合増大 この方法を利用すれば、グランラマン血小板無力症の変種が、ＧＰＩＩｂ−１１ １ａのリガンド結合機能における欠陥によるものであることが分かり、また骨髄 線維症を患う患者の著しく低い凝集性がＧＰＩＩｂ−１１１ａのアゴニスト−特 異的活性化における欠陥によるものであることが分かる。

後−占有機能不全を持つ患者はここでは同定されないが、このような障害をも□ 　つ患者は後に同定することができる。後−占有欠陥はアゴニスト−誘起性血小 板感度低下の過程を説明する。例えば、フィブリノーゲンの存在下で、ＡＤＰま たはエピネフリンと共に１０分以上活性化した攪拌されていない血小板は、フィ ブリノーゲンの不在下でインキュベートされた同一の血小板と比較した場合に、 後の凝集応答における大幅な減少を示す（ビアーシュケ（Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅ） 等、　Ｂｌｏｏｄ、　１９８１゜５７、　Ｐ、　６６３；シャッティル（Ｓｈａ ｔｔｉｌ）等、　Ｂｆｏｏｄ、　！９８６．６８．　ｐ、　１２２４）　、これ はフィブリノーゲンの結合の減少によっては説明し得ない。臨床的診療において 、多くの患者は、痣のできやすさ、長い出血時間、および１種以上のアゴニスト に対する応答における低い血小板凝集などの症状に遭遇する。アスピリン摂取の 排除およびスト−レージプール疾患（ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｏｏｌ　ｄｉｓｅａｓ ｅ）の排除後、根源的な原因は、通常未知のままである。このような患者群は、 しばしば［アスピリン一様（ａｓｐｉｒｉｎ−１ｉｋｅ）」欠陥をもつといわれ 、また幾人かはＧＰＩｌｂ−１１１ａの活性化異常に導く先天的または後天的な 血小板代謝欠陥をもつ可能性がある。同様に、この不均一な患者群の中で、後− 占有機能不全フェノタイプをもつ患者も同定されるであろう。

血小板無力症のＣａｍ変種は、主にＧＰＩＩｂ−１１１ａによるリガンド認識に おける欠陥によるものと思われる。この結論は（１）　Ｃａｎ　ＧＰＩｌｂ−＋ １１ａが不溶化されたＲＧＤペプチドに結合し得ないことおよび（２）活性化− 独立ペプチドリガンドの、占有−依存性抗−ＬＩＢＳ！抗体の結合を増大する能 力の２００−倍を越える減少に基（。フィブリノーゲンおよびフィブリノーゲン −関連ペプチドのタンパク分解性フラグメントに関する以前の研究は、フィブリ ノーゲン結合におけるＲＧＤおよびフィブリノーゲンγ鎖ペプチド配列の認識に 関連した（クロチェビアツク（Ｋｌｏｃｚｅｗｉａｋ）等。

Ｂｉｏｃｈｅｗ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、１９８２． 　１０７．　ｐ、１８１；ブロー（Ｐｌｏｗ）等、　Ｊ、　aｉ。

１、　Ｃｈｅｗ、、　１９Ｂ４．２５９．　ｐ、　５３８８ニブロー　（Ｐｌｏ ｗ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　tＳＡ。

１９８５、８２．１１．８０５７：ギンスバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）等、　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩＤ、、　＋９８５．２６０．９゜３９３１）。本研究 において、これらペプチド配列に結合する能力に欠けるＧＰＩＩｂ−１１１ａは フィブリノーゲンの結合および血小板凝集を維持する能力に欠けていた。該Ｃａ ｍ変種の見掛けの常染色体−劣勢遺伝、ＧＰＩＩｂ−１１１ａにおける重度の機 能的欠陥および該患者の中間的機能欠陥の観点から、基本的Ｃａａ＋欠陥はＧＰ Ｉｌｂ−１＋１ａにおける点突然変異によるものであると考えられる（ギンスバ ーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　１９８ ６．７８．　ｐ、　１１０３）。このような点突然変異は最近Ｃａｎ患者にも存 在することが明らかにされたくロフタス（Ｌｏｆ　ｔｕｓ）等、　Ｂｌｏｏｄ、 　１９８９．７４：５８Ａ、　５ｕｐｐ１．１）。この単一のアミノ酸変化がＲ ＧＤおよびγ鎖ペプチド配列両者の結合性の喪失に導（という観察は、両ペプチ ド配列が共通の結合サイトにより認識される可能性を裏付ける（ラム（Ｌａａｌ ）等、　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅ＋ｎ、、　１９８Ｂ、　２６３．　ｐ、　１ ２３９７）。

該ＰＡＣＩ抗体をＧＰＩＩｂ−１１１ａ活性化を監視するのに使用した。という のは、これが選択的かつ高いアフィニティーで血小板と結合して、これらを刺激 するからである（ブロー（Ｐｌｏｗ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ比Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ、　１９８５．８２．　ｐ、　８０５７）。更に、フィブリノー ゲンおよびフィブリノーゲン−類似ペプチドにょるＰＡＣＩ結合の阻害およびＰ ＡＣＩの高頻度可変領域由来のペプチドのフィブリノーゲン結合を阻害する能力 に基いて、この抗体がＧＰＩｌｂ−１１１ａのリガンド結合サイトを認識するも のと考えられる（シャッティル（Ｓｈａｔｔｉｌ）等、　Ｂｌｏｏｄ、　＋９８ ９．７３．　ｐ、　＋５０：ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　ＣｈｅＩｌｌ、、　１９Ｂ８．２６３．　ｐ、　１２９４８；トープ（Ｔａ ｕｂ）等、　Ｊ、　Ｂｉｏ戟A　Ｃ ｈｅｍ、、　１９８９．２６４．　Ｐ、　２５９）。この仮説は、ＰＡＣＩがリ ガンド結合機能に劣るＣａｏ＋変異体ＧＰＩｌｂ−１１１ａを認識できないとい う発見により強（支持される。ＰＡＣ１がＣａｎ血小板と相互作用し得ないこと がＧＰＩＩｂ−１１１ａの過度の変性によるものとすることはできそうもない。

というのは、４種の他の錯体−特異的抗−ＧＰＩｌｂ−１１１ａ抗体が抗−ＧＰ Ｉｌｂまたは抗−ＧＰＩＩＩａ抗体と同程度に結合すると思われるからである。

これら４種の抗体に関連して、７Ｅ３はより迅速に活性化された細胞に結合し、 かつ＾。

Ａ、はフィブリノーゲンγ鎖由来の合成ペプチドにより阻害される（コラ−（Ｃ ｏｌｌｅ「）等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　１９８５．７６、　 Ｐ、　１０１：ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

ＣｈｅＩＢ、、　１９８８．２６３．　Ｐ、　１２９４８）。Ｃａａ＋　ＧＰＩ ｌｂ−１１１ａはフィブリノーゲンまたはそのペプチドリガンドを認識する能力 に欠けるので、これらの以前の発見は７８３およびＡ！ＡＩエピトープとＧＰＩ ｌｂ−１１１ａのリガンド結合サイトとの間接的な関係によるものと考えられる 。

ＧＰＩｌｂ−１１１ａは、構造上関連性をもつ付着レセプタのインテグリン群の １員である（ハインズ（Ｈｙｎｅｓ）等、　Ｃｅ１１．１９８７．４８．　ｐ、 　５４９：　ビテラ（Ｐｙｔｅｌａ）等、　５ｃｉｅｎｃ３５１）。この群に含 まれるものは、血小板コラーゲンレセプタ、炎症および発熱性の感染症の防禦に 関与する白血球レセプタ、およびリンパ球の指向性に関与する（Ｈｏｌｚｍａｎ ｎ）等、　Ｃｅ１ｌ、　＋９８９．５６．　ｐ、　３７）。白血球レセプタにつ いて、最近の研究はこれらレセプタの活性化が白血球凝集および内皮細胞接着を 誘発することを報、告している（バーラン（Ｈａｒｌｉｎ）等、　Ｂｌｏｏｄ、 　１９８５．旦ｐ、　１６７）。更に、占有−依存性勤＾ｂが内皮細胞インテグ リンに対して形成された（フレリンジャー（Ｆｒｅｌｉｎｇｅｔ）等、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、、　１９９０．２６５．　ｐ、　６３４６）、このこ とは、活性化−特異的および占有−依存性抗体が他のインテグリンに対して形成 され、かつ本明細書にＧＰＩＩｂ−１＋１ａに関連して記載したものと同様な方 法で、白血球機能不全の分析にも利用できることを示唆する。事実、これらの方 法は非−インテグリンレセブタの結合機能の迅速な分析をも可能とするはずであ る。

７、抗−ＬＩＢＳ抗体の調製 ６０ｍ１のヒト全血を、最終濃度０．０６単位／ａｌｌ　（Ｕ／ｍｌ）でヒルジ ン（ＭＯ，セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、）を含む八ＣＤ（０，０６５Ｍのクエン酸、０゜０８５Ｍのクエン酸ナト リウム、２％のデキストロース）５ｍｌ中に集め、１２０Ｘｇにて１５分間遠心 処理した。得られた上澄（血小板に富む血漿（ＰＰＰ）と呼ぶ）を回収し、単離 し、更に１２００ｘ　ｇにて１５分間遠心処理して、単離血小板のペレットを形 成した。生成した上澄を集め、他のアッセイにおいて血小板に乏しい血漿として 使用した。

（２）血小板からのＧＰＩｌｂ−１１１ａの単離実施例７Ａ（１）　テ調製した 血小板のペレットを５ｍ１ＴＢＳ（０，１５Ｍ　）ＮａＣ１，０，２１１（Ｄ　 トリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７，４，０，５＋ｎＭのＣａＣ１＊　、０．０１ｍＭ のロイペプチン）中に再懸濁し、モデル（Ｍｏｄｅｌ）　Ｗ−３７５超音波装置 （ＮＹ、プレンビューのハートシステムズウルトラソエックス（Ｈｅａｔ　Ｓｙ ｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ））を使用して、最大セツティングにて１ ０分間、氷上で超音波処理した。この超音波処理した懸濁物を、ドライアイス− メタノール水浴を使用して２回凍結−解凍処理し、−２０’Ｃにて保存した。超 音波処理し、凍結−解凍処理した血小板を５ｍｌのスクロース溶液（ＴＢＳ中４ ｏ％Ｖ／Ｖ）上に展開し、５Ｗ４１遠心ロータ（ＣＡ、フラートンのベツクマン インスッルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｌｎｓけｕｍｅｎｔｓ））中で３８．００ ０回転／分（ＲＰＭ）にて１時間４℃にて遠心分離処理して、乳白色のインフラ ネータント（ｊｎｆｒａｎａｔａｎｔ）を形成した。この乳白色のインフラネー タントを、次に回収し、４℃にて１時間、ｆｆ５０．１遠心ロータ（ベックマン ）内で４３．００ＯＲＰＭにて遠心分離処理した。生成したペレットを典型的に は１〜２ｍｌのＴＢＳ中に再懸濁して、血小板膜溶液を調製した。バイオ−ラド プロティンアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｋ ｉｔ：　ＣＡ、リッチセントのバイオ−ラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を製造業者 の指示に従って使用して、駿溶液のタンパク濃度を測定したところ、１０−２５ 　ａ＋ｇ／ｍｌであることが分かった。

この血小板膜溶液を再度上記の５Ｗ５０．１遠心ロータ内で遠心処理し、得られ たペレットを抽出バフ　７　ｙ　−（０，０３ＭのトリＸ（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７ ，４、ｏ、ｏｌＩＩＩ＆Ｉノロイヘブチン、２００　ｍＭのｎ−才クチル−β− Ｄ−グルコピラノシド：ＣＡラジジラのカルビオケムーベーリング（Ｃａｌｂｉ ｏｃｈｅａ＋−Ｂｅｈｒｉｎｇ）社）２ｍｌ中に再懸濁した。か（して生成した 該血小板膜抽出物を攪拌により十分に混合し、次いで室温にて３０分間保った。

その後、この抽出物を４℃にて１時間、５Ｗ５０．１遠心ロータ内で４５．００ ＯＲＰＭにて遠心分離処理し、かくして生成した血小板膜抽出物の上澄を回収し た。

この回収した上澄を、Ｉｆのカラムバッフ　ｙ　−（０，０３Ｍのトリス（Ｔｒ ｉｓ）、ＰＨ７，４，０，１−〇ＣａＣＩ＝　、０．１％のｎ−才クチル−β− Ｄ−グルコピラノシド）で平衡化されているＬＫＢウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇ ｅｌ）Ａｃａ　３４ゲル濾過カラム（３ｘ９７　ｃｍ：　ＭＤガイザースバーグ のＬＫＢインスッルメンツ（ＬＫＢ　Ｉｎ５ｔｒｕＩｌｌｅｎｔｓ）社）に適用 し、各５ｍｌの両分を生成するカラム流出液から集めた。各画分の２８０　ｎｍ における光学密度を測定し、数個のピーク近傍の画分を併合して各ピークのプー ルを得た。６％ポリアクリルアミドスラブゲル中で、還元性バッファーおよびラ エムリ（Ｌａｅ＋ｗｌ　ｉ）、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、　１９７０． ２２７．　ｐｐ、　６８０−６８５に記載の手順、および１４．４（ＫＤａ）　 〜９２．５　ＫＤａの範囲内のサイズの低分子量タンパク標準（ＣＡリッチモン ドのバイオ−ラド（Ｂｉ。

−Ｒａｄ）社）を利用して、各プールからの試料を電気泳動することにより分析 した。

ＧＰＩｌｂおよびＧＰＩＩＩａに対応する分子量、即ちそれぞれ１２０　ＫＤａ および１００　ＫＤａを有する２種の支配的なタンパク種を含むプールを回収し た。かくして調製した単離ＧＰＩｌｂ−１１１ａ処方物のタンパク濃度は、典型 的にはバイオ−ラドプロティンアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｋｆｔｓ）を使用して測定し、０．３〜０．８　ｍｇ／ｍｌの 範囲内にあることが分かった。

（３）　ＧＰＩＩｂ−１１１ａのポリペプチドアフィニティーによる単離式：　 Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｓｅｔ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓで示されるペプチド の合成を、メリフィールド（ＭｅｒｒＬｆｉｅｌｄ）、　Ｊ、　Ａ＋＋＋、　Ｃ ｈｅｗ、　Ｓｏｃ、、　１９６３．８５．　ｐｐ、　２１４９−５４の方法を利 用■ て実施するか、あるいはベニンシュララボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：ＣＡベルモント）から購入した。全てのペプチドは、 Ｃ，ボンダパックカラムおよび０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの ０−６０％の線形勾配を使用した高速液体クロマトグラフィー（ｌ（ＰＬＣ）に より分析したところ、９０％以上の均一性を有していた。固定化したペプチドＧ ｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓを含むアフィニティー マトリックスを、該ペプチドとシアノゲンーブロミドー活性化セファロース４Ｂ （ＮＪ　、ビスカタウエイのファルマーシアＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐｈｉｒ ｍａｃｉａ　Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））とを、製造業者の指示に従っ てカップリングすることにより調製した。該固定化ペプチドを含むアフィニティ ーマトリックスをカラム（０，７Ｘ１５ｃａｂ）に充填し、５０Ｉｎ＆Ｉのオク チルグルコシド、ＩＩＩＩＭのフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳ Ｆ）、ＩＩＩＩＭのＣａＣ］ｔおよび１ｍＭのｕｇｃｔｔを含有するｐ）１７． ！５のＰＢＳで４℃にて平衡化した。実施例７Ａ（２）に従って調製した該血小 板溶解物上澄をこのＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ を含むアフィニティーマトリックスに適用した。

未結合のタンパクを、２５ｍＭのオクチルグルコシド、１ｍ＆ｌのＰＭＳＦ、１ ｍＭのＣａＣ１ｇおよびｌ−のＭｇＣ１，を含有するｐＨ７，５のＰＢＳ（カラ ムバッファー）で溶出した。次いで、結合したＧＰＩｌｂ−１１１ａを、１．７ −の濃度で上記ペプチドを含有するカラムバッファー１０ｍ１で該カラムを洗浄 し９、次いで更に１０ｍ１のカラムバッファーで洗浄することにより溶出した。

各２．５ｍｌの画分を集め、各両分中のタンパクを、１０％の２−メルカプトエ タノールで還元した後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（７ ，５％）上での電気泳動により分析した。カレントプロトコールインモレキュラ ーバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、オースペル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等線、ジョンウィリー ＆サンズ、ＮＹ、　１９８７に記載された方法に従って、クーマシーブルーで染 色することにより該タンパクのバンドを可視化した。

（４）　ＧＰＩｌｂ−１１１ａの免疫アフィニティーによる単離該抗体ＰＭＩ− １（これはＧＰＩｌｂに結合している；　ＭＤ、ロックビル、＾ＴＣＣ）とアフ ィーゲル（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ）　１０（ＣＡ、リッチモンドのバイオラド（Ｂｉ ｏｒａｄ）社）とを、１ｍｌの樹脂当たり４ｍｇの抗体なる比率で、該活性化樹 脂の製造業者の指示に従ってカップリングすることにより免疫アフィニティーカ ラムを調製した。実施例ＩＡに従って調製した血小板（６Ｘ１０”）を、１０ｍ ＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（２−！タンスルホン酸） 　（ＨＥＰＥＳ）、１　ｍＭ＋７）ＣａＣ１＊、１ｍＭのＭｇＣ１，，０，１５ ＭのＮａＣ１，１ｍｇ／ｍｌのフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳ Ｆ）、１．２５　ｍｇ／ｍｌのＮ−エチルマレイミドおよび０．　ｔ　ｍｇ／ｍ ｌのロイペプチンを含むカラムバッファー中の５０ｍＭのオクチルグルコシドの 溶液１ｍｌ中で溶解した。４℃にて１時間、５Ｗ５０．１０−ター内で４５．０ ００　ＲＰＭにて遠心処理することにより不溶物を除去した。血小板溶解物と呼 ぶ、生成した上澄を集め、１ｍＭの濃度の該ペプチドＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ＧＲＧＤＳＰ）と混合し、次いで２ｍｌの抗 体−アフィーゲルｌＯと混合し、４℃にて１２〜１８時間保った。次いで、この 混合物をカラムに入れ、ｌ−の該ペプチドＧ！ｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓおよび２５ｍＭのオクチルグルコシドを含有するカラムバ ッファーのカラム容量の１０倍量で洗浄し、カラム容量の５倍量の、該ペプチド を含まず、２５ｍＭのオクチルグルコシドを含有するＩ）Ｈ５のカラムバッファ ーで溶出した。か（して溶出した両分を即座にＰＨ７，２に中和し、プールし、 ５−のオクチルグルコシドを含有するカラムバッファーに対して透析した。か（ して調製され、単離されたＧＰＩｌｂ−１１１ａ処方物のタンパク濃度はバイオ −ラドプロティンアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａ ｙ　Ｋｉｔ）を使用して測定した。

Ｂ、　モノクローナル抗体組成物の調製ＧＰＩ　１ｂ−１＋　１ａを活性化し、 ＧＰＩｌｂ−１１１ａ上のりガント−誘起結合サイトと免疫反応するモノクロー ナル抗体を、以下に述べる例外を除き、標準的なハイブリドーマ技術を利用して 生成した。簡単に言えば、２種のＢａ１ｂ／ｃマウスを、それぞれ増大する投与 量（１８ｇ、１０ａｇ、２５μｇ、５０μｇおよび１００μｇ）の、実施例７Ａ （３）で調製されたようなアフィニティー−単離したＧＰＩｌｂ−１１１ａを含 むレセプターリガンド錯体（１，２５ｍｇ／ｍｌ）およびペプチドｃｔｙ−＾ｒ ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（３ａ＋ｇ１０＋１）からなる免 疫原で１週間の間隔で４回に渡り、腹腔内経路で免疫処理した。第１回の免疫処 理では、該免疫原を完全フロインドアジュバントでｌ：ｌに希釈し、第２および ３回の免疫処理では不完全フロインドアジュバントで１＝１に希釈し、また第４ 回目の免疫では通常の塩水で希釈した。第４回目の免疫処理の３日後に、約ｌ× ＩＯ＠個のリンパ球をこれら両マウスの牌臓から単離し、細胞融合促進剤として ５０％ＰＥＧ　１５００を使用して、５ＸＩＯ’個（ＤＰ３Ｘ６３ＡＧ８．０５ ３ｖウスミエローマ細胞と懸濁状態で混合し、かつ融合させた。得られた形質転 換された（融合された）抗体−産生細胞（ハイブリドーマ）をまず約ｌＸｌ０＠ 細胞／ウエルの密度で９６−ウェルマイクロタイタープレートに移し、選択）Ｉ ＡＴ培地中で培養した。

培養開始８日後に、生きたＨＡＴ耐性ハイブリドーマ細胞を含むと思われる約２ ０００のウェルからの組織培養上澄を、実施例７Ｃ（１）に記載のＥＬＩＳＡア ッセイで、プラスチック−固定化ＧＰＩ　１ｂ−１１１ａと免疫反応する抗体分 子につきスクリーニングした。約４４個のハイブリドーマ培養物が、ＧＰＩｌｂ −１１１ａと免疫反応する抗体分子を生成するものと同定された。次いで、単離 したハイブリドーマを限界希釈で２度継代培養して、ウェル当たり約１細胞とし た。得られたハイブリドーマ培養物の２４個が以下の３つの基準に基いてモノク ローナル源であることが示された。即ち、（１）各上澄は単一細胞フォーカス由 来のものであり、かつ該［！Ｌ　ＩｓＡスクリーニングにおいてＧＰＩｌｂ−１ １１ａと免疫反応したこと、（２）各上澄は、モノクローナル抗体：原理および 実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ 　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、　Ｊ、Ｗ。

ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）編、アカデミツクブレス社、オルランド、フロリ ダ、　１９８３に記載されている方法に従って、セルロースアセテートゲル電気 泳動により分析した場合に単一の均一なバンドを示したこと、および（３）各上 澄は、製造業者：インジアナ、インジアナポリスのベーリンガーマンハイムバイ オケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ）により与えられた指示に従って、マウスＩｇスクリーニング＆イソタイ ピングキット（Ｍｏｕｓｅ　Ｉｇ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｓｏｔｙｐ ｊｎｇ　Ｋｉｔ）を使用して分析した場合に、単一のイソタイプの免疫グロブリ ンを含んでいたこと。

特徴付けされた該ハイブリドーマ上澄の幾つかのイソタイプ分析の結果を以下の 表４に示す。

ＬＩＢＳａ　ＧＰＩＩＩａ　Ｇ＋Ｋ　Ｏ，６１０，３２４８ＬＩＢＳｂ　ＧＰＩ Ｉｌａ　Ｇ＊−に　０．６２　０．３５　４４ＬＩＢＳｃ　ＧＰＩＩＩａ　Ｇ、 Ｋ　Ｏ，４５０，２１５３ＬＩＢＳｄ　ＧＰＩＩＩａ　Ｇ＊−Ｋ　Ｏ，７９０， ６２２２ＬＩＢＳｅ　ＧＰＩＩＩａ　Ｇ＋Ｋ　Ｏ，８２０，５２３７ＬＩＢＳｆ 　ＧＰＩＩＩａ　ＮＤ’　０．２９　０．１７　４１ＬＩＢＳｇ　ＧＰＩＩＩａ 　ＮＤ　Ｏ，６４０，５１２０ＬＩＢＳｈ　ＧＰＩＩＩａ　ＧｔｓＫ　Ｏ，３８ ０，２８２６ＬＩＢＳｉ　ＧＰＩＩＩａ　Ｇ＊−Ｋ　Ｏ，２２０，１７２３ＰＭ Ｉ−２°　ＧＰＩＩＩａ　ＧｔｓＫ　Ｏ，５８０，４６２１Ｍａｂ１５　ＧＰＩ ＩＩａ　Ｇ＋Ｋ　Ｏ，２５０，２３８Ｍａｂ１９　ＧＰＩｌｌａ　ＭＫ　Ｏ，３ ２０，３２０Ｍａｂ２３　ＧＰＩＩＩａ　Ｇ＊、Ｋ　Ｏ，１７０，１５１２ＬＩ ＢＳｊ　ｈＧＰＩｌｂ　ＭＫ　Ｏ，９００，７０２２ＰＭＩＩ’　ｈＧＰＩｌｂ 　Ｇ＊ｂＫ　Ｏ，９８０，３６６３Ｍａｂ１３　ｈＧＰＩｌｂ　Ｇ＋Ｋ　Ｏ，６ １０，５１１６ＭａｂｌＯｈＧＰＩｌｂＧ＋ＫＯ，８４０，７９６Ｍａｂ１８　 １ＧＰＩｌｂ　ＭＫ　Ｏ，４００，３４１５Ｍａｂ１６　１ＧｐＨｂ　ＭＫ　Ｏ ，５４０，４７１３Ｍａｂ５　１ＧＰＩｌｂ　ＭＫ　Ｏ，６６０，６４３ＬＩＢ Ｓｋ　Ｇ、Ｋ　Ｏ，８００，５９２６Ｍａｂ３８　Ｇ＋に　０．８２　０．６９ 　１６Ｍａｂ５１　ＮＤ　Ｏ，７６０，７３４ａ：サブユニット特異性は実施例 ７Ｂに記載の如（ウェスターンブロッティング法により測定した。

ｂ：　Ｂ／Ｂｅは、血小板溶解物（５ＸＩＯ”個の血小板／ｍｌに等しい）の存 在下ＣＢ）でＡ４９０において測定された吸光度対溶解物の不在下（Ｂ、）でＡ ４９０において測定された吸光度の比を表す。この比Ｂ／Ｂ＠はＧＲＧＤＳＰ（ １ｍＷ＞の存在下（りおよびＧＲＧＤＳＰの不在下（−）の両者において測定し た。ＧＲＧＤＳＰを添加した際のＢ／Ｂｅの変化はＬＩＢＳの存在を示す。Ｂ／ Ｂ＠の％変化が２０％より大きい場合には、抗体は抗−ＬＩＢＳであると考えら れる。

ｄ：ＮＤ＝測定せず。

ｅ：　ＰＩＪＩ−１およびＰＭＩ−２は、シャトル（Ｓｈａｄｌｅ）等、　Ｊ、 　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１９Ｂ４．９９゜ｐｐ、　２０５６−６０に記載さ れたように、免疫原として血小板膜を使用して別々に感作し、融合することによ り形成され、本明細書に記載の如く抗−ＬＩＢＳ活性に関してスクリーニングさ れた。

上記のスクリーニング法により、プラスチック−固定化ＧＰＩ　１ｂ−１１１ａ と免疫反応する抗体分子を産生ずる２２個のハイブリドーマが同定された。

ＧＰＩＩｂ−１１１ａ上のりガント−誘起性結合サイト（ＬＩＢＳ）　（即ち、 ＧＰＩｌｂ−１１１ａＬＩＢＳ）と免疫反応する抗体分子を産生ずるハイブリド ーマを同定するために、実施例７Ｃ（２）に記載され、以下で論するように競合 ＥＬＩＳ＾スクリーニングを実施した。ここでは、免疫反応混合物をＧＰＩ　Ｉ ｂ−１１１ａ特異的リガンドの存在下および不在下に維持して、ＧＰＩＩｂ−１ １１ａＬＩＢＳを発現させた。抗−ＧＰＩｌｂ−１１夏ａＬＩＢｓ抗体分子は、 ＧＰＩｌｂ−１１！ａ特異的リガンドの存在下で測定した場合に、特異的リガン ドの不在下での測定値と比較して、より高いＧＰＩｌｂ−１１１ａとの免疫反応 のアフィニティーを示す。この大きなアフィニティーが、ＧＰＩＩｂ−１１１ａ 特異的リガンドの存在下で測定した場合に（その不在下での測定値と比較して） 、２０％を越える４９０　ｎｍにおける吸光度の比（Ｂ／Ｂ＠）の変化を表す。

表４に列挙した２２個のハイブリドーマ群から、ＧＰＩｌｂ−＋１１ａＬＩＢｓ と免疫反応する抗体分子を産生ずる２０個のハイブリドーマが同定され、これら のハイブリドーマを、表４に示した如く、ここではＬＩＢＳａ−ＬＩＢＳｎと呼 ぶ。

更に、表４に示したように、他の抗−ＬＩＢＳ抗体分子が上記方法により単離さ れた。これらは該血小板レセプタのＧＰＩｌｂまたはＧＰＩＩＩａサブユニット 上に存在する他のＬＩＢＳエピトープと免疫反応する。

特に好ましい抗体は、表４にみられるようなＬＩＢＳエピトープとの免疫反応の 高いアフィニティーを呈するものである。これらは該特異的リガンドを添加した 場合に、２５％を越える、好ましくは３０％を越える、より好ましくは４０％を 越えるＢ／Ｂ、における変化を示す抗体である。

表４に列挙したモノクローナル抗体により検出される特定のＧＰＩｌｂ−１１１ ａＬＩＢｓの位置は、トビン（Ｔｏｂｗｉｎ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ、　１９７９．７６、　ＰＰ、　４３５０−５４ に記載された一般的方法に従って、ウェスターンイムノブロッティングを実施す ることにより、該血小板レセプタのサブユニット領域にマツピングされた。

簡単に言えば、実施例７Ａ（２）において単離されたＧＰＩｌｂ−１１１ａを、 還元条件下での７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ ＧＩＩりにかけ、膜に移し、かつ表４に列挙したハイブリドーマの上澄と免疫反 応させた。該ハイブリドーマ上澄中に与えられたモノクローナル抗体と該膜上の ＧＰＩｌｂ−１１１ａタンパクサブユニツトとの間で形成される免疫反応生成物 を、ビオチン修飾した第二の抗体およびアビジンを結合したペルオキシダーゼを 使用して、製造業者の指示に従って検出した（ベクタスタイン（Ｖｅｃｔａｓｔ ａｉｎ）　ＡＢＣ法、ＣＡ州バーリンガムのベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））。

該ウェスターンイムノプロットマツピングの結果は、該ハイブリドーマ上澄の殆 どが５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいてそれぞれＧＰ１１ｂ重鎖（ｈＧＰＩｌｂ）、ＧＰ ＩＩｂ軽鎖（ｌＧＰＩｌｂ）またはＧｐＨｌａに対応する１２０　ＫＤａ　、　 ２０　ＫＤａまたは１００ＫＤａなる見掛は上の分子量を有するタンパクと免疫 反応する抗体分子を含有することを示した。幾つかの場合において、抗体分子は 該単離されたＧＰＩｌｂ−１１１ａサブユニツトの何れとも反応せず、そのサブ ユニット特異性は特徴付けされずに残された。これらの決定されたサブユニット 特異性を表４に示した。

かくして、例えばハイブリドーマＬＩＢＳａにより生成されたモノクローナル抗 体分子（該抗体分子はここではＬＩＢＳａおよびＬＩＢＳＩとも呼ばれる）はＧ ＰＩ　１ｂ−１１１ａ血小板レセプタのＧＰＩＩＩａサブユニットと免疫反応す ることが分かった。更に、該ＬＩＢＳａ抗体分子はＧＰＩ　１ｂ−１１１ａおよ びＧＰＩｌｂ−１１１ａ特異的リガンドを含むレセプターリガンド錯体上に存在 するＬＩＢＳＩエピトープと免疫反応する。

単離した抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物は、また典型的にはファルマ ーシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、　；　ＮＪビス力タウェイ）から入手 できるプロティンＡ−セファロースを、製造業者の指示に従って使用して、表４ に示したハイブリドーマセルラインの１種を含むマウスの腹水から該抗体分子を 単離することにより調製した。

必要に応じて、単離した抗体分子組成物のタンパク濃度を、パイオーラドプロテ ィンアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｋｉｔ： 　Ｃ＾リッチモンドのバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社）を該製造業者の指示 に従って使用して測定した。

１ｕｌｌ−標識抗体分子を含むモノクローナル抗体組成物を調製するために、ｌ ｌ１１ｇ／ｍｌ　（７）上記の単離された抗体分子を含む、３５０　μｍ　（Ｄ ＰＢＳ（０，１５Ｍ　〕ＮａＣ１，０，ＯＩＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ７，０９ ）を４０ａｇのクロラミン−Ｔおよび１ｍＣ１の担体を含まないＮａ”＠１　（ ル、アーリントンハイツのアマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社）と混合した。

生成する混合物を約２０℃にて５分間保持し、次いで２　ｍｇ／ｍｌのメタ重亜 硫酸ナトリウム溶液（２ｍｇ／ｍ１）２０μｍおよびヨウ化カリウム溶液２０μ ｌと混合した。その後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ　８００μｌを混合し、次いで 更にジイソプロピルフルオロホスフェートを最終濃度が１０ｍＭとなるように混 合した。得られた混合物を２２℃にて６０分間維持し、次いでＰＢＳに対して透 析した。生成した＋１１１−標識抗体分子の特異的活性は１ａｇ当たり約４，５ μＣｉであった。

上記の単離した抗体分子由来のＦａｂフラグメントを含む組成物を、ターン（Ｍ ａｇｅ）等、メソッズインエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ）、　１９Ｂ０．７０．　ｐｐ。

１４２−１５０に記載の方法に従って、パパイン（！ｇ／パパイン＝　２００／ １　（ｗ／ｗ））で、３７℃にて６時間消化することにより調製した。未消化の １ｇおよびＦｃフラグメントをプロティンＡ−セファロース上でのクロマトグラ フィーにより除去した。この得られたＦａｂフラグメント−含有組成物はそのま ま使用するか、あるいは必要に応じて、モノクローナル抗体組成物に関連して上 記したものと同一の方法に従って１章＠ｌ−標識した。

ハイブリドーマ培養上澄中に含まれる抗体分子を、プラスチック上に固定化され たＧＰＩＩｂ−１１１ａとの免疫反応性について調べた。実施例７Ａ（１）で調 製したｌＯμｇ／ｍｌの単離ＧＰＩｌｂ−１１１ａを含む被覆溶液（０，１１Ｊ のＮａＨＣＯｓ、ｐＨ８，０，０，１５ＮａＨｓ）５０μｍを、平底の９６−ウ ェルマイクロタイタープレート（イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）　２：　Ｖ＾シャ ンティリーのダイナチックラボラトリーズ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ））内で混合した。次いで、これらのプレートを３７℃にて６０分間 保持して、該ウェルの壁上に゛　該ＧＰＩ　Ｉｂ−１１１ａを吸着させた。該被 覆溶液を振盪して除去し、該ウェルを２度洗浄バッファー（ｌｏｍＭのトリス、 ｐＨ７，４、ｏ、　０５％（ｖ／ｖ）のツイーン（ＴＷＥＥＮ）−２０，Ｏ，１ ５ｎ＋のＮａＣｌ、および２００　ｍｇ／ｍｌのメルチオレー）　（ＩＩｌｅｒ ｔｈｉｏｌａｔｅ））ですすぎ、また２００μＩの遮断溶液〔被覆溶液中、５％ のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：　ｗ／ｖ））を各ウェル中に添加して、過剰の タンパクサイトを遮断した。

該ウェルを約３７℃にて６０分間維持し、次いで該遮断溶液を除去した。洗浄バ ッファー中に０．１％（冑／Ｖ）のＢＳＡを溶解した溶液からなる希釈バッファ ーでｌ：ｌに希釈した約５０μｍのハイブリドーマ培養上澄を各ウェルに添加し て、免疫反応混合物を形成した。得られた固／液相の免疫反応混合物を室温にて ６０分間維持して、該固相−結合ＧＰＩＩｂ−１１１ａ−リガンド錯体と、添加 した抗体との間の第一の固相−結合免疫反応生成物を形成した。次いで、該固体 および液体相を分離し、該ウェルを２回洗浄バッファーで洗浄し、過剰の液体を 振盪により除去した。

ホースラディツシュペルオキシダーゼで標識した山羊抗−マウスＩｇＧ　（ＣＡ 　ｔ＜　−リンガムのタボ（Ｔａｇｏ）社）を含み、希釈バッファーで１　：　 １０００に希釈した５０μｍの溶液を各ウェルに添加して、第二の固／液相免疫 反応混合物（標識免疫反応混合物）を形成した。これらのウェルを室温にて６０ 分間維持して、該標識抗体と該第−の免疫反応生成物の任意の固相−結合抗体と の間に第二の免疫反応生成物を形成させ、次いで洗浄バッファーで２回洗浄し、 該固相−結合標識−含有免疫反応生成物を単離した。次いで、過剰の液体を該ウ ェルから除去した。

次いで、ＣＰバッファー（１１のＨ２Ｏ当たり２４３ｍ１の０．１Ｍクエン酸お よび２５０ｍ１の０、２Ｍ二二塩性性燐酸ナトリウム含む、ｐ）１５．０）中に ４．０　ｍｇ／ｎｌの０−フェニレンジアミンおよび０．０１２％（Ｖ／りの過 酸化水素を含む、新たに調製した色素源基質溶液５０μｍを各ウェルに添加して 、発色性反応混合物を形成した。この発色性反応混合物を約２０℃にて１０分間 保った後、２Ｎ　Ｈ，５０，５０μｍを各ウェルに添加して、該発色反応を停止 させ、得られた溶液を、モデル（Ｍｏｄｅｌ）　３１０　ｆ！ＬＩＳＡプレート リーダー　（ＶＴ、ライノースキーのバイオーテックインスッルメン’７（Ｂｉ ｏ−Ｔｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社）を使用して、光波長４９０　ｎｍに おける吸光度につき該生成溶液をアッセイした。

４９０　ｎｍ（Ａ４９のにて測定した吸光度がバックグラウンドの少な（とも６ 倍、即ちＡ４９０で測定した場合に約０．３光学密度単位以上である場合に、抗 体分子組成物は抗−ＧＰＩ　１ｂ−１１１ａ免疫反応性抗体分子を含むものと考 えられた。

（２）抗−ＬＩＢＳＲＡ　Ｅ　Ｌを検出するための競合ＥＬＩＳＡ抗体組成物中 に含まれる抗体分子を、ＥＬＩＳＡ法におけるそのＧＰＩｌｂ−１１１ａ　ＬＩ ＢＳとの免疫反応性につき調べた。該ＥＬＩＳＡ法は、以下に述べる例外を除き 実施例７ｃ（１）に記載のＥＬＩＳＡと同様に実施した。

抗体組成物をＧＰＩ　Ｉｂ−１１１ａ被覆マイクロタイターウエルに添加する前 に、ｌｏｍＭのｐＨ７，４のトリス−１（ＣＬ　０．１５　ＭのＮａＣ１，０， ０５％（ｖ／ｖ）のツイーン（ＴＷＥＥＮ）−２０，０，０２％（ｗ／ｖ）のす ｌ・リウムメルチオレート、５ｍＶのＣａＣ１ｍ　、５　ｍｌＪのＭｇＣ１ｍお よび０．１％（Ｗ／Ｖ）のＢＳＡからなるＢＬＩＳＡアッセイ用バッファー２０ μｌを各マイクロタイターウェルに添加した。次いで、１ｍｌ当たり２Ｘ１０’ 個の血小板なる密度で血小板溶解物を含む溶液１０μｍ　（実施例７Ａ（４）に 記載のように調製した）を１組のウェルに添加し、かつ第二の組のウェルには血 小板溶解物の添加を省略した。血小板溶解物を含むまたは含まないこれら２つの 組に、ＥＬＩＳＡアッセイ用バッファーにＲＧＤ−含有ポリペプチドリガンドＧ ＲＧＤＳＰを０または５ｄ溶解した第二の溶液ｌＯμｌを添加した。その後、０ ．３μ１１０１の抗体組成物溶液１０ｕｌを、該ＥＬＩＳＡ免疫反応混合物中で 限界成分（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）となるように、ＥＬＩＳＡ アッセイ用バッファーで希釈された抗体濃縮物としてこれら２つの組のウェルに 添加した。抗体濃縮物は、ＥＬＩＳＡアッセイ用バッファーで希釈された場合に 限界成分として存在して、希釈バッファーの代わりに［！ＬＩＳＡアッセイ用バ ッファーを使用したこと以外は実施例７Ｃ（１）に記載のＥＬＩＳＡアッセイ法 を利用して測定した場合に、Ａ４９０における光学密度的１．０を与える。

各免疫反応混合物中で得られた結果は、前と同様に、発色反応の存在について測 定された。血小板溶解物を含まないウェルについて測定した吸光度をＢ、とじ、 血小板溶解物を含むウェルについて測定した吸光度をＢとする。吸光度の比をＢ ／Ｂ、につき計算し、ＲＧＤ−含有リガント（ＧＲＧＤＳＰ）の存在下（＋）ま たは不在下（−）の何れかの条件下で測定したものとして表す。ＬＩＢＳ潜在性 抗原決定基の発現は、リガンドが該免疫反応混合物中の血小板溶解物のＧＰＩ　 １ｂ−１１１ａに付加された場合の、Ｂ／Ｂ、に見られる％減少を算出すること により決定される。リガンドの添加の際に見られる、２０％を越えるＢ／Ｂ、に おける減少は、該抗体がＬＩＢＳエピトープと免疫反応する抗体分子であること を示す。表４は、ＧＰＩＩｂ−１１１ａと免疫反応する、実施例７Ｂで調製され たモノクローナル抗体分子に関する競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。

フィブリノーゲンを単離し、マーゲリー（Ｍａｒｇｕｅｒｉｅ）等、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、、　１９８０、２５５．　ｐＩ）、　＋５４−１６１に記 載の標準的方法に従って…■で標識して、…ｌ−Ｆｇを形成した。その後、血小 板と…Ｉ−Ｆｇとの結合を上記の如くアッセイした。マーゲリー（Ｍａｒｇｕｅ ｒｉｅ）等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｓ、、　１９８０．２５５．１１１ １．１５４−１６１を参照のこと。

ＩＯμｍｏｌｅのアデノシンニ燐酸（ＡＤＰ）の存在下または不在下で、１０＠ 個の静止血小板を０．００１−１ｎの範囲内の変動する濃度の放射性標識したフ ィブリノーゲンに添加し、３７℃にて３０分間インキュベートすることにより、 結合を開始させた。結合したフィブリノーゲンを２０％スクロース０．３ｍｌに より該血小板−フィブリノーゲン混合物を遠心分離処理することにより遊離フィ ブリノーゲンから分離し、細胞ペレットと結合した放射性標識フィブリノーゲン の量をγ−線検出により測定した。

該血小板に１０８ＭのＡＤＰを添加することにより、該血小板と結合する１１８ １　ｐｇの数が少なくとも３倍に増大することが観測された。刺激されなかった 血小板は…Ｉ−Ｆｇへの結合におけるバックグラウンドを越える増加を何等示さ なかった。

従って、血小板がＡＤＰにより刺激されなかった場合に観測された結合量よりも 少なくとも３倍結合フィブリノーゲンの量が大きい場合に、血小板の活性化が検 出される。

本発明を、明確化および理解を容易にするために、例示および実施例により幾分 詳細に記載してきたが、添付請求の範囲内で幾つかの変更をなすことが可能であ ることは明らかであろう。

Ｌ１８５−７ 凝集 ＣＡＭ　正常 ＦＩＧ、　２ １１ＰＤ　正常 蛍光強度 ＦＩＧ、　３ 国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．活性化、リガンド結合、または後−占有欠陥として血小板凝集欠陥をもつ患 者の該欠陥を特徴付けする方法であって、（ａ）該患者からの第一の血小板−含 有試料中の活性化能をもつ血小板の存在を決定し、 （ｂ）該患者からの第二の血小板−含有試料中のリガンドー占有能をもつ血小板 の存在を決定し、 （ｃ）該工程（ａ）および（ｂ）の結果を予め測定した血小板凝集欠陥を特徴付 けするための基準と関連ずけし、かくして（ｉ）該予め測定した基準を使用して 、活性化能をもつ血小板の存在が所定の活性化レベル未満である場合に、活性化 欠陥があるものと決定し、（ｉｉ）該予め測定した基準を使用して、リガンドー 占有能をもつ血小板の存在が所定のリガンドー占有レベル未満である場合に、リ ガンド結合欠陥があるものと決定し、また（ｉｉｉ）活性化能をもつ血小板の存 在が該所定の活性化レベルを越え、かつリガンドー占有能をもつ血小板の存在が 該所定のリガンドー占有レベルを越える場合に、後−占有欠陥があるものと決定 する工程を含むことを特徴とする上記方法。
2. ２．上記工程（ａ）および（ｂ）において、活性化能およびリガンドー占有能を もつ血小板の存在を決定するために蛍光活性化流動血球計数法を使用する請求の 範囲第１項に記載の方法。
3. ３．上記工程（ａ）が以下の諸工程： （ｉ）該第一の試料を、正常な血小板を活性化するのに十分な所定量の血小板ア ゴニストおよび選択的に活性化された血小板と結合する活性化特異的リガンド（ ＡＳＬ）と混合して、反応混合物を形成する工程、（ｉｉ）該反応混合物を、活 性化された正常な血小板が核ＡＳＬとの反応生成物を形成するのに十分な時間、 所定の生物学的なアッセイ条件下に維持する工程、および （ｉｉｉ）該工程（ｉｉ）で形成された反応生成物の量を測定し、これにより該 試料中における活性化能をもつ血小板の存在を決定する工程、を含む請求の範囲 第１項に記載の方法。
4. ４．該活性化特異的リガンドがモノクローナル抗体である請求の範囲第３項に記 載の方法。
5. ５．該活性化特異的リガンドがフィブリノーゲンである請求の範囲第３項に記載 の方法。
6. ６．該工程（ｂ）が以下の諸工程： （ｉ）該第二の試料を、正常な血小板上にリガンドー誘起性結合サイト（ＬＩＢ Ｓ）を形成する所定量の活性化独立リガンド（ＡＩＬ）および該ＬＩＢＳと選択 的に結合する抗一ＬＩＢＳ抗体と混合して免疫反応混合物を形成する工程、（ｉ ｉ）該免疫反応混合物を、該抗−ＬＩＢＳ抗体が該ＬＩＢＳと免疫反応して免疫 反応生成物を形成するのに十分な時間、所定の生物学的アッセイ条件下に維持す る工程、および （ｉｉｉ）該工程（ｉｉ）で形成された免疫反応生成物の量を画定し、それによ って該試料中におけるリガンドー占有能をもつ血小板の存在を決定する工程、を 含む請求の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．該抗−ＬＩＢＳ抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第６項記載の方 法。
8. ８．該モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４７６のハイブリドーマ ＰＭＩ−Ｉにより産生される抗体である請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．該活性化独立リガンドがＲＧＤ、ＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ、ＫＹＧＲＧＤＳ、 ＧＲＧＤＳＰおよびＫＱＡＧＤＶからなる群から選ばれる請求の範囲第６項に記 載の方法。
10. １０．該工程（ｂ）が以下の諸工程： （ｉ）該第二の試料を、正常な血小板を活性化するのに十分な所定量の血小板ア ゴニストおよび選択的に活性化された血小板と結合して、リガンドー誘起性結合 サイト（ＬＩＢＳ）を形成する活性化特異的リガンド（ＡＳＬ）、および該ＬＩ ＢＳと選択的に結合する抗−ＬＩＢＳ抗体と混合して免疫反応混合物を形成する 工程、（ｉｉ）該反応混合物を、該抗−ＬＩＢＳ抗体が該ＬＩＢＳと免疫反応し て免疫反応生成物を形成するのに十分な時間、所定の生物学的アッセイ条件下に 維持する工程、および （ｉｉｉ）該工程（ｉｉ）で形成された免疫反応生成物の量を測定し、それによ って該試料中におけるリガンドー占有能をもつ血小板の存在を決定する工程、を 含む請求の範囲第１項に記載の方法。
11. １１．該活性化特異的リガンドがフィブリノーゲンである請求の範囲第１０項に 記載の方法。
12. １２．該抗−ＬＩＢＳ抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１０項記載 の方法。
13. １３．該モノクローナル抗体がＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４７６のハイプリドーマ ＰＭＩ−１により産生される抗体である請求の範囲第１０項に記載の方法。
14. １４．別々の容器内に、 （ａ）活性化された血小板と結合する活性化特異的リガンド（ＡＳＬ）、（ｂ） 正常な血小板上にリガンドー誘起性結合サイト（ＬＩＢＳ）を形成する活性化独 立リガンド（ＡＩＬ）、および （ｃ）抗−ＬＩＢＳ抗体 を含有する包封体を含むキット型の診断系。
15. １５．該活性化特異的リガンドがフィブリノーゲンである請求の範囲第１４項に 記載の診断系。
16. １６．該活性化独立リガンドが、ＲＧＤ、ＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ、ＫＹＧＲＧＤ Ｓ、ＧＲＧＤＳＰおよびＫＱＡＧＤＶからなる群から選ばれるアミノ酸配列を含 む、約４０個未満のアミノ酸残基のペプチド配列を含有する請求の範囲第１４項 に記載の診断系。
17. １７．該抗−ＬＩＢＳ抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１４項に記 載の診断系。
18. １８．該モノクローナル抗体がＡＴＣＣ承認番号ＨＢ９４７６のハイブリドーマ ＰＭＩ−１により産生される抗体である請求の範囲第１７項に記載の診断系。
19. １９．更に、血小板アゴニストを含有する容器をも含む請求の範囲第１４項に記 載の診断系。