JPS62250362A - 抗トリプシンモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １）産業上の利用分野 Ｉ・リブシンは、種々の動物の膵臓に主として存在する
酵素である。トリプシンは膵炎の発病機序に関係が深い
酵素と考えられ、現在、臨床診断に応用されているアミ
ラーゼやリパーゼに比較して膵特異性が高いと言われて
いる。本発明は抗トリプシンモノクローナル抗体および
その製造法に関するものである。

２）従来の技術 トリプシンの測定法としてはベンゾイル−し−アルギニ
ンアミドまたはベンゾイルエチルエーテルを基質とする
方法が報告されている。これらの方法は血中トリプシン
活性を測定するものであるが、トリプシンは血中で、α
、−アンチトリプシンやαニーマクログロブリン等の酵
素活性阻害物質と結合して、正確な測定ができない等の
欠点があった。

また、上記欠点を改良するため、トリプシン濃度を活性
ではなくタンパク量として測定しようとする試みより免
疫学的測定法（イムノアッセイ）が開発された。これら
のイムノアッセイにおいて使用する抗体は従来の方法、
即ちウサギ等の動物に抗原で免疫して、血清より分離し
て得るものであるため、抗体を作製する度に大量の抗原
が必要となり、得られる抗体量も少なく、抗体自体も均
質なものではなく免疫する動物の個体差によるバラツキ
が生ずるという欠点を有している。

３）発明が解決しようとする問題点 イムノアッセイにおいて安価で大量に、かつ均一の抗体
を用いろことが有利となるため、このような特性を有す
る抗体の人手が要望されてきた。

そして、ケーラー（に６ｈｌｅｒ）とミルシュタイン（
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）は１９７５年に、抗原で感作したマ
ウスのｐｌ、ｗｉ胞のリンパ球と骨髄腫細胞（ミエロー
マ細胞）とを融合させることによって得られる融合細胞
（ハイブリドーマ）を用いて、単一、均質な抗体（モノ
クローナル抗体）を製造しうろことを示した。

この報告以来、種々のハイブリドーマおよびモノクロー
ナル抗体について報告されてきたが、抗トリプシンモノ
クローナル抗体についての報告はない。

４）問題を解決するための手段 そこで本発明者らはトリプシンを簡便に感度よく迅速に
測定することができるイムノアッセイに適用しろる抗体
を提供することを目的として、鋭意に検討した結果、抗
トリプシン抗体産生リンパ球とミエローマ細胞とを融合
させて得たハイブリドーマが、大量の抗トリプシンモノ
クローナル抗体を産生ずることおよびその抗体が前記の
目的を達成できることを見い出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は！・リブシンと抗原抗体反応特異性を有
する抗トリプシンモノクローナル抗体および抗トリプシ
ンモノクローナル抗体埋土ハイブリドーマを培養し、培
養物から抗トリプシンモノクローナル抗体を採取するこ
とを特徴とする抗トリプシンモノクローナル抗体の！！
遣方法に間するものである。

本発明に月いられるハイブリドーマを得るには、まず哺
乳動物、好ましくはマウスまたはラットにトリプシンを
感作する。使用する抗原はヒト膵）α等より精製したも
のを用いる。従来の方法に準じて免疫した動物より、リ
ンパ球を採取する。

一方、骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）としては被免疫動
物と同じ種由来のものを使用することが好ましく、かつ
未融合のミエローマ細胞がハイブリドーマ選択培地で生
育しないものが好ましい。一般的には８−アザグアニン
抵抗性のものが用いられる。このような理由より市販の
マウスミエローマ細胞（Ｘｌ３３−Ａｇ８−６・５争３
．Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ｔＪＩ　）　、ラットミエロ
ーマ細胞（２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・２・３）等を使
用するのが好ましい。

次にＭＥＭ、　ＲＰＭ＋　１６４０等の培地に上記リン
パ球およびミエローマ細胞を懸濁し混合した後、融合促
進剤を用いて融合する。融合促進剤としては種々の高分
子物質やウィルス等を用いることができるが、好ましく
はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いればよい。

ＰＥＧは平均分子量４００〜２０　、０００のものが使
用できるが、好ましくは１　、０００〜７　、５００の
ものを用いるのがよく、使用濃度は４０〜６０ｖｏ１．
％が好ましい。

融合細胞は洗浄して融合促進剤を除去した後、１０〜２
０ｖｏ１．％の血清を含むＭＥＭ、またはＲＰ旧１６４
０培地に懸濁して、９６穴培養皿等に０．５〜１．５　
ｘ　１０　　個／穴の割合で分注し、各穴に選択培地の
一種であるヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン
（ＩＩＡＴ）培地を加え培養させるとハイブリドーマの
み生育する。目的の抗体を産生じているハイブリドーマ
の検索は培養上清中の抗体価をイムノアッセイで行うこ
とができる。この方法で選択された穴には２（重置上の
ハイブリドーマのクローンが存在する可能性があるので
、クローニングにより単クローン（モノクローン）にす
る。クローニング方法としては、例えば限界希釈法で行
うことができる。即ち、各大当たり　０．５〜５個にな
るように希釈して９６穴培養皿に分注して培養後、コロ
ニーが出現したら大当たり１個のコロニーのみしか存在
しない穴のハイブリドーマを選び、上記と同様の操作を
繰り返しモノクローンを得ることができる。以上の方法
により抗トリプシンモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマを作製することができる。

本発明の抗トリプシンモノクローナル抗体は上記で得た
ハイブリドーマを培養して大量に得ることができる。培
養法としては培地を用いて培養容器で培養してその上清
液から抗体を採取する方法、またはハイブリドーマを１
０〜１０７個、同系の動物の腹腔内に投与し、ハイブリ
ドーマが増殖した時に血清および腹水を採取する方法が
ある。

このようにして得られた抗体は必要に応じて精製して使
用することができる。即ち、硫安分画、イオン交換、ア
フィニティクロマトグラフィ等の手段で精製することが
できる。

次に、本発明を実施例により具体的に説明する。

５）実施例と参考例 参考例Ｉ ＪｏｈｎｓｏｎとＴｒａｖｉｓ　（Ａｎａｌｙ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、７２，５７３（１９７Ｇ））　　、　Ｔｒ
ａｖｉｓとＲｏｂｅｒｔｓ　　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ。

迂、２８８４（１９６９））らの方法に従って、ヒト膵
）夜より２０〜８０％硫安分画部をＳＰ−セファデック
スＣ−５０カラム（ｐＨ４，７）にかけ、その両分をト
ラジロール・セファロース４Ｂカラム（ｐＨ８，０）に
吸着させ、カルシウム含有クエン酸溶液で溶出させ、そ
の両分をセファデックスＧ−７５カラム（ｐＨ２，０）
にかけ、溶出画分を希釈塩酸で透析して精製し抗原のト
リプシンを得た。

参考例２ ６週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスに参考例１て得た１００縄
のトリプシンをフロイントコンプリードアシュバンドと
１＝１に混和乳化し、腹腔に投与し、２週間毎に同様に
投与した。２ケ月後トリプシン１１００ｕを静注して追
加免疫し、静注３日後にＷＩ＃臓を取り出し、ＨＡＮＫ
Ｓ培地にほぐして洗浄し、血清無添加ＲＰＭ＋　１６４
０培地に懸濁した。

他方、マウスのミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８−６・
５・３）を培養し対数増殖期にある細胞を集め、血清無
添加ＲＰＭＩ　１６４０培地に懸濁した。ミエローマ細
胞１０’個と牌細胞１０’個を混和し、遠心分離により
細胞を集めた後、５０ｖｏ１．％のＰＥ　Ｇ　４０００
を１ｍｌ徐々に加え、攪拌後、血清無添加ＲＰＭ＋　１
６４０培地を徐々に加えテＰ　Ｅ　Ｇ　４０００を希釈
した。遠心分離によりＰＥＧ溶液を除き、ＨＡＴ培地１
０ｍ１を加えて９６穴培養皿に各穴０．１　ｍｌずつ分
注した。４日後に、ＨＡＴ培地を０．１　ｍｌずつ添加
し、３日毎に半量外の培養液を捨て、新しいＨＡ　Ｔ培
地を加えた。１４日後には９６大中９６穴でハイブリド
ーマの生育が認められたので、その抗体産生能をＥＬＩ
ＳＡ法で検出した。即ち、抗原のトリプシンを９６穴マ
イクロタイタープレートに吸着させ培養上清を添加した
後、アルカリ性ホスファターゼを標識した第二抗体を加
えて検出することにより、２９個発色するものが認めら
れ、そのうち、特に発色度の高い３株を選択し２４穴培
養皿ヘハイブリドーマを移行した。この時４遅動ＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスより調製した胸腺細胞１０７個を添加した
ＨＴ培地（ＨＡＴ培地よりアミツブゾリンを抜いたもの
）１１を同時に添加した。３日後にＨＴ培地を１ｍｌず
つ添加し５日後に上述の方法において抗体産生能を確認
後、９６穴培養皿に０．５〜５個／大の割合で細胞を希
釈して培養する限界希釈法によりクローニングを行い、
ハイブリドーマＭＴ−１を得た。

実施例１ 参考例２で得たハイブリドーマＭＴ−１を１５ｖｏ１．
％の牛胎児血清を含有するＲＰＭ＋　１６４０培地で培
養し、細胞濃度１０’個／ｍｌとなった上清液を採取し
て抗トリプシンモノクローナル抗体を得た。

次にハイブリドーマＭＴ−１，１ｘｌＯ個を２．６．　
ｔｏ、　１４−テトラメチルペンタデカン０．５１を投
与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与し、１４日後に
血清０．７　ｉｆ／匹および腹水５　ｍｌ／匹を採取し
、抗トリプシンモノクローナル抗体を得た。

上記二つの抗体はヒトトリプシンと反応し、かつＥＩＡ
（酵素免疫測定法）に適応可能であった。

参考例３ 参考例１て得たトリプシンを用いて、参考例２と同様に
別のＢＡＬＢ／Ｃマウスで免疫、融合しクローニングし
てハイブリドーマＭＴ−２，ＭＴ−３を得た。

実施例２ 参考例３で得たハイブリドーマ２種を実施例１と全く同
様に培養し、その上清液より抗トリプシンモノクローナ
ル抗体２種を得た。　これらの抗体はいずれもヒトトリ
プシンと反応し、かつＥＩＡに適応可能であった。

６）発明の効果 実施例、参考例の項より明らがな如く、本発明より得た
ハイブリトーマを培養して大同に得た抗トリプシンモノ
クローナル抗体はヒトトリプシンと反応し、かっＥＩＡ
に適応可能であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）トリプシンおよびトリプシノーゲンと抗原抗体反
   応特異性を有するモノクローナル抗体（以下抗トリプシ
   ンモノクローナル抗体という。）（２）抗トリプシンモ
   ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養し、
   培養物から抗トリプシンモノクローナル抗体を採取する
   ことを特徴とする抗トリプシンモノクローナル抗体の製
   造方法。