JPH0764879B2 - フアクタ−ｖ▲ｉｉｉ▼ｃに対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
フアクタ−ｖ▲ｉｉｉ▼ｃに対するモノクロ−ナル抗体Info
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- JPH0764879B2 JPH0764879B2 JP60002270A JP227085A JPH0764879B2 JP H0764879 B2 JPH0764879 B2 JP H0764879B2 JP 60002270 A JP60002270 A JP 60002270A JP 227085 A JP227085 A JP 227085A JP H0764879 B2 JPH0764879 B2 JP H0764879B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） ファクターVIIICは、血液凝固の本質的経路に関与する
血漿蛋白質である。このファクターは、遺伝的なＸ染色
体−連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を有する個体
において欠損し又は不足している。ファクターVIIICは
血漿中の濃度が非常に低く、そして一層大形の蛋白質の
分解中間体又は最終生成物であると考えられるため、こ
れを分離する場合非常に大きな困難に遭遇する。ファク
ターVIIICを分離しようとする場合、種々の分子量を有
する多様なポリペプチドの有意に不均一な複雑な混合物
が得られる。
血漿蛋白質である。このファクターは、遺伝的なＸ染色
体−連鎖劣性出血性疾患であるＡ型血友病を有する個体
において欠損し又は不足している。ファクターVIIICは
血漿中の濃度が非常に低く、そして一層大形の蛋白質の
分解中間体又は最終生成物であると考えられるため、こ
れを分離する場合非常に大きな困難に遭遇する。ファク
ターVIIICを分離しようとする場合、種々の分子量を有
する多様なポリペプチドの有意に不均一な複雑な混合物
が得られる。
従って、ファクターVIIIC由来の個々のポリペプチド又
はポリペプチド群と選択的に反応することができるモノ
クローナル抗体を製造することに大きな関心が持たれて
いる。
はポリペプチド群と選択的に反応することができるモノ
クローナル抗体を製造することに大きな関心が持たれて
いる。
（従来の技術） 米国特許第4,361,509号及びこの特許に引用されている
文献にはファクターVIIICの精製について記載されてい
る。さらに、Fulcher及びZimmerman、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA（1982）79:1648-1652を参照のこと。
文献にはファクターVIIICの精製について記載されてい
る。さらに、Fulcher及びZimmerman、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA（1982）79:1648-1652を参照のこと。
Tuddenham等、J.of Lab.Clinical Medicine（1979）93:
40-53にはポリクローナル抗体を用いるファクターVIIIC
の精製について記載されている。Austen.British J.Hem
atology（1979）43:669-674にはファクターVIIICの精製
のためのアミノヘキシル−セファロースの使用について
記載されている。Weinstein等、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A（1981）78:5137-5141にはファクターVIIICに対するス
ロンビンの効果が検討されている。さらにKuo等、Abstr
acts for IX International Congress of Thrombosis a
nd Hemostasis（ストックホルム、1983年７月）を参照
のこと。
40-53にはポリクローナル抗体を用いるファクターVIIIC
の精製について記載されている。Austen.British J.Hem
atology（1979）43:669-674にはファクターVIIICの精製
のためのアミノヘキシル−セファロースの使用について
記載されている。Weinstein等、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A（1981）78:5137-5141にはファクターVIIICに対するス
ロンビンの効果が検討されている。さらにKuo等、Abstr
acts for IX International Congress of Thrombosis a
nd Hemostasis（ストックホルム、1983年７月）を参照
のこと。
ハイブリテックデータシート（ハイブリテック社、1108
5トレヤナロード，サンジェゴ，カリホルニア92121）に
はヒト−ファクターVIIICに特異的なモノクローナル抗
体（カタログ＃0432）が記載されている。米国特許出願
第481,103号及び第556,508号に対応するデンマーク特許
出願第53519号にはヒト−ファクターVIIIC及びそのポリ
ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の製造につい
て記載されている。このデンマーク特許出願に記載され
ているモノクローナル抗体の幾つかはさらにZimmerman
等（1983）Blood61:807にも記載されている。Fass等（1
982）は、ヒト−ファクターVIIICをモノクローナル抗体
からエチレングリコール（50％）を用いて溶出すること
ができる旨記載している。
5トレヤナロード，サンジェゴ，カリホルニア92121）に
はヒト−ファクターVIIICに特異的なモノクローナル抗
体（カタログ＃0432）が記載されている。米国特許出願
第481,103号及び第556,508号に対応するデンマーク特許
出願第53519号にはヒト−ファクターVIIIC及びそのポリ
ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の製造につい
て記載されている。このデンマーク特許出願に記載され
ているモノクローナル抗体の幾つかはさらにZimmerman
等（1983）Blood61:807にも記載されている。Fass等（1
982）は、ヒト−ファクターVIIICをモノクローナル抗体
からエチレングリコール（50％）を用いて溶出すること
ができる旨記載している。
（発明の概要） ヒト−ファクターVIIICと反応性のモノクローナル抗体
を産生する特定のハイブリドーマセルラインが提供され
る。セルライン42,47及び56によって産生されるモノク
ローナル抗体は変性条件下でのファクターVIIIC物質の
電気泳動により得られる80/77kdダブレットと反応性で
ある。セルライン1B9,2B6及び2F6により産生されるモノ
クローナル抗体は80/77kdダブレット及び240kd断片と反
応する。セルライン4E5及び5B1により産生されるモノク
ローナル抗体は240kd断片、92.5kd断片及びその前駆
体、並びにファクターVIIIC物質の40kdスロンビン消化
生成物と反応する。上記の抗体の内セルライン56により
産生された抗体のみが凝固阻害を示す。
を産生する特定のハイブリドーマセルラインが提供され
る。セルライン42,47及び56によって産生されるモノク
ローナル抗体は変性条件下でのファクターVIIIC物質の
電気泳動により得られる80/77kdダブレットと反応性で
ある。セルライン1B9,2B6及び2F6により産生されるモノ
クローナル抗体は80/77kdダブレット及び240kd断片と反
応する。セルライン4E5及び5B1により産生されるモノク
ローナル抗体は240kd断片、92.5kd断片及びその前駆
体、並びにファクターVIIIC物質の40kdスロンビン消化
生成物と反応する。上記の抗体の内セルライン56により
産生された抗体のみが凝固阻害を示す。
（具体的な説明） ヒト−ファクターVIIICの種々のポリペプチド断片と反
応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが
提供される。クラスＩハイブリドーマはファクターVIII
Cの80/77kdダブレットと反応するモノクローナル抗体又
は240kd断片及び80/77kdダブレットの両者と反応するモ
ノクローナル抗体を産生する。クラスIIIハイブリドー
マは240kd断片、並びに92.5kd断片及びその前駆体と反
応するモノクローナル抗体を産生する。クラスIII抗体
はファクターVIIIC物質の40kdスロンビン消化生成物と
の追加の反応性を示す。
応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが
提供される。クラスＩハイブリドーマはファクターVIII
Cの80/77kdダブレットと反応するモノクローナル抗体又
は240kd断片及び80/77kdダブレットの両者と反応するモ
ノクローナル抗体を産生する。クラスIIIハイブリドー
マは240kd断片、並びに92.5kd断片及びその前駆体と反
応するモノクローナル抗体を産生する。クラスIII抗体
はファクターVIIIC物質の40kdスロンビン消化生成物と
の追加の反応性を示す。
ヒト−ファクターVIIICは、約460kdの見かけ分子量を示
しそして実質上純粋な形で単離され得る複合蛋白質であ
る。変性条件下での電気泳動に際し、種々の分子量、す
なわち240,160,140,115,92.5,80及び77kdの多数の断片
が生じ、後２者はダブレットとして移動する。免疫的関
係を調べるためにこの発明のモノクローナル抗体を用い
そして構造的関係を調べるために切断パターンを用いな
がら、化学的切断及びスロンビン切断を含むプロテアー
ゼ切断により断片を分析することにより、92.5kdポリペ
プチドが240,160,140及び115ポリペプチドと関連してお
り、他方77/80ダブレットは240kdポリペプチドとのみ共
通の抗原特性を有するらしいことが示される。さらに、
77/80kdダブレットはスロンビンにより67/70kdダブレッ
トに転換され、他方スロンビンで処理された精製ファク
ターVIIIC中に存在する92.5kdポリペプチドはスロンビ
ンにより直接的又は間接的に約40及び52.5kdの２個のポ
リペプチドに切断される。
しそして実質上純粋な形で単離され得る複合蛋白質であ
る。変性条件下での電気泳動に際し、種々の分子量、す
なわち240,160,140,115,92.5,80及び77kdの多数の断片
が生じ、後２者はダブレットとして移動する。免疫的関
係を調べるためにこの発明のモノクローナル抗体を用い
そして構造的関係を調べるために切断パターンを用いな
がら、化学的切断及びスロンビン切断を含むプロテアー
ゼ切断により断片を分析することにより、92.5kdポリペ
プチドが240,160,140及び115ポリペプチドと関連してお
り、他方77/80ダブレットは240kdポリペプチドとのみ共
通の抗原特性を有するらしいことが示される。さらに、
77/80kdダブレットはスロンビンにより67/70kdダブレッ
トに転換され、他方スロンビンで処理された精製ファク
ターVIIIC中に存在する92.5kdポリペプチドはスロンビ
ンにより直接的又は間接的に約40及び52.5kdの２個のポ
リペプチドに切断される。
この発明のモノクローナル抗体は種々の目的のために有
用である。例えば、これらの抗体は血漿から全ファクタ
ーVIIIC複合体を単離するため、及び精製された分離源
からファクターVIIICの種々のポリペプチド断片を単離
するために使用することができる。さらに、これらの抗
体は、種々のイムノアッセイ法により血漿中のファクタ
ーVIIIC及び関連ポリペプチドの存在を検出するために
使用することができる。適切なイムノアッセイ法はよく
知られており、そして科学文献及び特許文献に詳細に記
載されている。
用である。例えば、これらの抗体は血漿から全ファクタ
ーVIIIC複合体を単離するため、及び精製された分離源
からファクターVIIICの種々のポリペプチド断片を単離
するために使用することができる。さらに、これらの抗
体は、種々のイムノアッセイ法により血漿中のファクタ
ーVIIIC及び関連ポリペプチドの存在を検出するために
使用することができる。適切なイムノアッセイ法はよく
知られており、そして科学文献及び特許文献に詳細に記
載されている。
この発明のモノクローナル抗体はさらに、実質上同一の
反応性を有するがアイソタイプ、結合親和性等のごとき
他の特性においてしばしば異るモノクローナル抗体を産
生する追加のハイブリドーマの調製を促進するためにも
使用することができる。このことは、もとのファクター
VIIIC中で抗体により認識される決定部位を担持するこ
れらのポリペプチドを濃縮するためにモノクローナル抗
体を使用することにより達成される。便利には、所望の
抗体を用いてアフィニティーカラムを調製することがで
きる。次に、ファクターVIIICを適当な緩衝液中でカラ
ムに適用することにより抗体によって認識されるポリペ
プチドが結合されよう。カラムを洗浄して非特異的に結
合した蛋白質を確実に除去した後、pHを調製し、尿素を
用い、又は他の穏和な変性条件を用いることによりカラ
ムから注目のポリペプチドを放出することができる。次
に抗体を単離し、そしてこれを用いて適当な宿主を高度
免疫し、そしてKohler及びMilstein（1975）、Nature 2
56:495、又はこの方法の最近の改良法によりハイブリド
ーマを調製することができる。適当な免疫化方法、不滅
化（immortalization）方法、及びクリーニング方法は
後で詳細に記載する。このような方法により、実質上同
一の反応性を有するがクラス、結合定数、宿主等におい
て異る種々の抗体を得ることができる。
反応性を有するがアイソタイプ、結合親和性等のごとき
他の特性においてしばしば異るモノクローナル抗体を産
生する追加のハイブリドーマの調製を促進するためにも
使用することができる。このことは、もとのファクター
VIIIC中で抗体により認識される決定部位を担持するこ
れらのポリペプチドを濃縮するためにモノクローナル抗
体を使用することにより達成される。便利には、所望の
抗体を用いてアフィニティーカラムを調製することがで
きる。次に、ファクターVIIICを適当な緩衝液中でカラ
ムに適用することにより抗体によって認識されるポリペ
プチドが結合されよう。カラムを洗浄して非特異的に結
合した蛋白質を確実に除去した後、pHを調製し、尿素を
用い、又は他の穏和な変性条件を用いることによりカラ
ムから注目のポリペプチドを放出することができる。次
に抗体を単離し、そしてこれを用いて適当な宿主を高度
免疫し、そしてKohler及びMilstein（1975）、Nature 2
56:495、又はこの方法の最近の改良法によりハイブリド
ーマを調製することができる。適当な免疫化方法、不滅
化（immortalization）方法、及びクリーニング方法は
後で詳細に記載する。このような方法により、実質上同
一の反応性を有するがクラス、結合定数、宿主等におい
て異る種々の抗体を得ることができる。
一般に、ハイブリドーマの調製においてはまず注目のフ
ァクターVIIIポリペプチドを用いてマウス又は他の小哺
乳動物を高度免疫する。免疫化のための特定の方法はよ
く知られており、そして文献に詳細に記載されている。
ファクターVIIIポリペプチドをアジュバントと共に又は
アジュバントを用いないで哺乳動物に注射し、次に比較
的短期間にわたって２〜６回の追加の（ブースター）注
射を続ける。次に、通常は最終注射から数日後に動物を
殺し、脾臓を摘出し、そして脾臓細胞を不滅化する。
ァクターVIIIポリペプチドを用いてマウス又は他の小哺
乳動物を高度免疫する。免疫化のための特定の方法はよ
く知られており、そして文献に詳細に記載されている。
ファクターVIIIポリペプチドをアジュバントと共に又は
アジュバントを用いないで哺乳動物に注射し、次に比較
的短期間にわたって２〜６回の追加の（ブースター）注
射を続ける。次に、通常は最終注射から数日後に動物を
殺し、脾臓を摘出し、そして脾臓細胞を不滅化する。
不滅化の方法は臨界的ではない。現在最も一般的な方法
は融合のパートナーである骨髄腫細胞との融合であり、
この明細書においてはこの方法を例示する。他の方法と
しては、EBV形質転換、裸の（bare）DNA、例えば腫瘍遺
伝子、レトロウイルス等による形質転換、又はセルライ
ンの安定な維持とモノクローナル抗体の産生をもたらす
他の任意の方法を挙げることができる。
は融合のパートナーである骨髄腫細胞との融合であり、
この明細書においてはこの方法を例示する。他の方法と
しては、EBV形質転換、裸の（bare）DNA、例えば腫瘍遺
伝子、レトロウイルス等による形質転換、又はセルライ
ンの安定な維持とモノクローナル抗体の産生をもたらす
他の任意の方法を挙げることができる。
融合のパートナーとの融合を用いる場合、融合方法は臨
界的ではなく種々の方法を用いることができる。便利に
は、脾細胞及び骨髄腫細胞をポリエチレングリコール、
適当な増殖培地及び他の添加物の存在下で数分間一緒に
する。融合の終点において、細胞を洗浄することにより
非イオン性洗剤を除去する。
界的ではなく種々の方法を用いることができる。便利に
は、脾細胞及び骨髄腫細胞をポリエチレングリコール、
適当な増殖培地及び他の添加物の存在下で数分間一緒に
する。融合の終点において、細胞を洗浄することにより
非イオン性洗剤を除去する。
次に、融合処理した細胞を迅速に小培養ウエル中に、通
常はミクロタイタープレート中に、比較的低密度で分配
してスクリーニングする。培養ウエル中の増殖培地は、
骨髄腫細胞にとっては致死的であるが雑種細胞の増殖を
支持するように選択する。便利には、特定の薬剤に対し
て感受性であるように骨髄腫細胞を変異せしめておく。
典型的にはHAT感受性にしておく。
常はミクロタイタープレート中に、比較的低密度で分配
してスクリーニングする。培養ウエル中の増殖培地は、
骨髄腫細胞にとっては致死的であるが雑種細胞の増殖を
支持するように選択する。便利には、特定の薬剤に対し
て感受性であるように骨髄腫細胞を変異せしめておく。
典型的にはHAT感受性にしておく。
十分な時間、通常は１〜２週間の後、雑種のコロニーを
観察し、そして陽性ウエルを含むプレートを同定する。
ウエル当り１個のみのコロニーを有するプレート及びウ
エルを選択し、そしてこれらのウエルからの上清液をフ
ァクターVIIICの特定のポリペプチド断片に対する結合
活性について試験する。次に、ハイブリドーマセルライ
ン及びモノクローナル抗体のその他の特徴、例えばハイ
ブリドーマの増殖特性、モノクローナル抗体の結合親和
性、抗体クラス、抗体の交差反応性等を決定することが
できる。次に、所望の特異性及び他の望ましい特性を有
する抗体を産生するこれらのハイブリドーマを生培養物
及び／又は凍結貯蔵物として維持することができる。
観察し、そして陽性ウエルを含むプレートを同定する。
ウエル当り１個のみのコロニーを有するプレート及びウ
エルを選択し、そしてこれらのウエルからの上清液をフ
ァクターVIIICの特定のポリペプチド断片に対する結合
活性について試験する。次に、ハイブリドーマセルライ
ン及びモノクローナル抗体のその他の特徴、例えばハイ
ブリドーマの増殖特性、モノクローナル抗体の結合親和
性、抗体クラス、抗体の交差反応性等を決定することが
できる。次に、所望の特異性及び他の望ましい特性を有
する抗体を産生するこれらのハイブリドーマを生培養物
及び／又は凍結貯蔵物として維持することができる。
次に例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但
し、これによってこの発明の範囲を限定するものではな
い。
し、これによってこの発明の範囲を限定するものではな
い。
実験 1.ファクターVIIICの精製 ａ）E.G.D.Tuddenham.N.C.Trabold.J.A.Collins及びL.
W.Hoyer,J.of.Lab.Clinical Medicine（1979）93:40に
より最初に記載された方法によるポリクローナル抗VIII
R−セファロースカラムを用いるイムノソルベントクロ
マトグラフィー；及びｂ）D.E.G.Austen,British J.of
Hematology（1979）43:669により最初に記載されたアミ
ノヘキシル置換アガロース上でのウロマトグラフ的分離
法により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファクターVI
IICを単離した。この方法の詳細を次に記載する。
W.Hoyer,J.of.Lab.Clinical Medicine（1979）93:40に
より最初に記載された方法によるポリクローナル抗VIII
R−セファロースカラムを用いるイムノソルベントクロ
マトグラフィー；及びｂ）D.E.G.Austen,British J.of
Hematology（1979）43:669により最初に記載されたアミ
ノヘキシル置換アガロース上でのウロマトグラフ的分離
法により、市販の冷却沈澱標品からヒト−ファクターVI
IICを単離した。この方法の詳細を次に記載する。
アトランティック・アンチボディー（Atlantic Antibod
y）から得たヤギ抗−ヒトファクターVIII関連抗原（VII
IR）血清（カットNo 040-01）を、標準0-50％硫酸アン
モニウムカットで処理し、続いてDEAEセルロースカラム
クロマトグラフィーにかけ、あるいは同様の0-33％カッ
トで処理しこれに続くクロマトグラフィーを行わなかっ
た。次に、これらの材料をそれぞれCNBr−活性化セファ
ロースCL2B又は4B（ファルマシア、17-0140-01又は17-0
430-01）と接合せしめ、そしてカラムに注入した（抗VI
IIR−セファロースカラム）。
y）から得たヤギ抗−ヒトファクターVIII関連抗原（VII
IR）血清（カットNo 040-01）を、標準0-50％硫酸アン
モニウムカットで処理し、続いてDEAEセルロースカラム
クロマトグラフィーにかけ、あるいは同様の0-33％カッ
トで処理しこれに続くクロマトグラフィーを行わなかっ
た。次に、これらの材料をそれぞれCNBr−活性化セファ
ロースCL2B又は4B（ファルマシア、17-0140-01又は17-0
430-01）と接合せしめ、そしてカラムに注入した（抗VI
IIR−セファロースカラム）。
“HEMOFIL"、すなわち正常なヒトの新鮮な血漿から調製
された濃縮形の抗血友病因子（ファクターVIII、AHF、A
HG）の安定な乾燥標品（ファクターVIIICに関し約40倍
に濃縮されている）を、0.02Mイミダゾール、0.15M NaC
l、0.1Mリジン−Hcl、0.02％NaN3から成るpH7.4の緩衝
液に溶解した。
された濃縮形の抗血友病因子（ファクターVIII、AHF、A
HG）の安定な乾燥標品（ファクターVIIICに関し約40倍
に濃縮されている）を、0.02Mイミダゾール、0.15M NaC
l、0.1Mリジン−Hcl、0.02％NaN3から成るpH7.4の緩衝
液に溶解した。
溶解した後、HEMOFILを前記の抗VIIIR−セファロースカ
ラムに適用した。非特異的結合蛋白質を、0.5M NaClに
変性した上記の緩衝液により溶出した。次に、0.35M Ca
Cl2を含有する上記の緩衝液を用いて、ファクターVIIIC
活性を安定化する10％グリセロールを添加して、ファク
ターVIIICを溶出した。イムノソルベントカラムからの
活性画分をプールし、そして緩衝液（0.02Mイミダゾー
ル、0.15M NaCl、0.1Mリジン−HCl、0.025M CaCl2、0.0
2％NaN3、10％グリセリン、pH7.5）に対して透析した。
1,100ユニットのファクターVIIICを含有する透析画分の
アリコートを、上記の透析緩衝液で平衡化したアミノヘ
キシル−セファロース4Bカラム（１×6cm）に適用し
た。ファクターVIIIC活性を、0.35M CaCl2又は2M NaCl
を含有する同じ緩衝液により溶出した。500ユニット/ml
のファクターVIIICを含む2mlの容積中に活性が見出され
た。同じ方法により実施した後続の実験において、抗VI
IIRカラムにおける25％減の回収及びアミノヘキシルカ
ラムにおける約90％減の回収がもたらされた。上記の方
法に代えて、イムノソルベントカラムから溶出されたプ
ールされた透析物を、上記の透析緩衝液で平衡化された
デキストランサルフェートアガロース（ファルマシア）
カラムにまず適用する。若干の微量汚染物、例えばフィ
ブリノーゲン、フィブロネクチン、IgGはカラム上に保
持され、他方ファクターVIIICは流過液中に現われる。
この流れを集め、そして前記のアミノヘキシル−セファ
ロースカラムに負荷する。
ラムに適用した。非特異的結合蛋白質を、0.5M NaClに
変性した上記の緩衝液により溶出した。次に、0.35M Ca
Cl2を含有する上記の緩衝液を用いて、ファクターVIIIC
活性を安定化する10％グリセロールを添加して、ファク
ターVIIICを溶出した。イムノソルベントカラムからの
活性画分をプールし、そして緩衝液（0.02Mイミダゾー
ル、0.15M NaCl、0.1Mリジン−HCl、0.025M CaCl2、0.0
2％NaN3、10％グリセリン、pH7.5）に対して透析した。
1,100ユニットのファクターVIIICを含有する透析画分の
アリコートを、上記の透析緩衝液で平衡化したアミノヘ
キシル−セファロース4Bカラム（１×6cm）に適用し
た。ファクターVIIIC活性を、0.35M CaCl2又は2M NaCl
を含有する同じ緩衝液により溶出した。500ユニット/ml
のファクターVIIICを含む2mlの容積中に活性が見出され
た。同じ方法により実施した後続の実験において、抗VI
IIRカラムにおける25％減の回収及びアミノヘキシルカ
ラムにおける約90％減の回収がもたらされた。上記の方
法に代えて、イムノソルベントカラムから溶出されたプ
ールされた透析物を、上記の透析緩衝液で平衡化された
デキストランサルフェートアガロース（ファルマシア）
カラムにまず適用する。若干の微量汚染物、例えばフィ
ブリノーゲン、フィブロネクチン、IgGはカラム上に保
持され、他方ファクターVIIICは流過液中に現われる。
この流れを集め、そして前記のアミノヘキシル−セファ
ロースカラムに負荷する。
その後の測定により、精製されたファクターVIIIC中に
両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗原（CAg）活
性が存在することが示され、HEMOFIL中の40倍濃縮に対
してさらに5,000倍濃縮されていることが証明された。
ゼネラルディアグノスティクス（General Diagnostic
s）製の標準的市販３成分キット〔APTT,ファクターVIII
欠損血漿、ベリファイ・ノーマル・シトレート（Verify
Narmal Citrate）〕を用いて凝固試験を行った。これ
により高レベルのファクターVIIICの生物学的活性が示
された。
両生物学的活性、すなわち凝固活性及び抗原（CAg）活
性が存在することが示され、HEMOFIL中の40倍濃縮に対
してさらに5,000倍濃縮されていることが証明された。
ゼネラルディアグノスティクス（General Diagnostic
s）製の標準的市販３成分キット〔APTT,ファクターVIII
欠損血漿、ベリファイ・ノーマル・シトレート（Verify
Narmal Citrate）〕を用いて凝固試験を行った。これ
により高レベルのファクターVIIICの生物学的活性が示
された。
2.モノクローナル抗体の調製 Balb/cマウスを上記の精製ヒト−ファクターVIIICによ
り免疫した。脾臓細胞（108個）を、107個のNSOマウス
骨髄腫細胞又は107個のNSIマウス骨髄腫細胞と融合せし
めた〔Kohler及びMilstein（1975）Nature 256:495によ
る〕。各融合の生成物を２枚の96ウエルミクロタイター
プレート上にプレートした。脾臓細胞フィーダー層を10
4細胞／ウエルで使用した。コロニーは５日目から顕微
鏡観察できた。上清液を数日間隔でファクターVIIICに
対する抗体の存在について測定した。イムノアッセイプ
レート（Nunc F2）中に下記の層を用いて、エンザイム
・リンクド・イムノアドソルベントアッセイ（ELISA）
を行った。
り免疫した。脾臓細胞（108個）を、107個のNSOマウス
骨髄腫細胞又は107個のNSIマウス骨髄腫細胞と融合せし
めた〔Kohler及びMilstein（1975）Nature 256:495によ
る〕。各融合の生成物を２枚の96ウエルミクロタイター
プレート上にプレートした。脾臓細胞フィーダー層を10
4細胞／ウエルで使用した。コロニーは５日目から顕微
鏡観察できた。上清液を数日間隔でファクターVIIICに
対する抗体の存在について測定した。イムノアッセイプ
レート（Nunc F2）中に下記の層を用いて、エンザイム
・リンクド・イムノアドソルベントアッセイ（ELISA）
を行った。
第１層：単一特異性抗−マウスIg 第２層：ハイブリドーマ細胞上清液 第３層：ヒト−ファクターVIIICを含有する冷却沈澱物 第４層：血友病阻害患者からのパーオキシダーゼラベル
IgG ４つの陽性セルラインを同定し、サブクローニングによ
り純化し、そして実験室においてリットル規模の培養に
おいて増殖せしめた。陽性セルラインの内42,47及び56
と称する３種類のセルラインはNSO骨髄腫セルラインと
の融合に由来する。第４の陽性セルラインはNSI骨髄種
セルラインとの融合に由来し、そして1-28と称する。
IgG ４つの陽性セルラインを同定し、サブクローニングによ
り純化し、そして実験室においてリットル規模の培養に
おいて増殖せしめた。陽性セルラインの内42,47及び56
と称する３種類のセルラインはNSO骨髄腫セルラインと
の融合に由来する。第４の陽性セルラインはNSI骨髄種
セルラインとの融合に由来し、そして1-28と称する。
前記以外の融合処理を上記と同じ方法で行った。但し、
融合のパートナーとしてセルラインP3X63Ag8、653〔Kea
rney等（1979）J.Immunol.123:1548-1550〕を使用し
た。ELISAスクリーニングは次の層を用いて行った。
融合のパートナーとしてセルラインP3X63Ag8、653〔Kea
rney等（1979）J.Immunol.123:1548-1550〕を使用し
た。ELISAスクリーニングは次の層を用いて行った。
第１層：精製ファクターVIIIC 第２層：ハイブリドーマ細胞上清液 第３層：ホースラデッシュ・パーオキシダーゼ（HRP）
でラベルされたヤギ抗−マウスIgG 第４層:HRP−基質 ５個の陽性セルラインを同定し、サブクローニングし、
リットル規模の培養において増殖せしめ、そして４項に
記載するようにして特徴付けた。これらのセルラインを
1B9,2B6,2F9,4E5,及び5B1と称する。
でラベルされたヤギ抗−マウスIgG 第４層:HRP−基質 ５個の陽性セルラインを同定し、サブクローニングし、
リットル規模の培養において増殖せしめ、そして４項に
記載するようにして特徴付けた。これらのセルラインを
1B9,2B6,2F9,4E5,及び5B1と称する。
3.陽性ハイブリドーマの増幅 抗−ファクターVIII抗体を産生する各ハイブリドーマか
ら各地の免疫グロブリンを産生する細胞及び免疫グロブ
リンを産生しない細胞を確実に除去するために、サブク
ローニングによる純化を行った。ハイブリドーマ細胞4
2,47,56,及び28の稀釈物を、各ウエルが理論上１個の細
胞を含有するようにミクロタイターに接種した。クロー
ニング効率が低いために必要な場合には、最初の接種は
ウエル当り２細胞とし、次にウエル当り１細胞で第２接
種を行った。７〜14日後、各ハイブリドーマセルライン
由来の同一と推定される細胞の各コロニーからの上清液
をスクリーニングし、抗−ファクターVIII産生コロニー
を同定した。次に陽性サブクローンをマクロカルチュア
ーに拡大した。
ら各地の免疫グロブリンを産生する細胞及び免疫グロブ
リンを産生しない細胞を確実に除去するために、サブク
ローニングによる純化を行った。ハイブリドーマ細胞4
2,47,56,及び28の稀釈物を、各ウエルが理論上１個の細
胞を含有するようにミクロタイターに接種した。クロー
ニング効率が低いために必要な場合には、最初の接種は
ウエル当り２細胞とし、次にウエル当り１細胞で第２接
種を行った。７〜14日後、各ハイブリドーマセルライン
由来の同一と推定される細胞の各コロニーからの上清液
をスクリーニングし、抗−ファクターVIII産生コロニー
を同定した。次に陽性サブクローンをマクロカルチュア
ーに拡大した。
各セルラインの多数のアリコートを、純化が完了した直
後に液体窒素中で凍結した。この操作により、もとの１
個のミクロウエル（0.2ml中102細胞）から約108細胞へ
の培養物の増幅が得られた。この細胞数は100mlの培地
に相当する。細胞はこの増殖段階中非常に感受性であ
り、不適当な取り扱いをすれば培養物が死滅した。各セ
ルラインの個々の特徴は４種類のすべてのセルラインの
ために同一の方法を用いることができないことを意味し
たが、培養物の生存及び増殖を維持するために下記の段
階を一般的に使用した。
後に液体窒素中で凍結した。この操作により、もとの１
個のミクロウエル（0.2ml中102細胞）から約108細胞へ
の培養物の増幅が得られた。この細胞数は100mlの培地
に相当する。細胞はこの増殖段階中非常に感受性であ
り、不適当な取り扱いをすれば培養物が死滅した。各セ
ルラインの個々の特徴は４種類のすべてのセルラインの
ために同一の方法を用いることができないことを意味し
たが、培養物の生存及び増殖を維持するために下記の段
階を一般的に使用した。
1.マクロカルチュアーに移行する前にミクロウエルをお
よそ1/4コンフルエントにした。
よそ1/4コンフルエントにした。
2.サブカルチュアーの最初の２週間の間、前条件調節し
た培地を使用した。
た培地を使用した。
3.マクロカルチュアーからフラスコ培養への移行を、少
なくとも4mlのマクロカルチュアーが半コンフルエンス
に増殖するまで遅らせた。
なくとも4mlのマクロカルチュアーが半コンフルエンス
に増殖するまで遅らせた。
4.フラスコ培養の稀釈を、最初の数回の継代の間1:2未
満に制限した。
満に制限した。
4.モノクローナル抗体の特徴付け モノクローナル抗−ファクターVIIIC抗体の免疫グロブ
リンクラスを同定するため、マウスIgGについてイムノ
アッセイを行った。ここでは、コート抗体は免疫グロブ
リンサブクラスに特異的であった。抗−アイソタイプ抗
体によってプレコートされたミクロプレートをハゲドル
ン・リサーチ・ラブ（Hagedorn Research Lab.）から得
た。ハイブリドーマセルライン42,47及び56により産生
された抗体はIgG1であり、セルライン5B1により産生さ
れた抗体はIgMであった。
リンクラスを同定するため、マウスIgGについてイムノ
アッセイを行った。ここでは、コート抗体は免疫グロブ
リンサブクラスに特異的であった。抗−アイソタイプ抗
体によってプレコートされたミクロプレートをハゲドル
ン・リサーチ・ラブ（Hagedorn Research Lab.）から得
た。ハイブリドーマセルライン42,47及び56により産生
された抗体はIgG1であり、セルライン5B1により産生さ
れた抗体はIgMであった。
モノクローナル抗体の２つのクラスを、下記の方法によ
り、ファクターVIIICポリペプチドとの反応性に従って
同定した。ハイブリドーマ培養上清液を、アフィニティ
ー精製されたヤギ抗−マウス免疫グロブリン（IgG）を
コートしたポリスチレンビーズ（直径1/8″，プレシシ
ョン・プラスチック・ボール社（Precision Plastic Ba
ll Co.），シカゴ〕と共に室温にて12時間インキュベー
トした。ポリスチレンビーズを燐酸緩衝化塩溶液で洗浄
し、そしてクロラミンＴ法を用いて、I125でラベルされ
た精製ファクターVIIICと反応せしめた。ビーズ上に結
合したラベルされた蛋白質をゲル電気泳動用SDSサンプ
ル緩衝液中に可溶化し、そして7.5％アクリルアミドゲ
ル上で分離した〔Laemmli（1970）Nature 227:280〕。
ゲルを固定し、乾燥し、そして強化スクリーンを用いて
コダックX-Omatフイルムに、20時間又はそれより長時間
−80℃において暴露した。この方法により得られた結果
からモノクローナル抗体が次のように分類された。クラスＩ :80/77kdダブレット、又は80/77kdダブレット
及び240kd蛋白質と反応する。これらの抗体はまた測定
にスロンビン消化ファクターVIIIを用いる場合70/67kd
ダブレットとも反応し、このことはスロンビン消化によ
り生成する70/67kdダブレットが80/77kdダブレットに由
来することを示している。クラスII :240,140,115,92.5kd蛋白質、及び精製ファク
ターVIIIC物質のスロンビン消化により生成する40kdペ
プチドと反応する。
り、ファクターVIIICポリペプチドとの反応性に従って
同定した。ハイブリドーマ培養上清液を、アフィニティ
ー精製されたヤギ抗−マウス免疫グロブリン（IgG）を
コートしたポリスチレンビーズ（直径1/8″，プレシシ
ョン・プラスチック・ボール社（Precision Plastic Ba
ll Co.），シカゴ〕と共に室温にて12時間インキュベー
トした。ポリスチレンビーズを燐酸緩衝化塩溶液で洗浄
し、そしてクロラミンＴ法を用いて、I125でラベルされ
た精製ファクターVIIICと反応せしめた。ビーズ上に結
合したラベルされた蛋白質をゲル電気泳動用SDSサンプ
ル緩衝液中に可溶化し、そして7.5％アクリルアミドゲ
ル上で分離した〔Laemmli（1970）Nature 227:280〕。
ゲルを固定し、乾燥し、そして強化スクリーンを用いて
コダックX-Omatフイルムに、20時間又はそれより長時間
−80℃において暴露した。この方法により得られた結果
からモノクローナル抗体が次のように分類された。クラスＩ :80/77kdダブレット、又は80/77kdダブレット
及び240kd蛋白質と反応する。これらの抗体はまた測定
にスロンビン消化ファクターVIIIを用いる場合70/67kd
ダブレットとも反応し、このことはスロンビン消化によ
り生成する70/67kdダブレットが80/77kdダブレットに由
来することを示している。クラスII :240,140,115,92.5kd蛋白質、及び精製ファク
ターVIIIC物質のスロンビン消化により生成する40kdペ
プチドと反応する。
第１表に、種々のハイブリドーマセルラインにより産生
されるモノクローナル抗体のそれぞれに対応するクラス
を示す。
されるモノクローナル抗体のそれぞれに対応するクラス
を示す。
抗体を、常用のベセスダ（Bethesda）アッセイ〔C.Kasp
er（1975）Thrombos.Diathes.Haemorrh.34:869-782〕を
用いて、ファクターVIIIC凝固阻害活性についてスクリ
ーニングした。上記の抗体の内、セルライン56により産
生された抗体のみが凝固阻害活性を示した。
er（1975）Thrombos.Diathes.Haemorrh.34:869-782〕を
用いて、ファクターVIIIC凝固阻害活性についてスクリ
ーニングした。上記の抗体の内、セルライン56により産
生された抗体のみが凝固阻害活性を示した。
92.5kd蛋白質と80/77kdダブレットとの間の会合を検討
するため、及びこの会合におけるカルシウムの役割を研
究するため次の実験を行った。10mM CaCl2の存在下、又
は同濃度のCaCl2、10mM EGTA及び10mM EDTAの存在下で
次のELISA測定を行った。
するため、及びこの会合におけるカルシウムの役割を研
究するため次の実験を行った。10mM CaCl2の存在下、又
は同濃度のCaCl2、10mM EGTA及び10mM EDTAの存在下で
次のELISA測定を行った。
第１層：単一特異性抗−マウスIgG 第２層：クラスIIIモノクローナル抗体（抗−92.5k
d）、又はクラスＩモノクローナル抗体（抗−80/77kd） 第３層：精製ファクターVIIIC物質 第４層:77/80kdに対するHRP−ヒト阻害抗体結果を第２
表に示す。第２表において示されるように、測定中にカ
ルシウムが存在する場合にのみ強いHRP反応が得られ、
第４層（77/80kdに対するHRP−ヒト阻害抗体）がクラス
IIIモノクローナル抗体と会合した複合体と結合するこ
とが示される。測定にEGTA及びEDTAを加えた場合、測定
中に結合するHRP活性は非特異的結合にのみ相当する。
これらの結果は、92.5kd蛋白質がカルシウム橋を介して
80/77kdダブレットに結合することを示している。
d）、又はクラスＩモノクローナル抗体（抗−80/77kd） 第３層：精製ファクターVIIIC物質 第４層:77/80kdに対するHRP−ヒト阻害抗体結果を第２
表に示す。第２表において示されるように、測定中にカ
ルシウムが存在する場合にのみ強いHRP反応が得られ、
第４層（77/80kdに対するHRP−ヒト阻害抗体）がクラス
IIIモノクローナル抗体と会合した複合体と結合するこ
とが示される。測定にEGTA及びEDTAを加えた場合、測定
中に結合するHRP活性は非特異的結合にのみ相当する。
これらの結果は、92.5kd蛋白質がカルシウム橋を介して
80/77kdダブレットに結合することを示している。
抗体が認識するエピトープの観点からモノクローナル抗
体を特徴付けるために追加の測定を行ったミクロタイタ
ーウエルに固定化されたファクターVIIICを種々の濃度
の125I‐42IgG又は125I‐47IgG並びにラベルされていな
い42,47,56及びI-28と反応せしめることにより競争的測
定を行った。結果は、47及び42モノクローナル抗体は異
るエピトープと反応することを示した。この結果はま
た、56モノクローナル抗体は42モノクローナル抗体の結
合部位に近いエピトープと反応し、そしてVIIIC中の配
置変化を誘発し、このことが42抗体に対する親和性を強
化するらしいことを示した。
体を特徴付けるために追加の測定を行ったミクロタイタ
ーウエルに固定化されたファクターVIIICを種々の濃度
の125I‐42IgG又は125I‐47IgG並びにラベルされていな
い42,47,56及びI-28と反応せしめることにより競争的測
定を行った。結果は、47及び42モノクローナル抗体は異
るエピトープと反応することを示した。この結果はま
た、56モノクローナル抗体は42モノクローナル抗体の結
合部位に近いエピトープと反応し、そしてVIIIC中の配
置変化を誘発し、このことが42抗体に対する親和性を強
化するらしいことを示した。
ファクターVIIICの種々の構成ポリペプチド間の識別を
行うことができるモノクローナル抗体が提供される。ク
ラスＩ抗体は80/77kdダブレット、又は240kd断片及び80
/77kdダブレットと反応する。クラスIIIモノクローナル
抗体は240kdポリペプチド、並びに92.5kdポリペプチド
及びその前駆体と反応する。クラスIII抗体はファクタ
ーVIIIC物質のスロンビン消化生成物との追加の反応を
示す。
行うことができるモノクローナル抗体が提供される。ク
ラスＩ抗体は80/77kdダブレット、又は240kd断片及び80
/77kdダブレットと反応する。クラスIIIモノクローナル
抗体は240kdポリペプチド、並びに92.5kdポリペプチド
及びその前駆体と反応する。クラスIII抗体はファクタ
ーVIIIC物質のスロンビン消化生成物との追加の反応を
示す。
なお、下記のセルラインNG-NSO-42,NG-NSO-47,NG-NSO-5
6及びNG-NSI-28がナショナル・カレクション・オブ・ア
ニマル・セル・カルチュアーズ（National Collection
of Animal Cell Cultures;NCACC）に寄託されており、
そしてセルラインFVIIIC 4E5,FVIIIC 5B1及びFVIIIC 2B
6がアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション
（American Type Culture Collection;ATCC）に寄託さ
れている。
6及びNG-NSI-28がナショナル・カレクション・オブ・ア
ニマル・セル・カルチュアーズ（National Collection
of Animal Cell Cultures;NCACC）に寄託されており、
そしてセルラインFVIIIC 4E5,FVIIIC 5B1及びFVIIIC 2B
6がアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション
（American Type Culture Collection;ATCC）に寄託さ
れている。
セルライン42（NG-NSO-42）,47（NG-NSO-47）,56（NG-N
SO-56）、及びI-28（NG-NII-28）の寄託はブダペスト条
約に基く国際寄託である。
SO-56）、及びI-28（NG-NII-28）の寄託はブダペスト条
約に基く国際寄託である。
以上、この発明の理由のために詳細に説明したが、種々
の変化、変法を実施することができることは言うまでも
ない。
の変化、変法を実施することができることは言うまでも
ない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＮＣＡＣＣ ８４１２２１０３ 微生物の受託番号 ＮＣＡＣＣ ８４１２２１０４ 審査前置に係属中 (72)発明者 フランク アール．マシヤーズ アメリカ合衆国，カリフオルニア 94131, サン フランシスコ，マービユー ウエイ 148 (72)発明者 マーサ トウルート アメリカ合衆国，カリフオルニア 94611, オークランド，ブロードウエイ テラス 9082 (72)発明者 パブロ バレンズエラ アメリカ合衆国，カリフオルニア 94117, サン フランシスコ，アツパー テラス 455 (72)発明者 ミレラ エズバン ラスムセン デンマーク国，2100 コペンハーゲン，ア ビルドガードスガデ 24 (72)発明者 ジエニフアー フアバロロ オーストラリア国，ビクトリア，カールト ン 3035，フアラデイ ストリート 108 (56)参考文献 特開 昭59−184130（ＪＰ，Ａ) Ｂｌｏｏｄ，61（４）（1983）Ｐ．807 −811 Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，101 （５）（1983）Ｐ．736−746
Claims (3)
- 【請求項１】以下の特性： （１）ファクターVIIICと反応し、 （２）凝固阻害活性を有さず、 （３）変性条件下での電気泳動により得られるファクタ
ーVIIICの80/70Kdダブレットと反応し、そして （４）ファクターVIIICのスロンビン消化により生成す
る70/67Kdダブレットと反応する、 を有する、モノクローナル抗体。 - 【請求項２】前記抗体が、マウスミエローマ細胞と予め
ファクターVIIICで免疫化したマウスの脾臓細胞とを融
合することにより調製されたハイブリドーマセルライン
によって生産される、特許請求の範囲第１項に記載のモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項３】前記ハイブリドーマセルラインが、セルラ
イン42、セルライン47、セルラインI-28、セルライン1B
9、セルライン2B6およびセルライン2F9からなる群から
選ばれる、特許請求の範囲第２項に記載のモノクローナ
ル抗体。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/570,062 US5004804A (en) | 1984-01-12 | 1984-01-12 | Method and composition for preparation of factor VIIIC |
| US66491984A | 1984-10-26 | 1984-10-26 | |
| US570062 | 1984-10-26 | ||
| US664919 | 1984-10-26 | ||
| US689274 | 1985-01-07 | ||
| US06/689,274 US4716117A (en) | 1984-10-26 | 1985-01-07 | Monoclonal antibodies to factor VIIIC |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3215060A Division JPH0817697B2 (ja) | 1984-01-12 | 1991-08-27 | ファクターｖｉｉｉｃに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマセルライン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60210981A JPS60210981A (ja) | 1985-10-23 |
| JPH0764879B2 true JPH0764879B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=27416093
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60002270A Expired - Lifetime JPH0764879B2 (ja) | 1984-01-12 | 1985-01-11 | フアクタ−ｖ▲ｉｉｉ▼ｃに対するモノクロ−ナル抗体 |
| JP3215060A Expired - Lifetime JPH0817697B2 (ja) | 1984-01-12 | 1991-08-27 | ファクターｖｉｉｉｃに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマセルライン |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3215060A Expired - Lifetime JPH0817697B2 (ja) | 1984-01-12 | 1991-08-27 | ファクターｖｉｉｉｃに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマセルライン |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0152746B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0764879B2 (ja) |
| AT (1) | ATE66249T1 (ja) |
| DE (2) | DE152746T1 (ja) |
| DK (1) | DK13485A (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| WO1991004059A2 (en) * | 1989-09-14 | 1991-04-04 | Baxter International Inc. | Method and useful apparatus for preparing pharmaceutical compositions |
| FR2662166A1 (fr) * | 1990-05-18 | 1991-11-22 | Fondation Nale Transfusion San | Procede de preparation de facteur viii de tres haute purete comprenant une etape rapide d'immunoadsorption. |
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| EP1095143B1 (en) * | 1998-05-08 | 2008-08-20 | Stichting Sanquin Bloedvoorziening | Inhibitor for diagnosis and treatment of haemophilia a patients |
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