JP4589756B2 - Dダイマー測定用キット - Google Patents
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Description
Dダイマーとは、血液中のフィブリノゲンがトロンビンなどの働きにより凝固して形成されるポリマーである安定化フィブリンが、プラスミンのような酵素により分解されて得られるフィブリン分解産物のうちの高分子画分のことであり、DD/E画分およびこれを基本単位とするDD/E画分の多量体の総称である。DD/E画分の多量体は、DXD/YY画分(DD/E画分の3量体)、YXY/DXXD画分(DD/E画分の5量体)、DXXD/YXXY画分(DD/E画分の7量体)などを含む。
よって、血栓症患者の血液中にはフィブリンが分解されて生じるDダイマーと、フィブリノゲンが分解されて生じるフィブリノゲン分解産物とが混在することになる。
(抗原の取得)
抗原として用いるDダイマーは、プラスミンのようなフィブリンを分解し得る酵素をフィブリンに作用させて得ることができる。該Dダイマーは、DD/E画分より大きい分子量の画分を含むものが好ましい。このようなものとしては、DD/E画分の2〜5量体が挙げられる。また、Dダイマーのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的手法により得られるものを抗原として用いてもよい。
原料となるフィブリンは、市販のものを用いてもよいし、フィブリノゲンにトロンビン、XIII因子およびカルシウム塩を作用させて得られるものを用いてもよい。
上記のようにして得られる抗原を、アジュバントと任意に混合し、適当な緩衝液に溶解または懸濁して得られる抗原液で、動物を免疫することができる。該抗原液中の抗原の濃度は、50〜500μg/mL程度が好ましい。抗原の免疫原性が低い場合は、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリアータンパク質を任意に抗原と結合させてもよい。
免疫法は、使用する抗原の種類やアジュバントの有無により適宜選択することができる。例えば、マウスを用いる場合、アジュバント混合抗原液0.05〜1 mL (抗原10〜200μg)を腹腔内、皮下、筋肉内または(尾)静脈内に注射し、初回免疫から約4〜21日毎に1〜4回追加免疫を行い、さらに約1〜4週間後に最終免疫を行う。抗原量を多くして腹腔内注射することにより、抗原液にアジュバントを用いずに免疫を行ってもよい。追加免疫の約5〜10日後に血液を採取して抗体価を測定する。抗体価は、後記の抗体価アッセイのような公知の方法に従って測定できる。最終免疫から約3〜5日後に、免疫された動物から脾臓を摘出し、脾細胞を分離して抗体産生細胞を得ることができる。
モノクローナル抗体は、従来公知の方法、例えばKohler and Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975)に記載の方法に従って作製することができる。
用いる骨髄腫細胞は、マウス、ラット、ヒトなどいずれに由来するものであってもよく、例えば、マウスミエローマP3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が挙げられる。骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生するものがあり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合することがあるので、特に免疫グロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばP3X63-Ag8・653やSP2/o-Ag14などを用いるのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、特に同系統の動物由来のものが好ましい。
上記の担体の形状は特に限定されず、粒子状、平面状などいずれの形状でもよい。粒子状である場合、粒子の平均粒径は測定機器などに応じて適宜選択することができるが、通常、0.05〜0.5μmが適当である。
(1)Dダイマー溶液の調製
フィブリノゲン(シグマ社製)100 mg (5.3 mg/mL)に、塩化カルシウム、ヒトトロンビンおよびXIII因子(ERL社製)をそれぞれ最終濃度25 mM、2U/mLおよび1.25μg/mLとなるように加え、37℃で18時間反応させて、フィブリノゲンをフィブリンに変換させた。12,000×gで20分間遠心分離し、フィブリンを非凝固性物質から分離した。フィブリンを1 mm3以下に切断し、50 mM Tris緩衝液(pH 7.4) 2.5 mLに浮遊させ、プラスミン(シグマ社製)25μL (1 U/mL)を添加した。攪拌しながら37℃で3時間反応させた後、アプロチニンを最終濃度1,000 U/mLとなるように添加して分解反応を停止した。12,000×gで20分間遠心分離し、その上清を50 mM Tris緩衝液(pH 7.4)で平衡化したLysine-Sepharose 4B (容積3 mL)に充填し、クロマトグラフィーを行った。非還元下でのSDS-PAGEにより、DD/E画分の3量体以上のものを含む画分をDダイマー溶液とした。
独立行政法人産業技術総合研究所に受託番号FERM P−19687として寄託されたハイブリドーマDD-M1653株が産生するモノクローナル抗体(以下、DD-M1653抗体という)の反応特異性を、以下に記載のウェスタンブロット法により検討した。
ウェスタンブロット法
各成分の濃度が50μg/mLになるように1% (w/v) SDS溶液で調整したDD/E画分、DD/E画分の3〜5量体、X画分、Y画分、D画分、E画分およびフィブリノゲンの混合物を、0.1% (w/v) SDSを含む7.5% ポリアクリルアミドゲル上で60ボルトの定電圧で2.5時間展開させた。緩衝液には0.02% (w/v) SDS を含む 25 mM Tris-192 mM グリシン緩衝液(pH 7.5)を用いた。
結果を表1に示す。
DD-M1653抗体のマウスイムノグロブリンサブクラスを、Zymed社製MONOAbタイピングキットを用いて同定した。その結果、DD-M1653抗体はIgG 2aであった。
Dダイマー測定用キットの製造
液状試薬の製造
ポリエチレングリコール、アジ化ナトリウムおよびBSAを含むMOPSO緩衝液(pH 7.1)に、DD-M1653抗体を10μg/mLとなるように添加して、液状試薬を製造した。
10% (w/v)ポリスチレンラテックス懸濁液(積水化学株式会社製、粒径0.245μm)0.5 mLを、DD-M1653抗体を含むリン酸緩衝液(pH 7.5) 2.0 mL (抗体濃度0.625 mg/mL)に添加してボルテックスミキサーで混合した。この混合液を遠心分離し(25,000×g、20分間)、1% BSAを含むMOPSO緩衝液(pH 7.1) 2.5 mLに懸濁した。この懸濁液を遠心分離し(25,000×g、20分間)、ペレットを2% BSAを含むMOPSO緩衝液(pH 7.1) 40 mLに懸濁して、DD-M1653抗体が固定化されたラテックス粒子を含む溶液を得た。
上記の液状試薬の入った容器と、DD-M1653抗体が固定化されたラテックス粒子を含む溶液の入った容器とを組み合わせて、本発明のDダイマー測定用キットとした。
検体14μLと、実施例1で得られた液状試薬84μLとを混合し、37℃で5分間反応させた。ここに、実施例1で得られたDD-M1653抗体が固定化されたラテックス粒子を含む溶液84μLを混合して、波長800 nmで1分間当たりの吸光度変化量を測定することにより、Dダイマー量を測定した。検体としては、上記の(1)で作製したDダイマー溶液(25μg/mL)、上記の(1)で作製したDダイマー溶液(25μg/mL)に、X画分(森永生化学研究所社製)を40μg/mLとなるように添加したもの、および上記の(1)で作製したDダイマー溶液(25μg/mL)に、X画分(森永生化学研究所社製)を20μg/mLとなるように添加したものを用いた。
結果を表2に示す。
試験例1と同じ検体14μLと、DD-M1653抗体を含まない試薬(ポリエチレングリコール、アジ化ナトリウムおよびBSAを含むMOPSO緩衝液(pH 7.1))84μLとを混合し、37℃で5分間反応させた。ここに、実施例1で得られたDD-M1653抗体が固定化されたラテックス粒子を含む溶液84μLを混合して、波長800 nmで1分間当たりの吸光度変化量を測定することにより、Dダイマー量を測定した。
結果を表2に示す。
Claims (5)
- フィブリンの分解産物であるDダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体を含む液状試薬と、Dダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体が固定化された担体またはそれを含む溶液とを組み合わせてなるDダイマー測定用キット。
- 前記担体が、赤血球またはラテックス粒子である請求項1に記載のDダイマー測定用キット。
- 前記Dダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体が、前記液状試薬に懸濁または溶解されてなる請求項1または2に記載のDダイマー測定用キット。
- 前記液状試薬が、ウシ血清アルブミンを含む請求項3に記載のDダイマー測定用キット。
- 抗原抗体反応に基づいて検体中のDダイマーを測定する方法であって、
前記検体と、フィブリンの分解産物であるDダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体を含む液状試薬とを混合する第一の混合工程、及び
前記第一混合工程で得られた混合物と、Dダイマーに反応性を有するモノクローナル抗体が固定化された担体とを混合する第二の混合工程、
を含むDダイマーを測定する方法。
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