JP6770571B2

JP6770571B2 - 架橋化フィブリン分解産物の測定試薬および測定方法

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Publication number: JP6770571B2
Application number: JP2018501742A
Authority: JP
Inventors: 裕長濱; 順子野崎; 錠治櫻井
Original assignee: LSI Medience Corp
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2020-10-14
Anticipated expiration: 2037-02-22
Also published as: EP3421996A1; KR102589054B1; RU2742279C2; EP3421996A4; CN108700570A; KR20180115307A; WO2017146119A1; BR112018017170A2; RU2018133469A; JPWO2017146119A1; CN108700570B; US20190265257A1; RU2018133469A3

Description

本発明は、架橋化フィブリンのプラスミン分解産物の測定試薬および測定方法に関する。

血中に架橋化フィブリン分解産物（cross-linked fibrin degradation products：ＸＤＰ）が検出されることは血栓が溶解したことを意味し、その測定は全身性の凝固活性化と線溶活性化が認められる播種性血管内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation：ＤＩＣ）の診断に広く用いられている。一方、局所的な血管内血栓形成と限定された線溶活性化を伴う深部静脈血栓症（deep vein thrombosis：ＤＶＴ）の除外診断にも用いられるようになり、ＸＤＰ測定系に要求される測定範囲は低濃度から高濃度まで広範囲化する傾向にある。

ＸＤＰを認識する抗体としては、特許文献１のような抗体が知られている。この抗体は、ＸＤＰ（Ｄダイマー）以外のフラグメントとは反応性を有しないため、ＸＤＰの正確な測定が期待される。また、この抗体はその反応性などから、抗体の認識部位はＥ−Ｄ結合しているＸＤＰのＤドメイン及び／又はＥドメイン上にあるとされ、ＸＤＰの正確な測定にはＥ−Ｄ結合が重要であるとされている。

国際公開第２０１１／１２５８７５号

一方で、特許文献１のような特性を有する抗体を用いてＸＤＰを測定しようとした場合には、Ｅ−Ｄ結合を特異的に認識する抗体特有の問題として、試料中に存在しているＤドメインに架橋構造の無いフィブリンポリマーや可溶性フィブリン（soluble fibrin：ＳＦ）をも認識して測定してしまう可能性があることを見出した。
これらのフィブリンポリマーやＳＦのような物質は、一部ＸＤＰと構造上の類似点はあるものの、その由来や性質が全く異なるものであるため、フィブリンポリマーやＳＦを認識してしまうことによる偽陽性は大きな問題となり得る。従って、架橋化フィブリン分解産物（ＸＤＰ）とフィブリンポリマーやＳＦとは区別して測定する必要がある。

本発明者らは検討の結果、抗体の特性を明らかにするとともに、これらを区別する測定を可能にした。具体的には、Ｅドメイン上に該抗体の認識部位が存在すること、該抗体を使用して有用なＸＤＰ測定を行うためには、カルシウム濃度が重要であることを見出したものである。
カルシウムは血液凝固において重要な役割を果たしているイオンであり、Ｄドメインに２箇所、Ｅドメインに１箇所、カルシウム結合部位が存在することが報告されているが、本発明者らの検討の結果、フィブリンポリマー上のカルシウムがキレートされて存在しなくなるため、フィブリンポリマーの構造が変化することで、その反応性も変化するものと考えられた。

本発明は、
［１］（１）架橋化フィブリンのプラスミン分解産物（ＸＤＰ）と反応し、フィブリノゲン及びそのプラスミン分解産物であるフラグメントＸ、フラグメントＹ、フラグメントＤ_１、及びフラグメントＥ_３と反応しない抗ＸＤＰ抗体、及び
（２）カルシウムキレート剤
を含む、架橋化フィブリンのプラスミン分解産物の測定試薬、
［２］架橋化フィブリンのプラスミン分解産物の測定方法であって、ＸＤＰと抗ＸＤＰ抗体との反応をカルシウムキレート剤の存在下で実施する、前記測定方法、
に関する。

本発明によれば、ＸＤＰのより正確な測定を可能にする。

ａ）フィブリノゲン、ｂ）デスＡＡフィブリンモノマー、ｃ）フィブリンポリマーの構造を模式的に示す説明図である。ｄ）架橋フィブリンの構造を模式的に示す説明図である。ｅ）架橋フィブリン分解産物（ＤＤ／Ｅ）、ｆ）ＤＤ／Ｅを解離後、単離したＤＤ、ｇ）ＤＤ／Ｅを解離後、単離したフラグメントＥ_１、Ｅ_２、ｈ）フラグメントＥ_３、ｉ）フラグメントＤ_１、ｊ）フラグメントＤ_３、ｋ）Ｄ_１−Ｅ_１−Ｄ_１、ｌ）Ｄ_１−Ｅ_１の構造を模式的に示す説明図である。ヒトＤ_１とヒトＥ_１＋２との混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムで分画した結果を示すクロマトグラムである。ヒトＤ_１とヒトＥ_３との混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムで分画した結果を示すクロマトグラムである。ウシＤ_１（ｂＤ１）とヒトＥ_１＋２（ｈＥ_１＋２）との混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムで分画した結果を示すクロマトグラムである。ヒツジＤ_１（ｏＤ１）とヒトＥ_１＋２（ｈＥ_１＋２）との混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムで分画した結果を示すクロマトグラムである。Ｃａ^２＋イオン又はＥＤＴＡの影響を検討するために、ヒトＤＤ／Ｅ又はヒトＤ−Ｅ−Ｄ複合体を、固相化ＭＩＦ−２２０抗体と反応させ、ＥＬＩＳＡにより検出した結果を示すグラフである。

本発明の測定試薬および測定方法では、（１）架橋化フィブリンのプラスミン分解産物（ＸＤＰ）と反応し、フィブリノゲン及びそのプラスミン分解産物であるフラグメントＸ、フラグメントＹ、フラグメントＤ_１、及びフラグメントＥ_３と反応しない抗ＸＤＰ抗体、及び（２）カルシウムキレート剤を使用し、ＸＤＰと抗ＸＤＰ抗体との反応をカルシウムキレート剤の存在下で実施することを特徴とする。

本明細書において、架橋化フィブリン（別称として、安定化フィブリン）のプラスミン分解産物とは、別称として、「Ｄダイマー」、「Ｄ−Ｄダイマー」、「ＤＤ／Ｅ複合体」と称されることもある、基本単位であるＤＤ／Ｅモノマー、及びそのポリマー（ＤＤ／Ｅポリマー、例えば、ＤＸＤ／ＹＹ、ＹＸＹ／ＤＸＸＤ、ＤＸＸＹ／ＹＸＸＤ）を意味する。

《抗ＸＤＰ抗体》
本発明で用いる抗ＸＤＰ抗体は、
（１）ＸＤＰと反応し、
（２）フィブリノゲンと反応せず、
（３）フィブリノゲンのプラスミン分解産物、すなわち、フラグメントＸ、フラグメントＹ、フラグメントＤ_１、及びフラグメントＥ_３のいずれとも反応せず、好ましくは、
（４）ＤＤ／Ｅモノマーを解離させたフラグメント、すなわち、フラグメントＤＤ並びにフラグメントＥ_１及びフラグメントＥ_２のいずれとも反応しない。
本発明で用いる抗ＸＤＰ抗体としては、ＥドメインとＤドメインが会合して初めてＥドメイン側に出現する立体構造を認識する抗体を挙げることができる。

本発明で用いる抗ＸＤＰ抗体は、公知の手段により得ることができる。所望の反応性を有する限りモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）でもポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）のいずれでも良いが、モノクローナル抗体の方が好ましい。前記抗体としては、抗体それ自体を使用することもできるし、抗原結合部位を含む抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、またはＦｖ等の形で使用することもできる。これらの抗体フラグメントは、定法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いてタンパク質の分離、精製の定法に従って得ることができる。

本発明で用いる抗ＸＤＰ抗体を作製するための抗原としては、例えば、ＤＤ／Ｅモノマー又はＤＤ／Ｅポリマーを使用することができる。ＤＤ／Ｅポリマーは２〜５量体を挙げることができ、６量体以上になると水に溶けにくくなる。また、該抗原はフィブリノゲンから公知の方法に従って調製することができる。また、ヒトなどから精製して得ることができるし、遺伝子工学的手法によっても得ることができる。更に市販品を用いてもよい。

本発明で用いる抗ＸＤＰ抗体は、後述する実施例に示すような公知の免疫学的分析方法により、ＸＤＰ、フィブリノゲン及びそのプラスミン分解産物であるフラグメントＸ、フラグメントＹ、フラグメントＤ_１、及びフラグメントＥ_３、ＤＤ／Ｅモノマーを解離させたフラグメントＤＤ並びにフラグメントＥ_１及びフラグメントＥ_２との反応性を確認することにより取得することができる。

また、本発明で用いる抗ＸＤＰ抗体は、フラグメントＥ_１及び／又はフラグメントＥ_２（すなわち、フラグメントＥ_１若しくはフラグメントＥ_２のいずれか一方、又はそれらの混合物）とフラグメントＤ_１とを混合し、再構築したＤ−Ｅ−Ｄ複合体（Ｄ_１−Ｅ−Ｄ_１：図１−Ｃのｋ）参照）に対する反応性と、ＤＤ／Ｅモノマーに対する反応性に関して、Ｃａ^２＋イオン濃度の影響を確認することが好ましい。具体的には、ＤＤ／Ｅモノマーに対する反応性は、Ｃａ^２＋イオン濃度に大きな影響を受けないこと、再構築したＤ−Ｅ−Ｄ複合体に対する反応性は、Ｃａ^２＋イオン濃度に大きな影響を受け、Ｃａ^２＋イオン濃度が一定値を下回る場合に（あるいは、カルシウムキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）の存在下で）反応性が著減すること、を確認することが好ましい。

ＤＤ／Ｅモノマーと、再構築した前記Ｄ−Ｅ−Ｄ複合体との構造上の大きな違いは、ＤＤ／ＥモノマーではＤ−Ｄ間に架橋を有する点にあり、前記Ｄ−Ｅ−Ｄ複合体はＤ−Ｄ間に架橋がなく、例えば、フィブリンポリマー分解産物の特徴を表す最小単位とみなすことができる。従って、Ｄ−Ｅ−Ｄ複合体に対する反応性がＣａ^２＋イオン濃度の影響を大きく受ける抗ＸＤＰ抗体は、Ｄ−Ｄ間に架橋のないフィブリンポリマー分解産物が検体中に存在したとしても、カルシウムキレート剤の存在下では、ＤＤ／Ｅモノマーに対する反応性は維持したまま、フィブリンポリマー分解産物に対する反応性を著減することができ、結果として、より特異的なＸＤＰの測定を可能にする。

《測定方法および試薬》
本発明の測定方法は、前記の抗ＸＤＰ抗体を使用し、且つ、ＸＤＰと抗ＸＤＰ抗体との反応をカルシウムキレート剤の存在下で実施することを除けば、公知の免疫学的測定方法を使用することができる。例えば、ＸＤＰを含有する可能性のある被験試料と、抗ＸＤＰ抗体とを用意する工程、前記被験試料と抗ＸＤＰ抗体とをカルシウムキレート剤の存在下で接触させることにより免疫複合体を形成させる工程、前記免疫複合体またはそれに由来する信号を分析する工程を含むことができ、具体的には、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光免疫測定法、イムノクロマト法等が挙げられる。

凝固項目の検査においてはクエン酸ナトリウムを抗凝固剤として使用することが一般的である。日本臨床検査専門医会においても、凝固検査においては抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムの使用を推奨し、ＥＤＴＡ塩は適さないことを周知している。これは、活性型部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）等の検査において、クエン酸よりも長めの結果となるなど、検査結果に重大な影響を及ぼし正確な定量に不向きであるとされていることによる。

カルシウムキレート剤とは、中心に金属イオンを挟むような形で金属イオンと配位結合を形成する物質であり、本発明においてカルシウムを配位することのできる化合物を使用することができる。
本発明で用いることのできるカルシウムキレート剤としては、例えば、アミノポリカルボン酸系キレート剤、芳香族または脂肪族カルボン酸系キレート剤、アミノ酸系キレート剤、エーテルカルボン酸系キレート剤、ホスホン酸系キレート剤、ヒドロキシカルボン酸系キレート剤、高分子電解質（オリゴマー電解質を含む）系キレート剤、ポリアルコール、ジメチルグリオキシム等の窒素含有キレート剤、チオグリコール酸等の硫黄含有キレート剤などが挙げられる。

これらのキレート剤の形態は任意であり、酸系キレート剤の場合には、フリーの酸型であっても、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩の形であってもよい。さらに、それらは、加水分解可能なそれらのエステル誘導体の形であってもよい。

アミノポリカルボン酸系キレート剤としては、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミンジ酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジヒドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＤＨＥＤＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、β−アラニンジ酢酸、シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸、イミノジ酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノジ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミントリ酢酸、グリコールエーテルジアミンテトラ酢酸、グルタミン酸ジ酢酸、アスパラギン酸ジ酢酸、メチルグリシンジ酢酸、イミノジコハク酸、セリンジ酢酸、ヒドロキシイミノジコハク酸、ジヒドロキシエチルグリシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸、ならびにこれらの塩類およびエステル類など誘導体が挙げられる。

芳香族または脂肪族カルボン酸系キレート剤としては、例えば、グリオキシル酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、セバシン酸、アゼライン酸、イタコン酸、アコニット酸、ピルビン酸、グルコン酸、ピロメリット酸、ベンゾポリカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、サリチル酸、アセチルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸（アントラニル酸を含む）、フタル酸、フマル酸、トリメリット酸、没食子酸、およびヘキサヒドロフタル酸、ならびにこれらの塩類および誘導体が挙げられる。

アミノ酸系キレート剤としては、例えば、グリシン、セリン、アラニン、リジン、シスチン、システイン、エチオニン、チロシン、およびメチオニン、ならびにこれらの塩類および誘導体が挙げられる。

エーテルカルボン酸系キレート剤としては、カルボキシメチルタルトロン酸（ＣＭＴ）、カルボキシメチルオキシコハク酸（ＣＭＯＳ）などのエーテルカルボン酸塩、カルボキシメチルタルトロネート、カルボキシメチルオキシサクシネート、オキシジサクシネート、酒石酸モノサクシネート、および酒石酸ジサクシネート、ならびにこれらの塩類および誘導体が挙げられる。

ホスホン酸系キレート剤としては、例えば、イミノジメチルホスホン酸、アルキルジホスホン酸、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸およびフィチン酸、ならびにこれらの塩類および誘導体が挙げられる。

ヒドロキシカルボン酸系キレート剤としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、グリコール酸、グルコン酸、ヘプトン酸、酒石酸、および乳酸、ならびにこれらの塩類および誘導体が挙げられる。

高分子電解質（オリゴマー電解質を含む）系キレート剤としては、例えば、アクリル酸重合体、無水マレイン酸重合体、α−ヒドロキシアクリル酸重合体、イタコン酸重合体、これらの重合体の構成モノマー２種以上からなる共重合体およびエポキシコハク酸重合体が挙げられる。

ポリアルコールとしては、エチレングリコール、ピロカテコール、ピロガロール、ビスフェノール、およびタンニン酸、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。

特に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン、ジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジヒドロキシエチレングリシン、トリエタノールアミン、ヒドロキシエチレンジアミン四酢酸、カルボキシメチルタルトロン酸（ＣＭＴ）、カルボキシメチルオキシコハク酸（ＣＭＯＳ）、ＢＡＰＴＡ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＣｙＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ（ＥＧＴＡ）、ＨＩＤＡ、ＩＤＡ、ＮＴＰＯ、ＴＴＨＡ、ＴＰＥＮ、ビピリジン、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテルなどが好ましい。

また、キレート剤は１種の化合物から構成されていてもよいし、２種以上の化合物を組み合わせて使用してもよい。

キレート剤の含有量は、そのキレート能力を考慮して適宜設定することができるが、本発明の測定方法において、ＸＤＰと抗ＸＤＰ抗体との反応系におけるカルシウムキレート剤の濃度は、ＥＤＴＡを例にした場合には、抗原抗体反応時に好ましくは０．０１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．２〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．２〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。ＥＤＴＡ下限濃度は０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度であればよい。なお、好ましくは、０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、更に好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より更に好ましくは０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、最も好ましくは０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。ＥＤＴＡ濃度に上限は無く、当業者であれば適宜設定することが可能であるが、抗ＸＤＰ抗体の反応に影響の出ない範囲で設定することが好ましい。なお、前記の各下限と各上限は、所望により、任意に組み合わせることができる。

カルシウムは血液凝固において重要な役割を果たしているイオンであり、Ｄドメインに２箇所、Ｅドメインに１箇所、カルシウム結合部位が存在することが報告されているが、本発明者らの検討の結果、フィブリンポリマー上のカルシウムがキレートされて存在しなくなるため、フィブリンポリマーの構造が変化することで、その反応性も変化するものと考えられた。

本発明の測定試薬は、前記の抗ＸＤＰ抗体と、カルシウムキレート剤を含むこと以外は、公知の免疫学的測定試薬と同様の構成とすることができる。抗ＸＤＰ抗体及びカルシウムキレート剤に加えて、例えば、緩衝液、増感剤、界面活性剤、無機塩などを適宜添加することができる。

試薬形態も、第一試薬と第二試薬からなる２試薬系からなる試薬形態の他、１試薬からなる試薬形態であってもよい。好ましくは測定精度の観点などから第一試薬と第二試薬からなる２試薬系が好く、以下に、ラテックス凝集反応法に基づく測定試薬について例示する。
第一試薬は緩衝液からなり、第二試薬は抗体感作ラテックス粒子からなり、増感剤、界面活性剤、無機塩などを適宜添加することができる。好ましい例としては、第一試薬は緩衝液、増感剤、及び無機塩からなり、第二試薬は抗体感作ラテックス粒子からなる試薬が挙げられる。カルシウムキレート剤は、第一試薬または第二試薬のいずれかに、あるいは、第一試薬および第二試薬の両方に添加することができるが、第一試薬に添加することが好ましい。
試薬中のカルシウムキレート剤の濃度は、例えば、試薬構成、添加順、添加容量などに応じて変動するが、ＸＤＰと抗ＸＤＰ抗体との反応系において前記濃度範囲となるように、適宜決定することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：フィブリン／フィブリノゲン分解産物の調製》
架橋化フィブリン分解産物（ＸＤＰ）は最小単位であるＤＤ／Ｅが整数ｎ個連なった構造（ＤＤ／Ｅ）ｎを持つ。以下の実施例では、ｎ≧２のＸＤＰを高分子ＸＤＰ、ｎ＝１のＸＤＰをＤＤ／Ｅと表記した。高分子ＸＤＰ、ＤＤ／Ｅは、主にStephanie A.OlexaとAndrei Z.Budzynskiの方法（1978）、Circulation,Suppl.58,119,Olexa et al.の方法（1979）、およびBiochim.Biophys.Acta 576,39〜50に準じて行った。ヒトフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories社）に、ウシトロンビン（持田製薬社）および塩化カルシウムを加え、３７℃２時間反応させフィブリノーゲンをフィブリンに変換させた。これを遠心分離し、フィブリンを非凝固性物質から分離した。フィブリンは塩化カルシウムを含むトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８に浮遊させた。３７℃環境下で浮遊液にヒトプラスミン（Chromogenix社）を添加した。アプロチニン（Pentapharm.社）を加えて分解反応を停止させた後、リジンセファロースカラムを通過させプラスミンを除去した。この通過液は分子量の異なる高分子ＸＤＰとＤＤ／Ｅ混合物である。次に塩化カルシウムを含むトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５（溶液Ａ）で平衡化したセファクリルＳ−３００（S-300）カラムに先に得られた通過液を、溶液Ａで展開する分子ふるいクロマトグラフィーによって分画した。この分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動法、ウェスタンブロット法によって高分子ＸＤＰとＤＤ／Ｅ分画を同定、分離した。

ヒトフィブリノゲン分解産物（Ｘ、Ｙ、Ｄ_１、Ｅ_３）は、ヒトフィブリノーゲン（Enzyme Research Laboratories社）に塩化カルシウムを加えた後、ヒトプラスミン（Chromogenix社）を添加し、３７℃２時間反応させた。反応停止は、アプロチニン（Pentapharm.社）を加えることで行った。反応を停止させた後の生成物は、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファクリルＳ−３００（S-300）カラムに充填し、ゲルろ過法により、フラグメントＸ、フラグメントＹ、フラグメントＤ_１、フラグメントＥ_３を分画した。
ＤＤ分画（ＤＤ）及びＥ_１＋２分画（Ｅ_１とＥ_２の混合物：Ｅ_１＋２）の調製は、上述で得られたＤＤ／Ｅを、３ｍｏｌ／Ｌ尿素−５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸（ｐＨ５．５）溶液中で３７℃４時間保温した。次に５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）−２８ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム−０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液で平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂのカラムに充填し、上記の溶液で展開した。分画したフラグメントＤＤおよびフラグメントＥ_１及びフラグメントＥ_２をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動法、ウェスタンブロット法によって同定、分離した。ウシ及びヒツジのＤＤ／Ｅ及びＤ_１も同様に調製した。ヒトＤ_３の調製はVaradi A. and Scheraga H.A.の方法（Biochemistry 25: 519-28, 1986）に準じて行った。諸分画の模式図を図１−Ａ〜図１−Ｃに示す。

これらの諸分画は基本的に０．９％ＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液ｐＨ８．０（以下、ＴＢＳと記す）に懸濁した。各分解産物の純度は、還元・非還元条件でのウエスタンブロッティング、ＨＰＬＣによって確認し、各分画のタンパク質量は，２８０ｎｍにおける分子吸光係数から定めた（桜井ら、日本検査血液学会誌16：128-135，2015）。

《実施例２：モノクローナル抗体の作製》
モノクローナル抗体は、ヒトＤＤ／Ｅを免疫原として、KohlerとMilsteinの方法（Nature 256: 495-7, 1975.）で作製した。抗マウスＩｇＧを固相した９６穴マイクロプレートに、限界希釈法を用いてクローニングしたハイブリドーマの培養上清を分注した。ＤＤ／Ｅに反応し、フィブリノゲン及びフィブリノゲン分解産物（Ｘ、Ｙ、Ｄ_１、Ｅ_３）に反応しない抗体（ＭＩＦ−２２０）を選択した。

《実施例３：ＭＩＦ−２２０抗体のエピトープの解析》
（１）ＥＬＩＳＡによるフィブリン／フィブリノゲン分解産物に対する反応性解析
ＭＩＦ−２２０抗体溶液を９６穴マイクロプレートに分注し、１時間以上室温で静置し、０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート含有０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．０（以下、Ｔ−ＰＢＳと記す）で洗浄し、０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴ−ＰＢＳでブロックした。各種抗原を各ウエルに分注後、室温で１時間静置した。次いで、Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、０．３％ＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳで５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトフィブリノゲン抗体を加え、室温に１時間静置し、Ｔ−ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）試薬を加え、発色を４５０ｎｍで測定した。なお、吸光度が０．２を超える抗原に対して、反応性ありと判断した。
結果を表１−Ａに示す。

ＭＩＦ−２２０抗体は、ＸＤＰ（高分子ＸＤＰ及びＤＤ／Ｅ）とは反応したが、フィブリノゲン及びその分解産物である個々のＸ、Ｙ、Ｄ_１、Ｅ_３とは反応しなかった。また、ＤＤ／Ｅを尿素によって解離させ、単離したＤＤ、Ｅ_１＋２とは反応しなかったが、ＤＤとＥ_１＋２の混合物（再構築物）とは反応した。

（２）ウエスタンブロッティングによる解析
フィブリノゲン、高分子ＸＤＰ、ＤＤ／Ｅ、ＤＤ，Ｅ_１＋２、Ｘ、Ｙ、Ｄ_１、Ｅ_３各々をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写後、各抗原に対するＭＩＦ−２２０抗体あるいは抗ヒトフィブリノゲン抗体との反応性を測定した。

これらの抗原を非還元条件下のウエスタンブロッティングにて抗体の反応性を検討したところ、ＭＩＦ−２２０抗体はいずれの抗原とも反応しなかった。また，ＳＤＳ非存在下で行ったウエスタンブロッティングにおいても、前述の各抗原と反応しなかった。

《実施例４：ＭＩＦ−２２０抗体のＤ−Ｅ−Ｄ複合体に対する反応性》
（１）Ｅ−Ｄ結合の再構築による解析（Ｄ_１とＥに対する反応性）
ＴＢＳに懸濁したヒトＤ_１とヒトＥ_１＋２又はヒトＥ_３とを混合し、３７℃で３０分間反応させてＥ−Ｄ結合を再構築し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラム（ＧＥヘルスケア）にて分画を行い、ＤＤ／Ｅ、Ｄ_１、Ｅ_１＋２の保持時間と比較した。また、抗体との反応性をＥＬＩＳＡで評価した。他の動物種由来の分画についても、同様に検討した。

ＭＩＦ−２２０抗体のＤ−Ｅ−Ｄ複合体に対する反応性をＥＬＩＳＡで検討した結果を、表１−Ｂに示す。
ＭＩＦ−２２０抗体は、Ｄ_１、Ｅ_１＋２、Ｅ_３各々とは反応しなかったが、Ｄ_１とＥ_１＋２との混合物（再構築物）とは反応した。しかし、Ｄ_１とＥ_３との混合物（再構築物）とは反応しなかった。

ヒトＤ_１とヒトＥ_１＋２との混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムで分画したところ、図２−Ａに示すように、新たにピークＡ及びＢを認めた。ピークＡの保持時間は、ＤＤ／Ｅの保持時間とほぼ一致し、ピークＢの保持時間はＤＤ／ＥとＤ_１との中間となった。一方、ヒトＤ_１とヒトＥ_３の混合物には、図２−Ｂに示すように、新たなピークは認められなかった。

（２）ヒト、ウシ、又はヒツジのＤ_１とヒトＥ_１＋２との反応性
ＭＩＦ−２２０抗体と各種哺乳動物のＤＤ／Ｅとの反応性について、あるいは、ヒト、ウシ、又はヒツジのＤ_１とヒトＥ_１＋２との反応性について、ＥＬＩＳＡで評価した結果を表２に示す。
ＭＩＦ−２２０抗体はヒトＤＤ／Ｅとは反応したが、ウシ又はヒツジＤＤ／Ｅとは反応しなかった。一方、ヒトＥ_１＋２をヒト、ウシ、又はヒツジＤ_１と混合したところ、ＭＩＦ−２２０抗体はいずれの混合物とも反応した。なお、表中では、ヒト（human）抗原にはhを、ウシ（bovine)抗原にはbを、ヒツジ（ovine）抗原にはoを冠した。

ウシＤ_１とヒトＥ_１＋２との混合物、あるいは、ヒツジＤ_１とヒトＥ_１＋２との混合物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラムで分画した結果を、それぞれ、図３−Ａ、図３−Ｂに示す。
ヒトＤ_１とヒトＥ_１＋２との混合物の場合（図２−Ａ）と同様に、ピークＡ及びＢに相当する２つの新たなピークが出現し、ヒトＥ_１＋２は、ウシ又はヒツジ由来のＤ_１と動物種の違いを超えてＤ−Ｅ−Ｄ複合体を形成していることを確認した。

《実施例５：ＤＤ／ＥとＤ−Ｅ−Ｄ複合体に対する反応性のＣａ^２＋依存性の解析》
ヒトＤＤ／Ｅ、あるいは、図２−ＡにおけるピークＡで得たヒトＤ−Ｅ−Ｄ複合体０．３μｇ／ｍＬをＣａ^２＋濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＥＤＴＡ濃度０．２ｍｍｏｌ／Ｌの緩衝液に懸濁し、固相化ＭＩＦ−２２０抗体と反応させ、ＥＬＩＳＡにより検出した。結果を図４に示す。

ヒトＤＤ／Ｅの反応性はＣａ^２＋濃度、ＥＤＴＡ濃度に大きな影響を受けなかったが、Ｄ−Ｅ−Ｄ複合体ではＣａ^２＋濃度が２ｍｍｏｌ／Ｌでの反応性はＤＤ／Ｅとほぼ同等であったが、Ｃａ^２＋濃度が２ｍｍｏｌ／Ｌ未満においてＤ−Ｅ−Ｄ複合体の反応性は著減し、ＥＤＴＡ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上で反応性はほぼブランクのレベルとなった。

これまでの解析から、ヒトＤＤ／Ｅを免疫原として取得したモノクローナル抗体ＭＩＦ−２２０モノクローナル抗体は、架橋化フィブリン分解産物ＸＤＰとは反応するが、フィブリノゲン及びフィブリノゲン分解産物（Ｘ、Ｙ、Ｄ_１、Ｅ_３）とは反応しないことから、ＸＤＰ：（ＤＤ／Ｅ）ｎに特徴的な構造を認識する抗体であることが示された。ＸＤＰの最小単位であるＤＤ／Ｅ（図１−Ｃのｅ）をＤＤ（図１−Ｃのｆ）とＥ_１＋２（図１−Ｃのｇ）に解離させると、各々に対する反応性が消失すること、かつ、ウエスタンブロッティングではＸＤＰ及びフィブリノゲン分解産物のいずれの抗原とも反応しないことから、ＭＩＦ−２２０抗体はＥ−Ｄ結合によって生ずる立体構造を認識する抗体であることが示された。

ＤＤとＥ_１＋２とを混合すると、再びＥ−Ｄ結合してＤＤ／ＥとなることはOlexaらによって報告されており、本検討でＤＤの代わりにＤ_１を用いても同様にＥ−Ｄ結合を再構築できることが示された（図２−Ａ）。ＤＤ／Ｅの保持時間を参照することで，図２−Ａで示すピークＡはＤ−Ｅ−Ｄの構造（図１−Ｃのｋ）、ピークＢはＤ−Ｅの構造（図１−Ｃのｌ）をとるものと考えた。一方、同じ著者の報告でＥ_３はＤＤと結合しないことが示されており、本検討でも図２−Ｂに示されるようにＥ−Ｄ結合は見られなかった（図１−Ｃのｈに示すとおり、Ｅ_３上にＡ反応基もＢ反応基も存在しないため、Ｄ_１と混合してもＤ−Ｅ−Ｄ複合体、Ｄ−Ｅ複合体が生成されないため、ＭＩＦ−２２０抗体と反応しなかった）。

ＭＩＦ−２２０抗体のエピトープがＤ領域とＥ領域のどちらに存在するかを調べるために、ヒト、ウシ、及びヒツジのＤＤ／Ｅ、ヒト、ウシ、及びヒツジのＤ_１とヒトＥ_１＋２を用いてＥ−Ｄ結合の再構築を検討した。ヒト、ウシ、及びヒツジのＤ_１とヒトＥ_１＋２はいずれの組み合わせでもＤ−Ｅ−Ｄ複合体が生成されたことから（図２−Ａ、図３−Ａ、図３−Ｂ）、Ｅ−Ｄ結合は種差によらないことが確認できた。しかし、ＭＩＦ−２２０抗体は、ヒトＥ_１＋２とヒト、ウシ、及びヒツジＤ_１を混合した場合は反応するが、ウシ及びヒツジＤＤ／Ｅとは反応しないことから、ＭＩＦ−２２０抗体の反応にはヒトＥ領域が重要であることが示された（表２）。以上の結果から、ＭＩＦ−２２０はトロンビンの作用を受け、Ｅ−Ｄ結合によってヒトＥ領域上に新たに顕われた立体構造を認識する抗体であることが示された。

同一タンパク質量においてＣａ^２＋存在下ではＤＤ／Ｅ、Ｄ−Ｅ−Ｄ複合体のＭＩＦ−２２０抗体に対する反応性はほぼ同一であったが、ＥＤＴＡ存在下ではＤ−Ｅ−Ｄ複合体に対する反応性はＤＤ／Ｅに比べて著減した。図１−Ｃのｅ、ｋに示されるようにＤＤ／ＥとＤ−Ｅ−Ｄの違いはＤとＤの間の架橋構造であり、ＤＤ／Ｅの場合、架橋によりＣａ結合部位のＣａ結合力がＤ−Ｅ−Ｄ複合体に比べ強いものと考察した。
本発明においてはキレート剤を２段階で使用することができる。例えば、採血時に必要となるキレート剤としてはクエン酸等を使用し、ＸＤＰ測定時においては採血時とは異なるキレート剤を使用する、或いは異なる濃度で測定を行うことができる。特に、試薬においてキレート剤を添加してカルシウムの影響を小さくすることによって抗体の特異性をあげ正確な測定が可能となることを見出したものである。

ＤＤ／ＥはＸＤＰを構成する最小単位（図１−Ｂのｄ、図１−Ｃのｅ）であり、Ｄ−Ｅ−Ｄ複合体はフィブリンポリマー分解産物の特徴を表す最小の構造（図１−Ａのｃ）であるが、ＭＩＦ−２２０抗体のＤ−Ｅ−Ｄ複合体に対する反応性を抑制することにより、本抗体をＸＤＰ検出に臨床応用することが可能と考えた。

本発明の測定試薬および測定方法は、例えば、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の診断マーカーとして有用な架橋化フィブリンのプラスミン分解産物（ＸＤＰ）の測定に利用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

（１）架橋化フィブリンのプラスミン分解産物（ＸＤＰ）と反応し、フィブリノゲン及びそのプラスミン分解産物であるフラグメントＸ、フラグメントＹ、フラグメントＤ_１、及びフラグメントＥ_３と反応しない抗ＸＤＰ抗体、及び
（２）カルシウムキレート剤
を含む、架橋化フィブリンのプラスミン分解産物の測定試薬。
（１）架橋化フィブリンのプラスミン分解産物（ＸＤＰ）を含有する可能性のある被験試料と、抗ＸＤＰ抗体とを用意する工程、
（２）前記被験試料と抗ＸＤＰ抗体とを接触させることにより免疫複合体を形成させる工程、
（３）前記免疫複合体またはそれに由来する信号を分析する工程
を含む、架橋化フィブリンのプラスミン分解産物の免疫学的測定方法であって、
前記抗ＸＤＰ抗体が、ＸＤＰと反応し、フィブリノゲン及びそのプラスミン分解産物であるフラグメントＸ、フラグメントＹ、フラグメントＤ _１、及びフラグメントＥ _３と反応しない抗体であり、
ＸＤＰと抗ＸＤＰ抗体との接触をカルシウムキレート剤の存在下で実施する、前記免疫学的測定方法。