KR20180115307A

KR20180115307A - 가교화 피브린 분해 산물의 측정 시약 및 측정 방법

Info

Publication number: KR20180115307A
Application number: KR1020187027283A
Authority: KR
Inventors: 유타카 나가하마; 준코 노자키; 조지 사쿠라이
Original assignee: 가부시키가이샤 엘에스아이 메디엔스
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2018-10-22
Also published as: EP3421996A1; US20190265257A1; RU2742279C2; EP3421996A4; KR102589054B1; RU2018133469A3; CN108700570B; BR112018017170A2; JPWO2017146119A1; CN108700570A; JP6770571B2; WO2017146119A1; RU2018133469A

Abstract

가교화 피브린의 플라스민 분해 산물(XDP)의 보다 정확한 측정을 가능하게 하는 시약 및 방법을 제공한다.
본 발명의 측정 시약은, (1)가교화 피브린의 플라스민 분해 산물(XDP)과 반응하여, 피브리노겐 및 그 플라스민 분해 산물인 프래그먼트X, 프래그먼트Y, 프래그먼트D₁, 및 프래그먼트E₃와 반응하지 않는 항XDP 항체, 및 (2)칼슘킬레이트제를 포함한다.

Description

가교화 피브린 분해 산물의 측정 시약 및 측정 방법

본 발명은, 가교화 피브린의 플라스민 분해 산물의 측정 시약 및 측정 방법에 관한 것이다.

혈중에 가교화 피브린 분해 산물(cross-linked fibrin degradation products:XDP)이 검출되는 것은 혈전이 용해된 것을 의미하며, 그 측정은 전신성의 응고 활성화와 선용(線溶) 활성화가 확인되는 파종성혈관내응고증후군(disseminated intravascular coagulation: DIC)의 진단에 널리 이용되고 있다. 한편, 국소적인 혈관 내 혈전 형성과 한정된 선용 활성화를 동반하는 심부정맥혈전증(deep vein thrombosis: DVT)의 제외 진단에도 이용되게 되어, XDP 측정계에 요구되는 측정범위는 저농도로부터 고농도까지 광범위화 되는 경향이 있다.

XDP를 인식하는 항체로는, 특허문헌 1과 같은 항체가 알려져 있다. 이 항체는, XDP(D다이머)이외의 프래그먼트와는 반응성을 갖지 않으므로, XDP의 정확한 측정이 기대된다. 또한, 이 항체는 그 반응성 등으로부터, 항체의 인식 부위는 E-D 결합하고있는 XDP의 D 도메인 및/또는 E 도메인 상에 있다고 여겨지고, XDP의 정확한 측정에는 E-D 결합이 중요하다고 여겨지고 있다.

국제공개 제2011/125875호

한편으로, 특허문헌 1과 같은 특성을 갖는 항체를 사용하여 XDP를 측정하고자 한 경우에는, E-D 결합을 특이적으로 인식하는 항체 특유의 문제로서, 시료 중에 존재하고 있는 D 도메인에 가교구조가 없는 피브린 폴리머나 가용성 피브린(soluble fibrin: SF)까지도 인식하여 측정해버릴 가능성이 있는 것을 발견했다.

이들 피브린 폴리머나 SF와 같은 물질은, 일부 XDP와 구조 상의 유사점은 있지만, 그 유래나 성질이 전혀 다른 것이기 때문에, 피브린 폴리머나 SF를 인식해버리는 것으로 인한 위양성(僞陽性)은 큰 문제가 될 수 있다. 따라서, 가교화 피브린 분해 산물(XDP)과 피브린 폴리머나 SF와는 구별하여 측정할 필요가 있다.

본 발명자들은 검토 결과, 항체의 특성을 밝힘과 동시에, 이들을 구별하는 측정을 가능하게 하였다. 구체적으로는, E 도메인 상에 해당(該) 항체의 인식 부위가 존재하는 것, 해당 항체를 사용하여 유용한 XDP 측정을 행하기 위해서는, 칼슘 농도가 중요하다는 것을 밝혀낸 것이다.

칼슘은 혈액응고에에 있어서 중요한 역할을 하고 있는 이온이며, D 도메인에 2개소, E 도메인에 1개소, 칼슘 결합 부위가 존재하는 것이 보고되어 있으나, 본 발명자들의 검토 결과, 피브린 폴리머 상의 칼슘이 킬레이트되어서 존재하지 않게 되기 때문에, 피브린 폴리머의 구조가 변화하는 것으로, 그 반응성도 변화하는 것으로 생각되었다.

본 발명은,

[1](1)가교화 피브린의 플라스민 분해 산물(XDP)과 반응하여, 피브리노겐 및 그 플라스민 분해 산물인 프래그먼트X, 프래그먼트Y, 프래그먼트D₁, 및 프래그먼트E₃와 반응하지 않는 항XDP 항체, 및

(2)칼슘킬레이트제

를 포함하는, 가교화 피브린의 플라스민 분해 산물의 측정 시약,

[2]가교화 피브린의 플라스민 분해 산물의 측정 방법이며, XDP와 항XDP 항체와의 반응을 칼슘 킬레이트제의 존재 하에서 실시하는, 상기 측정 방법,

에 관한다.

본 발명에 의하면, XDP의 보다 정확한 측정을 가능하게 한다.

[도 1-A] a) 피브리노겐, b) 데스AA피브린모노머(デスААフィブリンモノ―マ), c) 피브린 폴리머의 구조를 모식적으로 나타낸 설명도이다.
[도 1-B] d) 가교 피브린의 구조를 모식적으로 나타낸 설명도이다.
[도 1-C] e) 가교 피브린 분해 산물(DD/E), f) DD/E를 해리 후, 단리한 DD, g) DD/E를 해리 후, 단리한 프래그먼트 E₁, E₂, h) 프래그먼트E₃, i) 프래그먼트D₁, j) 프래그먼트D₃, k) D₁-E₁-D₁, l)D₁-E₁의 구조를 모식적으로 나타낸 설명도이다.
[도 2-A] 인간 D₁과 인간 E₁₊₂와의 혼합물을 Superdex200 HR칼럼으로 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
[도 2-B] 인간 D₁과 인간 E₃와의 혼합물을 Superdex200 HR칼럼으로 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
[도 3-A] 소 D₁(bD1)과 인간 E₁₊₂(hE₁₊₂)와의 혼합물을 Superdex200 HR칼럼으로 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
[도 3-B] 양 D₁(oD1)과 인간 E₁₊₂(hE₁₊₂)와의 혼합물을 Superdex200 HR칼럼으로 분획한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
[도 4] Ca²⁺이온 또는 EDTA의 영향을 검토하기 위해서, 인간 DD/E 또는 인간 D-E-D 복합체를, 고상화(固相化) MIF-220항체와 반응시켜, ELISA에 의해 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명의 측정 시약 및 측정 방법으로는, (1) 가교화 피브린의 플라스민 분해 산물(XDP)과 반응하여, 피브리노겐 및 그 플라스민 분해 산물인 프래그먼트X, 프래그먼트Y, 프래그먼트D₁, 및 프래그먼트 E₃와 반응하지 않는 항XDP 항체, 및 (2) 칼슘킬레이트제를 사용하여, XDP와 항XDP 항체와의 반응을 칼슘 킬레이트제의 존재 하에 실시하는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에 있어서, 가교화 피브린(별칭으로서, 안정화 피브린)의 플라스민 분해 산물이란, 별칭으로서, 「D다이머」, 「D-D다이머」, 「DD/E복합체」로 불리기도 하는, 기본 단위인 DD/E 모노머, 및 그 폴리머(DD/E 폴리머, 예를 들면, DXD/YY, YXY/DXXD, DXXY/YXXD)를 의미한다.

《항XDP 항체》

본 발명에서 이용하는 항XDP 항체는,

(1) XDP와 반응하고,

(2) 피브리노겐과 반응하지 않으며,

(3) 피브리노겐의 플라스민 분해 산물, 즉, 프래그먼트X, 프래그먼트Y, 프래그먼트D₁, 및 프래그먼트E₃의 어느 것 과도 반응하지 않으며, 바람직하게는,

(4) DD/E 모노머를 해리시킨 프래그먼트, 즉, 프래그먼트DD 및 프래그먼트E₁ 및 프래그먼트E₂의 어느 것 과도 반응하지 않는다.

본 발명에서 이용하는 항XDP 항체로는, E 도메인과 D 도메인이 회합(會合)하여 처음으로 E 도메인 측에 출현하는 입체 구조를 인식하는 항체를 들 수 있다.

본 발명에서 이용하는 항XDP 항체는, 공지의 수단에 의해 얻을 수 있다. 원하는 반응성을 갖는 한 모노클로널 항체(MoAb)여도 폴리클로널 항체(PoAb)의 어느 것 이어도 좋으나, 모노클로널 항체 쪽이 바람직하다. 상기 항체로는, 항체 그 자체를 사용할 수도 있고, 항원 결합부위를 포함하는 항체 프래그먼트, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 Fv 등의 형태로 사용할 수도 있다. 이들의 항체 프래그먼트는, 정법(定法)에 의해 단백질분해효소에 의해서 소화하고, 계속해서 단백질의 분리, 정제의 정법에 따라서 얻을 수 있다.

본 발명에서 이용하는 항XDP 항체를 만들기 위한 항원으로서는, 예를 들면, DD/E 모노머 또는 DD/E 폴리머를 사용할 수 있다. DD/E 폴리머는 2~5량체를 들 수 있고, 6량체 이상이 되면 물에 녹기 어려워진다. 또한, 해당 항원은 피브리노겐으로부터 공지의 방법에 따라서 조제할 수 있다. 또한, 인간 등으로부터 정제하여 얻을 수 있고, 유전자 공학적 수법에 의해서도 얻을 수 있다. 또한 시판품을 사용하여도 좋다.

본 발명에서 이용하는 항XDP 항체는, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이 공지의 면역학적 분석 방법에 의해, XDP, 피브리노겐 및 그 플라스민 분해 산물인 프래그먼트X, 프래그먼트Y, 프래그먼트D₁, 및 프래그먼트E₃, DD/E 모노머를 해리시킨 프래그먼트DD 및 프래그먼트E₁ 및 프래그먼트E₂와의 반응성을 확인함에 의해서 취득할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용하는 항XDP 항체는, 프래그먼트E₁ 및/또는 프래그먼트E₂(즉, 프래그먼트E₁ 또는 프래그먼트E₂의 어느 한 쪽, 또는 그들의 혼합물)와 프래그먼트D₁를 혼합하여, 재구축한 D-E-D 복합체(D₁-E-D₁: 도 1-C의 k)참조)에 대한 반응성과, DD/E 모노머에 대한 반응성에 관해서, Ca²⁺ 이온농도의 영향을 확인하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, DD/E 모노머에 대한 반응성은, Ca²⁺ 이온농도에 큰 영향을 받지 않는 것, 재구축한 D-E-D 복합체에 대한 반응성은, Ca²⁺ 이온농도에 큰 영향을 받아, Ca²⁺ 이온농도가 일정치를 밑돌 경우에(혹은, 칼슘 킬레이트제(예를 들면, EDTA)의 존재 하에서) 반응성이 저감하는 것을 확인하는 것이 바람직하다.

DD/E 모노머와, 재구축한 상기 D-E-D 복합체와의 구조 상의 큰 차이는, DD/E 모노머에서는 D-D 간에 가교를 갖는 점에 있으며, 상기 D-E-D 복합체는 D-D 간에 가교가 없고, 예를 들면, 피브린 폴리머 분해 산물의 특징을 나타내는 최소 단위로 간주할 수 있다. 따라서, D-E-D 복합체에 대한 반응성이 Ca²⁺ 이온농도의 영향을 크게 받는 항XDP 항체는, D-D 간에 가교가 없는 피브린 폴리머 분해 산물이 검체 중에 존재했다고 해도, 칼슘 킬레이트제의 존재 하에서는, DD/E 모노머에 대한 반응성은 유지한 채, 피브린 폴리머 분해 산물에 대한 반응성을 저감할 수 있고, 결과로서, 보다 특이적인 XDP의 측정을 가능하게 한다.

《측정 방법 및 시약 》

본 발명의 측정 방법은, 상기의 항XDP 항체를 사용하며, 또한, XDP와 항XDP 항체와의 반응을 칼슘 킬레이트제의 존재 하에서 실시하는 것을 제외하면, 공지의 면역학적 측정 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, XDP를 함유할 가능성이 있는 피험 시료와, 항XDP 항체를 준비하는 공정, 상기 피험시료와 항XDP 항체를 칼슘 킬레이트제의 존재 하에서 접촉시키는 것에 의해 면역복합체를 형성시키는 공정, 상기 면역복합체 또는 그 것에서 유래하는 신호를 분석하는 공정을 포함할 수 있으며, 구체적으로는, 면역비탁법(TIA), 효소면역측정법(EIA), 방사면역측정법(RIA), 라텍스 응집 반응법, 형광면역측정법, 면역크로마토(イムノクロマト)법 등을 들 수 있다.

응고 항목의 검사에 있어서는 구연산 나트륨을 항응고제로서 사용하는 것이 일반적이다. 일본임상검사전문의회에 있어서도, 응고검사에 있어서는 항응고제로서 구연산 나트륨의 사용을 권장(推奬)하고, EDTA염은 적합하지 않은 것을 주지하고 있다. 이는, 활성형 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT), 프로트롬빈 시간(PT)등의 검사에 있어서, 구연산보다도 긴 결과가 되는 등, 검사결과에 중대한 영향을 미치고 정확한 정량에 부적격하다고 여겨지고 있는 것에 따른 것이다.

칼슘 킬레이트제란, 중심에 금속이온을 끼우는 듯한 모양으로 금속이온과 배위결합을 형성하는 물질이며, 본 발명에 있어서 칼슘을 배위할 수 있는 화합물을 사용할 수 있다.

본 발명에서 이용할 수 있는 칼슘 킬레이트제로서는, 예를 들면, 아미노폴리카복실산(アミノポリカルボン酸)계 킬레이트제, 방향족 또는 지방족 카복실산계 킬레이트제, 아미노산계 킬레이트제, 에테르카복실산계 킬레이트제, 포스폰산계 킬레이트제, 히드록시카복실산계 킬레이트제, 고분자전해질(올리고머 전해질을 포함)계 킬레이트제, 폴리알코올, 디메틸-글리옥심 등의 질소 함유 킬레이트제, 티오글리콜산 등의 황 함유킬레이트제등을 들 수 있다.

이들의 킬레이트제의 형태는 임의이며, 산계 킬레이트제의 경우에는, 자유의 산형이어도, 나트륨염, 칼륨염, 암모늄염 등의 염의 형태여도 좋다. 또한, 그들은, 가수분해 가능한 그들의 에스테르 유도체의 형태여도 좋다.

아미노폴리카복실산계 킬레이트제로서는, 예를 들면, 에틸렌디아민테트라초산(EDTA), 에틸렌디아민디초산, 히드록시에틸에틸렌디아민삼초산(HEDTA), 디히드록시에틸에틸렌디아민사초산(DHEDDA), 니트릴로산초산(NTA), 히드록시에틸이미노이초산(HIDA), β-알라닌디초산, 시클로헥산디아민테트라초산, 니트릴로트리초산, 이미노디초산, N-(2-히드록시에틸)이미노디초산, 디에틸렌트리아민펜타초산, N-(2-히드록시에틸)에틸렌디아민트리초산, 글리콜에테르디아민테트라초산, 글루타민산디초산, 아스파라긴산디초산, 메틸글리신디초산, 이미노디숙신산, 세린디초산, 히드록시이미노디숙신산, 디히드록시에틸글리신, 아스파라긴산, 및 글루타민산, 및 이들의 염류 및 에스테르류 등의 유도체를 들 수 있다.

방향족또는 지방족카복실산계 킬레이트제로서는, 예를 들면, 글리옥실산, 옥살산(シュウ酸), 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 세바스산, 아젤라산, 이타콘산, 아코니트산, 피루브산, 글루콘산, 피로멜리틱산, 벤조폴리카복실산, 시클로펜탄테트라카복실산, 살리실산, 아세틸살리실산, 히드록시안식향산, 아미노안식향산(안트라닐산을 포함), 프탈산, 푸마르산, 트리멜리트산, 갈산(沒食子酸), 및 헥사히드로프탈산, 및 이들의 염류 및 유도체를 들 수 있다.

아미노산계 킬레이트제로서는, 예를 들면, 글리신, 세린, 알라닌, 리신, 시스틴, 시스테인, 에티오닌, 티로신, 및 메티오닌, 및 이들의 염류 및 유도체를 들 수 있다.

에테르카복실산계 킬레이트제로서는, 카르복시메틸타르트론산(CMT), 카르복시메틸옥시숙신산(CMOS) 등의 에테르카복실산염, 카르복시메틸타르트로네이트, 카르복시메틸옥시숙시네이트, 옥시디숙시네이트, 주석산모노숙시네이트, 및 주석산디숙시네이트, 및 이들의 염류 및 유도체를 들 수 있다.

포스폰산계 킬레이트제로서는, 예를 들면, 이미노디메틸포스폰산, 알킬디포스폰산, 1-히드록시에탄-1,1-디포스폰산및 피드산, 및 이들의 염류 및 유도체를 들 수 있다.

히드록시카복실산계 킬레이트제로서는, 예를 들면, 사과산, 구연산, 글리콜산, 글루콘산, 헵톤산, 주석산, 및 젖산, 및 이들의 염류 및 유도체를 들 수 있다.

고분자전해질(올리고머 전해질을 포함)계 킬레이트제로서는, 예를 들면, 아크릴산 중합체, 무수말레인산 중합체, α-히드록시아크릴산 중합체, 이타콘산 중합체, 이들의 중합체의 구성 모노머 2종 이상으로 구성되는 공중합체 및 에폭시숙신산 중합체를 들 수 있다.

폴리알코올로서는, 에틸렌글리콜, 피로카테콜, 피로갈롤, 비스페놀, 및 타닌산, 및 이들의 유도체를 들 수 있다.

특히, 에틸렌디아민사초산(EDTA), 옥살산, 구연산, 주석산, 글루콘산, 니트릴로삼초산(NTA), 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아미노오초산(DTPA), 디히드록시에틸렌글리신, 트리에탄올아민, 히드록시에틸렌디아민사초산, 카르복시메틸타르트론산(CMT), 카르복시메틸옥시숙신산(CMOS), BAPTA, Bicine, CyDTA, GEDTA(EGTA), HIDA, IDA, NTPO, TTHA, TPEN, 비피리딘, 페난트롤린, 포르피린, 크라운에테르 등이 바람직하다.

또한, 킬레이트제는 1종의 화합물로 구성되어 있어도 좋고, 2종 이상의 화합물을 조합하여 사용하여도 좋다.

킬레이트제의 함유량은, 그 킬레이트 능력을 고려하여 적절히 설정할 수 있으나, 본 발명의 측정 방법에 있어서, XDP와 항XDP 항체와의 반응계에 있어서의 칼슘 킬레이트제의 농도는, EDTA를 예로 한 경우에는, 항원항체 반응시에 바람직하게는 0.01~30mmol/L, 더 바람직하게는 0.2~30mmol/L, 더욱 바람직하게는 0.2~2mmol/L이다. EDTA 하한 농도는 0.001mmol/L이상의 농도이면 된다. 또한, 바람직하게는, 0.002mmol/L, 더 바람직하게는 0.005mmol/L 이상, 더욱 바람직하게는 0.01mmol/L이상, 더욱더 바람직하게는 0.02mmol/L이상, 0.05mmol/L이상, 가장 바람직하게는0.02mmol/L이상이다. EDTA농도에 상한은 없고, 당업자라면 적절히 설정하는 것이 가능하나, 항XDP 항체의 반응에 영향이 나타나지 않는 범위에서 설정하는 것이 바람직하다. 또한, 상기의 각 하한과 각 상한은, 원하는 바에 의해, 임의로 조합할 수 있다.

칼슘은 혈액응고에 있어서 중요한 역할을 하고 있는 이온이며, D 도메인에 2개소, E 도메인에 1개소, 칼슘 결합 부위가 존재하는 것이 보고되어 있으나, 본 발명자들의 검토 결과, 피브린 폴리머 상의 칼슘이 킬레이트되어 존재하지 않게 되기 때문에, 피브린 폴리머의 구조가 변화하는 것으로, 그 반응성도 변화하는 것으로 생각되었다.

본 발명의 측정 시약은, 상기의 항XDP 항체와, 칼슘 킬레이트제를 포함하는 것 이외에는, 공지의 면역학적측정 시약과 같은 구성으로 할 수 있다. 항XDP 항체 및 칼슘 킬레이트제에 더하여, 예를 들면, 완충액, 증감제, 계면활성제, 무기염 등을 적절히 첨가할 수 있다.

시약 형태도, 제 1 시약과 제 2 시약으로 이루어진 2 시약계로 구성되는 시약 형태 외에, 1 시약으로 구성되는 시약 형태여도 좋다. 바람직하게는 측정 정도(精度)의 관점 등으로부터 제 1 시약과 제 2 시약으로 이루어진 2 시약 계가 바람직하며, 이하에, 라텍스 응집 반응법에 근거하여 측정 시약에 대해서 예시한다.

제1 시약은 완충액으로 이루어지며, 제 2 시약은 항체 감작(感作) 라텍스 입자로 이루어지고, 증감제, 계면활성제, 무기염 등을 적절히 첨가할 수 있다. 바람직한 예로서는, 제 1 시약은 완충액, 증감제, 및 무기염으로 이루어지며, 제 2 시약은 항체 감작 라텍스 입자로 이루어지는 시약을 들 수 있다. 칼슘 킬레이트제는, 제 1 시약 또는 제 2 시약의 어느 것에, 혹은, 제 1 시약 및 제 2 시약의 양쪽에 첨가할 수 있으나, 제 1 시약에 첨가하는 것이 바람직하다.

시약 중의 칼슘 킬레이트제의 농도는, 예를 들면, 시약 구성, 첨가 순서, 첨가 용량 등에 응하여 변동하지만, XDP와 항XDP 항체와의 반응계에 있어서 상기 농도범위가 되도록, 적절히 결정할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

《실시예1: 피브린/피브리노겐분해 산물의 조제》

가교화 피브린 분해 산물(XDP)은 최소단위인 DD/E가 정수 n개 늘어선 구조 (DD/E)n을 갖는다. 이하의 실시예에서는, n≥2의 XDP를 고분자 XDP, n=1의 XDP를 DD/E라고 표기하였다. 고분자 XDP, DD/E는, 주로 Stephanie A.Olexa와 Andrei Z.Budzynski의 방법(1978), Circulation,Suppl.58,119,Olexa et al.의 방법(1979), 및 Biochim.Biophys.Acta 576,39~50에 준하여 행하였다. 인간 피브리노겐(Enzyme Research Laboratories사)에, 소 트롬빈(모치다제약(持田製藥)사) 및 염화칼슘을 가해, 37℃ 2시간 반응시켜 피브리노겐을 피브린으로 변환시켰다. 이를 원심분리하여, 피브린을 비응고성 물질로부터 분리하였다. 피브린은 염화칼슘을 포함한 트리스염산완충액 pH7.8에 부유시켰다. 37℃ 환경 하에서 부유액에 인간 플라스민(Chromogenix사)을 첨가하였다. 아프로티닌(アプロチニン)(Pentapharm.사)를 더하여 분해반응을 정지시킨 후, 리신세파로오스(リジンセファロ―ス)칼럼을 통과시켜 플라스민을 제거하였다. 이 통과액은 분자량이 다른 고분자 XDP와 DD/E 혼합물이다. 다음으로 염화칼슘을 포함한 트리스염산완충액 pH7.5(용액A)으로 평형화한 세파크릴(セファクリル) S-300(S-300)칼럼에 앞서 얻은 통과액을, 용액A로 전개하는 분자체크로마토그래피(分子ふるいクロマトグラフィ―)에 의해서 분획하였다. 이 분획을 SDS-PAGE에 의한 전기영동법, 웨스턴 블롯법에 의해 고분자 XDP와 DD/E 분획을 동정, 분리하였다.

인간 피브리노겐 분해 산물(X, Y, D₁, E₃)은, 인간 피브리노겐(Enzyme Research Laboratories사)에 염화칼슘을 가한 뒤, 인간 플라스민(Chromogenix사)을 첨가하여, 37℃ 2시간 반응시켰다. 반응정지는, 아프로티닌(Pentapharm.사)을 가하는 것으로 행해졌다. 반응을 정지시킨 뒤의 생성물은, 트리스염산완충액(pH7.5)으로 평형화한 세파크릴S-300(S-300)칼럼에 충전하고, 겔 여과법에 의해, 프래그먼트X, 프래그먼트Y, 프래그먼트D₁, 프래그먼트E₃을 분획하였다.

DD분획(DD) 및 E₁₊₂분획(E₁과 E₂의 혼합물: E₁₊₂)의 조제는, 상술에서 얻은 DD/E를, 3mol/L 요소-50mmol/L 구연산(pH5.5)용액 중에서 37℃ 4시간 보온하였다. 다음으로 50mmol/L 트리스-염산완충액(pH7.4)-28mmol/L 구연산나트륨-0.1mol/L 염화나트륨 용액으로 평형화한 세파로오스CL-6B의 칼럼에 충전하고, 상기의 용액에서 전개하였다. 분획한 프래그먼트 DD및 프래그먼트 E₁ 및 프래그먼트 E₂를 SDS-PAGE에 의한 전기영동법, 웨스턴 블롯법에 의하여 동정, 분리하였다. 소 및 양의 DD/E 및 D₁도 마찬가지로 조제하였다. 인간 D₃의 조제는 Varadi A. and Scheraga H.A.의 방법(Biochemistry 25: 519-28, 1986)에 준하여 행하였다. 해당 분획의 모식도를 도 1-A~도 1-C에 나타냈다.

이들의 해당 분획은 기본적으로 0.9% NaCl을 포함하는 50mmol/L 트리스완충액 pH8.0(이하, TBS로 기재)에 현탁하였다. 각 분해 산물의 순도는, 환원·비환원조건에서의 웨스턴 블로팅, HPLC에 의해서 확인하고, 각 분획의 단백질량은,280nm에서의 분자흡광계수로부터 정하였다(사쿠라이(櫻井)들, 일본검사혈액학회지16:128-135,2015).

《실시예2: 모노클로널항체의 제작》

모노클로널항체는, 인간 DD/E를 면역원으로서, Kohler과 Milstein의 방법(Nature 256: 495-7, 1975.)으로 제작하였다. 항마우스IgG를 고상(固相)한 96웰 마이크로 플레이트에, 한계 희석법을 사용하여 클로닝한 하이브리도마(ハイブリド―マ)의 배양 상청을 분주하였다. DD/E에 반응하고, 피브리노겐 및 피브리노겐분해 산물(X, Y, D₁, E₃)에 반응하지 않는 항체(MIF-220)를 선택하였다.

《실시예3: MIF-220항체의 에피토프(エピト―プ)의 해석》

(1) ELISA에 의한 피브린/피브리노겐분해 산물에 대한 반응성 해석

MIF-220항체용액을 96웰 마이크로 플레이트에 분주하고, 1시간 이상 실온에서 정치(靜置)하고, 0.05% 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄모노라우레이트 함유 0.1mol/L 인산완충액 pH7.0(이하, T-PBS로 기재)로 세정하고, 0.3% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한 T-PBS로 블록하였다. 각종 항원을 각 웰에 분주 후, 실온에서 1시간 정치하였다. 다음으로, T-PBS로 세정 후, 0.3% BSA를 포함한 T-PBS로 5000배 희석한 과산화효소 표식 항 인간 피브리노겐항체를 가하고, 실온에 1시간 정치하고, T-PBS로 세정 후, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 시약을 가해, 발색을 450nm에서 측정하였다. 또한, 흡광도가 0.2를 넘는 항원에 대하여, 반응성 있음으로 판단하였다.

결과를 표 1-A에 나타냈다.

[표 1-A]

MIF-220항체는, XDP(고분자 XDP 및 DD/E)와는 반응하였으나, 피브리노겐 및 그 분해 산물인 개개의 X, Y, D₁, E₃과는 반응하지 않았다. 또한, DD/E를 요소에 의해서 해리시켜, 단리한 DD, E₁₊₂과는 반응하지 않았으나, DD와 E₁₊₂의 혼합물(재구축물)과는 반응하였다.

(2) 웨스턴 블로팅에 의한 해석

피브리노겐, 고분자XDP, DD/E, DD, E₁₊₂, X, Y, D₁, E₃ 각각을 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동(PAGE)에 올리고, 폴리불화비닐리덴(PVDF)막에 전사 후, 각 항원에 대한 MIF-220항체 혹은 항 인간 피브리노겐 항체와의 반응성을 측정하였다.

이들의 항원을 비환원조건 하에서 웨스턴 블로팅으로 항체의 반응성을 검토한 결과, MIF-220항체는 어느 항원과도 반응하지 않았다. 또한, SDS 비존재 하에서 행한 웨스턴 블로팅에 있어서도, 전술한 각 항원과 반응하지 않았다.

《실시예4: MIF-220항체의 D-E-D 복합체에 대한 반응성》

(1) E-D 결합의 재구축에 의한 해석(D₁과 E에 대한 반응성)

TBS에 현탁한 인간 D₁과 인간 E₁₊₂ 또는 인간 E₃을 혼합하여, 37℃에서 30분간 반응시켜서 E-D 결합을 재구축하여, Superdex200 HR칼럼(GE헬스케어(GEヘルスケア))으로 분획을 행하고, DD/E, D₁, E₁₊₂의 보지(保持)시간과 비교하였다. 또한, 항체와의 반응성을 ELISA로 평가하였다. 다른 동물 종 유래의 분획에 대해서도, 동일하게 검토하였다.

MIF-220항체의 D-E-D 복합체에 대한 반응성을 ELISA로 검토한 결과를, 표 1-B에 나타냈다.

MIF-220항체는, D₁, E₁₊₂, E₃각각과는 반응하지 않았으나, D₁과 E₁₊₂과의 혼합물(재구축물)과는 반응하였다. 그러나, D₁과 E₃과의 혼합물(재구축물)과는 반응하지 않았다.

[표 1-B]

인간 D₁과 인간 E₁₊₂과의 혼합물을 Superdex200 HR칼럼으로 분획한결과, 도 2-A에 나타낸 것과 같이, 새롭게 피크 A 및 B를 확인하였다. 피크 A의 보지시간은, DD/E의 보지시간과 거의 일치하고, 피크 B의 보지시간은 DD/E와 D₁과의 중간이 되었다. 한편, 인간 D₁과 인간 E₃의 혼합물에서는, 도 2-B에 나타낸 바와 같이, 새로운 피크는 확인되지 않았다.

(2) 인간, 소, 또는 양의 D₁과 인간 E₁₊₂과의 반응성

MIF-220항체와 각종 포유 동물의 DD/E와의 반응성에 있어서, 혹은, 인간, 소, 또는 양의 D₁과 인간 E₁₊₂과의 반응성에 있어서, ELISA로 평가한 결과를 표 2에 나타냈다.

MIF-220항체는 인간 DD/E와는 반응하였으나, 소 또는 양 DD/E와는 반응하지 않았다. 한편, 인간 E₁₊₂를 인간, 소, 또는 양 D₁과 혼합한 결과, MIF-220항체는 어느 혼합물과도 반응하였다. 또한, 표 중에서는, 인간(human)항원에는 h를, 소(bovine)항원에는 b를, 양(ovine)항원에는 o를 붙였다.

[표 2]

소 D₁과 인간 E₁₊₂과의 혼합물, 혹은, 양 D₁과 인간 E₁₊₂과의 혼합물을, Superdex200 HR칼럼으로 분획한 결과를, 각각, 도 3-A, 도 3-B에 나타냈다.

인간 D₁과 인간 E₁₊₂과의 혼합물의 경우(도 2-A)와 동일하게, 피크 A 및 B에 해당하는 2개의 새로운 피크가 출현하고, 인간 E₁₊₂는, 소 또는 양 유래의 D₁과 동물종의 차이를 넘어서 D-E-D 복합체를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

《실시예5: DD/E와 D-E-D 복합체에 대한 반응성의 Ca²⁺의존성의 해석》

인간 DD/E, 혹은, 도 2-A에서의 피크 A로 얻은 인간 D-E-D 복합체 0.3μg/mL을 Ca²⁺ 농도 2mmol/L, EDTA 농도 0.2mmol/L의 완충액에 현탁하고, 고상화(固相化) MIF-220 항체와 반응시켜, ELISA에 의해 검출하였다. 결과를 도 4에 나타냈다.

인간 DD/E의 반응성은 Ca²⁺ 농도, EDTA 농도에 큰 영향을 받지 않았으나, D-E-D 복합체에서는 Ca²⁺ 농도가 2mmol/L에서의 반응성은 DD/E와 거의 동등하였으나, Ca²⁺ 농도가 2mmol/L 미만에 있어서 D-E-D 복합체의 반응성은 저감하고, EDTA 0.2mmol/L 이상에서 반응성은 거의 공백의 수준이 되었다.

지금까지의 해석으로부터, 인간 DD/E를 면역원으로서 취득한 모노클로널항체 MIF-220 모노클로널항체는, 가교화 피브린 분해 산물 XDP와는 반응하나, 피브리노겐 및 피브리노겐분해 산물(X, Y, D₁, E₃)과는 반응하지 않는 점에서, XDP:(DD/E)n에 특징적인 구조를 인식하는 항체인 것이 나타났다. XDP의 최소단위인 DD/E(도 1-C의 e)를 DD(도 1-C의 f)와 E₁₊₂(도 1-C의 g)에 해리시키면, 각각에 대한 반응성이 소실하는 것, 또한, 웨스턴 블로팅에서는 XDP 및 피브리노겐 분해 산물의 어느 항원과도 반응하지 않는 점에서, MIF-220 항체는 E-D 결합에 의해서 생기는 입체 구조를 인식하는 항체인 것이 밝혀졌다.

DD와 E₁₊₂를 혼합하면, 다시 E-D 결합하여 DD/E가 되는 것은 Olexa들에 의해서 보고되어 있고, 본 검토에서 DD의 대신에 D₁을 이용하여도 동일하게 E-D 결합을 재구축할 수 있는 것이 밝혀졌다(도 2-A). DD/E의 보지시간을 참조하는 것으로, 도 2-A에서 나타내는 피크 A는 D-E-D의 구조(도 1-C의 k), 피크 B는 D-E의 구조(도 1-C의 l)를 취하는 것으로 생각하였다. 한편, 같은 저자의 보고에서 E₃는 DD와 결합하지 않는 것이 밝혀져 있고, 본 검토에서도 도 2-B에 나타내진 것과 같이 E-D 결합은 볼 수 없었다 (도 1-C의 h에 나타낸대로, E₃상에 A반응기도 B반응기도 존재하지 않기 때문에, D₁과 혼합하여도 D-E-D 복합체, D-E복합체가 생성되지 않기 때문에, MIF-220항체와 반응하지 않았다).

MIF-220항체의 에피토프가 D영역과 E영역의 어디에 존재하는가를 조사하기 위해서, 인간, 소, 및 양의 DD/E, 인간, 소, 및 양의 D1과 인간 E1+2을 사용하여 E-D 결합의 재구축을 검토하였다. 인간, 소, 및 양의 D1과 인간 E1+2는 어느 조합에서도 D-E-D 복합체가 생성된 것으로부터(도 2-A, 도 3-A, 도 3-B), E-D 결합은 종 차에 따르지 않는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, MIF-220 항체는, 인간 E1+2과 인간, 소, 및 양 D1을 혼합한 경우에는 반응하지만, 소 및 양 DD/E와는 반응하지 않는 것으로부터, MIF-220 항체의 반응에는 인간 E 영역이 중요한 것이 밝혀졌다(표 2). 이상의 결과로부터, MIF-220는 트롬빈의 작용을 받아, E-D 결합에 의해서 인간 E영역 상에 새롭게 나타난 입체 구조를 인식하는 항체인 것이 밝혀졌다.

동일 단백질량에 있어서 Ca²⁺ 존재 하에서는 DD/E, D-E-D 복합체의 MIF-220항체에 대한 반응성은 거의 동일하였으나, EDTA 존재 하에서는 D-E-D 복합체에 대한 반응성은 DD/E에 비해서 저감하였다. 도 1-C의 e, k에 나타내진 것과 같이 DD/E와 D-E-D의 차이는 D와 D의 사이의 가교구조이며, DD/E의 경우, 가교에 의해 Ca 결합 부위의 Ca 결합력이 D-E-D 복합체에 비해 강한 것으로 고찰하였다.

본 발명에 있어서는 킬레이트제를 2단계로 사용할 수 있다. 예를 들면, 채혈 시에 필요해지는 킬레이트제로서는 구연산 등을 사용하여, XDP 측정 시에 있어서는 채혈 시와는 다른 킬레이트제를 사용하고, 혹은 다른 농도에서 측정을 행할 수 있다. 특히, 시약에 있어서 킬레이트제를 첨가하여 칼슘의 영향을 작게 하는 것으로 인해 항체의 특이성을 높여 정확한 측정이 가능해진다는 것을 발견한 것이다.

DD/E는 XDP를 구성하는 최소단위(도 1-B의 d, 도 1-C의 e)이며, D-E-D 복합체는 피브린 폴리머 분해 산물의 특징을 나타내는 최소의 구조(도 1-A의 c)이나, MIF-220항체의 D-E-D 복합체에 대한 반응성을 억제하는 것에 의해, 본 항체를 XDP검출에 임상 응용하는 것이 가능하다고 생각하였다.

본 발명의 측정 시약 및 측정 방법은, 예를 들면, 파종성 혈관 내 응고 증후군(DIC)의 진단 마커로서 유용한 가교화 피브린의 플라스민 분해 산물(XDP)의 측정에 이용할 수 있다.

이상, 본 발명을 특정의 태양에 따라서 설명하였으나, 당업자에 자명의 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims

(1)가교화 피브린의 플라스민 분해 산물(XDP)과 반응하여, 피브리노겐 및 그 플라스민 분해 산물인 프래그먼트X, 프래그먼트Y, 프래그먼트D₁, 및 프래그먼트E₃과 반응하지 않는 항XDP 항체, 및
(2)칼슘킬레이트제
를 포함하는, 가교화 피브린의 플라스민 분해 산물의 측정 시약.
가교화 피브린의 플라스민 분해 산물의 측정 방법으로서, XDP와 항XDP 항체와의 반응을 칼슘 킬레이트제의 존재 하에서 실시하는, 상기 측정 방법.