KR101877457B1 - 신규 단클론항체 및 d 다이머의 면역학적 측정법 - Google Patents

Abstract

특이적이고 또한 정확하게 안정화 피브린 분해산물(D 다이머)을 측정할 수 있는 항체, 및 그것을 이용하는 D 다이머의 측정방법 및 측정시약을 제공한다. 상기 항체는, 안정화 피브린의 플라스민 분해산물인 D 다이머와 특이적으로 반응하나, 피브리노겐 및 그 플라스민 분해산물인 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 및 프래그먼트 E3, 또한, DD/E 모노머를 해리시킨 프래그먼트 DD 및, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2와 반응하지 않는다.

Description

신규 단클론항체 및 D 다이머의 면역학적 측정법{Novel monoclonal antibody and method for immunoassaying D dimer}

본 발명은, 안정화 피브린(フィブリン, 특히, 사람 안정화 피브린)의 플라스민(プラスミン) 분해산물(D 다이머)을 정확하게 측정하기 위한 신규의 단클론항체 및 이것을 이용한 면역학적 분석방법에 관한 것이다.

본 명세서에서의 용어「분석」에는, 분석대상물질의 존재의 유무를 판정하는 「검출」과, 분석대상물질의 양 또는 활성을 정량적 또는 반(半)정량적으로 결정하는 「측정」이 포함된다.

안정화 피브린의 각종 프로테아제(プロテア-ゼ)에 의한 분해산물은, 임상적 진단법에 있어서의 진단 마커로서 유용하다. 예를 들면, 도 1에 도시한 바와 같이, 안정화 피브린(cross-linked fibrin)의 플라스민 분해산물(별칭으로서, 예를 들면, 「D 다이머」, 「D-D 다이머」, 「DD/E 복합체」, 「XDP」라고 총칭될 수 있다), 즉, 기본 단위인 DD/E 모노머, 및 그 폴리머(DD/E 폴리머, 예를 들면, DXD/YY, YXY/DXXD, DXXY/YXXD)는, 파종성(播種性) 혈관내 응고증후군(DIC)의 진단 마커로서 광범위하게 사용되고 있다.

또한, 각종 프로테아제는, 혈액 중에 존재하는 피브리노겐도 분해할 수 있고, 예를 들면, 플라스민에 의해 D 다이머의 구성요소인 D 도메인, E 도메인을 포함하는, 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 프래그먼트 E3 등의 피브리노겐 분해산물(총칭해서 FgDP라 칭할 수 있다)이 생성될 수 있다.

따라서, 혈전증(血栓症) 환자의 혈액 중에는, 프로테아제에 의해 안정화 피브린이 분해되어 생성되는 D 다이머와, 프로테아제에 의해 피브리노겐이 분해되어 생성되는 피브리노겐 분해산물(FgDP)이 혼재하는 경우가 있다. 이 양자를 칭하여 FDP라 할 수 있다(이상, 도 1 참조).

또한, 혈전증 환자의 혈장 중의 D 다이머는, 종래, 분자량 약 23만의 DD/E 획분이 주성분이라고 판단되었으나, 최근, 실제로는 DXD/YY 획분, YXY/DXXD 획분, DXXY/YXXD 획분 등의 보다 고분자량의 다량체가 주성분인 것이 명백해졌다(비특허문헌 1 참조).

최근, 혈전 및/또는 색전에 의해 사망하는 기초질환이 증가하는 경향을 나타내고 있어, 혈전을 검출하기 위한 임상검사는 나날이 진보하고 있다. 초기에는 피브리노겐(Fbg)에 대한 다클론항체를 이용하여 혈청 중의 피브린/피브리노겐 분해산물을 측정하는 FDP의 측정이 진단에 사용되어 왔으나, 탈(脫)피브리노겐 처리 시에 이 조작이 불충분하기 때문에 잘못된 높은 수치를 나타낼 수 있는 문제가 있었다.

이에, 이 문제를 해결하기 위하여, FDP의 측정과 병행하여, 피브리노겐에 반응하지 않고, DD/E 복합체인 안정화 피브린 분해산물(D 다이머)만을 측정하는 D 다이머 시약이 필요하게 되었다.

예를 들면, D 다이머의 측정방법으로서는, D 다이머를 인식하는 단클론항체를, 라텍스 입자, 플라스틱 플레이트 등의 고상에 고정하여 D 다이머와 결합시키는 항원항체 반응에 의거하는 방법, 즉 라텍스 응집법이나 ELISA법 등이 알려져 있다(특허문헌 1).

그러나, 항원항체 반응에 의거하는 방법에 있어서, 현재 이용되고 있는 고상에 결합시키는 단클론항체는, D 다이머에 반응성을 가지는 동시에, D 다이머와 유사 구조를 가지는 프래그먼트 X 및/또는 프래그먼트 Y 및/또는 프래그먼트 D1 및/또는 프래그먼트 E3에 대한 반응성도 가지는 경우가 있다. 이와 같은 단클론항체를 이용하면, 고상에 결합된 단클론항체가 측정 시에 D 다이머 이외의 프래그먼트에도 결합되어, 정확하게 측정할 수 없는 경우가 있다.

또한, 이와 같은 문제를 해결하기 위한 이하의 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이하의 시약에 사용되고 있는 단클론항체는, D 다이머에 특이적이라고는 할 수 없다. 예를 들면, 특허문헌 2에서는, DD/E 획분(畵分)의 다량체 및 DD/E 획분의 단량체에 반응하나, X 획분, Y 획분, D 획분, E 획분에 반응하지 않고, 또한, DD/E 획분의 4량체의 반응성에 대하여, 적어도 10%의 DD/E 획분에 대한 반응성을 가지는 D 다이머 측정시약이 보고되어 있다. 그러나, 특허문헌 2에 구체적으로 거론되고 있는 DD-M1653(수탁 번호 FERM P-19687호)은, 특허문헌 3에서 DD/E 획분의 다량체 및 DD/E 획분의 단량체 및 X 획분 및 Y획분에 반응하지만, D 획분 및 E 획분에 반응하지 않는 것이 명백해져서, D 다이머에 특이적이라고는 말할 수 없다.

또한, 특허문헌 2에는, 검체 중의 D 다이머를 특이적이고 또한 정확하게 측정할 수 있는지가 나타나있지 있다. 특허문헌 3에는, 이와 같은 D 다이머에 대한 반응 특이성이 비교적 낮은 단클론항체를 이용하여도, D 다이머에 반응성을 가지는 단클론항체를 포함하는 액상시약과, D 다이머에 반응성을 가지는 단클론항체가 고정화된 담체 또는 이를 포함하는 용액을 조합하여 이루어지는 D 다이머 측정용 키트에 의해, 실제의 D 다이머의 양을 보다 정확하게 측정할 수 있는 것이 개시되어 있지만, 검체 중의 D 다이머를 간편하게, 특이적이고 또한 정확하게 측정할 수 있는 것은 아니다.

또한, 최근, 의학의 진보, 치료 및 치료제의 진보에 의해, 예를 들면, 혈전증 환자 등의 치료에 혈전용해제가 사용되게 되고, 상기와 같이 생리적 환경에서는 일어날 수 없다고 생각한 상태에서 선용(線溶)이 생겨서, 프래그먼트 D를 포함하는 피브리노겐 분해산물의 존재를 무시할 수 없게 된 것이라고 생각된다. 때문에, 특허문헌 4에서는, 피검시료 중에 프래그먼트 D가 존재하였을 경우, 라텍스 응집반응에 대하여 프래그먼트 D가 간섭하고, 본래의 응집이 억제되어, 본래의 수치보다 낮은 수치의 결과를 부여하는 것을 회피하기 위해, 피검시료 유래의 불확정한 프래그먼트 D의 영향을, 과잉량의 프래그먼트 D를 미리 인위적으로 공존시킴으로써, D 다이머를 정확하게 측정할 수 있는 것을 나타내고 있다. 그러나, 1종류의 항체의 반응 특이성만으로 검체 중의 D 다이머를 특이적이고 또한 정확하게 측정할 수 있는 것은 아니다.

이와 같이, 안정화 피브린 분해산물(D 다이머)에 특이적인 D 다이머 시약이 요구되어 왔으나, 아직, 1종류의 단클론항체를 사용하여, 특이적이고 또한 정확하게 D 다이머를 측정할 수 있는 항체나 이것을 함유하는 시약은 보고되어 있지 않다.

또한, 혈장 검체를 이용하여 FDP, D 다이머를 측정하는 것이 주류이지만, 드물게 FDP 및 D 다이머가 잘못된 높은 수치를 나타내는 것이 문제로 되고 있다. 비특허문헌 2에서는, 환자 혈장의 채혈 시에 수기(手技)에 의해 응고, 선용(線溶)이 항진(亢進)되어, FDP, D 다이머가 잘못된 높은 수치로 될 가능성이 있다는 것을 나타내고 있다.

[특허문헌 1] 일본특허공개 소 63-79900호 공보 [특허문헌 2] 일본특허공개 2006-105633호 공보 [특허문헌 3] 일본특허공개 2006-234676호 공보 [특허문헌 4] 일본특허공개 2001-21557호 공보

[비특허문헌 1] Charles W. Francis, Victor J. Marder and Grant H. Barlow ; Plasmic Degradation of Crosslinked Fibrin: CHARACTERIZATION OF NEW MACROMOLECULAR SOLUBLE COMPLEXES AND A MODEL OF THEIR STRUCTURE. J. Clin. Invest.(1980) 66(5):1033∼1043. [비특허문헌 2] 다카다 아키요시(高田章美), 마에카와 요시아키(前川芳明), 야마모토 요시카즈(山本慶和), 마쓰오 슈지(松尾收二); 혈장 검체를 이용하여 측정한 FDP및 D 다이머 잘못된 높은 수치의 원인. JJCLA.(2005) 30(5):721∼726.

본 발명은, 상기 문제에 감안해서 이루어진 것으로, 피검시료 중에 존재하는 피브리노겐 및 그 분해산물인 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 및 프래그먼트 E3에 영향을 받지 않으며, 또한, DD/E 모노머를 해리시킨 프래그먼트 DD 및, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2와 반응하지 않는 항체를 적어도 하나 사용함으로써, 특이적이고 또한 정확하게 안정화 피브린 분해산물(D 다이머)을 측정하는 방법 및 측정 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기와 같은 현재 상황에 감안해서 예의 검토를 거듭한 결과, 피검시료 중에 존재하는 피브리노겐 및 그 분해산물인 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 및 프래그먼트 E3, 또한, DD/E 모노머를 해리시킨 프래그먼트 DD 및, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2와 반응하지 않는 항체를 적어도 하나 사용함으로써, D 다이머 이외의 분자에 반응하여, 실제의 D 다이머의 수치보다도 낮은 수치 또는 잘못된 높은 수치를 나타내는 경우가 없다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이 지견에 의거하여, 특이적이고 또한 정확하게 안정화 피브린 분해산물(D 다이머)을 측정하는 방법 및 측정시약을 완성한 것이다.

따라서, 본 발명은,

[1] 안정화 피브린의 플라스민 분해산물인 D 다이머와 특이적으로 반응하지만, 피브리노겐 및 그 플라스민 분해산물인 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 및 프래그먼트 E3, 또한, DD/E 모노머를 해리(解離)시킨 프래그먼트 DD 및, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2와 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 항 D 다이머 항체,

[2] [1]의 항체의 프래그먼트,

[3] [1]의 항체를 생산(産生)하는 하이브리도마(ハイブリド-マ),

[4] [1]의 항체 또는 [2]의 항체 프래그먼트를 이용하여 생체시료 중의 D 다이머를 면역학적으로 측정하는 방법,

[5] [1]의 항체 또는 [2]의 항체 프래그먼트를 포함하는, D 다이머의 면역학적 측정시약에 관한 것이다.

본 발명의 항체를 이용함으로써, 선용(線溶)이 강하게 항진하여 피브리노겐 분해산물(FgDP)이 다량으로 존재하는 것이 추측되는 검체에 있어서도, 특이적이고 또한 정확하게 안정화 피브린 분해산물(D 다이머)을 측정하는 것이 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 항체를 이용하여 조제한 라텍스 시약에서는, DD/E 모노머에 의한 라텍스 반응의 억제를 회피할 수 있으며, 보다 정확한 안정화 피브린 분해산물(D 다이머)의 측정이 가능하다.

또한, 본 발명의 항체로, 질환에 의해 야기된 선용의 항진에 의해 형성되는 D 다이머 만을 특이적으로 측정할 수 있으므로, 아티팩트(ア-ティファクト)에서 생성할 가능성이 있는 분자 (예를 들면, DD/E 모노머가 해리된 DD, 후술하는 실시예 7에 나타낸 바와 같은 수식된 D 다이머 등)의 영향을 회피할 수 있다.

도 1은 피브리노겐의 플라스민 분해산물(FgDP) 및 안정화 피브린의 플라스민 분해산물(D 다이머)의 구조를 모식적으로 나타내는 설명도이다.
도 2는 각종 항D 다이머 항체를 이용하는 라텍스 응집법에 있어서, 피검시료 중에 존재하는 DD/E 모노머의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 3은 각종 항D 다이머 항체를 이용하는 라텍스 응집법에 있어서, 피검시료 중에 존재하는 프래그먼트 D1의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4는 각종 항D 다이머 항체를 이용하는 ELISA법에 있어서, DD/E 모노머 또는 그 각 구성 프래그먼트, 피브리노겐 분해산물(FgDP)인 프래그먼트 D1 또는 프래그먼트 E3, 또는, 이들 프래그먼트 혼합물과의 반응성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 각종 항D 다이머 항체를 이용하는 라텍스 응집법에 있어서, 피검시료 중에 존재하는 DD/E 모노머의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6은 각종 항D 다이머 항체를 이용하는 라텍스 응집법에 있어서, 피검시료 중에 존재하는 프래그먼트 D1의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 항D 다이머 항체를 이용하는 라텍스 시약, 및, 종래 시판의 D 다이머 시약에 있어서, 피검시료 중에 존재하는 프래그먼트 D1의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 8은 동결 융해한 혈장 검체를 본 발명 항체(비교하기 위해 종래항체)로 흡수 조작을 행하여 얻어진 상청(上淸, S), 항체 결합물 (B) 〔대조하기 위해 미처리 혈장(P)〕을 전기영동하고, 웨스턴 블로팅(항Fbg 항체로 검출)의 결과를 나타낸 상이다.

본 발명의 D 다이머(DD/E 모노머 및 DD/E 폴리머를 포함한다)를 특이적으로 측정하는 방법은, 적어도 피브리노겐 및 그 플라스민 분해산물인 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 프래그먼트 E3, 또한, DD/E 모노머를 해리시킨 프래그먼트 DD 및, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2에 반응하지 않고, D 다이머와만 특이적으로 반응하는 항체에 의해 실시할 수 있다.

(1)항체

본 발명의 항체는, 공지 수단에 의해 얻을 수 있다. 상기 반응성을 가지는 한, 단클론항체(MoAb)나 다클론항체(PoAb) 모두 가능하나, 단클론항체 쪽이 바람직하다. 항체는, 마우스 유래에 한정되지 않으며, 래트(ラット), 햄스터, 토끼, 염소, 말 등이 예시되나, 바람직하게는 마우스이다. 항체는 IgG에 한정되는 것이 아니라, IgM, IgA, IgE, IgD 등이어도 된다.

본 발명의 항체는, 예를 들면, 원하는 MoAb을 생산(産生)하는 하이브리도마를, 배지 또는 포유동물의 복강 내에서 배양함으로써 제조할 수 있다. 여기에서 사용하는 하이브리도마는, 일반적으로 D 다이머를 면역된 마우스의 비장 세포와 마우스 골수종 세포를, Kohler 및 Milstein의 세포융합의 기본방법 〔nature, 256, 495(1975) 참조〕에 의해 세포 융합하여 얻는 것이 가능하다.

또한, 상기 하이브리도마를 배양하는 배지로서는, 하이브리도마의 배양에 적합한 배지라면 가능하고, 바람직하게는 ERDF(極東製藥社)에 소 혈청(Gibco사), D-글루코오스(和光純藥社), 탄산수소나트륨(和光純藥社), 배지첨가제 RD-1(極東製藥社)을 포함하는 배지가 사용된다.

상기 하이브리도마의 배양은, 배지 중에서 행할 경우에는, 5% 이산화탄소 농도 및 37 ℃의 조건하에서 약 3일 정도에 행할 수 있다. 또한, 마우스의 복강 내에서 배양할 경우에는, 약 14일 정도에 행할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 배양액 또는 포유동물의 복수(腹水)로부터, 단백질의 단리 및 정제에 일반적으로 사용되는 방법에 의해, 상기 단클론항체를 분리 및 정제하는 것이 가능하다. 이와 같은 방법으로서는, 황산암모늄 침전법(

), 이온교환 셀룰로오스를 이용하는 이온교환 칼럼크로마토그래피, 분자체 겔을 이용하는 분자체 칼럼크로마토그래피, 프로틴A 결합 다당류를 이용하는 친화성 칼럼크로마토그래피, 투석, 동결건조 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체 프래그먼트, 즉, 본 발명의 MoAb의 프래그먼트로, D 다이머와 특이적으로 반응하는 항원결합 부위를 포함하는 항체 프래그먼트에는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 Fv 등이 포함된다. 이들의 프래그먼트는, 예를 들면 본 발명의 단클론항체를 정법(定法)에 의해 단백질 분해 효소로 소화하고, 이어서 단백질의 분리, 정제의 정법에 따라 얻을 수 있다.

본 발명의 항체를 제작하기 위한 항원은, 예를 들면 DD/E 모노머 또는 DD/E 폴리머를 사용할 수 있다. DD/E 폴리머는 2∼5량체를 들 수 있으며, 6량체 이상이 되면 물에 녹기 어려워진다. 또한, 상기 항원은 피브리노겐으로부터 공지의 방법에 따라 조제할 수 있다. 또한, 인간 등으로부터 정제해서 얻을 수 있으며, 유전자공학적 방법에 의해서도 얻을 수 있다. 또한 시판제품을 이용하여도 된다.

본 발명의 항체는, 제작한 항체가, 적어도 피브리노겐 및 그 플라스민 분해산물인 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 프래그먼트 E3, 또한, DD/E 모노머를 해리시킨 프래그먼트 DD 및, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2에 반응하지 않고, D 다이머와만 특이적으로 반응하는 것을 확인함으로써 취득할 수 있다. 상기 확인 방법으로서는, 실시예에 나타낸 것 같은 공지의 면역학적 측정방법을 사용할 수 있다.

또한, D 다이머는 DD/E 모노머인지 DD/E 폴리머인지에 의해 분자 사이즈나 구조가 상이하므로, 입체장애 등에 의해 항체의 반응성에 영향이 있다고 판단된다. 이 때문에, D 다이머의 각 분자종의 존재 비율에 따라 측정치에 영향을 받는지의 여부는, 예를 들면 실시예에 나타낸 바와 같이, 일정량의 DD/E 폴리머에 대하여, 다양한 양의 DD/E 모노머를 첨가함으로써 확인할 수 있다.

(2) 측정방법 및 시약

본 발명의 측정방법 및 시약은, 적어도 피브리노겐 및 그 플라스민 분해산물인 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 프래그먼트 E3, 또한, DD/E 모노머를 해리시킨 프래그먼트 DD 및, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2와 반응하지 않고, D 다이머와만 특이적으로 반응하는 항체에 의해 실시할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 단독으로 이용하여도 특이적이고 또한 정확하게 D 다이머를 측정할 수 있으나, 복수의 항체, 예를 들면 인식 부위가 다른 항체를 적당히 조합해서 이용하는 것도 가능하다.

본 발명의 측정방법은, 본 발명의 항체를 이용하는 것을 제외하면, 공지의 면역학적 측정방법을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 면역비탁법(免疫比濁法, TIA), 효소면역측정법(EIA), 방사면역측정법(RIA), 라텍스 응집반응법, 형광면역측정법, 면역크로마토그래피법 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 항체와 이것 이외의 D 다이머에 반응하는 항체를 2종류 이상 조합해서 사용하는 상기 면역학적 측정방법에 이용할 수도 있으나, 본 발명의 항체만으로도 특이적으로 D 다이머를 측정할 수 있으므로, 본 발명의 항체를 2종류 이상 조합해서 사용할 수도 있으며, 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체를 1종류만 사용하는 상기 면역학적 측정방법에 이용할 수 있다.

불용성 담체를 사용한 면역학적 응집법에 대해서, 보다 구체적으로 기재한다. 상기 면역학적 응집법은 그 원리에서, 비특이적으로 반응하는 항체가 포함되어 있으면, 비특이적인 응집이 생기기 쉬워 정확한 측정을 행할 수 없기 때문에, 본 발명의 항체만을 이용하는 것이 바람직하다.

불용성 담체로서는 유기 고분자 입자, 무기 물질 입자, 적혈구 등을 들 수 있다. 유기 고분자 입자로서는 예를 들면, 불용성 아가로스, 불용성 덱스트란, 셀룰로오스, 라텍스 입자를 들 수 있다. 바람직하게는 라텍스 입자를 들 수 있으며, 폴리스티렌, 스티렌-메타아크릴산 공중합체, 스티렌-글리시딜(메타)아크릴레이트 공중합체, 스티렌-스티렌술폰산염 공중합체, 메타아크릴산 중합체, 아크릴산 중합체, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산에스테르 공중합체, 폴리아세트산(酢酸)비닐아크릴레이트 등의 입자를 들 수 있다. 또한, 무기 물질 입자로서는 실리카, 알루미나 등을 들 수 있다. 또한 입자의 평균입경은, 측정기기 등에 의해 적당히 선택되나, 0.05 ∼ 0.50 μm의 것을 들 수 있다.

항체를 불용성 담체에 담지시키는 방법으로서는, 물리적 흡착법과 화학적 결합법이 있으며, 담지 조작의 간편성이라고 하는 점에서 물리적 흡착법이 바람직하게 사용된다.

완충액, 증감제, 계면활성제, 무기염을 적당히 첨가할 수 있다. 완충액으로서는 pH 5∼10, 특히 pH 6∼9에 완충작용을 가지는 것이 바람직하고, 인산완충액, Tris완충액, 이미다졸완충액, 트리에탄올아민·염산, 굿(グッド) 완충액 등을 들 수 있으며, 굿 완충액으로서는, MES완충액, Bis-Tris완충액, ADA완충액, PIPES완충액, Bis-Tris-Propane완충액, ACES완충액, MOPS완충액, BES완충액, TES완충액, HEPES완충액, HEPPS완충액, Tricine완충액, Bicine완충액, TAPS완충액을 들 수 있다.

응집속도를 촉진하는 것 등을 목적으로 증감제를 첨가할 수 있다. 증감제로서는 특별히 한정되지 않으며, 폴리비닐피롤리돈, 폴리음이온, 폴리에틸렌글리콜, 다당류 등을 들 수 있다.

계면활성제로서는, 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제를 들 수 있다.

검체 중의 염농도의 영향을 억제하는 것 등을 목적으로 무기염을 첨가할 수 있다. 무기염으로서는 염화나트륨, 염화칼슘 등을 들 수 있다.

피검체 중의 D 다이머 농도를 측정할 경우의 측정 시약으로서는, 제1 시약과 제2 시약으로 이루어지는 2시약계로 이루어지는 시약 형태 외에, 1시약으로 이루어지는 시약 형태이어도 된다. 바람직하게는 측정 정밀도의 관점 등에서 제1 시약과 제2 시약으로 이루어지는 2시약계가 바람직하고, 이하에 예시한다.

제1 시약은 완충액으로 이루어지고, 제2 시약은 항체 감작 라텍스 입자로 이루어지며, 증감제, 계면활성제, 무기염 등을 적당히 첨가할 수 있다. 바람직한 예로서는, 제1 시약은 완충액, 증감제, 및 무기염으로 이루어지고, 제2 시약은 항체 감작 라텍스 입자로 이루어지는 시약을 들 수 있다.

상기 측정 시약을 이용하여 측정할 경우는, 제1 시약과 검체를 반응셀 중에서 혼합한 후, 제2 시약을 첨가하여 항체 감작 라텍스 입자의 응집 정도를 광학적으로 측정하는 방법이나, 제1 시약과 제2 시약을 반응셀 중에서 혼합한 후, 검체를 첨가하여 항체 감작 라텍스 입자의 응집 정도를 광학적으로 측정하는 방법 등이 채용된다.

본 발명에 의해 분석 가능한 피검 시료로서는, 예를 들면, 액상 생체 시료, 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청, 또는 소변 등을 들 수 있다.

예를 들면 상기 예시 형태의 시약을 이용하여 응집 반응을 행하고, 기지 농도의 D 다이머 용액과 검체의 각각에 대해서 생긴 응집의 정도를 광학적으로 관찰해 비교하는 것으로 검체 중의 D 다이머 농도가 측정될 수 있다. 구체적으로는, 우선 기지 농도의 D 다이머 용액을 2농도(D 다이머 농도가 0 μg/mL의 용액을 포함하는 것이 바람직하다) 이상 측정하고, 얻어진 광학 밀도 변화량과 D 다이머 농도의 관계로부터 검량선을 작성한다. 다음에 피검체를 측정하고 그 광학밀도 변화량으로부터 검량선을 이용하여 농도를 구하고, 그 값을 D 다이머 농도로 한다. 항체 감작 라텍스 입자의 응집의 정도를 광학적으로 검출하는 방법에서는, 측정은 산란 광강도, 흡광도 또는 투과광 강도를 측정하는 광학 기기로 행한다. 측정 파장은 300 ∼ 2400 nm, 바람직하게는 300 ∼ 1000 nm, 보다 바람직하게는 300 ∼ 800 nm의 범위에서 적절한 파장이 선택된다. 측정 방법에 대해서는 공지의 방법에 따라, 이용하는 항체 감작 라텍스 입자의 크기 혹은 농도의 선택, 반응 시간의 설정에 의해, 산란광 강도, 흡광도 또는 투과광 강도의 증가 또는 감소를 측정함으로써 행해진다. 또한, 이들의 방법을 병용하는 것도 가능하다.

면역 반응의 조건은 공지의 조건이 채용되나, 반응 시의 온도는 10 ∼ 50 ℃, 특히 20 ∼ 40 ℃가 바람직하다. 반응 시간은 적당히 결정할 수 있다.

[실시예] 이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

《실시예 1: 항원 및 각종 분자의 조제》

(1) D 다이머의 조제

D 다이머의 조제는, 주로 Stephanie A. Olexa와 Andrei Z. Budzynski의 방법(1978), Circulation, Suppl. 58, 119, Olexa et al.의 방법(1979), 및 Biochim. Biophys. Acta 576, 39∼50에 준하여 행하였다. 사람 피브리노겐(Enzyme Research Laboratories사)에, 소 트롬빈(持田製藥社) 및 염화칼슘을 더하고, 37 ℃에서 2시간 반응시켜 피브리노겐을 피브린으로 변환시켰다. 이를 원심분리하고, 피브린을 비응고성 물질로부터 분리하였다. 피브린은 염화칼슘을 포함하는 트리스염산완충액 pH 7.8에 부유시켰다. 37 ℃ 환경 하에서 부유액에 사람 플라스민(Chromogenix사)을 첨가하였다. 아프로티닌(アプロチニン, Pentapharm.사)을 첨가하여 분해 반응을 정지시킨 후, 리신(リジン)세파로스 컬럼을 통과시켜 플라스민을 제거하였다. 이 통과액은 분자량이 상이한 D 다이머의 혼합물이다.

다음에 염화칼슘을 포함하는 트리스염산 완충액 pH 7.5(용액 A)로 평형화한 세파크릴S-300(S-300)컬럼에 먼저 얻어진 통과액을, 용액 A로 전개하는 분자체 크로마토그래피에 의해 분획하였다. 이 분획을 SDS-PAGE에 의한 전기영동법, 웨스턴 블로팅법에 의해 D 다이머 분획을 동정, 분리하였다. 이와 같이하여 조제한 각 D 다이머 분획은 면역원으로서, 또한 항D 다이머 단클론항체 생산성 하이브리도마를 선별하기 위한 효소면역 측정법(ELISA)이나 라텍스(LTX)용 항원으로서 사용하였다.

(2) 프래그먼트 DD, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2 조제

위에서 얻어진 분자량이 가장 작은 D 다이머 분획(DD/E 모노머)을, 3 mol/L 요소 - 50 mmol/L 구연산(pH 5.5) 용액 중에서 37 ℃에서 4시간 보온하였다. 다음에 50 mmol/L 트리스-염산 완충액(pH 7.4) - 28 mmol/L 구연산 나트륨 - 0.1 mol/L 염화나트륨 용액으로 평형화한 세파로스 CL-6B의 컬럼에 충전하고, 상기의 용액으로 전개하였다. 분획한 프래그먼트 DD 및, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2를 SDS-PAGE에 의한 전기영동법, 웨스턴 블로팅법에 의해 동정, 분리하였다.

(3) 사람피브리노겐의 플라스민 분해산물의 조제

사람피브리노겐(Enzyme Research Laboratories사)에 염화칼슘을 더한 후, 사람 플라스민(Chromogenix사)을 첨가하여, 37 ℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 정지는, 아프로티닌(Pentapharm.사)을 첨가하여 행하였다. 반응을 정지시킨 후의 생성물은, 트리스염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 세파크릴S-300(S-300) 컬럼에 충전하고, 겔 여과법에 의해, 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 프래그먼트 E3을 분획하였다. 이들의 프래그먼트는, 항D 다이머 단클론항체 생산성 하이브리도마를 선별하기 위한 ELISA나 LTX용 항원으로서 사용하였다.

《실시예 2: 단클론항체의 제작》

(1) 면역화한 비장세포의 조제

실시예 1에서 제작한 DD/E 모노머 용액을 등량의 프로인드 완전 보조제(フロインド氏完全アジュバント)와 유화할 때까지 혼합하고(면역원 혼합액), 마우스 피부 내에 투여함으로써 면역을 행하였다(1회 면역). 2주 경과 후에, 상기 마우스에 동일한 방법으로 면역원 혼합액을 마우스 피부 내에 투여하였다(2회 면역). 이하 2주 간격으로 마우스 피부 내에 면역원 혼합액을 투여하고, 총4회의 면역을 행하였다. 4회 면역으로부터 2주 경과 후에, 실시예 1에서 제작한 DD/E 모노머 용액을 등량의 수산화알루미늄 겔과 혼합하고, 그 혼합액을 상기 마우스의 비장 내에 투여하였다(최종 면역). 최종 면역으로부터 3일 경과 후에, 비장을 마우스로부터 꺼내어, 세포 융합에 사용하였다.

(2) 세포융합

무균적으로 적출한 상기 비장으로부터, 비장 세포를 ERDF 배지에 회수하였다. 이 비세포를 원심튜브에 모아서 원심 분리하고, 얻어진 펠릿을 ERDF 배지에서 현탁하여, 살아 있는 비세포수(脾細胞數)를 계측하였다.

한편, 미리 배양해 둔 마우스 골수종 세포(미에로마(ミエロ-マ) 세포) P3U1을 상기 비세포와 혼합하고, 원심분리하였다. 이 펠릿을 PEG1500, 계속해서 ERDF 배지에서 순차 현탁하고, 세포를 융합시켰다. 펠릿을 소 혈청, 히포크산틴(ヒポキサンチン), 아미노프테린(アミノプテリン), 티미딘(チミジン), RD-1을 포함하는 ERDF 배지에서 현탁하였다. 이 세포 현탁액을 96웰 세포배양 플레이트로, 37 ℃, 5% 탄산가스를 포함하는 탄산가스 배양기로 배양하였다.

(3) 하이브리도마의 수립

약 13일간 배양한 후, 배양 상청을 채취하고, ELISA법을 이용하여 목적으로 하는 항체의 유무를 확인하였다. 96웰 ELISA용 플레이트에, 인산 완충액(PBS)으로 희석한 항마우스 면역글로브린 항체를 분주하고, 4 ℃에서 하룻밤 방치하였다. 이를 0.05 % Tween-20 함유 인산 완충액(T-PBS)으로 4회 세정하였다. 세정 후, 배양 상청을 분주하고 4 ℃에서 하룻밤 방치하였다. 다음에 T-PBS로 4회 세정하고, T-PBS로 희석한 실시예 1에서 제작한 DD/E 모노머 분획을 분주하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. T-PBS로 4회 세정한 후, T-PBS로 희석한 퍼옥시다아제(ペルオキシダ-ゼ, HRP) 표식-항사람 피브리노겐 다클론항체를 분주하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 이를 T-PBS로 4회 세정한 후, TMB 시약(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.사)을 분주하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 여기에 1 mol/L 인산 용액을 분주하여 반응을 정지하고, 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마찬가지로, 피브리노겐, 프래그먼트 D1에 대해서도 반응성을 확인하고, DD/E 모노머 분획에는 반응하나, 피브리노겐, 프래그먼트 D1에는 반응하지 않는 항체를 생산하는 하이브리도마에 대해서 한계희석법에 의한 클로닝을 행하고, 클론의 수립을 행하였다. 이 방법으로 3회의 세포 융합을 행하고 3마리의 마우스에 면역하여, 합계 18클론을 수립하였다.

(4) 단클론항체의 제조

이어서, 미리 프리스탄(プリスタン)을 복강 내에 투여해 둔 BALB/c 마우스에, 상기에서 얻어진 하이브리도마를 복강 내 투여하였다. 약 2주간 후에 복수를 채취하였다. 복수를 원심분리 후, 상청에 고형의 황산암모늄을 서서히 더하고, 혼합물을 빙냉하에서 30분간 교반한 후 60분간 방치하고, 원심분리를 행하였다. 얻어진 침사(沈渣)를 소량의 트리스염산 완충액 pH 7.5(용액 B)에 용해하였다. 이를, 용액 B로 평형화한 Q세파로스 컬럼에 충전하였다. 0.16 mol/L NaCl을 포함하는 용액 B로 항체를 용출시키고, 정제한 항D 다이머 항체를 얻었다.

(5) 항D 다이머 항체의 ELISA법에 의한 스크리닝

얻어진 정제 항체에 대해서, 피브리노겐 관련 프래그먼트의 반응성을, ELISA법을 이용하여 확인하고, 하이브리도마의 선택을 행하였다. 항원은 피브리노겐(Fbg), DD/E 모노머(DD/E mono), DD/E 폴리머(DD/E poly), 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 프래그먼트 E3을 이용하였다.

결과를 표 1에 나타내었다. 또한, 흡광도의 값을 나타내는, 표 1에서 사용한 기호의 정의를 표 2에 나타내었다. 얻어진 18클론의 항체가 피브리노겐 및 피브리노겐 분해산물(프래그먼트 X, Y, D1, E3)과 반응하지 않는다는 것을 확인하였다.

《실시예 3: 라텍스 응집법에 의한 D 다이머 측정 시약의 제작과 항D 다이머 항체의 평가》

(1) 항D 다이머 항체 감작 폴리스티렌 라텍스 입자의 조제

실시예 2에서 정제한 항체를 트리스염산 완충액(pH 8.0)에 용해하여 조제한 항체액에, 폴리스티렌 라텍스(JSR사) 5 mL를 첨가하여 실온에서 60분간 교반하였다. 상기 혼합물에, 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 트리스염산 완충액(pH 8.0)을 첨가하고, 실온에 60분간 교반한 후, 상기 혼합물을 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 트리스염산 완충액(pH 8.0)으로 현탁하고, 항D 다이머 항체 감작 라텍스액을 조제하였다.

(2) 항D 다이머 항체의 라텍스 응집법에 의한 스크리닝

실시예 2에서 얻어진 항D 다이머 항체에 대한 피검시료 중의 DD/E 모노머, 프래그먼트 D1 존재의 영향 확인

(2-1) 표준액 및 샘플 조제

정제 D 다이머를 0, 2, 8, 32, 48, 60 μg/mL가 되도록, BSA를 포함하는 트리스염산 완충액(pH 8.0)으로 조제하여, 표준액으로 하였다.

또한, 정제 D 다이머(DD/E 폴리머)를 BSA 함유 트리스염산 완충액(pH 8.0)으로 10 μg/mL가 되도록 조제하고, DD/E 폴리머 농도를 일정하게 한 채, DD/E 모노머의 농도가 0 ∼ 20 μg/mL (각 0, 4, 8, 12, 16, 20 μg/mL)가 되도록 첨가한 샘플과, 프래그먼트 D1의 농도가 0 ∼ 100 μg/mL (각 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL)가 되도록 첨가한 샘플을 제작하였다.

(2-2) 측정방법

처음에 상기 표준액을 각각 5 μL에, BSA 함유 트리스염산 완충액(pH 8.0)을 160 μL첨가하고 혼합하여 37 ℃에서 약 5분간 유지한 후, 상기 항D 다이머 항체 감작 라텍스액을 80 μL 첨가하여 교반하고, 약 10분간 경과하는 동안의 흡광도 변화를 파장 800 nm에서 측정하고, 검량선을 작성하였다. 이어서, 상기 샘플 시료를 표준 용액과 동일하게 측정하고, 상기에서 작성한 검량선에서의 측정치를 구하였다. 상기 흡광도 측정은, 전자동 분석기 히타치(日立) 7170을 이용하여 행하였다.

그 결과의 일부를 이하에 나타낸다. 도 2에 도시한 바와 같이, MF-17 항체는 DD/E 모노머에 의해 라텍스 응집반응이 억제되고, 다른 3항체(MF-3, MF-9, MF-11)는 첨가 농도 의존적으로 측정치가 높아졌다. 또한, 도 3에 도시한 바와 같이, 프래그먼트 D1의 농도 증가에 의해 상기 4항체를 포함, 18종류의 항체 모두에서 라텍스 응집반응에 영향은 인정되지 않았다.

DD/E 모노머의 존재에 의해 영향을 받은 항체는, MF-17 이외에 MF-13, MF-14, MF-15, MF-16, MF-18이 있었다. 이들 항체는 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 프래그먼트 E3에는 반응하지 않고, 라텍스 응집으로의 영향도 주지 않았다. DD/E 모노머는 D 다이머의 일부로, DD/E 모노머의 증가에 의해 반응이 억제된 항체는 라텍스 응집 측정에는 적합하지 않으므로, MF-17과 동일한 반응을 나타낸 6클론을 제외하고, 12클론을 선택하였다.

(3) 단클론항체의 면역글로브린 클래스 및 특이성의 확인

선택된 12항체의 면역글로브린 클래스(クラス)의 동정을 아이소타이핑키트(アイソタイピングキット, 大日本製藥社)에 의해 행하였다. 결과는 표3에 나타낸 바와 같다.

이후, 대표적인 클론으로서 MF-3과 MF-12에 대한 결과를 나타낸다.

《실시예 4: 단클론항체의 인식 부위의 동정》

(1) 웨스턴 블로팅에 의한 확인

웨스턴 블로팅은, NewPAGE/Western Bleeze(Invitrogen사)에 의해 행하였다. 실험 조작의 개요는 다음과 같다.

피브리노겐(Fbg), D 다이머, 및 피브리노겐 분해산물(FgDP)을, 디티오트레이톨(ジチオスレイト-ル) 존재 및 비존재 하에서 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE) 및 Native-PAGE를 행하였다. PAGE 후의 겔에 대해서 웨스턴 블로팅을 행하고, 항Fbg항체, MF-3항체, MF-12항체를 이용하여 면역 염색을 행하였다. 대조로 한 항Fbg항체에 대하여, 단클론항체 MF-3, MF-12는, 어느 샘플에서도 밴드가 검출되지 않았다.

(2) ELISA법에 의한 확인

전기영동의 결과로부터, 전기적인 부하가 걸림으로 인하여, E-D 결합이 분리되고, 또한, 항체가 인식하는 부위의 구조가 변화되고 있다고 판단되므로, E-D 결합의 유무가 항체의 반응에 영향을 미치고 있는지를 확인하기 위하여, 실시예 2와 마찬가지로 ELISA법에 의한 해석을 행하였다.

D 다이머는 DD/E를 구성단위로 하여 존재하고, D 도메인끼리는 공유결합으로 강하게 결합되어 있으나, D와 E는 입체구조를 인식하여 전기적으로 결합되어 있다. 그러므로, 요소, SDS 등에 의해 용이하게 프래그먼트 DD와 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2로 분리할 수 있다. 이 분리된 프래그먼트 DD와 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2는 요소를 제외한 것으로 재구성되고, 원래 분자와 같은 구조가 되는 것이 알려져 있다. 또한, FgDP인 프래그먼트 E3은, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2와 유사한 구조를 가지나, D도메인과의 결합 사이트가 없기 때문에, E-D결합은 할 수 없다. 또한, 생체 내에서는 DD/E 모노머를 해리시키는 환경은 없기 때문에, DD/E 유래의 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2가 FgDP인 프래그먼트 D1과 결합하는 일은 없다.

ELISA의 항원으로서, 하기의 분자를 제작하였다.

(1) DD/E 모노머(D 다이머의 일부),

(2) 프래그먼트 DD(DD/E 모노머를 요소 처리하여 조제),

(3) 프래그먼트 D1(FgDP의 일부),

(4) 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2(DD/E 모노머를 요소 처리하여 조제),

(5) 프래그먼트 E3(FgDP의 일부),

(6) 프래그먼트 DD + 프래그먼트 E1 및 E2 [(2)와 (4)를 시험관 내에서(インビトロ) 일정시간 반응시킨 것],

(7) 프래그먼트 DD + 프래그먼트 E3 [(2)와 (5)를 시험관 내에서 일정시간 반응시킨 것],

(8) 프래그먼트 D1 + 프래그먼트 E1 및 E2 [(3)과 (4)를 시험관내에서 일정시간 반응시킨 것],

(9) 프래그먼트 D1 + 프래그먼트 E3 [(3)과 (5)를 시험관 내에서 일정시간 반응시킨 것]

상기 ELISA의 결과를 도 4에 도시한다. MF-3 항체와 MF-12 항체는, DD/E 모노머를 요소처리하는 것으로 해리시킨 프래그먼트 DD(2)와 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2(4)에 대하여는 반응이 얻어지지 않았으나, 프래그먼트 DD와 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2를 혼합한 것(6), 또는 프래그먼트 D1과 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2를 혼합한 것(8)과 반응성이 인정되었다. 그러나, 프래그먼트 DD와 프래그먼트 E3의 혼합물(7), 프래그먼트 D1과 프래그먼트 E3의 혼합물(9) 모두 반응성은 얻어지지 않았다. 이로부터 MF-3 항체와 MF-12 항체는 D 도메인과 E 도메인이 결합한 물질에 반응성을 나타낸다는 것이 증명되었다.

대조로 한 DD/D-1 항체(일본특허공개 소63-79900호 공보)는, D도메인에 인식부위를 가지므로, DD/E 모노머(1), 요소처리에 의해 얻어진 프래그먼트 DD(2), 프래그먼트 D1(3)에 반응하고, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2(4), 프래그먼트 E3(5)에는 반응하지 않았다. 또한, 프래그먼트 DD와 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2의 혼합물(6) 또는 프래그먼트 DD와 프래그먼트 E3의 혼합물(7), 프래그먼트 D1과 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2의 혼합물(8) 또는 프래그먼트 D1과 프래그먼트 E3의 혼합물(9)에도 반응성이 인정되었다. 프래그먼트 E3은 프래그먼트 DD 또는 프래그먼트 D1과는 E-D 결합되어 있지 않으나, D도메인이 존재하기 때문에, ELISA상의 시그날로서 나타났다.

또한, DD/E 모노머에 의해 라텍스 반응이 억제된 MF-16 항체의 반응성을 ELISA로 확인한 바, 프래그먼트 DD(2)에 반응하고, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2(4)에는 반응하지 않았다. 또한, 프래그먼트 D1과 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2의 혼합물(8)에도 반응성이 인정된 것에서, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2에 2분자의 프래그먼트 D1이 결합되고, 2개의 D 도메인이 근접하는 것으로, 항체가 반응하고 있다고 판단되었다. MF-16 항체 이외의 DD/E 모노머에 의해 라텍스 반응이 억제된 5항체(MF-13, MF-14, MF-15, MF-17, MF-18)에 대해서도 프래그먼트 DD(2)와의 반응성이 인정되었다. 금회의 결과로부터, 프래그먼트 DD에 반응성을 가진 이들 5항체는, DD/E 모노머에 의해 라텍스 응집이 억제되었기 때문에, 단일 항체에 의한 D 다이머 라텍스 시약에는 적합하지 않았다.

이상으로부터, MF-3 항체와 MF-12 항체는 FgDP 유래의 프래그먼트와는 반응하지 않고, 피브린 분해산물이며 E-D 결합되어 있는 D 다이머와만 특이적으로 반응하는 것이 증명되었다.

또한, 웨스턴 블로팅과 ELISA의 결과로부터, 항체의 인식부위는, E-D 결합되어 있는 D 다이머의 D도메인 및/또는 E 도메인이라고 판단되었다.

《실시예 5: 본 발명의 항체와 종래 항체의 라텍스 응집법 시약의 특이성 및 정확성 확인》

실시예 3과 마찬가지로, MF-12 항체와 DD/D-1 항체의, DD/E 폴리머 중의 DD/E 모노머와 프래그먼트 D1의 반응성을 확인하였다. 도 5 및 도 6에 도시한 바와 같이, MF-12 항체는 DD/E 모노머의 첨가 농도 의존적으로 측정치가 높아지고, 프래그먼트 D1에 의해 라텍스 응집 반응이 억제되지 않았다. 한편, DD/D-1 항체는 DD/E 모노머, 프래그먼트 D1의 첨가 농도 의존적으로 라텍스 응집 반응이 억제되었다.

《실시예 6: 본 발명의 D 다이머 측정시약의 특이성 및 정확성 확인》

실시예 3에서 제작한 정제 D 다이머(DD/E 폴리머)와 프래그먼트 D1을 첨가한 샘플을 사용하여, MF-12 항체와, 종래의 D 다이머 시약, 상품 A, 상품 B 및 상품 C와의 비교를 행하였다. 측정 방법은 첨부 문서에 따라, 전자동분석기 히타치(日立) 7170을 이용하여 행하였다. MF-12 항체는, 실시예 3의 라텍스 응집법으로 측정하였다.

결과를 도 7에 도시한다. 종래법의 D 다이머 3시약은, 샘플 중의 프래그먼트 D1 양이 증가함에 따라 D 다이머의 측정치가 저하되는 것에 반하여, MF-12 항체를 이용한 시약에서는 프래그먼트 D1 농도가 100 μg/mL까지 D 다이머의 측정치에 영향을 주지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.

그러므로, MF-12 항체를 이용한 D 다이머 측정시약은, 종래의 D 다이머 시약에 대하여, 피브리노겐 분해산물인 프래그먼트 D1의 영향을 받지 않고, D 다이머를 정확하게 측정할 수 있는 항체인 것이 확인되었다.

《실시예 7: 본 발명의 D 다이머 측정시약의 혈장 검체에 있어서의 특이성의 확인과 검증》

실시예 6에서 사용한 본 발명의 D 다이머 측정시약과 종래법의 D 다이머 측정시약과의 특이성의 차이를 확인하기 위하여, 구연산(クエン酸) 첨가 혈장 검체를 측정하였다. 종래법의 D 다이머 측정시약으로서는 상품 A를 사용하였다. 측정방법 등은 실시예 6과 마찬가지로 행하였다.

검토에는, 구연산 첨가 혈장 검체로서 조제한 동결 검체를 37 ℃에서 30분 가온하여 융해한 후, 측정에 사용하였다. 12예 중에서, 대표적인 2예의 결과를 나타낸다. 검체 1에서는 검체의 동결융해의 회수에 관계없이, 종래 시약, 본 발명 시약(MF-12 항체) 모두 D 다이머 수치에 변동은 없었다. 그러나, 검체 2에서는, 검체의 동결융해에 의해 종래 시약으로 측정한 D 다이머 수치가 약 3배나 상승하였다. 한편, MF-12 항체를 이용한 본 발명의 D 다이머 시약에서는 측정치의 이러한 큰 변동은 없었다(표 4).

혈장 검체에서는, 드물게 피브린 덩어리가 형성되는 것이 비특허문헌 2에서도 보고되어 있다. 검체의 동결융해에 의해 원래부터 있었던 D 다이머는 변화하지 않고, 아티팩트(ア-ティファクト)에 의해 형성된 피브린 덩어리가 수식(修飾)을 받아서 D 다이머가 생성되고, 종래법의 측정치가 상승된 것으로 판단되었다.

다음에, 검체 2의 동결 융해에 의한 측정치 변동의 원인을 조사하기 위하여, 본 발명의 항체(MF-12 항체)와 종래의 항체(DD/D-1 항체)로 검체의 흡수 조작을 행하고, 흡수후의 상청(S, 上淸) 및 항체 결합물 (B), 및 미처리 혈장(P)을 웨스턴 블로팅에 의해 해석하였다. 구체적으로는, (S) 획분, (B) 획분, (P) 획분을 비환원 조건에서, 3∼8 %의 SDS-PAGE로 전기영동하고, 폴리불화비닐리덴(PVDF)막에 전사한 후 항Fbg 항체로 검출하였다. 결과를 도 8에 도시한다. S1, B1 레인은, DD/D-1 항체의 결과이며, S2, B2 레인은 MF-12 항체의 결과이다. 또한, 왼쪽에 표시한 화살표는, 각각, Fbg, 안정화 피브린의 플라스민 분해산물(XDP, YD, DD, E1E2)과, 피브리노겐 분해산물(X, Y, D1)이다.

검체 1에서는, DD/D-1 항체의 결합물(B1)과 MF-12 항체 결합물(B2)을 비교하면, B1에는 프래그먼트 D1의 밴드가 검출된 것 외에는 차이는 발견되지 않았다. 이것은, DD/D-1 항체가 D 도메인을 인식하고 있기 때문이다. 그러나, 동결융해에 의해 D 다이머 수치가 상승한 검체 2에서는, 프래그먼트 D1의 밴드 이외에, B1에만 프래그먼트 E2보다도 더욱 더 저분자의 밴드가 확인되었다 (중앙의 별표시 화살표). 한편, 이 밴드는 MF-12 항체에서 검출되지 않았다. 또한, 이 밴드는, D 도메인을 인식하는 항체의 웨스턴 블로팅에 의해 검출할 수 없었으므로 프래그먼트 E 유래로 판단되었다.

프래그먼트 E2 보다 저분자의 E 획분의 존재는, 피브리노겐의 분해로 생성되는 프래그먼트 E3가 고려되나, DD/D-1 항체는 D도메인을 인식하는 항체이므로, B1에, 단독으로 프래그먼트 E3가 존재한다는 것은 생각하기 어렵다. 또한, 실시예 4에서 설명한 바와 같이, 프래그먼트 E3은 D도메인과의 결합능을 가지고 있지 않으므로, D 도메인과 결합하여 DD/D-1 항체에 결합되는 일은 없다.

이들의 결과로부터, 동결융해에 의해 상승된 D 다이머는 아티팩트(ア-ティファクト)에서 생성된 가능성이 높고, 그 D 다이머는, DD/E가 수식(修飾)을 받고, 통상의 E-D 결합을 하지 않는, 저분자의 E 획분을 포함하는 분자인 것이 시사되었다.

이상으로부터, MF-12 항체를 이용한 본 발명의 D 다이머 시약은, 아티팩트에 의해 생성된 D 다이머의 영향을 받지 않고, 생체 내의 D 다이머 수치를 보다 정확하게 측정할 수 있는 시약인 것이 명백해졌다.

[산업상의 이용 가능성] 본 발명의 항체는, 예를 들면, 파종성(播種性) 혈관 내 응고증후군(DIC)의 진단 마커로서 유용한 안정화 피브린의 플라스민 분해산물(D 다이머)의 측정에 이용할 수 있다.

이상, 본 발명을 특정 형태에 따라 설명했으나, 당업자에게 자명한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (5)

1. 안정화 피브린의 플라스민 분해산물인 D 다이머와 특이적으로 반응하나,
   피브리노겐과 반응하지 않고,
   피브리노겐의 플라스민 분해산물인 프래그먼트 X, 프래그먼트 Y, 프래그먼트 D1, 및 프래그먼트 E3의 어느 것과도 반응하지 않으며,
   DD/E 모노머를 해리시킨 프래그먼트 DD 및, 프래그먼트 E1 및 프래그먼트 E2의 어느 것과도 반응하지 않는 것을 특징으로 하는, 항D 다이머 항체.
2. 청구항 1 기재의 항체의 프래그먼트로서, D 다이머와 특이적으로 반응하는 항원결합 부위를 포함하는 항체 프래그먼트.
3. 청구항 1 기재의 항체를 생산하는 하이브리도마.
4. 삭제
5. 청구항 1 기재의 항체 또는 청구항 2 기재의 항체 프래그먼트를 포함하는, D 다이머의 면역학적 측정시약.

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