JPWO2013077332A1 - ラテックス凝集法によるマトリックスメタロプロテイナーゼ−3の検出方法 - Google Patents
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Abstract
低値領域において反応性が高く、かつ、MMP−10等の他のMMPファミリーとの交差反応性が認められない、MMP−3に対するモノクローナル抗体を用いた、迅速な測定が可能であり検体処理能力が高いLTIA法に基づくMMP−3の検出方法を提供することを課題とし、モノクローナル抗体14B1が担持されたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体3D3が担持されたラテックス粒子、を血液検体と接触させることによる抗原抗体反応による凝集をシグナルとして、当該血液検体におけるヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−3を検出するラテックス凝集法による検出方法、並びに、当該検出方法を行うための検出試薬と検出キットを提供することにより、上記の課題を解決することを見出した。
Description
本発明は、特定の生体物質の検出方法に関する発明であり、さらに具体的にはラテックス凝集法によるマトリックスメタロプロテイナーゼ−3の検出方法に関する発明である。
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)−3は、軟骨細胞や滑膜細胞で産生される蛋白質分解酵素であり、関節滑膜増殖時に増加し、プロテオグリカン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン等の細胞外マトリックスの分解作用を有している。よって、血中のMMP−3濃度は、関節リウマチに認められる関節破壊を反映し関節炎活動性の指標として有用である。現在市販されているMMP−3測定用試薬には、酵素免疫測定法(ELISA法)を用いた試薬、及び、ラテックス凝集法(LTIA法)を用いた試薬がある。
また、MMP−3の検出法に関する既存特許関連文献としては、国際公開パンフレット(WO2010/090079)(特許文献1)、特開平4−237499号公報(特許文献2)、特開平11−318449号公報(特許文献3)が挙げられる。また、非特許文献としては、PRESKY,DH.,et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,1993,vol.193,No.1,pp.364-370(非特許文献1)が挙げられる。
PRESKY,DH.,et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,1993, vol.193,No.1,pp.364-370
「単クローン抗体実験操作入門」(講談社サイエンティフィック、安藤民衛、千葉丈 著)、1993年8月20日発行
このように血中MMP−3の検出は既に行われているが、上記した既存の測定試薬にも実用上の課題が存在する。すなわち、ELISA法を用いた試薬では検体処理能力(迅速性)に問題があり、ラテックス凝集法(LTIA法を)用いた試薬では迅速性は認められるものの、低値領域においてELISA法との測定値が解離する現象が認められる。
本発明は、血中MMP−3をラテックス凝集法に基づいて測定する際に、低値領域における測定値の解離が起こらないモノクローナル抗体を見出し、これを用いたラテックス凝集法による血中MMP−3の検出手段を提供することを課題とする。
上記の課題を解決し得るモノクローナル抗体は、一般的には低値領域において反応性が高く、かつ、MMP−10等の他のMMPファミリーとの交差反応性が認められないMMP−3に対するモノクローナル抗体の中に認められると考えられるが、具体的な予測を立てることは困難であった。
上記の課題の解決を目指した本発明者は、遂に、モノクローナル抗体14B1が担持されたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体3D3が担持されたラテックス粒子、を血液検体と接触させることにより、血液検体中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−3との抗原抗体反応による凝集をシグナルとして、当該血液検体におけるヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−3を定量的に検出する、ラテックス凝集法による検出方法(以下、本発明の検出方法ともいう)により、上記の課題を解決し得ることを見出した。
上記の2種のモノクローナル抗体は常法、例えば、非特許文献2の「単クローン抗体実験操作入門」に基づいて製造した。
また、本発明の検出方法において行われる、ラテックス凝集法(LTIA法)は、典型的には上記の特許文献4,5の開示に基づき行うことができる。
すなわち、上記の2種のモノクローナル抗体を個別にコーティングしたラテックス粒子を血液検体と共存させ、当該検体におけるヒトMMP−3とこれらのラテックス粒子上のモノクローナル抗体との結合による、当該ラテックス粒子の凝集を検出するLTIA法を行うことにより、当該検体中のヒトMMP−3を定量することができる。
第2に本発明は、上記の検出方法を行うための検出試薬と検出キットを提供する。当該検出試薬及び検出キットには、少なくとも「モノクローナル抗体14B1が担持されたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体3D3が担持されたラテックス粒子」が含有される。また、必要に応じて希釈液、洗浄液等を含有させることも可能である。
後述するように、これらの2種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、モノクローナル抗体3D3については「Mouse-Mouse hybridoma 3D3(受託番号:FERM P−22223)」として、モノクローナル抗体14B1については「Mouse-Mouse hybridoma 14B1(受託番号:FERM P−22225)」として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにて寄託されている。
本発明において「血液検体」とは、血清、血漿、全血等としての検体を意味するものであり、特に血清検体又は血漿検体が好適であり、血清検体がさらに好適である。
なお、本明細書において「マトリックスメタロプロテイナーゼ」又は「MMP」とは、特に断らない限り、「ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ」又は「ヒトMMP」を意味するものとする。
本発明により、低値領域において反応性が維持されていて、かつ、MMP−10等の他のMMPファミリーや、類似蛋白質との交差反応性が認められない、MMP−3に対する2種のモノクローナル抗体、「モノクローナル抗体14B1」、及び、「モノクローナル抗体3D3」を用いた、迅速な測定が可能であり検体処理能力が高いLTIA法に基づくMMP−3の検出方法、及び、当該検出方法を行うための検出試薬と検出キットが提供される。
1.モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、上記の非特許文献2に記載された方法に従って、組換え蛋白質を用いた免疫によりハイブリドーマを調製することで製造した。
モノクローナル抗体は、上記の非特許文献2に記載された方法に従って、組換え蛋白質を用いた免疫によりハイブリドーマを調製することで製造した。
(1)モノクローナル抗体産生クローンの一次選抜
上記により得られたハイブリドーマは、下記(i)〜(iv)の過程を経て一次選択が行われた。その結果、32クローンに絞り込まれた。
上記により得られたハイブリドーマは、下記(i)〜(iv)の過程を経て一次選択が行われた。その結果、32クローンに絞り込まれた。
(i)ELISAによるスクリーニング
それぞれのマウス由来のハイブリドーマを含む96穴プレートのウェルから、rMMP3固相ELISAに強く反応する上位のウェルを選択した。すなわち、各免疫方法を施したマウスの中で上位のもの、また培養スケールアップ後でも陽性を維持したウェル等の、計56ウェルをクローニングした。
それぞれのマウス由来のハイブリドーマを含む96穴プレートのウェルから、rMMP3固相ELISAに強く反応する上位のウェルを選択した。すなわち、各免疫方法を施したマウスの中で上位のもの、また培養スケールアップ後でも陽性を維持したウェル等の、計56ウェルをクローニングした。
(ii)限界希釈法によるクローン化
上記において選択された56ウェルにおける細胞に対して、限界希釈法によるクローン化を行ったところ、34クローンが樹立できた。
上記において選択された56ウェルにおける細胞に対して、限界希釈法によるクローン化を行ったところ、34クローンが樹立できた。
(iii) 抗体のサブクラスタイピング
得られたモノクローナル抗体サブクラスは、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用キット(ISO-STRIP Mouse IgG Isotyping kit , 1-493-027, Boehringer mannheim)を用い、キットに添付されている操作手順に準じて測定した。
得られたモノクローナル抗体サブクラスは、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用キット(ISO-STRIP Mouse IgG Isotyping kit , 1-493-027, Boehringer mannheim)を用い、キットに添付されている操作手順に準じて測定した。
上記の限界希釈法によりクローン化された34クローンの抗体サブクラスは、IgG 1kが17クローン、IgG 2akが5クローン、IgG 2bkが10クローン、IgMkが2クローンであった。
(iv)選択
抗体サブクラスIgMは抗体精製方法等が煩雑なため、IgMクラスの上記2クローンは以降の検討から除いた。
抗体サブクラスIgMは抗体精製方法等が煩雑なため、IgMクラスの上記2クローンは以降の検討から除いた。
(2)モノクローナル抗体クローンの二次選抜
上記のようにして選択された32クローンそれぞれを、プリスタンを投与したBALBcマウス(雄・8週齢)の腹腔に注射し、1週間前後及びそれ以降に腹水を取り出し、硫安沈殿法、及びProtein A Sepharoseを用いて精製を行って、それぞれのクローンに対応するモノクローナル抗体を得た。それぞれのモノクローナル抗体について、ヒトMMP−3及びMMP−10に対する反応性を、それぞれの蛋白質を結合させたプレートを用いたEIA法にて検討した。
上記のようにして選択された32クローンそれぞれを、プリスタンを投与したBALBcマウス(雄・8週齢)の腹腔に注射し、1週間前後及びそれ以降に腹水を取り出し、硫安沈殿法、及びProtein A Sepharoseを用いて精製を行って、それぞれのクローンに対応するモノクローナル抗体を得た。それぞれのモノクローナル抗体について、ヒトMMP−3及びMMP−10に対する反応性を、それぞれの蛋白質を結合させたプレートを用いたEIA法にて検討した。
次に、ここで絞り込まれた19種のモノクローナル抗体を、市販の体外診断薬用ラテックス粒子に接触固定させて、ラテックス製品とした場合の性能を検討し、さらなるモノクローナル抗体の絞り込みを行った。すなわち、非特異的なラテックス凝集反応が認められない(単一のモノクローナル抗体では抗原と反応しない)ことを条件としたスクリーニングを行った結果、12種のモノクローナル抗体が当該条件を満足した。次に、これらの12クローンについて2種のモノクローナル抗体を組み合わせた66通りの組を検討し、MMP−3に対して特異的なラテックス凝集反応が得られた19通りの組を候補とした。これらの19通りのモノクローナル抗体の組について、ラテックス凝集製品として製剤化する場合に適した抗体のサブクラスであるIgG1タイプであり、かつ盲検とした生理食塩水を測定した際に明らかな非特異的凝集反応を示さず、MMP−3を測定した際に十分な特異的凝集反応を示した組み合わせを選別した。最後に慢性関節リウマチ患者の血清との特異的反応性を精査した結果、モノクローナル抗体名「14B1」、「3D3」、及び、「8A6」の組み合わせを最終的に選択した。
(3)モノクローナル抗体のキャラクタライズ
上記のごとく確定したモノクローナル抗体のキャラクタライズを行った。
(i)サブクラス
14B1抗体:IgG1/κ
3D3抗体:IgG1/κ
8A6抗体:IgG1/κ
(ii)解離定数(M)
14B1抗体:5.34×10−10
3D3抗体:1.91×10−9
8A6抗体:2.20×10−9
(iii)結合定数(1/Ms)
14B1抗体:2.45×105
3D3抗体:2.09×105
8A6抗体:3.20×105
(iv)特異反応性
上述のEIA法による検討の結果、3つのモノクローナル抗体共に、MMP−3に対しては反応するが、MMP−10に対する交差反応性は実質的に認められないことが確認された。
上記のごとく確定したモノクローナル抗体のキャラクタライズを行った。
(i)サブクラス
14B1抗体:IgG1/κ
3D3抗体:IgG1/κ
8A6抗体:IgG1/κ
(ii)解離定数(M)
14B1抗体:5.34×10−10
3D3抗体:1.91×10−9
8A6抗体:2.20×10−9
(iii)結合定数(1/Ms)
14B1抗体:2.45×105
3D3抗体:2.09×105
8A6抗体:3.20×105
(iv)特異反応性
上述のEIA法による検討の結果、3つのモノクローナル抗体共に、MMP−3に対しては反応するが、MMP−10に対する交差反応性は実質的に認められないことが確認された。
(4)ハイブリドーマの寄託
これらの3種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、モノクローナル抗体3D3については「Mouse-Mouse hybridoma 3D3(受託番号:FERM P−22223)」として、モノクローナル抗体14B1については「Mouse-Mouse hybridoma 14B1(受託番号:FERM P−22225)」として、モノクローナル抗体8A6については「Mouse-Mouse hybridoma 8A6(受託番号:FERM P−22224)」として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにて寄託されている。
これらの3種のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、モノクローナル抗体3D3については「Mouse-Mouse hybridoma 3D3(受託番号:FERM P−22223)」として、モノクローナル抗体14B1については「Mouse-Mouse hybridoma 14B1(受託番号:FERM P−22225)」として、モノクローナル抗体8A6については「Mouse-Mouse hybridoma 8A6(受託番号:FERM P−22224)」として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにて寄託されている。
2.本発明の検出方法
上記のモノクローナル抗体「14B1」をコーティングしたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体「3D3」をコーティングしたラテックス粒子を用いた、MMP−3検出系(本品ともいう)の評価を行った。さらに併せて上記のモノクローナル抗体「8A6」を用いた試験を行い、モノクローナル抗体「14B1」と「3D3」に係わる本発明の検出方法の独立した優位性を検証した。
上記のモノクローナル抗体「14B1」をコーティングしたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体「3D3」をコーティングしたラテックス粒子を用いた、MMP−3検出系(本品ともいう)の評価を行った。さらに併せて上記のモノクローナル抗体「8A6」を用いた試験を行い、モノクローナル抗体「14B1」と「3D3」に係わる本発明の検出方法の独立した優位性を検証した。
さらなる比較用の試薬としては、酵素免疫測定法(ELISA法)による市販のMMP−3検出試薬(パナクリアMMP−3「プレート」第一ファインケミカル製:既承認製品Aともいう)、及び、LTIA法による市販のMMP−3検出試薬(パナクリアMMP−3「ラテックス」第一ファインケミカル製:既承認製品Bともいう)を用いた。検体は、血清検体を用いた。
機器は下記のものを用いた。
7170S型自動分析装置(日立社製)(LTIA試薬の測定に使用した装置)
JCA−BM8060自動分析装置(日本電子社製)(LTIA試薬の測定に使用した装置)
AccuFLEX EL4000(アロカ社製)(ELISA試薬の測定に使用した装置)
7170S型自動分析装置(日立社製)(LTIA試薬の測定に使用した装置)
JCA−BM8060自動分析装置(日本電子社製)(LTIA試薬の測定に使用した装置)
AccuFLEX EL4000(アロカ社製)(ELISA試薬の測定に使用した装置)
(1)再現性試験
本発明の検出系を用いて、同時再現性と日差再現性についての試験を行った。その結果を図1に示す。図1において左表は同時再現性の結果を示しており、右グラフは日差再現性を示している。具体的には、2種類の濃度の試料を用いて、同時再現性は各10回測定、日差再現性は各5回、5日間測定した。
本発明の検出系を用いて、同時再現性と日差再現性についての試験を行った。その結果を図1に示す。図1において左表は同時再現性の結果を示しており、右グラフは日差再現性を示している。具体的には、2種類の濃度の試料を用いて、同時再現性は各10回測定、日差再現性は各5回、5日間測定した。
図1に示されるように、同時再現性試験においても、日差再現性試験においても、変動係数CV(%)は3%以内であり、本発明の検出系の再現性は良好であった。
(2)測定範囲の検討
図2は、本発明の検出系における検出限界(左グラフ)と希釈直線性(右グラフ)による測定範囲を示した図面である。
図2は、本発明の検出系における検出限界(左グラフ)と希釈直線性(右グラフ)による測定範囲を示した図面である。
具体的には、検出限界に関しては、試料を生理食塩水にて10段階希釈し、各10回測定した。そして平均値と標準偏差(SD)を算出し、±2SD法により検出限界を求めた。希釈直線性に関しては、約1300ng/mlの高値試料を生理食塩水にて10段階希釈して試料を調製し、測定した。
図2に示されるように、本発明の検出系のMMP−3に対する検出限界は8.9ng/ml(左グラフ)であり、上限は1200ng/mlであることが明らかになった。
(3)プロゾーンの確認
図3は、本発明の検出系におけるプロゾーン現象(抗原又は抗体の過剰による反応抑制現象)の確認を行った結果を示す図面である。具体的には、超高値試料を5段階希釈して試料を調製し、測定した。
図3は、本発明の検出系におけるプロゾーン現象(抗原又は抗体の過剰による反応抑制現象)の確認を行った結果を示す図面である。具体的には、超高値試料を5段階希釈して試料を調製し、測定した。
図3に示すように、MMP−3濃度5000ng/mlまで上記測定範囲内に測定値が落ち込むことはなく、ヒト由来血液検体の測定においてプロゾーン現象が測定結果に影響を与えることが通常ないことが確認できた。
(4)共存物質の影響の検討
図4は、本発明の検出系における共存物質の検討を行った結果を示す図面である。
図4は、本発明の検出系における共存物質の検討を行った結果を示す図面である。
具体的には、2種類の濃度の試料に干渉物質を添加し、添加濃度0濃度(10回測定)の測定値の平均値±10%を算出した。各添加濃度での測定値が添加濃度0濃度の平均値±10%以内であるとき、測定値に影響がないと判断した。
図4に示すように、遊離型ビリルビンは20.0mg/dl、抱合型ビリルビンは20.0mg/dl、溶血ヘモグロビンは500.0mg/dl、乳び(高濃度の脂質が存在する溶液)は2000FTU、リウマチ因子は500.0IU/ml、の濃度まで共存の影響は認められなかった。
(5)ELISA法を用いた既承認製品Aとの相関性
図5は、本発明の検出系とELISA法を用いた既承認製品Aとの相関性を検討した図面である。
図5は、本発明の検出系とELISA法を用いた既承認製品Aとの相関性を検討した図面である。
検体を生理食塩水で希釈して、その希釈直線性を検討したところ、MMP−3が約1200ng/mlまで良好な直線性が得られた。本品と既承認製品Aの相関性は、回帰式y=1.002x−1.2、相関係数r=0.995と良好であることが確認できた(検体数60)。
(6)LTIA法を用いた既承認製品Bとの関係(1)
図6は、LTIA法を用いた既承認製品においてマイナス値が得られた血液検体に対し、本発明の検出方法について検討した結果を示す図面である。
図6は、LTIA法を用いた既承認製品においてマイナス値が得られた血液検体に対し、本発明の検出方法について検討した結果を示す図面である。
既承認製品Bでは、MMP−3の測定値が低値範囲ではマイナス値となってしまう例がしばしば認められた。そこで、当該製品でマイナス値が示された28検体を、他のMMP−3検出系で測定し、結果を比較した。
図6の左グラフにおいて明らかなように、既承認製品Bでマイナス値であった検体の全てが、本品とELISA法を用いた既承認製品Aではプラス値となった。また右グラフは、当該マイナス値の検体を生理食塩水で希釈して既承認製品Aと本品との相関性を検討した結果を示している。その結果、この範囲での本品と既承認製品Aとの相関関係は良好であることが明らかになった。既承認製品AはELISA法を測定原理とするために測定感度は優れているが、測定の迅速性と検体処理能力においては問題が認められる。この結果は、本発明の検出系には、ELISA法と同等程度に測定感度に優れ、かつ、LTIA法による優れた測定の迅速性と検体処理能力が認められることが明らかになった。
(7)LTIA法を用いた既承認製品Bとの関係(2)
図7は、本発明の検出系(本品)と既承認製品Bとの相関関係を、既承認製品Bを用いた測定においてマイナス値が認められなかった60検体について、生理用食塩水による希釈において求めた図面である。
図7は、本発明の検出系(本品)と既承認製品Bとの相関関係を、既承認製品Bを用いた測定においてマイナス値が認められなかった60検体について、生理用食塩水による希釈において求めた図面である。
図に示すようにこれらの60検体において、既承認製品Bと本品には良好な相関関係が認められることが明らかになった。
LTIA法を用いる本発明の検出方法は、測定範囲がMMP−3濃度で概ね10〜1200ng/mlと広い範囲であることに特徴が認められる。既承認製品Aは10〜800ng/ml程度である。また、生理食塩水による検体希釈が可能であることも明らかとなった。従って、測定レンジオーバーによる再測定(再検査率)を減らすことが可能となり、検査現場での作業効率の向上が期待できる。また、本発明の検出系は、測定感度に優れるELISA法を用いる既承認製品Aとの相関性が良好であり、かつ、LTIA法を用いる既承認製品Bのように低値領域においてMMP−3がマイナス値になる現象は認められない。よって本発明の検出方法は、簡便性と正確性を兼ね備えた、日常の検査における適用に非常に適した試薬性能を有していることが明らかとなった。
(8)本発明の検出系のさらなる優位性の検討
上述したMMP−3に対するモノクローナル抗体の製造工程において、本発明に係わるモノクローナル抗体「3D3」と「14B1」と共に、最終候補の中に残った「8A6」を担持させたラテックス粒子を用いた場合についての検討を行った。
上述したMMP−3に対するモノクローナル抗体の製造工程において、本発明に係わるモノクローナル抗体「3D3」と「14B1」と共に、最終候補の中に残った「8A6」を担持させたラテックス粒子を用いた場合についての検討を行った。
すなわち、LTIA法を用いた既承認製品Bにおいてマイナス値であったにもかかわらず、本発明に係わるモノクローナル抗体「3D3」と「14B1」を用いた上述のラテックス粒子系とELISA法による既承認製品AではMMP−3が検出された3検体に対して、モノクローナル抗体「8A6」を担持したラテックス粒子に、「3D3」のラテックス粒子と「14B1」のラテックス粒子を、それぞれ組み合わせた試験系でMMP−3の検出を行った。併せて、本発明の「3D3」のラテックス粒子と「14B1」のラテックス粒子の組み合わせ、ELISA法による既承認製品A、LTIA法を用いた既承認製品B、による検出も行った。
その結果を表1に示す。なお、7170S型自動分析装置(日立社製)を用いて測定した場合、マイナス値は「0」として表示され、既承認製品Bではマイナス値が認められた。
表1の結果において、本発明の試験系に比してモノクローナル抗体「8A6」を用いた試験系は、検出値が不規則に高くなってしまう傾向が認められた。上述したようにモノクローナル抗体「8A6」は、本発明に係わるモノクローナル抗体「3D3」と「14B1」と共にスクリーニングの最終候補であった。すなわちこの試験の結果は、本発明のラテックス粒子を用いる検出方法が、開示されたスクリーニング手法によって得られるハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体で画一的に可能となるものではないことを示している。
Claims (3)
- モノクローナル抗体14B1が担持されたラテックス粒子、及び、モノクローナル抗体3D3が担持されたラテックス粒子、を血液検体と接触させることによる抗原抗体反応による凝集をシグナルとして、当該血液検体におけるヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ−3を検出する、ラテックス凝集法による検出方法。
- 請求項1に記載のラテックス凝集法による検出方法を行うための、検出試薬。
- 請求項1に記載のラテックス凝集法による検出方法を行うための、検出キット。
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