CN105974105A - 基质金属蛋白酶-3（mmp3）检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基质金属蛋白酶‑3(MMP3)测定试剂盒及其测定方法，属于医学生物检测技术领域。该试剂盒包括试剂1、试剂2、校准品及质控品，试剂1包含Tris‑HCl、叠氮钠、PEG‑6000，试剂2包含Tris‑HCl、包被了抗人基质金属蛋白酶‑3抗体胶乳颗粒、叠氮钠和尼泊金甲酯，校准品包含基质金属蛋白酶‑3抗原、叠氮钠，质控品包含基质金属蛋白酶‑3抗原、叠氮钠。本发明提供的一种基质金属蛋白酶‑3(MMP3)测定试剂盒及其测定方法，采用胶乳免疫比浊技术，具有分析灵敏度高、结果准确、操作简单、成本适合等优点，便于推广。

Description

基质金属蛋白酶-3(MMP3)检测试剂盒
技术领域
本发明属医学生物检测技术领域，具体涉及一种基质金属蛋白酶-3(MMP3)检测试剂盒。
背景技术
基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成:(1)疏水信号肽序列；(2)前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激活；(3)催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；(4)富含脯氨酸的铰链区；(5)羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成份，而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP降解，但不同酶的降解效率可不同。
MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。MMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1～26。根据作用底物以及片断同源性，将MMPs分为6类，为胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、furin活化的MMP和其他分泌型MMP。
Ⅳ型胶原酶为其中重要的一类，它主要有两种形式，一种被糖化，分子量为92kD，命名为MMP-9；另一种非糖化，分子量为72kD，被称为MMP-2。当前对MMP-2，MMP-9的研究较深入。
MMP-2基因位于人类染色体16q21，由13个外显子和12个内含子所组成，结构基因总长度为27kb，与其他金属蛋白酶不同，MMP-2基因5’旁侧序列促进子区域含有2个GC盒而不是TATA盒。活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，估计其在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用。
此外，已证实MMP-3和MMP-10能作用于PG、LN、FN、Ⅲ型和Ⅳ型胶原及明胶。且MMP-3能够激活MMP-1和其他家族成员。MMP-7能作用于明胶和FN。MMP-1的产生范围较广，可由基质纤维母细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞产生。正常情况下MMP-1阳性率很低，但在各种刺激下可高表达。有研究显示恶性肿瘤中MMP-1高表达与预后相关。
MMPs的活性受到三个水平的调节，即基因转录水平，无活性酶前体经蛋白水解作用而激活以及特异性抑制因子(TIMP)的作用。
目前已知检测基质金属蛋白酶-3的试剂盒较少，方法也存在较大的缺陷，如测定灵敏度不足，操作繁琐，成本昂贵等，均不利于临床推广使用。
发明内容
本发明提供一种基质金属蛋白酶-3(MMP3)检测试剂盒。
本发明还提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种基质金属蛋白酶-3(MMP3)检测试剂盒，它包括：试剂1、试剂2、校准品及质控品。
上述基质金属蛋白酶-3(MMP3)测定试剂盒，具体包括如下组分：
(1)试剂1：Tris 100mM，叠氮钠5g/L，PEG-6000 4g/L，PH值为8.1；
(2)试剂2：Tris 100mM，叠氮钠2g/L，尼泊金甲酯1g/L，抗人基质金属蛋白酶-3抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为6.0；
(3)校准品：水平1含基质金属蛋白酶-3抗原37.5ng/ml，叠氮钠5g/L；水平2含基质金属蛋白酶-3抗原75ng/ml，叠氮钠5g/L；水平3含基质金属蛋白酶-3抗原150ng/ml，叠氮钠5g/L；水平4含基质金属蛋白酶-3抗原300ng/ml，叠氮钠5g/L；
(4)质控品：基质金属蛋白酶-3抗原50ng/ml，叠氮钠5g/L。
所述的试剂1、试剂2、校准品及质控品的溶剂为电导率(25℃)不大于0.1mS/m的纯净水。
所述的抗人基质金属蛋白酶-3抗体为兔抗人多克隆抗体。
所述的胶乳颗粒为粒径为80-100nm。
所述的PH值调节试剂为1mM的盐酸溶液。
所述检测试剂盒用于定量测定血清中基质金属蛋白酶-3的含量。
本发明第二方面提供所述测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)准备编号为1、2、3、4的4支反应管；
2)同时在第1反应管内加入试剂1 150μL，水平1校准品3μL混合均匀，在第2反应管内加入试剂1 150μL，水平2校准品3μL混合均匀，在第3反应管内加入试剂1 150μL，水平3校准品3μL混合均匀，在第4反应管内加入试剂1 150μL，水平4校准品3μL混合均匀，4支反应管均孵育5分钟；
3)5分钟孵育结束后，同时在第1反应管内加入试剂2 50μL混合均匀，在第2反应管内加入试剂2 50μL混合均匀，在第3反应管内加入试剂2 50μL混合均匀，在第4反应管内加入试剂2 50μL混合均匀，均孵育半分钟；
4)半分钟孵育结束后，分别读取1、2、3、4反应管吸光度A11,A12,A13,A14；
5)继续孵育5分钟后，再次分别读取1、2、3、4反应管吸光度A21,A22,A23,A24；
6)分别以4个不同浓度水平校准品浓度为横坐标，以(A21-A11)、(A22-A12)、(A23-A13)、(A24-A14)为纵坐标作一标准曲线图；
7)再次准备1支反应管，在反应管内加入试剂1 150μL，检测样本3μL混合均匀并孵育5分钟；
8)5分钟孵育结束后，在反应管内加入试剂2 50μL混合均匀并孵育半分钟，读取吸光度A1；
9)继续孵育5分钟，读取吸光度A2；
10)计算A2-A1，然后在标准曲线上找出对应的浓度值，即为样本中基质金属蛋白酶-3的含量。
所述的反应孵育温度为37℃。
本发明的有益效果为：
本发明所提供的一种基质金属蛋白酶-3(MMP3)测定试剂盒，采用胶乳免疫比浊技术，并提供配套的校准品及质控品，具有测定结果准确、检测灵敏度高、方便快捷、稳定性好、特异性高、成本低廉等优点，利于临床推广使用。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：抗基质金属蛋白酶-3抗体胶乳颗粒制备。
1)配制50mM的MES缓冲液，PH值为6.0；
2)用上述MES缓冲液稀释胶乳微球，浓度为1％(v/v)；
3)在胶乳微球悬浮液中加入EDAC，加入浓度为40mg/ml,在室温孵育40分钟；
4)用相同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球，然后13000g/min离心30分钟，再次用相同体积的MES缓冲液洗涤胶乳微球，然后13000g/min离心30分钟，然后再将胶乳微球溶于MES缓冲液中；
5)将兔抗人基质金属蛋白酶-3抗体溶于上述MES缓冲液中，浓度为1mg/mL；
6)将抗体溶液和胶乳微球悬浮液混合，37℃搅拌反应3小时；
7)在混合液中加入乙醇胺，加入量为2.5μL/mL，搅拌反应10分钟；
8)除去未结合的抗体，将包被好的抗体胶乳颗粒贮存在MES缓冲液中。
实施例2：试剂盒的制备方法。
(1)试剂1：
Tris 100mM，叠氮钠5g/L，PEG-6000 4g/L，PH值为8.1；
(2)试剂2：
Tris 100mM，叠氮钠2g/L，尼泊金甲酯1g/L，抗人基质金属蛋白酶-3抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为6.0；
(3)校准品：
水平1含基质金属蛋白酶-3抗原37.5ng/ml，叠氮钠5g/L；水平2含基质金属蛋白酶-3抗原75ng/ml，叠氮钠5g/L；水平3含基质金属蛋白酶-3抗原150ng/ml，叠氮钠5g/L；水平4含基质金属蛋白酶-3抗原300ng/ml，叠氮钠5g/L；
(4)质控品：
基质金属蛋白酶-3抗原50ng/ml，叠氮钠5g/L。
实施例3：检测方法。
本实施例描述的基质金属蛋白酶-3测定试剂盒，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动生化分析仪等，利用两点终点法进行测定。将试剂1和试剂2按3：1放于仪器试剂位上，在样本盘相应位置上放置好纯净水、校准品和样本，操作如下表：
表1实施例2试剂检测方法
计算：MMP3含量(ng/mL)＝ΔA测定/ΔA测定×C标准
实施例4：分析灵敏度验证实验。
用实施例2试剂盒测定已知浓度的样本，记录吸光度差值。检测结果如表2所示。
表2分析灵敏度实验结果
测定浓度(ng/mL) 检测结果ΔA
5.0 0.0021
10.0 0.0044
20.0 0.0087
全自动生化分析仪在吸光度大于0.001时均可准确的获得检测结果，且仪器噪音对检测结果影响较少.上述结果表明本发明试剂盒的灵敏度可达5ng/ml。
实施例5：稳定性考察
在2-8℃储存条件下，分别在0个月、12个月和24个月对同一标准品样本(MMP3浓度为5ng/ml)进行测定，每个样本测定10次，取均值。结果表明(见表3)，测值差异非常小，说明实施例2制备的检测试剂盒在2-8度储存条件下至少可以稳定24个月以上。
12个月测定结果(ng/mL) 24个月测定结果(ng/mL)
实施例2 5.05 4.92
对比例1 4.87 2.76
对比例2 4.96 4.14
对比例3 4.72 3.81
对比例4 4.94 3.23
对比例5 4.23 1.09
对比例6 3.91 0.64
对比例1：试剂2中不添加尼泊金甲酯，其他组分同实施例2
对比例2：试剂2中尼泊金甲酯浓度3g/L，其他组分同实施例2
对比例3：试剂1的pH值为7.5，其他同实施例2
对比例4：试剂1的pH值为8.7，其他同实施例2
对比例5：试剂2的pH值为5.5，其他同实施例2
对比例6：试剂1的pH值为6.5，其他同实施例2
实施例6：特异性考察
在同一份人血清样本(MMP3含量为27.8ng/ml)中分别加入不同含量的干扰物质MMP10至浓度为30ng/ml，然后进行测定。结果表明，本发明实施例2试剂盒检测结果为27.6ng/ml；MMP10对本发明试剂盒无干扰。另外，对血红蛋白以及乳糜微粒也进行了类似测试，结果表明，其对本发明试剂盒也不存在干扰。

Claims (5)

1.一种基质金属蛋白酶-3(MMP3)检测试剂盒，它包括：试剂1、试剂2、校准品及质控品。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂1的组成为：Tris 100mM，叠氮钠5g/L，PEG-6000 4g/L，PH值为8.1；余量为水。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂2的组成为：Tris 100mM，叠氮钠2g/L，尼泊金甲酯1g/L，抗人基质金属蛋白酶-3抗体胶乳颗粒1g/L，PH值为6.0；余量为水。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，校准品为：水平1含基质金属蛋白酶-3抗原37.5ng/ml，叠氮钠5g/L；水平2含基质金属蛋白酶-3抗原75ng/ml，叠氮钠5g/L；水平3含基质金属蛋白酶-3抗原150ng/ml，叠氮钠5g/L；水平4含基质金属蛋白酶-3抗原300ng/ml，叠氮钠5g/L。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，质控品为：基质金属蛋白酶-3抗原50ng/ml，叠氮钠5g/L。
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