CN106872685A - Mmp3试剂盒的制备方法 - Google Patents

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张睿
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Abstract

本发明涉及MMP3试剂盒的制备方法，包括MMP3试剂R1与试剂R2的制备方法。是将制备好的R1试剂与R2试剂组装在一起构成MMP3试剂盒。本发明制备工艺简单，在制备试剂R1时，调节因子用聚乙二醇20000代替普通的聚乙二醇6000即能达到相同的效果又能有效降低试剂本底起到了改善试剂盒性能的作用，在制备试剂R2时，活化剂HEPES代替常规的MES缓冲液，使包被效率提高，改善了试剂的线性范围，进一步完善了试剂盒的性能。

Description

MMP3试剂盒的制备方法
技术领域
本发明涉及乳胶试剂盒的一种制备方法，尤其涉及MMP3试剂盒制备用。
背景技术
胶乳颗粒增强比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一类结构中含Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶类,主要参与细胞外基质的代谢.它们在血管形成、伤口愈合、肿瘤浸润和纤维化等方面起着重要的作用,因此备受关注。
其中MMP3为基质分解素类,可降解蛋白多糖、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原,包括MMP3、MMP7和MMP10。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，通过优化MMP3试剂盒中试剂R1与R2的制备工艺，降低试剂的本底与提高试剂的线性范围，达到提升MMP3试剂盒性能的目的。
本发明的具体技术方案是：
一种MMP3试剂盒的制备方法，包括由MMP3试剂R1的制备和MMP3试剂R2的制备组成；
其中，MMP3试剂R1的配方：
甘氨酸 6g/L；
氯化钠 8.22g/L；
曲拉通X-100 1.0ml/L；
BSA 1.5g/L；
聚乙二醇20000 约6.0g/L；
叠氮钠 1g/L；
其中，MMP3试剂R2的配方：
HEPES 20g/L；
氯化钠 3g/L；
BSA 0.5g/L；
乳胶 1.4g/L；
抗人MMP-3小鼠单克隆抗体I 57.15mg/L；
抗人MMP-3小鼠单克隆抗体Ⅱ 57.15mg/L；
将制备好的R1试剂与R2试剂组装在一起构成MMP3试剂盒。
进一步的，所述试剂R1中，每升R1中甘氨酸的添加量在1g~10g之间；每升R1中曲拉通的添加量在0.5g~5ml之间；每升R1中PEG20000的添加量在1g~10g之间。
进一步的，所述试剂R2中，每升R2中HEPES的添加量在5g~30g之间；每升R2中乳胶的添加量在0.5g~5g之间；每升R2中抗人MMP-3小鼠单克隆抗体I的添加量在10mg~100mg之间。
有益效果
本发明在制备试剂R1时，调节因子用聚乙二醇20000代替普通的聚乙二醇6000即能达到相同的效果又能有效降低试剂本底起到了改善试剂盒性能的作用，在制备试剂R2时，活化剂HEPES代替常规的MES缓冲液，使包被效率提高，改善了试剂的线性范围，进一步完善了试剂盒的性能。
具体实施方式
下面对本发明做进一步描述：
MMP3试剂R1的制备：
甘氨酸 6g/L；
氯化钠 8.22g/L；
曲拉通X-100 1.0ml/L；
BSA 1.5g/L；
聚乙二醇20000 约5.0g/L；
叠氮钠 1g/L。
根据上述配方，计算并准确称量各组分所需用量，在不断搅拌的情况下依次加入称量好的物料，充分混匀即可。
本发明用PEG20000代替常规的PEG6000既能达到相同的实验效果又能降低试剂本底。
PEG20000数据
MMP(ng/L) 吸光度 吸光度
R1 R2
0 8 10
100 358 355
200 790 780
400 1930 1920
800 4100 4080
1600 5820 5816
PEG6000数据
MMP(ng/L) 吸光度 吸光度
R1 R2
0 101 121
100 400 385
200 898 880
400 2030 2080
800 4250 4380
1600 5920 5986
从实验数据看100/200/400/800/1600各浓度点的吸光度差异不大，本发明用PEG20000代替PEG6000后试剂本底降了很多，优化了试剂盒性能。
MMP3试剂R2的制备：
HEPES 20g/L
氯化钠 3g/L
BSA 0.5g/L
乳胶 1.4g/L
抗人MMP-3小鼠单克隆抗体I 57.15mg/L
抗人MMP-3小鼠单克隆抗体Ⅱ 57.15mg/L
根据上述配方，计算并准确称量各组分所需用量，按照如下步骤进行制备：
1.活化 取HEPES buffer（pH=7.4） 于离心管中，取乳胶于上述离心管内并混匀，然后
将离心管放在恒温水浴箱里震动活化20分钟，温度23℃，转速 130rpm/min。本发明采用活化剂HEPES缓冲液代替常规的MES缓冲液，使包被效率提高，改善了试剂的线性范围，进一步完善了试剂盒的性能。
2.包被 活化时间20分钟到了后向离心管里加入两种抗体并将离心管放在恒温水浴箱里震动包被120分钟，温度37℃，转速 130rpm/min。
3.离心，清洗 包被时间结束后开始离心。离心结束后倾倒上清液加入抗体清洗液（HEPES buffer（pH=7.4））并再次离心，离心结束后倾倒上清液加入封闭液（HEPES buffer（pH=7.4）加入BSA）。离心条件设置为：温度=9℃；转速=15000RPM；时间=15分钟。
4.封闭 将加有封闭液的离心管放在水浴箱里水浴加热振荡60分钟，温度42℃，转速 117rpm/min。
5.离心，定容 封闭60分钟结束后开始离心，离心结束后倾倒上清液加入储存液（HEPES buffer（pH=7.4）加入氯化钠）并超声分散，分散好的液体就是包被好的MMP3试剂R2。
HEPES活化液数据
MMP(ng/L) 吸光度 吸光度
R1 R2
0 8 10
100 358 355
200 790 780
400 1530 1520
800 3100 3080
1600 6120 6116
MES活化液数据
MMP(ng/L) 吸光度 吸光度
R1 R2
0 28 40
100 308 315
200 690 680
400 1330 1320
800 2100 2080
1600 3320 3316
从实验数据看，用MES做活化液的话，100/200/400/800/1600各浓度点的吸光度后面有点上不去了，本发明用HEPES做活化液的话，100/200/400/800/1600各浓度点的吸光度上升很快，线性比较好。

Claims (3)

1.一种MMP3试剂盒的制备方法,其特征在于，包括由MMP3试剂R1的制备和MMP3试剂R2的制备组成；
其中，MMP3试剂R1的配方：
甘氨酸 6g/L；
氯化钠 8.22g/L；
曲拉通X-100 1.0ml/L；
BSA 1.5g/L；
聚乙二醇20000 约6.0g/L；
叠氮钠 1g/L；
其中，MMP3试剂R2的配方：
HEPES 20g/L；
氯化钠 3g/L；
BSA 0.5g/L；
乳胶 1.4g/L；
抗人MMP-3小鼠单克隆抗体I 57.15mg/L；
抗人MMP-3小鼠单克隆抗体Ⅱ 57.15mg/L；
将制备好的R1试剂与R2试剂组装在一起构成MMP3试剂盒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述试剂R1中，每升R1中甘氨酸的添加量在1g~10g之间；每升R1中曲拉通的添加量在0.5g~5ml之间；每升R1中PEG20000的添加量在1g~10g之间。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述试剂R2中，每升R2中HEPES的添加量在5g~30g之间；每升R2中乳胶的添加量在0.5g~5g之间；每升R2中抗人MMP-3小鼠单克隆抗体I的添加量在10mg~100mg之间。
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